JP2002542779A - 核導入用の終期除核卵母細胞 - Google Patents
核導入用の終期除核卵母細胞Info
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Abstract
(57)【要約】
この発明は、哺乳動物のクローニングまたは繁殖を目的とした、胚細胞、生殖細胞、および体細胞由来の核を導入するための除核宿主卵母細胞を獲得するための改良方法、ならびに非ヒト胚の再構築法に関するものである。
Description
【発明の詳細な説明】発明の背景 (a) 発明の分野 この発明は、哺乳動物のクローニングまたは繁殖を目的として、胚細胞、生殖
細胞および体細胞由来の核を導入するための除核宿主卵母細胞を得るための改良
方法と、非ヒト胚の再構築方法に関するものである。 (b) 先行技術の説明 胚を増殖させるために除核卵母細胞への初期胚由来の割球核の導入による核導
入技術が広く使用されている。この技術により、最高の遺伝的価値のある親から
産生される胚の収量が増加し、動物集団内の年間遺伝獲得量を増加させることが
可能である。核導入には、胚由来の細胞株（Campbellら、1996、Nature、380、64〜6
6）、胚および成体組織（Wilmut et al., 1997, Nature, 385, 810〜813）由来
の核も用いられている。無制限の供給源由来の核の使用によって、細胞株由来の
核導入による多数の遺伝的に同定された子孫の産生だけでなく、生きた子孫の産
生前のインビトロでの細胞の遺伝的特徴の修飾によるトランスジェニック哺乳動
物の産生が可能である。さらに、核導入用の成体動物由来の細胞を直接使用する
か、または事前にインビトロ継代して使用することにより、公知の表現型を有す
る動物の増殖（クローニング）が可能である。
細胞および体細胞由来の核を導入するための除核宿主卵母細胞を得るための改良
方法と、非ヒト胚の再構築方法に関するものである。 (b) 先行技術の説明 胚を増殖させるために除核卵母細胞への初期胚由来の割球核の導入による核導
入技術が広く使用されている。この技術により、最高の遺伝的価値のある親から
産生される胚の収量が増加し、動物集団内の年間遺伝獲得量を増加させることが
可能である。核導入には、胚由来の細胞株（Campbellら、1996、Nature、380、64〜6
6）、胚および成体組織（Wilmut et al., 1997, Nature, 385, 810〜813）由来
の核も用いられている。無制限の供給源由来の核の使用によって、細胞株由来の
核導入による多数の遺伝的に同定された子孫の産生だけでなく、生きた子孫の産
生前のインビトロでの細胞の遺伝的特徴の修飾によるトランスジェニック哺乳動
物の産生が可能である。さらに、核導入用の成体動物由来の細胞を直接使用する
か、または事前にインビトロ継代して使用することにより、公知の表現型を有す
る動物の増殖（クローニング）が可能である。
【０００１】 基本的には、核導入技術には、選択した遺伝物質を提供するドナー核と、胚発
達を支持するための核の再プログラミングの役割を果たす細胞質を提供する宿主
卵母細胞が必要である。核および細胞質材料を入手した場合、核導入による卵母
細胞の再構築には3つの主な工程が必要である。第1に、全ての核遺伝物質の除去
には、宿主卵母細胞を除核する必要がある。この工程は、一般に中期プレートま
たは前核のいずれか由来の染色体の顕微手術によって行われる。第2に、ドナー
核を卵母細胞に移入する必要がある（核導入）。この工程は、通常、核ドナー細
胞と宿主卵母細胞の膜融合によって行われる。しかし、核導入はまた卵母細胞原
形質膜の穿孔および宿主細胞質への核の直接的マイクロインジェクションによっ
て行うことができる。最後に、非活性化宿主卵母細胞はその減数分裂の停止に由
来する再開（卵母細胞の活性化）を必要とする。卵母細胞の物理的刺激（温度変
化または電気ショックなど）または卵母細胞の化学薬品（エタノールまたは外因
性カルシウム）によってこの工程を行うことができる。各工程を行う順序は、条
件によって変化し、これは、さらに発達させるための再構築卵母細胞の能力に対
して重要な効果を有し得る。
達を支持するための核の再プログラミングの役割を果たす細胞質を提供する宿主
卵母細胞が必要である。核および細胞質材料を入手した場合、核導入による卵母
細胞の再構築には3つの主な工程が必要である。第1に、全ての核遺伝物質の除去
には、宿主卵母細胞を除核する必要がある。この工程は、一般に中期プレートま
たは前核のいずれか由来の染色体の顕微手術によって行われる。第2に、ドナー
核を卵母細胞に移入する必要がある（核導入）。この工程は、通常、核ドナー細
胞と宿主卵母細胞の膜融合によって行われる。しかし、核導入はまた卵母細胞原
形質膜の穿孔および宿主細胞質への核の直接的マイクロインジェクションによっ
て行うことができる。最後に、非活性化宿主卵母細胞はその減数分裂の停止に由
来する再開（卵母細胞の活性化）を必要とする。卵母細胞の物理的刺激（温度変
化または電気ショックなど）または卵母細胞の化学薬品（エタノールまたは外因
性カルシウム）によってこの工程を行うことができる。各工程を行う順序は、条
件によって変化し、これは、さらに発達させるための再構築卵母細胞の能力に対
して重要な効果を有し得る。
【０００２】 マウスでは、卵母細胞の除核は、受精後に顕微手術による前核の視覚化と除去
によって行われた。この除核技術は、高密度の細胞質によって前核の視覚化が不
十分なために他の哺乳動物ではあまり効果が無い。さらに、核ドナーとして分割
期の割球を用いる場合、前核期除核卵母細胞の使用は常に発達速度が遅くなる。
核導入後の発達の改良を、融合時では達成できなかった宿主卵母細胞を使用して
、最初ヒツジ（Willadsen, S., 1986, Nature, 320, 63〜65）で、その後他の哺
乳動物で行った。しかし、中期クロマチンは、ほとんどの哺乳動物で顕微鏡で容
易に目視できないという問題が残された。Willadsen (Willadsen, S., 1986, Na
ture, 320, 63〜65)は、ヒツジ卵母細胞を第一極体を含むか含まない半分に盲目
的に分割する除核法を提案した。除核中の大量の細胞質の損失を回避するために
、後にこの手順を、MIIプレートの細胞質のほんの一部が除去されているかどう
かをチェックするためのDNA生体染色（Bisbenzimid; Hoechst）および紫外線（U
V）照射によって改良した。最も一般的な卵母細胞の除核法は、二次卵母細胞のB
isbenzimidへの暴露、第一極体周囲の細胞質フラグメントの除去、および除核が
正確に行われているかどうかを評価するための卵母細胞のUVへの暴露である。概
して、この手順により60%から80%の間の卵母細胞が正確に除核される。この手順
の別の制限の可能性は、卵母細胞が細胞質に対して有害な結果を招くことが示さ
れているUV照射およびHoechst 33342の両方に暴露されることである（Smith, L.
, 1993, J.Reprod.Fert,.99, 39〜44）。
によって行われた。この除核技術は、高密度の細胞質によって前核の視覚化が不
十分なために他の哺乳動物ではあまり効果が無い。さらに、核ドナーとして分割
期の割球を用いる場合、前核期除核卵母細胞の使用は常に発達速度が遅くなる。
核導入後の発達の改良を、融合時では達成できなかった宿主卵母細胞を使用して
、最初ヒツジ（Willadsen, S., 1986, Nature, 320, 63〜65）で、その後他の哺
乳動物で行った。しかし、中期クロマチンは、ほとんどの哺乳動物で顕微鏡で容
易に目視できないという問題が残された。Willadsen (Willadsen, S., 1986, Na
ture, 320, 63〜65)は、ヒツジ卵母細胞を第一極体を含むか含まない半分に盲目
的に分割する除核法を提案した。除核中の大量の細胞質の損失を回避するために
、後にこの手順を、MIIプレートの細胞質のほんの一部が除去されているかどう
かをチェックするためのDNA生体染色（Bisbenzimid; Hoechst）および紫外線（U
V）照射によって改良した。最も一般的な卵母細胞の除核法は、二次卵母細胞のB
isbenzimidへの暴露、第一極体周囲の細胞質フラグメントの除去、および除核が
正確に行われているかどうかを評価するための卵母細胞のUVへの暴露である。概
して、この手順により60%から80%の間の卵母細胞が正確に除核される。この手順
の別の制限の可能性は、卵母細胞が細胞質に対して有害な結果を招くことが示さ
れているUV照射およびHoechst 33342の両方に暴露されることである（Smith, L.
, 1993, J.Reprod.Fert,.99, 39〜44）。
【０００３】 上記のように、前核除核宿主接合子と比較した場合、宿主卵母細胞は核導入後
の良好な発達を支持することができる。融合前に成熟または活性化させたMII期
の除核卵母細胞はより良好な発達を支持することが既に示されている。幼若な未
成熟卵母細胞の使用上の問題は、核ドナー細胞の細胞周期と宿主細胞質との間の
不適合性に起因する。中期停止二次（MII）卵母細胞は、核膜を用いずにクロマ
チンの濃度の維持を担う細胞活性である高レベルの卵成熟促進因子(MPF)を有す
る。脱凝縮クロマチンを含む割球中期の核がMII卵母細胞に移入された場合、MPF
により核膜が迅速に破壊し、早期染色体濃縮（PCC）が起こる。しかし、PCCは、
細胞周期のDNA合成期（S期）中に誘導された場合のみに有害であると考えられて
いる。これは、割球由来のドナー核を使用した場合、これらは細胞分裂のほとん
どの期間S期となるので特に問題である。これに対して、核ドナー細胞への融合
前に活性化または成熟した除核卵母細胞はMPFレベルが低いので、PCCを引き起こ
さない。
の良好な発達を支持することができる。融合前に成熟または活性化させたMII期
の除核卵母細胞はより良好な発達を支持することが既に示されている。幼若な未
成熟卵母細胞の使用上の問題は、核ドナー細胞の細胞周期と宿主細胞質との間の
不適合性に起因する。中期停止二次（MII）卵母細胞は、核膜を用いずにクロマ
チンの濃度の維持を担う細胞活性である高レベルの卵成熟促進因子(MPF)を有す
る。脱凝縮クロマチンを含む割球中期の核がMII卵母細胞に移入された場合、MPF
により核膜が迅速に破壊し、早期染色体濃縮（PCC）が起こる。しかし、PCCは、
細胞周期のDNA合成期（S期）中に誘導された場合のみに有害であると考えられて
いる。これは、割球由来のドナー核を使用した場合、これらは細胞分裂のほとん
どの期間S期となるので特に問題である。これに対して、核ドナー細胞への融合
前に活性化または成熟した除核卵母細胞はMPFレベルが低いので、PCCを引き起こ
さない。
【０００４】 割球は例外として、ほとんどの他の細胞型はS期の前（G1期）および後（G2期
）の両方でより長いギャップを有するので、MII卵母細胞に融合させた場合、S期
PCCの悪影響にあまり感受性を示さない。高レベルのMPFにより核膜が破壊される
ので、MII期の宿主卵母細胞は、さらに分化が改良された細胞由来の核のクロマ
チンの再プログラミングに必要なドナー核と推定卵母細胞細胞質「因子」との間
の相互作用を促進すると考えられている。文献中のいくつかの例では、再構築卵
母細胞の活性化前の非活性化MII卵母細胞中のさらに分化したドナー核の継代に
おける利点を報告している。ウシでは、胚細胞株由来の核は、活性化の4時間前
に除核卵母細胞に融合した場合、有意な胚盤胞発達量の増加および妊娠30日齢の
増加が支持された。マウスでは、活性化1〜6時間前のMII細胞質へのドナー核の
暴露によって、卵丘細胞核を用いて再構築した有意に多数の胚が胚盤胞期に発達
した（Wells et al., 1999, Biol.Reprod., 60, 996〜1005）。さらに、同時活
性化および融合を使用した場合、胚発達も生きた子孫も得られなかった。さらに
、分化細胞株を使用した他の報告では、ドナー核の移入後または同時に活性化し
た宿主卵母細胞が使用されている（Cibelli et al., 1998, Nature Biotechnol.
, 16, 642〜646, Wilmut et al., 1997, Nature, 385, 810〜813）。したがって
、核導入によるクローニング分野での有力な理論は、胚割球以外の細胞由来のド
ナー核を使用する場合、非活性化卵母細胞の細胞質の再プログラミング期間が必
要であることである。
）の両方でより長いギャップを有するので、MII卵母細胞に融合させた場合、S期
PCCの悪影響にあまり感受性を示さない。高レベルのMPFにより核膜が破壊される
ので、MII期の宿主卵母細胞は、さらに分化が改良された細胞由来の核のクロマ
チンの再プログラミングに必要なドナー核と推定卵母細胞細胞質「因子」との間
の相互作用を促進すると考えられている。文献中のいくつかの例では、再構築卵
母細胞の活性化前の非活性化MII卵母細胞中のさらに分化したドナー核の継代に
おける利点を報告している。ウシでは、胚細胞株由来の核は、活性化の4時間前
に除核卵母細胞に融合した場合、有意な胚盤胞発達量の増加および妊娠30日齢の
増加が支持された。マウスでは、活性化1〜6時間前のMII細胞質へのドナー核の
暴露によって、卵丘細胞核を用いて再構築した有意に多数の胚が胚盤胞期に発達
した（Wells et al., 1999, Biol.Reprod., 60, 996〜1005）。さらに、同時活
性化および融合を使用した場合、胚発達も生きた子孫も得られなかった。さらに
、分化細胞株を使用した他の報告では、ドナー核の移入後または同時に活性化し
た宿主卵母細胞が使用されている（Cibelli et al., 1998, Nature Biotechnol.
, 16, 642〜646, Wilmut et al., 1997, Nature, 385, 810〜813）。したがって
、核導入によるクローニング分野での有力な理論は、胚割球以外の細胞由来のド
ナー核を使用する場合、非活性化卵母細胞の細胞質の再プログラミング期間が必
要であることである。
【０００５】 哺乳動物のクローニングまたは繁殖を目的とした場合の、胚細胞、生殖細胞、
および体細胞由来の核導入用の除核宿主卵母細胞を獲得するための改良方法の提
供が強く望まれている。
および体細胞由来の核導入用の除核宿主卵母細胞を獲得するための改良方法の提
供が強く望まれている。
【０００６】 動物胚を再構築するための改良方法の提供が強く望まれている。発明の要旨 以下に記載する発明は、胚細胞株および体細胞株からの細胞由来核のレシピエ
ントとしての活性化卵母細胞の使用を教示するという点で、現存の知識とは異な
るものである。
ントとしての活性化卵母細胞の使用を教示するという点で、現存の知識とは異な
るものである。
【０００７】 この発明の1つの目的は、哺乳動物のクローニングまたは繁殖を目的として、
胚細胞、生殖細胞、および体細胞由来の核導入用の除核宿主卵母細胞を獲得する
ための改良方法を提供することである。
胚細胞、生殖細胞、および体細胞由来の核導入用の除核宿主卵母細胞を獲得する
ための改良方法を提供することである。
【０００８】 この発明の別の目的は、非ヒト胚を構築するための改良方法を提供することに
ある。
ある。
【０００９】 この発明によれば、胚細胞、生殖細胞、または体細胞由来の核を導入するため
の除核宿主卵母細胞の調製方法であって、以下の工程： a) 人為的手段によって前記宿主卵母細胞を活性化させる工程； b) 前記活性化卵母細胞が第二極体を排出しつつある時に、または前記活性化卵
母細胞が第二極体を放出した間近の時に(Tel-II)、前記活性化宿主卵母細胞を除
核する工程； c) 胚細胞、生殖細胞または体細胞由来の核を工程b)の除核宿主卵母細胞に導入
する工程、を含む方法であって、胚細胞は核導入に先立って培養されている方法
が提供される。
の除核宿主卵母細胞の調製方法であって、以下の工程： a) 人為的手段によって前記宿主卵母細胞を活性化させる工程； b) 前記活性化卵母細胞が第二極体を排出しつつある時に、または前記活性化卵
母細胞が第二極体を放出した間近の時に(Tel-II)、前記活性化宿主卵母細胞を除
核する工程； c) 胚細胞、生殖細胞または体細胞由来の核を工程b)の除核宿主卵母細胞に導入
する工程、を含む方法であって、胚細胞は核導入に先立って培養されている方法
が提供される。
【００１０】 生殖細胞、または体細胞は核導入に先だって培養されている。
【００１１】 工程a)の卵母細胞は第一極体を有し、人為的手段はエタノールまたはイオノマ
イシンなどの化学的手段である。
イシンなどの化学的手段である。
【００１２】 第二極体が突出するのに十分な期間卵母細胞を培養した後に工程b)を行うこと
ができる。
ができる。
【００１３】 細胞骨格インヒビターを含む培地を用いて工程b)を行うことができる。
【００１４】 第2極体周囲の細胞質の約1／10と共に第2極体を顕微手術で除去することによ
って工程b)を行うことができる。
って工程b)を行うことができる。
【００１５】 好ましい卵母細胞は、二次(M-II)卵母細胞である。
【００１６】 この発明によれば、非ヒト胚の再構築方法であって、以下の工程： a) 人為的手段によって卵母細胞を活性化させる工程； b) 前記活性化卵母細胞が第二極体を排出しつつある時に、または前記活性化卵
母細胞が第二極体を放出した間近の時に(Tel-II)、前記活性化卵母細胞を除核す
る工程； c) 二倍体核を前記除核卵母細胞に導入して、二倍体染色体内容物を含む再構築
卵母細胞を得る工程；および d) 非ヒト胚へと発達することができるように前記再構築卵母細胞をインビトロ
で培養し、そして／または前記再構築卵母細胞を適切な代理母の生殖管に導入す
る工程、を含む方法が提供される。
母細胞が第二極体を放出した間近の時に(Tel-II)、前記活性化卵母細胞を除核す
る工程； c) 二倍体核を前記除核卵母細胞に導入して、二倍体染色体内容物を含む再構築
卵母細胞を得る工程；および d) 非ヒト胚へと発達することができるように前記再構築卵母細胞をインビトロ
で培養し、そして／または前記再構築卵母細胞を適切な代理母の生殖管に導入す
る工程、を含む方法が提供される。
【００１７】 この発明によれば、トランスジェニック非ヒト胚の製造方法であって、以下の
工程： a) 胚細胞、生殖細胞、および体細胞からなる群から選択される培養細胞に所望
のDNAコンストラクトをトランスフェクトする工程； b) 人為的手段によって卵母細胞を活性化させる工程； c) 前記活性化卵母細胞が第二極体を排出しつつある時に、または前記活性化卵
母細胞が第二極体を放出した間近の時に(Tel-II)、前記活性化卵母細胞を除核す
る工程； d) 工程a)のトランスフェクトした細胞から抽出した二倍体核を、前記除核卵母
細胞に導入して、二倍体染色体内容物を含む再構築卵母細胞を得る工程；および e) 非ヒト胚へと発達することができるように前記再構築卵母細胞をインビトロ
で培養し、そして／または前記再構築卵母細胞を適切な代理母の生殖管に導入す
る工程、を含む方法が提供される。
工程： a) 胚細胞、生殖細胞、および体細胞からなる群から選択される培養細胞に所望
のDNAコンストラクトをトランスフェクトする工程； b) 人為的手段によって卵母細胞を活性化させる工程； c) 前記活性化卵母細胞が第二極体を排出しつつある時に、または前記活性化卵
母細胞が第二極体を放出した間近の時に(Tel-II)、前記活性化卵母細胞を除核す
る工程； d) 工程a)のトランスフェクトした細胞から抽出した二倍体核を、前記除核卵母
細胞に導入して、二倍体染色体内容物を含む再構築卵母細胞を得る工程；および e) 非ヒト胚へと発達することができるように前記再構築卵母細胞をインビトロ
で培養し、そして／または前記再構築卵母細胞を適切な代理母の生殖管に導入す
る工程、を含む方法が提供される。
【００１８】 非ヒト胚は、非ヒト動物へと発達され得る。発明の詳しい説明 この発明は、胚細胞、生殖細胞、および体細胞株由来の核移植による胚の作製
法に関する。核導入法は、常に宿主卵母細胞の除核から開始されている。除核手
順は、以下のうちの1つに従う：(a)活性化後の融合、(b)活性化と融合の同時実
施、または(c)融合後の活性化。すなわち、卵母細胞が(a)除核され、活性化され
、次いで融合される手続はほとんどが胚割球に適用され、さらに分化したドナー
核に適用されるほとんどの技術は卵母細胞を除核する手順を使用するか、(b)同
時に融合および活性化を行うか、(c)融合後に活性化する。核導入法の異なるア
プローチは既に記載されているが（米国特許第4,994,384号、米国特許第5,057,4
20号、米国特許第5,843,754号、ならびに国際特許出願番号PCT/GB96/02098、PCT/
US/00002、PCT/US98/12800、PCT/US98/12806、およびPCT/US97/12919）、この発明
は、核導入法における一連の新規な工程を提供する（図１）。
法に関する。核導入法は、常に宿主卵母細胞の除核から開始されている。除核手
順は、以下のうちの1つに従う：(a)活性化後の融合、(b)活性化と融合の同時実
施、または(c)融合後の活性化。すなわち、卵母細胞が(a)除核され、活性化され
、次いで融合される手続はほとんどが胚割球に適用され、さらに分化したドナー
核に適用されるほとんどの技術は卵母細胞を除核する手順を使用するか、(b)同
時に融合および活性化を行うか、(c)融合後に活性化する。核導入法の異なるア
プローチは既に記載されているが（米国特許第4,994,384号、米国特許第5,057,4
20号、米国特許第5,843,754号、ならびに国際特許出願番号PCT/GB96/02098、PCT/
US/00002、PCT/US98/12800、PCT/US98/12806、およびPCT/US97/12919）、この発明
は、核導入法における一連の新規な工程を提供する（図１）。
【００１９】 図１に例示されるように、工程1は、人為的手段による二次(M-II)卵母細胞の
活性化を含む。卵母細胞が第二極体を排出しつつある時に、または第二極体を放
出した間近の時に(Tel-II)、工程2を行う。工程3は、二倍体染色体内容物を有す
る卵母細胞の再構築のために、任意の供給源由来の核を導入することに関する。
工程1（卵母細胞の活性化） 卵母細胞をインビボまたはインビトロで獲得し、成熟培地中で培養する。成熟
後、卵丘細胞から卵母細胞を裸出させ、第一極体を含むものをエタノールまたは
イオノマイシン（ionomycin）を用いた化学的手段によって単為的に活性化させ
る。活性化後、第二極体が突出するように卵母細胞を数時間培養する。 工程2（卵母細胞の除核） 活性化後、卵母細胞を、顕微手術を容易にするための細胞骨格インヒビターを
含む培地に置くようにする。第二極体が突出するか部分的に突出した卵母細胞の
みを使用する。第二極体と共に第二極体周囲の細胞質の約1／10を顕微手術で除
去する。 工程3（核導入） 除核後、二倍体核を含む単一細胞を細胞融合またはマイクロインジェクション
のいずれかによって除核卵母細胞に移入する（核導入）。次いで、さらに発達す
ることができるように再構築卵母細胞をインビトロで培養し、そして／または再
構築卵母細胞を適切な代理母の生殖管に導入する。
活性化を含む。卵母細胞が第二極体を排出しつつある時に、または第二極体を放
出した間近の時に(Tel-II)、工程2を行う。工程3は、二倍体染色体内容物を有す
る卵母細胞の再構築のために、任意の供給源由来の核を導入することに関する。
工程1（卵母細胞の活性化） 卵母細胞をインビボまたはインビトロで獲得し、成熟培地中で培養する。成熟
後、卵丘細胞から卵母細胞を裸出させ、第一極体を含むものをエタノールまたは
イオノマイシン（ionomycin）を用いた化学的手段によって単為的に活性化させ
る。活性化後、第二極体が突出するように卵母細胞を数時間培養する。 工程2（卵母細胞の除核） 活性化後、卵母細胞を、顕微手術を容易にするための細胞骨格インヒビターを
含む培地に置くようにする。第二極体が突出するか部分的に突出した卵母細胞の
みを使用する。第二極体と共に第二極体周囲の細胞質の約1／10を顕微手術で除
去する。 工程3（核導入） 除核後、二倍体核を含む単一細胞を細胞融合またはマイクロインジェクション
のいずれかによって除核卵母細胞に移入する（核導入）。次いで、さらに発達す
ることができるように再構築卵母細胞をインビトロで培養し、そして／または再
構築卵母細胞を適切な代理母の生殖管に導入する。
【００２０】 この発明は、以下の実施例の参照によってより容易に理解されるが、これらは
この発明の範囲を制限するよりもむしろ本発明を例示するために記載する。実施例１ 終期除核 直径2〜8mmの濾胞を、屠殺ウシ卵巣から吸引した。均一な細胞質および数層の
卵丘細胞を有する卵母細胞を選択し、濾胞吸引から1時間以内に成熟培地に置い
た。成熟から28時間後、卵丘細胞から卵母細胞を裸出させ、第一極体を有するも
のを実験に使用した。卵丘細胞を7％エタノールに5分間暴露し、異なる期間成熟
培地に置いた。顕微手術の1時間前、卵母細胞をサイトカラシン（cytochalasin
）B中に置き、顕微操作用に位置合わせした。第二極体を排出しつつあるか、ま
たは既に排出している卵母細胞の10％の細胞質体積を第二極体と共に除去した。
顕微手術後、卵母細胞を10％ホルマリン中で固定し、5μｇのHoechst 33342で染
色して、UV落射蛍光下で観察した。いかなるクロマチンも含まない卵母細胞を、
首尾よく除核したとみなした。試験時に顕微操作した場合、ほとんどの卵母細胞
は首尾よく除核された（表1）。この除核技術の効率は高く、DNA染色およびUV光
を用いたチェックは必要ない。インビトロ成熟開始から24時間後の周期卵母細胞
中の細胞質周囲（59％）の30％を吸引するための第一極体の位置を盲目的に除去
した場合は、除核率が有意に低い。
この発明の範囲を制限するよりもむしろ本発明を例示するために記載する。実施例１ 終期除核 直径2〜8mmの濾胞を、屠殺ウシ卵巣から吸引した。均一な細胞質および数層の
卵丘細胞を有する卵母細胞を選択し、濾胞吸引から1時間以内に成熟培地に置い
た。成熟から28時間後、卵丘細胞から卵母細胞を裸出させ、第一極体を有するも
のを実験に使用した。卵丘細胞を7％エタノールに5分間暴露し、異なる期間成熟
培地に置いた。顕微手術の1時間前、卵母細胞をサイトカラシン（cytochalasin
）B中に置き、顕微操作用に位置合わせした。第二極体を排出しつつあるか、ま
たは既に排出している卵母細胞の10％の細胞質体積を第二極体と共に除去した。
顕微手術後、卵母細胞を10％ホルマリン中で固定し、5μｇのHoechst 33342で染
色して、UV落射蛍光下で観察した。いかなるクロマチンも含まない卵母細胞を、
首尾よく除核したとみなした。試験時に顕微操作した場合、ほとんどの卵母細胞
は首尾よく除核された（表1）。この除核技術の効率は高く、DNA染色およびUV光
を用いたチェックは必要ない。インビトロ成熟開始から24時間後の周期卵母細胞
中の細胞質周囲（59％）の30％を吸引するための第一極体の位置を盲目的に除去
した場合は、除核率が有意に低い。
【００２１】
【表１】
【００２２】実施例２ 桑実胚期の割球（morula-stage blatomeres）を使用した核導入 ウシ二次卵母細胞をインビトロで成熟させ、上記の技術を用いて除核した（終
期除核）。桑実胚を脱凝集し、各卵割を除核卵母細胞の囲卵空間に挿入した。ド
ナーとレシピエント細胞との間の膜融合を引き起こす電気パルスを用いて、卵割
膜と卵母細胞との間の融合を行った。使用した電気的パラメータは、1.5 kVolt/
cmの60μ秒のダブルパルスであった。融合後、胚を10％ウシ胚血清を補充したMe
nezoのB2培地の存在下で7日間培養した。
期除核）。桑実胚を脱凝集し、各卵割を除核卵母細胞の囲卵空間に挿入した。ド
ナーとレシピエント細胞との間の膜融合を引き起こす電気パルスを用いて、卵割
膜と卵母細胞との間の融合を行った。使用した電気的パラメータは、1.5 kVolt/
cmの60μ秒のダブルパルスであった。融合後、胚を10％ウシ胚血清を補充したMe
nezoのB2培地の存在下で7日間培養した。
【００２３】
【表２】
【００２４】実施例３ 非飢餓（non-starved）ウシES細胞での核導入 完全にインビトロで産生させた第8日目の胚盤胞期の胚から、ウシ胚幹細胞（E
S）様細胞を得た。ICMsを、マイトマイシン不活化マウス線維芽細胞上に施した
。確立したES様株を、細口ピペットを使用したトリプシンへの短時間の暴露によ
って脱凝集した。単離細胞を除核卵母細胞の囲卵空間に置き、ドナー細胞とレシ
ピエント細胞との間の膜融合を引き起こす電気パルスに暴露した。使用した電気
的パラメータは、1.5 kVolt/cmの100μ秒のダブルパルスであった。より良い融
合結果を得るために、囲卵空間に核ドナー細胞を置いてからできるだけ早く電気
刺激を行った。融合後、胚を10％ウシ胚血清を補充したMenezoのB2培地の存在下
で7日間培養した。
S）様細胞を得た。ICMsを、マイトマイシン不活化マウス線維芽細胞上に施した
。確立したES様株を、細口ピペットを使用したトリプシンへの短時間の暴露によ
って脱凝集した。単離細胞を除核卵母細胞の囲卵空間に置き、ドナー細胞とレシ
ピエント細胞との間の膜融合を引き起こす電気パルスに暴露した。使用した電気
的パラメータは、1.5 kVolt/cmの100μ秒のダブルパルスであった。より良い融
合結果を得るために、囲卵空間に核ドナー細胞を置いてからできるだけ早く電気
刺激を行った。融合後、胚を10％ウシ胚血清を補充したMenezoのB2培地の存在下
で7日間培養した。
【００２５】
【表３】
【００２６】実施例４ 血清飢餓ウシES細胞を使用した核導入 ウシ胚幹細胞（ES）様細胞を、顕微操作の5日前に0．5％FCSを含む培地中で培
養した。上記のように、ES様細胞を脱凝集し、除核卵母細胞の囲卵空間に置き、
ドナー細胞とレシピエント細胞との間の膜融合を引き起こす電気パルスに暴露し
た。融合後、胚を10％ウシ胚血清を補充したMenezoのB2培地の存在下で7日間培
養した。
養した。上記のように、ES様細胞を脱凝集し、除核卵母細胞の囲卵空間に置き、
ドナー細胞とレシピエント細胞との間の膜融合を引き起こす電気パルスに暴露し
た。融合後、胚を10％ウシ胚血清を補充したMenezoのB2培地の存在下で7日間培
養した。
【００２７】
【表４】
【００２８】実施例５ 飢餓および非飢餓ウシ胚線維芽細胞を用いた核導入 ウシ胚線維芽細胞を、50日目の胚から回収し、10％FCSを含むD-MEM培地中で継
代した。継代から2日後の成長中の非飢餓線維芽細胞を回収した。血清飢餓細胞
をNTの5日前0．5％血清を含む培地に暴露した。上記のように、NTを行った。
代した。継代から2日後の成長中の非飢餓線維芽細胞を回収した。血清飢餓細胞
をNTの5日前0．5％血清を含む培地に暴露した。上記のように、NTを行った。
【００２９】
【表５】
【００３０】実施例６ GFPコンストラクトでトランスフェクトした飢餓または非飢餓ウシ胚線維芽細胞
を用いた核導入 ウシ胚線維芽細胞を、50日目の胚から回収し、10％FCSを含むD-MEM培地中で継
代した。胚線維芽細胞を、CMV/eGFP遺伝子（プラスミドpGREEN LANTERN-1、Life
Technologies）を含むコンストラクトでトランスフェクトした。このコンストラ
クトはレポーター遺伝子であり、視覚化に基質を必要としない天然の蛍光タンパ
ク質をコードするAequorea victoriaクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質（GFP）を
含む。使用したGFPを、「ヒト化」（すなわち、コドン配列）し、蛍光ピークを
向上させるために第65位にトレオニンを含むように変異する。この蛍光遺伝子の
レポーターとしての使用上の利点は、生きているか固定された細胞に青色の光を
当てると鮮明な緑色の蛍光を発し、検出感度が向上する点である。プラスミドは
、GFP遺伝子のCMV前初期エンハンサー／プロモーター上流、その後ろにSV40のt
イントロンおよびポリアデニル化シグナルを含む。上記のように、NTを行った。
を用いた核導入 ウシ胚線維芽細胞を、50日目の胚から回収し、10％FCSを含むD-MEM培地中で継
代した。胚線維芽細胞を、CMV/eGFP遺伝子（プラスミドpGREEN LANTERN-1、Life
Technologies）を含むコンストラクトでトランスフェクトした。このコンストラ
クトはレポーター遺伝子であり、視覚化に基質を必要としない天然の蛍光タンパ
ク質をコードするAequorea victoriaクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質（GFP）を
含む。使用したGFPを、「ヒト化」（すなわち、コドン配列）し、蛍光ピークを
向上させるために第65位にトレオニンを含むように変異する。この蛍光遺伝子の
レポーターとしての使用上の利点は、生きているか固定された細胞に青色の光を
当てると鮮明な緑色の蛍光を発し、検出感度が向上する点である。プラスミドは
、GFP遺伝子のCMV前初期エンハンサー／プロモーター上流、その後ろにSV40のt
イントロンおよびポリアデニル化シグナルを含む。上記のように、NTを行った。
【００３１】
【表６】
【００３２】
【表７】
【００３３】 この発明を特定の実施形態に関して記載したが、さらなる修正形態が可能であ
り、この出願は、一般に、この発明の原理にしたがったこの発明の任意の変形形
態、使用、または適用を対象とすることを意図し、この発明に関連する技術の範
囲内での公知または慣習的な実施の範囲内で行われ、上記の本質的な特徴に適用
することができ、特許請求の範囲に従うようなこの開示からの逸脱を含むことが
理解されよう。
り、この出願は、一般に、この発明の原理にしたがったこの発明の任意の変形形
態、使用、または適用を対象とすることを意図し、この発明に関連する技術の範
囲内での公知または慣習的な実施の範囲内で行われ、上記の本質的な特徴に適用
することができ、特許請求の範囲に従うようなこの開示からの逸脱を含むことが
理解されよう。
【図１】 核導入用の終期除核技術のプロトコールの概要を示す図である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年５月３０日（２００１．５．３０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA10 AA20 CA02 DA02 GA03 GA12 4B065 AA90X AA90Y AB01 AB04 BA04 BA08 BB40 BD50 CA60
Claims (37)
- 【請求項１】 除核宿主卵母細胞への生殖細胞または体細胞由来の細胞もし
くは核の導入による再構築卵母細胞の調製方法であって、以下の工程： a) 人為的または天然の手段によって前記宿主卵母細胞を活性化させる工程； b) 前記活性化卵母細胞が第二極体を排出しつつある時に、または前記活性化卵
母細胞が第二極体を放出した間近の時に(Tel-II)、前記活性化宿主卵母細胞を除
核する工程；そして c) 生殖細胞または体細胞由来の核を工程b)の除核宿主卵母細胞に導入して再構
築卵母細胞を得る工程、 を含む方法。 - 【請求項２】 前記導入細胞または核が、核ステージG0、G1、S、G2、またはMで
ある請求項１の方法。 - 【請求項３】 前記工程c)の生殖細胞または体細胞を核導入前に培養する請
求項１の方法。 - 【請求項４】 前記工程a)の卵母細胞が二次卵母細胞(M-II)であり、前記人
為的手段が物理的または化学的手段である請求項１の方法。 - 【請求項５】 前記化学的手段がエタノールまたはイオノマイシンである請
求項４の方法。 - 【請求項６】 前記物理的手段が電気的手段、熱手段および照射技術からな
る群から選択される請求項４の方法。 - 【請求項７】 第二極体が少なくとも部分的に突出するのに十分な期間卵母
細胞を培養した後に前記工程b)を行う請求項１の方法。 - 【請求項８】 細胞骨格インヒビターを含む培地中の卵母細胞に対して前記
工程b)を行う請求項１の方法。 - 【請求項９】 少なくとも部分的に突出した第二極体周囲の染色体を含む細
胞質の一部と共に前記第二極体を顕微手術で除去することによって前記工程b)を
行う請求項７の方法。 - 【請求項１０】 非ヒト胚の再構築方法であって、以下の工程： a) 人為的または天然の手段によって卵母細胞を活性化させる工程； b) 前記活性化卵母細胞が第二極体を排出しつつある時に、または前記活性化卵
母細胞が第二極体を放出した間近の時に(Tel-II)、前記活性化卵母細胞を除核す
る工程； c) 二倍体核または細胞を前記除核卵母細胞に導入して、二倍体染色体内容物を
含む再構築卵母細胞を得る工程；および d) 非ヒト胚へと発達することができるように前記再構築卵母細胞をインビトロ
で培養し、そして／または前記再構築卵母細胞を適切な代理母の生殖管に導入す
る工程、 を含む方法。 - 【請求項１１】 前記導入細胞または核が、核ステージG0、G1、S、G2、またはM
である請求項１０の方法。 - 【請求項１２】 前記工程a)の卵母細胞が二次卵母細胞(M-II)であり、前記
人為的手段が物理的または化学的手段である請求項１０の方法。 - 【請求項１３】 前記化学的手段がエタノールまたはイオノマイシンである
請求項１２の方法。 - 【請求項１４】 前記物理的手段が、電気的手段、熱手段、および照射技術
からなる群から選択される請求項１２の方法。 - 【請求項１５】 第二極体が少なくとも部分的に突出するのに十分な期間卵
母細胞を培養した後に前記工程b)を行う請求項１３の方法。 - 【請求項１６】 細胞骨格インヒビターを含む培地中の卵母細胞に対して前
記工程b)を行う請求項１５の方法。 - 【請求項１７】 少なくとも部分的に突出した第二極体周囲に染色体を含む
細胞質の一部と共に前記第二極体を顕微手術で除去することによって前記工程b)
を行う請求項１５の方法。 - 【請求項１８】 前記除核卵母細胞への二倍体核を含む単一細胞の細胞融合
またはマイクロインジェクションによる導入によって前記工程c)を行う請求項１
７の方法。 - 【請求項１９】 前記非ヒト胚が非ヒト動物へと発達する請求項１０の方法
。 - 【請求項２０】 トランスジェニック非ヒト胚の製造方法であって、以下の
工程： a) 人為的または天然の手段によって卵母細胞を活性化させる工程； b) 前記活性化卵母細胞が第二極体を排出しつつある時に、または前記活性化卵
母細胞が第二極体を放出した間近の時に(Tel-II)、前記活性化卵母細胞を除核す
る工程； c) 所望のDNAコンストラクトをトランスフェクトした細胞から抽出したトラン
スジェニック二倍体核を、前記除核卵母細胞に導入して、二倍体染色体内容物を
含む再構築卵母細胞を得る工程；および d) 非ヒト胚へと発達することができるように前記再構築卵母細胞をインビトロ
で培養し、そして／または前記再構築卵母細胞を適切な代理母の生殖管に導入す
る工程、 を含む方法。 - 【請求項２１】 前記導入細胞または核が、核ステージG0、G1、S、G2、ま
たはMである請求項２０の方法。 - 【請求項２２】 前記非ヒト胚を胎児へと発達させる工程をさらに含む請求
項２０の方法。 - 【請求項２３】 前記胎児を子孫へと発達させる工程をさらに含む請求項２
２の方法。 - 【請求項２４】 前記非ヒト胚が非ヒト動物へと発達する請求項２０の方法
。 - 【請求項２５】 請求項２０の方法で得られるトランスジェニック胚。
- 【請求項２６】 請求項２１の方法で得られるトランスジェニック胎児。
- 【請求項２７】 請求項２２の方法で得られるトランスジェニック子孫。
- 【請求項２８】 細胞または核導入による非ヒト動物のクローニング方法で
あって、以下の工程： a) 人為的手段によって前記卵母細胞を活性化させる工程； b) 前記活性化卵母細胞が第二極体を排出しつつある時に、または前記活性化卵
母細胞が第二極体を放出した間近の時に(Tel-II)、前記活性化卵母細胞を除核す
る工程； c) 二倍体核または細胞を前記除核卵母細胞に導入して、二倍体染色体内容物を
含む再構築卵母細胞を得る工程；および d) 非ヒト胚へと発達することができるように前記再構築卵母細胞をインビトロ
で培養し、そして／または前記再構築卵母細胞を適切な代理母の生殖管に導入す
る工程、 を含む方法。 - 【請求項２９】 前記導入細胞または核が、核ステージG0、G1、S、G2、ま
たはMである請求項２８の方法。 - 【請求項３０】 前記工程a)の卵母細胞が二次卵母細胞(M-II)であり、前記
人為的手段が物理的または化学的手段である請求項２８の方法。 - 【請求項３１】 前記化学的手段がエタノールまたはイオノマイシンである
請求項３０の方法。 - 【請求項３２】 前記物理的手段が、電気的手段、熱手段、および照射技術
からなる群から選択される請求項３０の方法。 - 【請求項３３】 第二極体が少なくとも部分的に突出するのに十分な期間卵
母細胞を培養した後に前記工程b)を行う請求項２８の方法。 - 【請求項３４】 細胞骨格インヒビターを含む培地中で卵母細胞を用いて前
記工程b)を行う請求項３０の方法。 - 【請求項３５】 少なくとも部分的に突出した第二極体周囲に染色体を含む
細胞質の一部と共に前記第二極体を顕微手術で除去することによって前記工程b)
を行う請求項３１の方法。 - 【請求項３６】 前記除核卵母細胞への二倍体核を含む単一細胞の細胞融合
またはマイクロインジェクションによる導入によって前記工程c)を行う請求項３
２の方法。 - 【請求項３７】 前記工程c)の核または細胞がトランスジェニックまたは非
トランスジェニックである請求項２８の方法。
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