CN105524940B - 一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体、细胞及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体、细胞及方法。本发明提供的载体包括阻遏物表达载体和含有阻遏操纵子的表达载体，在转染时将两者共转染到供体细胞中；所述的含有阻遏操纵子的表达载体中插入有牛KDM4B或牛KDM4C基因。将阳性转染的细胞作为供体细胞，再将其注入到去核后的卵母细胞并进行电融合，挑选成功融合的牛体细胞克隆胚培养至36h时，诱导表达牛KDM4B和KDM4C。本发明可以有效减弱体细胞克隆胚在合子激活时期的组蛋白H3K9me3表观遗传修饰水平，从而显著提高后期牛体细胞克隆囊胚的发育率和质量，可高效体外生产牛体细胞克隆胚胎，胚胎移植后克隆牛的出生率也显著提高。

Description

一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体、 细胞及方法

技术领域

本发明属于动物体细胞克隆技术领域，涉及一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体、细胞及方法。

背景技术

体细胞克隆是一项具有巨大研究和商用价值的技术，可应用到治疗性克隆，疾病模型，人类器官移植，动物转基因研究，濒临灭绝动物品种保护，优良家畜品种扩增等方面。但至今体细胞克隆效率仍然不高，显著制约着此技术的广泛应用。

目前认为，克隆效率低下的主要原因是供体体细胞核没有被受体卵胞质完全的重编程，即重编程失败或不完全。此重编程过程中没有涉及基因序列的变化，主要是表观遗传修饰的变化。表观遗传修饰主要包括组蛋白甲基化和DNA甲基化两方面。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体、细胞及方法，在牛体细胞注入去核的卵母细胞并进行电融合之后，对融合后的细胞进行处理，诱导牛KDM4B和KDM4C蛋白的表达，提高牛体细胞克隆囊胚质量和发育率。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体，包括阻遏物表达载体和含有阻遏操纵子的表达载体，在转染时将两者共转染到供体细胞中；

所述的含有阻遏操纵子的表达载体中插入有牛KDM4B或牛KDM4C基因。

所述的阻遏物表达载体为能够表达四环素阻遏蛋白的TetR的载体；

所述的含有阻遏操纵子的表达载体为含有四环素操纵基因TetO的载体，其中插入携有荧光标记的牛KDM4B或KDM4C基因的读码框。

还在牛KDM4B或KDM4C基因末端添加Kozak序列、EGFP标签和酶切位点；

其中，牛KDM4B的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；

牛KDM4C基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

所述的阻遏物表达载体为pCMV-Tet3G，其能够表达四环素阻遏蛋白TetR；

所述的含有阻遏操纵子的表达载体为pTRE3G-EGFP-KDM4B/C，其含有四环素操纵基因TetO，并在其多克隆位点中克隆2个拷贝的KDM4B或KDM4C，2个拷贝均连有Kozak序列，其中的1个拷贝还与EGFP标签相连接。

一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的细胞，以牛胎儿成纤维细胞为宿主细胞，将阻遏物表达载体和含有阻遏操纵子的表达载体共转染到宿主细胞；通过与阻遏物相对应的诱导表达药物对转染的细胞诱导表达，筛选表达载体阳性表达的细胞作为核供体细胞；

所述的阻遏物表达载体为能够表达四环素阻遏蛋白TetR的载体；所述的含有阻遏操纵子的表达载体为含有四环素操纵基因TetO的载体，其中插入携有荧光标记的牛KDM4B或KDM4C基因的读码框。

所述的转染为电击转染；

将阻遏物表达载体pCMV-Tet3G和含有阻遏操纵子的表达载体和pTRE3G-EGFP-KDM4B/C按4:1的质量比电击共转染；

所述的pTRE3G-EGFP-KDM4B/C是在pTRE3G-BI载体多克隆位点中克隆2个拷贝的KDM4B或KDM4C，2个拷贝均连有Kozak序列，其中的1个拷贝还与EGFP标签相连接；

所述的诱导表达药物为Dox，其浓度为100～200ng/mL；

所述的表达载体阳性表达的细胞激发后发出绿色荧光。

一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的融合方法，包括以下步骤：

1)分别构建携有荧光标签的牛KDM4B基因或KDM4C基因的真核诱导表达载体，并将所构建的载体与可诱导表达的载体通过电击共转化胎牛原代成纤维细胞，筛选出细胞克隆，加入诱导表达药物对牛KDM4B基因或KDM4C基因进行诱导表达，挑取可被荧光激发的阳性细胞克隆作为体细胞核移植的牛供体细胞；

2)将所制备的牛供体细胞注入到去核后的卵母细胞并进行电融合，在电融合后1h，挑选电融合的融合细胞进行以下激活处理：2～5μmol/L离子霉素的mSOF溶液中室温孵育4～10min，然后转移到1～2mmol/L 6-DMAP的mSOF溶液中，在38.5℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养4～10h；

所述的mSOF溶液是以SOF培养液作为基础培养基，并包含有体积分数2％的BME、体积分数1％的MEM、体积分数1％的ITS、1mmol/L的谷氨酰胺、80mg/mL的BSA、100IU/mL的青霉素和0.1mg/mL的链霉素；

3)在进行激活处理后，转移到G1.5培养液中，在38.5℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养4h，再用G1.5培养液清洗多次，继续在G1.5培养液中培养至36h；再转移到含200ng/mL诱导表达药物的G1.5培养液中培养至60h，诱导牛KDM4B基因或KDM4C基因表达；最后转移到G2.5培养液中继续在38.5℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养至第7d。

所述的牛KDM4B基因或KDM4C基因的真核诱导表达载体为pTRE3G-EGFP-KDM4B/C，其含有四环素操纵基因TetO，并在其多克隆位点中克隆2个拷贝的KDM4B或KDM4C，2个拷贝均连有Kozak序列，其中的1个拷贝还与EGFP标签相连接；

所述的可诱导表达的载体为pCMV-Tet3G，其能够表达四环素阻遏蛋白TetR；

在共转化胎牛原代成纤维细胞时，载体pTRE3G-EGFP-KDM4B/C与pCMV-Tet3G的质量比为4:1；

所述的诱导表达药物为Dox，其浓度为100～200ng/mL。

所述诱导表达药物诱导牛KDM4B基因或KDM4C基因表达时，诱导表达时段选在细胞融合后第36h～60h；

所述的G1.5培养液上还覆盖有石蜡油，并预先在CO₂培养箱中平衡至少2h；G1.5培养液中，液滴大小为120～150μL，每个液滴中放18～20枚牛体细胞克隆胚。

所述的去核的卵母细胞的制备为：

在去核前，卵母细胞先在含有7.5μg/ml细胞松弛素B、10μg/ml Hoechst33342和体积浓度10％FBS的PBS溶液中孵育15min；然后在显微操仪下，用内径为20μm的去核管吸取第一极体及其周围的卵胞质，紫外光照射吸出的卵胞质团检查去核情况；完全去除第一极体及染色体的卵母细胞应用于核移植；

所述的电融合的操作为：

挑选直径为15～20μm的待移植的牛供体细胞，注入到去核的卵母细胞透明带下；在进行电融合前，重构体在电融合液中预平衡3min；将重构体的供体、作为受体的去核的卵母细胞膜接触面与两电极的连线垂直，融合参数为电压32V、脉冲时为20μs、2次脉冲间隔10ms。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体、细胞及方法，是基于甲基化水平的修饰来进行表观遗传修饰。牛KDM4B和KDM4C蛋白是专一性去除组蛋白H3赖氨酸K9的3甲基化(H3K9me3)表观遗传修饰的去甲基化酶，将牛KDM4B或牛KDM4C基因构建于含有阻遏操纵子的表达载体，并将其与阻遏物表达载体共转染核供体细胞，这样就可以在特定的阶段通过药物诱导去阻遏，从而达到去甲基化的表观遗传修饰。通过在体细胞克隆胚合子激活时期(8细胞至桑椹胚时期)之前诱导表达牛KDM4B或牛KDM4C蛋白，可有效减弱体细胞克隆胚在合子激活时期的组蛋白H3K9me3表观遗传修饰水平，达到促进体细胞克隆胚正常发育的目的。

本发明提供的基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体、细胞及方法，在核供体细胞、卵母细胞重构体构建完成后36h，利用Dox对重构体进行处理，诱导重构体表达牛KDM4B和KDM4C蛋白，可有效减弱体细胞克隆胚在合子激活时期的组蛋白H3K9me3表观遗传修饰水平。显著提高后期牛体细胞克隆囊胚的发育率和质量，可高效体外生产牛体细胞克隆胚胎。

与未诱导表达的对照组相比，利用Dox诱导处理之后，可检测出胚胎在随后的8细胞到桑椹胚时期之间可激发出绿色荧光，可显著提高囊胚的发育率。Dox诱导处理牛体细胞克隆胚胎表达牛KDM4B和KDM4C蛋白，可有效减弱体细胞克隆胚在合子激活时期的组蛋白H3K9me3表观遗传修饰水平，可以显著提高囊胚的细胞总数、内细胞团细胞数和ICM:TE的比值。牛体细胞克隆囊胚在合子激活时期的组蛋白H3K9me3表观遗传修饰水平显著低于对照组(P<0.05)；牛体细胞克隆囊胚的细胞总数显著高于对照组(P<0.05)；囊胚的内细胞团细胞数显著高于对照组(P<0.05)；囊胚的内细胞团细胞数和滋养层细胞数的比值显著高于对照组(P<0.05)。

附图说明

图1为Tet-On 3G Inducible Expression System真核细胞诱导系统载体图及牛KDM4B和KDM4C真核细胞诱导表达载体图。

图2为KDM4B和KDM4C的CDS区域，EGFP标签，Kozak序列等表达元件和pTRE3G-BI多克隆位点的排列示意图。

图3为KDM4B和KDM4C诱导表达细胞克隆效果图，结果显示200ng/mL Dox处理24h足够诱导阳性细胞克隆表达绿色荧光蛋白，说明KDM4B和KDM4C的诱导表达效果正常。

图4为KDM4B和KDM4C诱导表达细胞克隆的qPCR和Western Blot鉴定结果，显示200ng/mL Dox处理24h足够诱导阳性细胞克隆高效表达KDM4B和KDM4C的mRNA及蛋白。

图5为牛体细胞克隆胚的KDM4B和KDM4C诱导表达效果图，蓝色为DAPI染色的细胞核，红色为胚胎H3K9me3的免疫染色，绿色为胚胎表达携有绿色荧光蛋白EGFP的KDM4B和KDM4C蛋白。结果显示200ng/mL Dox在36h～60h时段内足够诱导体细胞克隆胚表达KDM4B和KDM4C，且相应的去H3K9me3功效未受影响，说明KDM4B和KDM4C的诱导表达效果正常。合成图为三者数据的重叠效果。

图6为利用本发明的处理方法制备的牛体细胞克隆囊胚的显微视图。

具体实施方式

本发明提供的一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体、细胞及方法，是基于甲基化水平的修饰来进行表观遗传修饰。选择牛KDM4B和KDM4C作为去甲基化的基因，而为了便于在特定的阶段进行去甲基化的修饰，所以将其分别构建在阻遏物表达载体和含有阻遏操纵子的表达载体中，这样既能够进行阳性细胞的筛选，又方便进行诱导表达。

本发明提供的一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体，包括阻遏物表达载体和含有阻遏操纵子的表达载体，在转染时将两者共转染到供体细胞中；

所述的含有阻遏操纵子的表达载体中插入有牛KDM4B或牛KDM4C基因。

进一步的，所述的阻遏物表达载体为能够表达四环素阻遏蛋白的TetR的载体；

所述的含有阻遏操纵子的表达载体为含有四环素操纵基因TetO的载体，其中插入携有荧光标记的牛KDM4B或KDM4C基因的读码框。

还在牛KDM4B或KDM4C基因末端添加Kozak序列、EGFP标签和酶切位点；

其中，牛KDM4B的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；

牛KDM4C基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

具体的，所述的阻遏物表达载体为pCMV-Tet3G，其能够表达四环素阻遏蛋白TetR；

所述的含有阻遏操纵子的表达载体为pTRE3G-EGFP-KDM4B/C，其含有四环素操纵基因TetO，并在其多克隆位点中克隆2个拷贝的KDM4B或KDM4C，2个拷贝均连有Kozak序列，其中的1个拷贝还与EGFP标签相连接。

本发明提供的一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的细胞，以牛胎儿成纤维细胞为宿主细胞，将阻遏物表达载体和含有阻遏操纵子的表达载体共转染到宿主细胞；通过与阻遏物相对应的诱导表达药物对转染的细胞诱导表达，筛选表达载体阳性表达的细胞作为核供体细胞；

所述的阻遏物表达载体为能够表达四环素阻遏蛋白TetR的载体；所述的含有阻遏操纵子的表达载体为含有四环素操纵基因TetO的载体，其中插入携有荧光标记的牛KDM4B或KDM4C基因的读码框。

本发明提供的一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的融合方法，包括以下步骤：

1)分别构建携有荧光标签的牛KDM4B基因或KDM4C基因的真核诱导表达载体，并将所构建的载体与可诱导表达的载体通过电击共转化胎牛原代成纤维细胞，筛选出细胞克隆，加入诱导表达药物对牛KDM4B基因或KDM4C基因进行诱导表达，挑取可被荧光激发的阳性细胞克隆作为体细胞核移植的牛供体细胞；

2)将所制备的牛供体细胞注入到去核后的卵母细胞并进行电融合，在电融合后1h，挑选电融合的融合细胞进行以下激活处理：2～5μmol/L离子霉素的mSOF溶液中室温孵育4～10min，然后转移到1～2mmol/L 6-DMAP的mSOF溶液中，在38.5℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养4～10h；

所述的mSOF溶液是以SOF培养液作为基础培养基，并包含有体积分数2％的BME、体积分数1％的MEM、体积分数1％的ITS、1mmol/L的谷氨酰胺、80mg/mL的BSA、100IU/mL的青霉素和0.1mg/mL的链霉素；

3)在进行激活处理后转移到G1.5培养液中培养，并在细胞融合后第36h～60h内添加诱导表达药物，以诱导牛KDM4B基因或KDM4C基因表达；最后转移到G2.5培养液中继续在38.5℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养至第7d。

具体的，所述的激活后的诱导表达为：

在进行激活处理后转移到G1.5培养液中，在38.5℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养至融合后4h，再用G1.5培养液清洗多次，继续在G1.5培养液中培养至融合后36h；再转移到含200ng/mL诱导表达药物的G1.5培养液中培养至融合后60h，诱导牛KDM4B基因或KDM4C基因表达；最后转移到G2.5培养液中继续在38.5℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养至第7d；

所述的G1.5培养液上还覆盖有石蜡油，并预先在CO₂培养箱中平衡至少2h；G1.5培养液中，液滴大小为120～150μL，每个液滴中放18～20枚牛体细胞克隆胚。

在重构体构建完成后36h，利用Dox对重构体进行处理，诱导重构体表达牛KDM4B和KDM4C蛋白，可有效减弱体细胞克隆胚在合子激活时期的组蛋白H3K9me3表观遗传修饰水平。显著提高后期牛体细胞克隆囊胚的发育率和质量，可高效体外生产牛体细胞克隆胚胎。下面结合具体的操作过程和对比分析结果对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

首先给出以下试剂和培养液/处理液的来源或制备：

Dox、G418、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、青霉素、链霉素、无机盐、石蜡油为sigma公司产品，DMEM和Opti-MEM液体培养基，PBS细胞洗涤液，细胞消化液和特级胎牛血清(FBS)为Gibco产品，胚胎培养液G1.5、G2.5均购买于vitrolife公司。H3K9me3的抗体购自Abcam公司，货号ab8898。其他未标明的均为sigma公司产品。

a、卵母细胞体外成熟培养液

成熟培养液为TCM199液中添加2.2mg/mL NaHCO₃、0.075IU/mL HMG、1μg/mL 17β-E₂、0.33mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺以及100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素。

b、mSOF溶液

mSOF溶液是以SOF培养液作为基础培养基，还包含有体积分数2％的BME、体积分数1％的MEM、体积分数1％的ITS、1mmol/L的谷氨酰胺、80mg/mL的BSA、100IU/mL的青霉素和0.1mg/mL的链霉素；

c、电融合液

电融合液的组成为：0.3mol/L甘露醇、0.05mol/L氯化钙、0.1mol/L硫酸镁、0.27mol/L组氨酸、0.1％BSA。

d、Dox储存液的配置

Dox储存液浓度1mg/mL:称取10mg Dox于灭菌的15ml离心管中，加入10mL ddH₂O后混匀，过滤除菌并分装，避光储存于-20℃冰箱待用，一年内有效。

e、G418储存液的配制

G418储存液浓度100mg/mL:称取1g G418于灭菌的15ml离心管中，加入10mL ddH₂O后混匀，过滤除菌并分装，储存于-20℃冰箱待用，一年内有效。

f、DMEM细胞筛选培养液的配制

成品DMEM液体培养基加入10％FBS，10ng/mL bFGF，以此为基础培养液，细胞筛选培养液的G418初始筛选浓度为800ug/mL，复筛浓度为200ug/mL。

g、BTX细胞电击转染缓冲液及工作液的配制

配方为KCl 120mM，CaCl₂·2H₂O 0.15mM，K₂HPO₄10mM，MgCl₂·6H₂O5mM。工作液为BTX细胞电击转染缓冲液与Opti-MEM体积比3:1预混。

1、下面给出真核细胞诱导系统载体的构建及阳性细胞克隆筛选方法

Tet-On 3G Inducible Expression System是真核诱导表达系统，由pCMV-Tet3G和pTRE3G-BI载体所组成。其中pCMV-Tet3G(图1A)载体表达四环素阻遏蛋白(TetR)，pTRE3G-BI含有四环素操纵基因(TetO)，当细胞内无四环素类似物(Dox)存在时，TetR会与TetO结合，从而阻断下游目的基因的表达；当有Dox存在时，四环素类似物药物使TetR的构象发生改变，导致TetR与TetO分离，从而引起目的基因的抑制解除，使目的蛋白得以表达。pTRE3G-BI(图1B)载体中有两个多克隆位点(MCS)，MSC-1区插入含Kozak序列的牛KDM4B或KDM4C基因的读码框，MCS-2区均插入携有绿色荧光蛋白EGFP及Kozak序列的牛KDM4B或KDM4C基因的读码框，所构载体命名为pTRE3G-EGFP-KDM4B(图1C)，pTRE3G-EGFP-KDM4C(图1D)，表示为pTRE3G-EGFP-KDM4B/C。

牛KDM4B基因位于7号染色体上，编码序列长3351bp，编码氨基酸1116个，牛KDM4C基因位于8号染色体上，编码序列长2958bp，编码氨基酸985个。Trizol法提取牛睾丸组织RNA，通过反转录PCR获得相应cDNA，以此为模板使用PCR酶Takara PrimerStar获得KDM4B/C的CDS区域全长，并在基因片段末端添加Kozak序列、EGFP标签和酶切位点，片段随后通过酶切连接，拼接入pTRE3G-BI载体的MSC区(元件连接如图2所示，两个克隆位点中分别插入一个KDM4B/C)。

其中，KDM4B CDS区核酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；KDM4C CDS区核酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

扩增KDM4B/C的CDS区是为了正确表达KDM4B/C蛋白的核酸序列，将其插入真核诱导表达载体，即可在诱导后准确依照CDS区域核酸序列转录出相应mRNA，随后翻译出正确的肽链，并组装成KDM4B/C有活性的蛋白。

Kozak序列均为GCCACC，加在CDS区序列ATG的前端，主要目的是促进依照CDS区转录出的mRNA有效地与核糖体结合，保证翻译的正常进行。

pTRE3G-EGFP-KDM4B/C中KDM4B、KDM4C的元件排列如图2所示，pTRE3G-BI共有MSCI和MSC II两个多克隆位点，在其中分别插入一个KDM4B或KDM4C。框内酶切位点为连入基因所选择的位点，其中pTRE3G-BI的MSC I区域还添加了NheI和SphI酶切位点，以便随后基因的插入。

将pCMV-Tet3G和pTRE3G-EGFP-KDM4B/C使用电击转染按4:1的质量比共转入原代胎牛成纤维细胞中，使用800ug/mL G418对转染成功的细胞进行筛选。约2周后得到具有G418抗性的细胞克隆，加入200ng/mL Dox诱导后，在荧光显微镜下标记出EGFP表达的细胞克隆，并将满足以上两项条件的细胞克隆进行扩大培养。对于扩大培养得到出的克隆，一部分再次加入Dox诱导，通过qPCR或Western Blot确定KDM4B/C的表达，另一部分冻存入液氮中以备后用。

图3显示KDM4B和KDM4C诱导表达细胞克隆效果图，结果显示200ng/mL Dox处理24h足够诱导阳性细胞克隆表达携有绿色荧光蛋白的KDM4B和KDM4C，诱导表达效果正常。

图4显示细胞克隆加入Dox诱导后qPCR和Western Blot的结果，在qPCR结果图中左侧柱状为KDM4B的诱导表达结果，右侧柱状为KDM4C的诱导表达结果；与未添加Dox相比较，显然在加入Dox诱导后KDM4B和KDM4C均得到了显著的表达，qPCR内参基因为GAPDH。

Western Blot结果为EGFP标签杂交结果，KDM4C比KDM4B稍大，内参抗体为GAPDH。

qPCR的定量引物如下：

KDM4B上游5’-TTCCTGCGTTTTGTAAACCATCG-3’；

KDM4B下游5’-TGATCTTACAGCTTGGGTTCTGG-3’；

KDM4C上游5’-ATTCCCTTTGACAAGATCACCCA-3’；

KDM4C下游5’-CTTTCCTTGTTTCCAAAGCTGGT-3’；

GAPDH上游5’-CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3’；

GAPDH下游5’-GAGTGTCGCTGTTGAAGTCGC-3’。

结果表明Dox可高效正常地诱导所构建的载体中的KDM4B/C的mRNA转录和蛋白翻译。

2、下面给出体细胞核移植技术生产牛克隆胚胎的制备

a.牛胎儿成纤维阳性克隆的培养

从液氮中取一管牛胎儿成纤维阳性克隆于38℃解冻，加0.8ml的DMEM细胞培养液离心，弃上清，加细胞培养液重悬，取3ml细胞悬浮液接种于直径60mm的培养皿中，置于CO₂培养箱中38.5℃条件下培养。

待牛胎儿成纤维细胞达到80％汇合时，吸弃培养液，用PBS细胞洗涤液冲洗细胞，加入细胞消化液消化细胞。在倒置显微镜下观察细胞，待大多数细胞回缩、变圆、细胞间隙扩大时，用含10％FBS的DMEM细胞培养液终止消化，用移液器吹打后，离心收集并悬浮，按1：3的比例接种于24孔板，放入CO₂培养箱中培养。

b.卵母细胞的成熟培养

牛卵巢采自陕西省西安市三桥定点屠宰场，将卵巢置于含青、链霉素的20～25℃的生理盐水保温瓶中，5h以内运回试验室。卵巢运回后，用灭菌剪刀剪除卵巢表面的结缔组织、脂肪和附着的输卵管，在高压过的无菌生理盐水中清洗三次，用装有12G针头的10mL注射器抽取卵巢表面2～8mm卵泡中的卵母细胞，放入6cm玻璃皿中在实体显微镜下收集卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes，COCs)。收集后在含5～15％血清的PBS中清洗三遍。选择形态正常的A、B级卵母细胞用于体外成熟培养。A级卵母细胞为胞质均匀、卵丘细胞致密、最少有5层卵丘细胞完全包裹的卵母细胞；B级卵母细胞的卵丘细胞为2～4层，基本上包裹卵母细胞。

将采集的COCs在成熟液中洗两遍，然后移入装有3毫升成熟液的3cm平皿中(提前在培养箱平衡一小时)，在38.5℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养24-26h。将培养成熟的卵母细胞用PBS液清洗3次，放入含0.1％透明质酸酶的无Ca²⁺、Mg²⁺PBS中消化1-2min，并用1000ml移液枪反复吹打COCs，以除去卵母细胞外扩散的卵丘细胞。吹打干净后，在PBS中洗3次，然后在实体视显微镜下，以异物针拨动卵母细胞挑选有极体的卵母细胞待用。

c.牛体细胞克隆胚的构建

去核：

去核前卵母细胞先在含7.5μg/ml细胞松弛素B、10μg/ml Hoechst 33342和10％FBS的PBS中孵育15min。在显微操仪下，用内径为20μm的去核管吸取第一极体及其周围的部分卵胞质，紫外光照射吸出的卵胞质团检查去核情况。完全去除第一极体及染色体的卵母细胞被用于核移植。

注核和电融合：

注核时挑选直径为15～20μm的细胞注入去核的卵母细胞透明带下。注核后的重组体采用微电极的方法进行融合。融合前，重构体在电融合液中预平衡3min，电融合在150倍的显微操作仪下进行。用于融合操作的两根“Z”字形微电极顶端直径为15μm，后端连于显微操作仪上，使重组体的供体、受体细胞膜接触面与两电极的连线垂直，融合参数为电压32V、脉冲时长20μs、2次脉冲间隔10ms。融合后1h在显微镜下观察融合情况。

d、牛体细胞克隆胚的激活与培养

在电融合之后1h，挑选成功融合的牛体细胞克隆胚进行以下激活处理(用离子霉素(Ionomycin)联合6-DMAP激活)：首先在含2～5μmol/L离子霉素的mSOF溶液中室温孵育4min～10，然后在含1～2mmol/L 6-DMAP的mSOF溶液中，在38.5℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养4～10h。(优选的激活条件为：5μmol/L离子霉素的mSOF溶液中室温孵育4min，然后在含2mmol/L 6-DMAP的mSOF溶液中培养)

所述的mSOF溶液是以SOF培养液作为基础培养基，并包含有体积分数2％的BME、体积分数1％的MEM、体积分数1％的ITS、1mmol/L的谷氨酰胺、80mg/mL的BSA、100IU/mL的青霉素和0.1mg/mL的链霉素；

牛体细胞克隆胚在进行激活处理后，转移到G1.5培养液中，在38.5℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养4h，再用G1.5培养液清洗多次，继续在G1.5培养液中培养至36h。所述的作为培养基的G1.5培养液上还覆盖有石蜡油(Sigma,M8410)，并预先在CO₂培养箱中平衡至少2h。G1.5培养液液滴大小为120～150μL，每个液滴中放18～20枚牛体细胞克隆胚。

处理组将牛体细胞克隆胚转移到含200ng/mL Dox的G1.5培养液中培养至60h；对照组不加Dox。图5为牛体细胞克隆胚的KDM4B和KDM4C诱导表达效果图，蓝色为DAPI染色的细胞核，红色为胚胎H3K9me3的免疫染色，绿色为胚胎表达携有绿色荧光蛋白EGFP的KDM4B和KDM4C蛋白。结果显示200ng/mL Dox在36h～60h时段内足够诱导体细胞克隆胚表达KDM4B和KDM4C，且相应的去H3K9me3功效未受影响，说明KDM4B和KDM4C的诱导表达效果正常。合成图为三者数据的重叠效果。

然后将牛体细胞克隆胚转移到G2.5培养液中继续在38.5℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养至第7d。第7d记录囊胚发育情况，如图6所示的牛体细胞克隆囊胚的显微视图，为体外培养后7d的显示结果。

与对照组相比，利用Dox诱导牛体细胞克隆胚在合子激活前期表达牛KDM4B和KDM4C蛋白，可以显著提高牛体细胞克隆囊胚的发育率和质量，可高效体外生产牛体细胞克隆胚胎。具体表现为：

1)牛体细胞克隆胚中KDM4B和KDM4C的诱导表达效果和H3K9me3的修饰水平

分别利用Dox处理牛体细胞克隆胚，诱导表达携有EGFP标签的KDM4B和KDM4C，72h后收集处理组与对照组的8-细胞期胚胎，免疫荧光染色检测胚胎H3K9me3的修饰水平，如图5，蓝色为DAPI染色的细胞核，红色为胚胎H3K9me3的免疫染色，绿色为胚胎表达携有绿色荧光蛋白EGFP的KDM4B和KDM4C蛋白，合成图为三者数据的重叠效果。结果显示，200ng/mL Dox在36h～60h时段内足够诱导体细胞克隆胚表达KDM4B和KDM4C，且相应的去H3K9me3功效未受影响，说明KDM4B和KDM4C的诱导表达效果正常。由表1所示，显示出KDM4B和KDM4C在牛体细胞克隆胚的H3K9me3表观修饰的去除效率分别为75.68±3.73％Vs 31.53±1.22％(P<0.05)和77.93±2.75％Vs 30.15±1.67％(P<0.05)。

表1.Dox诱导表达KDM4B/C对牛体细胞克隆胚胎H3K9me3表观修饰去除的影响

每个处理组与对照组的实验都重复三次。H3K9me3表观修饰的去除效率(mean±SEM％)，克隆胚胎数为三次重复实验的8-细胞期胚胎总数。在同一栏内数据，上标不同表示差异显著(P<0.05)。

2)牛体细胞克隆囊胚的发育率

如表2和图6所示，Dox诱导表达KDM4B和KDM4C对牛体细胞克隆胚胎发育的影响，可以看出200ng/mL Dox在36h～60h时段内处理牛体细胞克隆胚胎，可显著提高囊胚的发育率，分别为25.95±1.48％Vs 39.93±2.46％(P<0.05)和24.63±0.68％Vs 41.26±2.90％(P<0.05)。

表2.Dox诱导表达KDM4B和KDM4C对牛体细胞克隆胚胎发育的影响

每个处理组与对照组的实验都重复三次。括号内的数为发育率(mean±SEM％)，克隆胚胎数为三次重复实验的胚胎总数。2-细胞期胚胎、8-细胞期胚胎、桑椹胚和囊胚的发育率分别在重组胚培养36h、96h、144h和192h检测(0h代表胚胎激活后转入G1.5的时候)。在同一栏内数据，上标不同表示差异显著(P<0.05)。

3)牛体细胞克隆囊胚的细胞数的试验结果

由表3可以看出，经Dox诱导处理的牛体细胞克隆胚胎可以显著提高囊胚的细胞总数、内细胞团细胞数和ICM:TE的比值。此处理方法得到的囊胚的细胞总数显著高于对照组(KDM4B:110.80±5.13Vs 83.00±3.58，KDM4C:112.40±5.54Vs 88.20±4.47，P<0.05)；此处理方法得到的囊胚的内细胞团细胞数显著高于对照组(KDM4B:36.00±2.81Vs 20.80±2.27，KDM4C:34.80±4.14Vs 20.40±1.36，P<0.05)；此处理方法得到的囊胚的内细胞团细胞数和滋养层细胞数的比值显著高于对照组(KDM4B:48.18±3.59％Vs33.55±3.54％，KDM4C:44.87±4.92％Vs 30.13±1.52％，P<0.05)。

表3牛体细胞克隆囊胚的细胞数分析

每个处理组与对照组的样品均为重复三次的实验结果汇总(mean±SEM)。在同一栏内数据上标不同表示差异显著(P<0.05)。

4)牛体细胞克隆囊胚的克隆出生率

如表4所述的基于Dox诱导表达KDM4B和KDM4C降低胚胎组蛋白甲基化H3K9me3水平可显著提高克隆出生率。此处理方法得到囊胚的体内发育能力显著高于对照组(KDM4B:30.77±1.92％Vs 5.26±0.51％，KDM4C:29.24±1.69％Vs 4.35±0.44％，P<0.05)。

表4各组牛克隆胚胎的体内发育能力

第7d囊胚移植同期发情的受体牛，每头受体牛移植2枚胚胎。每个处理组与对照组的样品均为重复五次的实验结果汇总(mean±SEM％)。在同一栏内数据，上标不同表示差异显著(P<0.05)。

Claims (8)

1.一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体，其特征在于，包括阻遏物表达载体和含有阻遏操纵子的表达载体，在转染时将两者共转染到供体细胞中；

所述的含有阻遏操纵子的表达载体中插入有牛KDM4B或牛KDM4C基因；

牛KDM4B的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；牛KDM4C基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；

所述的阻遏物表达载体为能够表达四环素阻遏蛋白的TetR的载体；

所述的含有阻遏操纵子的表达载体为含有四环素操纵基因TetO的载体，其中插入携有荧光标记的牛KDM4B或KDM4C基因的读码框；

在牛KDM4B或KDM4C基因末端添加Kozak序列、EGFP标签和酶切位点。

2.如权利要求1所述的基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体，其特征在于，所述的阻遏物表达载体为pCMV-Tet3G，其能够表达四环素阻遏蛋白TetR；

所述的含有阻遏操纵子的表达载体为pTRE3G-EGFP-KDM4B/C，其含有四环素操纵基因TetO，并在其多克隆位点中克隆2个拷贝的KDM4B或KDM4C，2个拷贝均连有Kozak序列，其中的1个拷贝还与EGFP标签相连接。

3.一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的细胞，其特征在于，以牛胎儿成纤维细胞为宿主细胞，将阻遏物表达载体和含有阻遏操纵子的表达载体共转染到宿主细胞；通过与阻遏物相对应的诱导表达药物对转染的细胞诱导表达，筛选表达载体阳性表达的细胞作为核供体细胞；

所述的阻遏物表达载体为能够表达四环素阻遏蛋白TetR的载体；所述的含有阻遏操纵子的表达载体为含有四环素操纵基因TetO的载体，其中插入携有荧光标记的牛KDM4B或KDM4C基因的读码框。

4.如权利要求3所述的基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的细胞，其特征在于，所述的转染为电击转染；

将阻遏物表达载体pCMV-Tet3G和含有阻遏操纵子的表达载体和pTRE3G-EGFP-KDM4B/C按4:1的质量比电击共转染；

所述的pTRE3G-EGFP-KDM4B/C是在pTRE3G-BI载体多克隆位点中克隆2个拷贝的KDM4B或KDM4C，2个拷贝均连有Kozak序列，其中的1个拷贝还与EGFP标签相连接；

所述的诱导表达药物为Dox，其浓度为100～200ng/mL；

所述的表达载体阳性表达的细胞激发后发出绿色荧光。

5.一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的融合方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)分别构建携有荧光标签的牛KDM4B基因或KDM4C基因的真核诱导表达载体，并将所构建的载体与可诱导表达的载体通过电击共转化胎牛原代成纤维细胞，筛选出细胞克隆，加入诱导表达药物对牛KDM4B基因或KDM4C基因进行诱导表达，挑取可被荧光激发的阳性细胞克隆作为体细胞核移植的牛供体细胞；

2)将所制备的牛供体细胞注入到去核后的卵母细胞并进行电融合，在电融合后1h，挑选电融合的融合细胞进行以下激活处理：2～5μmol/L离子霉素的mSOF溶液中室温孵育4～10min，然后转移到1～2mmol/L 6-DMAP的mSOF溶液中，在38.5℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养4～10h；

所述的mSOF溶液是以SOF培养液作为基础培养基，并包含有体积分数2％的BME、体积分数1％的MEM、体积分数1％的ITS、1mmol/L的谷氨酰胺、80mg/mL的BSA、100IU/mL的青霉素和0.1mg/mL的链霉素；

3)在进行激活处理后转移到G1.5培养液中培养，并在细胞融合后第36h～60h内添加诱导表达药物，以诱导牛KDM4B基因或KDM4C基因表达；最后转移到G2.5培养液中继续在38.5℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养至第7d。

6.如权利要求5所述的基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的融合方法，其特征在于，所述的牛KDM4B基因或KDM4C基因的真核诱导表达载体为pTRE3G-EGFP-KDM4B/C，其含有四环素操纵基因TetO，并在其多克隆位点中克隆2个拷贝的KDM4B或KDM4C，2个拷贝均连有Kozak序列，其中的1个拷贝还与EGFP标签相连接；

所述的可诱导表达的载体为pCMV-Tet3G，其能够表达四环素阻遏蛋白TetR；

在共转化胎牛原代成纤维细胞时，载体pTRE3G-EGFP-KDM4B/C与pCMV-Tet3G的质量比为4:1；

所述的诱导表达药物为Dox，其浓度为100～200ng/mL。

7.如权利要求5或6所述的基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的融合方法，其特征在于，所述的激活后的诱导表达为：在进行激活处理后转移到G1.5培养液中，在38.5℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养至融合后4h，再用G1.5培养液清洗多次，继续在G1.5培养液中培养至融合后36h；再转移到含200ng/mL诱导表达药物的G1.5培养液中培养至融合后60h，诱导牛KDM4B基因或KDM4C基因表达；最后转移到G2.5培养液中继续在38.5℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养至第7d；

所述的G1.5培养液上还覆盖有石蜡油，并预先在CO₂培养箱中平衡至少2h；G1.5培养液中，液滴大小为120～150μL，每个液滴中放18～20枚牛体细胞克隆胚。

8.如权利要求5或6所述的基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的融合方法，其特征在于，所述的去核的卵母细胞的制备为：在去核前，卵母细胞先在含有7.5μg/ml细胞松弛素B、10μg/ml Hoechst33342和体积浓度10％FBS的PBS溶液中孵育15min；然后在显微操仪下，用内径为20μm的去核管吸取第一极体及其周围的卵胞质，紫外光照射吸出的卵胞质团检查去核情况；完全去除第一极体及染色体的卵母细胞应用于核移植；

所述的电融合的操作为：

挑选直径为15～20μm的待移植的牛供体细胞，注入到去核的卵母细胞透明带下；在进行电融合前，重构体在电融合液中预平衡3min；将重构体的供体、作为受体的去核的卵母细胞膜接触面与两电极的连线垂直，融合参数为电压32V、脉冲时为20μs、2次脉冲间隔10ms。