CN107828718B - 一种制备单倍体核细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，提供一种单倍体核细胞的制备方法，包括：将次级卵母细胞中的第一极体取出并放置在次级卵母细胞的卵周间隙中除原位置外的任意位置，融合第一极体和次级卵母细胞并激活，使其分裂为第二极体和单倍体核细胞，再使第二极体与单倍体核细胞完全分离。本发明的方法提高了卵子遗传物质的利用效率，有效降低突变线粒体的残留量，且操作简便。

Description

一种制备单倍体核细胞的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体提供一种制备单倍体核细胞的方法。
背景技术
线粒体基因病(Mitochondrial genic disorders)是线粒体基因组中发生基因突变所导致的一类疾病，其传递和表达完全不同于由核基因突变引起的疾病，是一组独特的遗传病。正是由于线粒体疾病本身的特点，故目前的辅助生殖技术无法从根本上解决其向子代的传递。目前针对该类疾病的潜在的有效解决手段是进行线粒体置换，也就是将疾病患者卵母细胞的细胞核转移到含有正常线粒体的卵母细胞质中，从而达到阻断突变线粒体向子代传递的目的。目前主要用于线粒体置换的母源细胞核主要有纺锤体(第一次减数分裂后的产物)。纺锤体结构的观察需要借助于特殊的观察设备，另外纺锤体结构受环境的影响非常大，因此在日常操作中经常出现无法鉴别纺锤体位置的现象。另外，由于纺锤体结构本身的体积较大，因此最终的线粒体残留量难以控制。
用于线粒体置换的其他类型的细胞核有第一极体(第一次减数分裂后的产物)、第二极体(第二次减数分裂后的产物)以及原核(第二次减数分裂后的产物)。由于第一次减数分裂和第二次减数分裂的产物在染色体的状态及卵子所处发育时期具有显著的差异，因此一般情况下同一个卵子只能提供一个或两个细胞核物质用于线粒体置换操作，这一方面给操作带来了很大的不便(细胞核处于不同的状态)；另一方面不能充分利用卵子的核物质样本，这对于卵子数目极少的患者显得尤为不利。
发明内容
本发明目的在于提供一种单倍体核细胞的制备方法，以提供更多的可以用于线粒体置换的细胞，从而解决现有技术中存在的问题。
本发明的单倍体核细胞的制备方法包括如下步骤：
(1)提供次级卵母细胞，用显微操作针将第一极体取出；
初级卵母细胞在完成第一次减数分裂后形成次级卵母细胞，停滞在第二次减数分裂中期，此时卵周间隙中含有第一极体；
所述次级卵母细胞来自任何非人哺乳动物，如猴子、小鼠、兔子、牛；
(2)将取出的所述第一极体放置于所述次级卵母细胞的卵周间隙中除原位置以外的任意位置；
(3)将所述第一极体与次级卵母细胞进行融合；
(4)激活完全融合的上述细胞，之后其分裂为两个第二极体以及两个单倍体核细胞；所述激活为人工体外激活；
(5)在激活后特定时间内，用显微操作针分别将所述两个第二极体与邻近的两个单倍体核细胞分离开来，得到四个单倍体细胞；所述单倍体核细胞包含细胞核及一小部分细胞质；所述一小部分细胞质的量为尽量少，如所述单倍体核细胞基本上不包含细胞质；
这步操作的目的即是减少单倍体核细胞中的细胞质，从而减少线粒体的量，减少发病的可能性；因此，细胞质的量应当尽量少，所述量可以实现本发明目的且本领域技术人员可以实现这样的操作；
(6)将步骤(5)中得到的四个单倍体细胞在培养液中培养1-4小时，使第二极体与邻近的单倍体核细胞完全分离开。
用显微操作针取出第一极体、将第一极体放置于卵周间隙中、将第一极体与次级卵母细胞融合、激活融合的细胞以及细胞核与细胞质分离开这些操作都是本领域常规技术。
在本发明的一个实施方案中，步骤(1)、(5)中所述的显微操作针内径可为10微米－30微米，优选内径为20微米。
在本发明的一个实施方案中，步骤(2)中所述的第一极体放置位置为卵周间隙中相对于原第一极体位置的对侧。
在本发明的一个实施方案中，步骤(3)中所述的融合方法可以为电融合、化学融合或病毒融合。
在本发明的一个实施方案中，步骤(4)中所述激活的方式可以为胞浆内单精子注射、机械激活、电激活或化学激活中的任意一种。
在本发明的一个实施方案中，步骤(5)中所述激活后特定时间是激活后3-6小时。
在本发明的一个实施方案中，步骤(6)中的培养时间为2小时。
在本发明的一个实施方案中，步骤(6)中的培养液可以为卵裂培养液、囊胚培养液、普通细胞培养液或体外操作液中的任意一种，如Vitrolife品牌的G1、G2、G-MOPs等。
在本发明的一个实施方案中，第一极体与卵母细胞完全融合后，分裂得到两个第二极体及其邻近的单倍体核细胞，共计四个单倍体核细胞。然而此时第二极体与其邻近的单倍体核细胞仅细胞核完全分离，细胞质尚未完全分离。用所述显微操作针分别将所述两个第二极体与邻近的所述两个单倍体核细胞的细胞核及一小部分细胞质分离出来，所述单倍体核细胞的细胞核及一小部分细胞质构成含有少量细胞质的单倍体核细胞。此时，第二极体和含有少量细胞质的单倍体核细胞仍未完全脱离。经过在培养液中培养1-4小时之后，第二极体与其邻近的含有少量细胞质的单倍体核细胞完全分离开来。
在常规操作过程中，使用一个卵母细胞只能得到一个单倍体核细胞，其中含有卵母细胞中全部的细胞质。因此，在线粒体等通过细胞质遗传的患者中，细胞质遗传病难以避免地遗传到下一代。然而在本发明的技术方案中，通过一个卵母细胞能够得到两个第二极体以及两个含有少量细胞质的单倍体核细胞。第二极体含有很少量的细胞质，其在第二次减数分裂后一段时间内发生退化消失，本发明在第二极体尚未退化消失之前获取第二极体，其可用于后续操作。本发明通过将含有少量细胞质的单倍体核细胞的细胞核分离出来，其中含有很少量的细胞质，能够有效地避免细胞质遗传病遗传到下一代。
本发明提供的由卵母细胞的分离制备单倍体核细胞的方法，不需要借助任何特殊设备，可由一个卵母细胞获得四个单倍体核细胞，操作更简便。另外，通过本发明的方法，第一极体不会退化消失，而是与次级卵母细胞融合后分离形成四个单倍体细胞，这四个单倍体细胞均可以用于后续的操作。因而可以充分的利用卵母细胞的所有遗传物质，提高卵细胞的利用效率。
与现有技术相比，利用本发明所述的方法制备卵母细胞单倍体核细胞，具有明显的优越性：
(1)不需要特殊的设备，只需要一般的倒置显微镜及显微操纵仪就可以进行，操作简便，便于广泛推广使用；
(2)分离后残留的细胞质较少，可以有效的降低突变线粒体的残留量，因而特别有利于患有线粒体基因病的群体；
(3)所获得的所有细胞核处于同样的状态，利于标准化操作；
(4)同一个卵母细胞可以获得4个单倍体核细胞，大大提高了卵子遗传物质的利用效率；
(5)不需要使用化学物质人为控制细胞周期的进程。
附图说明
图1表示用显微操作针分离第一极体的示意图，
其中：1为第一极体；2为卵周间隙；
图2表示将第一极体重新注射进卵周间隙中的示意图；
图3表示将第一极体与卵母细胞重新融合的示意图；
图4表示卵母细胞的激活及单倍体核细胞的分离的示意图；
其中：3为单个精子，4、5为分离的第二极体与单倍体核细胞，6、8为第二极体，7、9为单倍体核细胞。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明做进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。
以下实施例中使用的各种动物次级卵母细胞、精子来自于申请人实验室，这些材料也都是本领域常用的实验材料，可以通过商购的途径获得。
如无明确说明，以下实施例中使用的仪器、试剂都是本领域常规仪器、试剂，可以通过商购方式获得；所使用的方法也是本领域常规方法，本领域技术人员可以根据实施例的描述实现该方法并得到相应的实验结果。
实施例1：
(1)如图1所示，取猴子的次级卵母细胞，其包含第一极体1和卵周间隙2，用内径为20微米的显微操作针将第一极体取出；
(2)如图2所示，将取出的第一极体放置于该次级卵母细胞的卵周间隙中，放置的位置位于卵周间隙中相对于原第一极体位置的对侧；
(3)如图3所示，用电融合的方式将第一极体与卵母细胞进行融合；
(4)如图4所示，取单精子3，用胞浆内单精子注射的方式激活融合完全的细胞，之后其分裂为两个第二极体以及两个单倍体核细胞4、5；
(5)激活后4小时用内径20微米的显微操作针分别将两个第二极体6、8及邻近的单倍体核细胞7、9分离开来，单倍体核细胞7和9包含细胞核及一小部分细胞质；如此，得到四个单倍体细胞；
(6)将上述得到的四个单倍体细胞在Vitrolife G1培养液中培养2小时，第二极体与邻近的单倍体核细胞完全分离开。
实施例2：
(1)取小鼠的次级卵母细胞，用内径为10微米的显微操作针将第一极体取出；
(2)将取出的第一极体放置于该次级卵母细胞的卵周间隙中，放置于卵周间隙中原第一极体位置的三点钟位置处；
(3)用化学融合的方式将第一极体与卵母细胞进行融合；
(4)取小鼠单精子，用胞浆内单精子注射的方式激活融合完全的细胞，之后其分裂为两个第二极体以及两个单倍体核细胞；
(5)激活后3小时，用内径10微米的显微操作针分别将两个第二极体及邻近的单倍体核细胞分离开来，单倍体核细胞包含细胞核及一小部分细胞质，得到四个单倍体细胞；
(6)将上述得到的四个单倍体细胞在操作Vitrolife G2培养液中培养1小时，各第二极体与邻近的单倍体核细胞完全分离开。
实施例3：
(1)取兔子的次级卵母细胞，用内径为15微米的显微操作针将第一极体取出；
(2)将取出的第一极体放置于该卵母细胞的卵周间隙中，放置于卵周间隙中原第一极体位置的九点钟位置处；
(3)用病毒融合的方式将第一极体与卵母细胞进行融合；
(4)待完全融合后，用机械激活的方式激活融合完全的细胞，之后其分裂为两个第二极体以及两个单倍体核细胞；
(5)在激活后3小时用内径10微米的显微操作针分别将两个第二极体及邻近的单倍体核细胞分离开来，单倍体核细胞包含细胞核，基本上没有细胞质，得到四个单倍体细胞；
(6)将上述得到的四个单倍体细胞在Vitrolife G-MOPs培养液中培养3小时，第二极体与邻近的单倍体核细胞完全分离开。
实施例4：
(1)取牛的次级卵母细胞，用内径为30微米的显微操作针将第一极体取出；
(2)将取出的第一极体放置于该卵母细胞的卵周间隙中，放置于卵周间隙中原第一极体位置的4点钟位置处；
(3)用仙台病毒融合的方式将第一极体与卵母细胞进行融合；
(4)用电激活的方式激活融合完全的细胞，之后其分裂为两个第二极体以及两个单倍体核细胞；
(5)激活后6小时用内径30微米的显微操作针分别将两个第二极体及邻近的单倍体核细胞分离开来，单倍体核细胞包含细胞核及微量的细胞质；得到四个单倍体细胞
(6)将上述得到的四个单倍体细胞在Vitrolife G1培养液中培养4小时，第二极体与邻近的单倍体核细胞完全分离开。
实施例5：
(1)取兔子次级卵母细胞，其包含第一极体，并具有卵周间隙，用内径为25微米的显微操作针将第一极体取出；
(2)将取出的第一极体放置于该卵母细胞的卵周间隙中，放置的位置位于卵周间隙中相对于原第一极体位置的对侧；
(3)用电融合的方式将第一极体与卵母细胞进行融合；
(4)待完全融合后，用含有终浓度为5μg/ml的A23187的培养液，通过化学激活方式激活融合完全的细胞，之后其分裂为两个第二极体以及两个单倍体核细胞；
(5)激活后4小时用内径25微米的显微操作针分别将两个第二极体及邻近的单倍体核细胞分离开来，所述单倍体核细胞包含细胞核，基本上不包含细胞质；得到四个单倍体细胞；
(6)将上述得到的四个单倍体细胞在卵裂培养液中进行培养2小时，第二极体与邻近的单倍体核细胞完全分离开。
实施例6：
(1)取小鼠的次级卵母细胞，其包含第一极体，并具有卵周间隙，用内径为20微米的显微操作针将第一极体取出；
(2)将取出的第一极体放置于该卵母细胞的卵周间隙中，放置的位置位于卵周间隙中相对于原第一极体位置的对侧；
(3)用电融合的方式将第一极体与卵母细胞进行融合；
(4)用电激活方式激活融合完全的细胞，之后其分裂为两个第二极体以及两个单倍体核细胞；
(5)激活后5小时用内径20微米的显微操作针分别将两个第二极体及邻近的单倍体核细胞分离开来，所述单倍体核细胞包含细胞核及少量细胞质；得到四个单倍体细胞；
(6)将上述得到的四个单倍体细胞在卵裂培养液中培养2小时，使第二极体与邻近的单倍体核细胞完全分离开。
需要说明的是，上述发明内容及具体实施方式意在证明本发明所提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。本领域技术人员在本发明的精神和原理内，当可作各种修改、等同替换或改进。

Claims (8)

1.一种单倍体核细胞的制备方法，包括如下步骤：
(1)提供次级卵母细胞，用显微操作针将第一极体取出；所述次级卵母细胞来自小鼠、猴、兔子或牛；所述显微操作针内径为10微米-30微米；
(2)将取出的所述第一极体放置于所述次级卵母细胞的卵周间隙中相对于原第一极体位置的三点钟至九点钟位置；
(3)将所述第一极体与次级卵母细胞进行融合；
(4)激活完全融合的上述细胞，之后其分裂为两个第二极体以及两个单倍体核细胞；
(5)在激活后3-6小时内，用显微操作针分别将所述两个第二极体与邻近的两个单倍体核细胞分离开来，得到四个单倍体细胞；所述单倍体核细胞包含细胞核及一小部分细胞质；
(6)将步骤(5)中得到的四个单倍体细胞在培养液中培养1-4小时，使所述第二极体与邻近的单倍体核细胞完全分离开。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述显微操作针内径为20微米。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中，所述第一极体的放置位置为卵周间隙中相对于原第一极体位置的对侧。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(3)中，所述融合方法为电融合、化学融合或病毒融合。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(4)中，所述激活的方式为胞浆内单精子注射激活、机械激活、电激活或化学激活。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(5)中，所述单倍体核细胞基本上不包含细胞质。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(6)中，所述培养时间是2小时。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(6)中，所述培养液为卵裂培养液、囊胚培养液、普通细胞培养液或体外操作液，其中体外操作液选自Vitrolife的G1、G2或G-MOPs。
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