JP2003513673A

JP2003513673A - 体細胞核移植によるブタクローン胚の改善された生産方法

Info

Publication number: JP2003513673A
Application number: JP2001537540A
Authority: JP
Inventors: ヨンマンハン; キョンクワンイ; トクボンク; ジョンソンパク; ヨンクックカン; ヨンヒチェ; デーユルユ
Original assignee: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Current assignee: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Priority date: 1999-11-19
Filing date: 2000-11-16
Publication date: 2003-04-15
Also published as: WO2001035734A1; EP1229784A1; AU1896101A; EP1229784B1; AU769618B2; KR20010047362A; CN1407851A; KR100417566B1; DE60017931D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、体細胞核移植によって複製されたブタ胚の大量生産方法に関する。詳しくは、卵母細胞は屠畜場から得た卵巣から得られた後体外成熟させた。体外成熟（ＩＶＭ）を終了した後、卵母細胞の核を取除き、電気刺激によって体細胞と融合させた。再構成された卵子は２次電気刺激で活性化した後体外培養した。本発明は、再構成された卵母細胞を活性化し、核移植胚の生存力を増加させることにより、クローン胚とクローン動物を誕生させるための最適条件を確率するためのものである。したがって、ブタの体細胞核移植に関する本発明は、優良ブタを増殖させ、異種移植用または疾病発生モデル用形質転換ブタを開発するのに応用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、核移植によるクローン胚の生産方法に関し、さらに詳細には、核が
取除かれレシピエント卵母細胞と体細胞または体細胞由来核を電気刺激で融合し
、卵母細胞を再構成し、２次電気刺激によって前記再構成された卵母細胞を活性
化することを含む、新規な体細胞核移植技術によってクローン胚を大量生産する
改良方法に関する。

【０００２】背景技術伝統的に用いられてきた家畜のような動物種の形質改良方法は、優れた形質を
示す動物間の交配に大きく依存する。しかし、この方法は、遺伝的に優れた子孫
を産むまでかなり長時間が所要されるためあまり良い方法ではなく、したがって
、選択された動物の早い改良が難しいという問題があった。しかし、動物の体細
胞を用いた核移植（nuclear transfer,NT）という新たな科学的方法が導入され
て以来、ヒツジ（０９９９９９お Schnieke et al., Science, 278:2130-2133 ( 1997); Wilmut et al., Nature, 385:810-813 (1997)）、ヤギ(Baguisi et al., Nature Biotechnology, 17:456-461 (1999))、マウス(Wakayama et al., Natur e, 394:369-374 (1998))、ウシ(Cibelli et al., Science, 280:1256-1258 (199 8); Kato et al., Science, 282:2095-2098 (1998); Wells et al., Biol. Repr od., 60:996-1005 (1999))、そしてブタ(Onishi et al., Science, 289:1188-11 90 (2000); Polejaeva et al., Nature, 407:505-509 (2000))のような動物の複
製が成功裏に行われてきた。実際、体細胞は卵丘細胞や卵管細胞(Wakayama et a l., Nature, 394:369-374 (1998); Kato et al., Science, 282:2095-2098 (199 8))、顆粒膜細胞(Wells et al., Biol. Reprod., 60:996-1005 (1999))、胸腺上
皮細胞(Wilmut et al., Nature, 385:810-813(1997))、胎児繊維芽細胞(Schniek e et al., Science, 278:2130-2133 (1997); Baguisi et al., Nature Biotechn ology,17:456-461(1999); Cibelli et al., Science, 280:1256-1258(1998))、
および耳皮膚細胞(Zakhartchenko et al., Mol. Reprod. Dev., 54:264-272 (19 99))等から多様に得られ、ドナー細胞の良いソースとして用いられる。

【０００３】しかし、このような努力にもかかわらず、体細胞を用いた核移植技術はブタで
は長期間成功できず(Du et al., Theriogenology, 51:201 (1999); Tao et al., Cloning, 1:55-62 (1999))、４つの細胞核を有している核移植胚から生まれた
仔ブタに関する一つの報告があったのみである（Prather et al., Biol. Reprod ., 41:414-418 (1989)）。体細胞を用いてブタをクローニングすることは非常に
難しい課題とみなされており、最近になって複製が成功したことが２〜３報告が
あったが(Onishi et al., Science, 289:1188-1190 (2000); Polejaeva et al., Nature, 407:505-509 (2000))、研究者はレシピエント細胞質としてin vivo 由
来の卵母細胞を用いて行ったと報告されている。

【０００４】イオノフォア A23187は、種々の動物種にみられる皮質顆粒型エクソサイトー
シス（ exocytosis ）と第２極体放出、そして卵子の前核形成を誘導するため(M arcus, Mol. Reprod. Dev., 16:1384-1391 (1990); Liu et al., Mol. Reprod. Dev., 49:298-307(1998); Wang et al., Mol. Reprod. Dev., 51:346-353 (1998 ))、哺乳類の卵子において優れた一般的な活性剤として知られている（Steinhar dt et al., Nature, 252:41-43(1974)）。そして、イオノフォアで処理したブタ
の卵母細胞は前核を形成し、胚盤胞期に単為生殖的に発生することが示された (Funahashi et al., Biol. Reprod., 50:1072-1077 (1994); Wang et al., Biol . Reprod., 60:1020-1028 (1999))。

【０００５】一般に、Ca-ignophore/6-DMAP(Cibelli et al., Science, 280:1256-1258 (19 98); De Sousa et al., Cloning, 1:63-69 (1999))、イオノマイシン/6-DMAP(We lls et al., Biol. Reprod., 60:996-1005 (1999))、またはシクロヘキシミド／
サイトカラシンＢ( Zakhartchenko et al., J. Reprod. Fertil., 115:325-331 (1999))のような混合化学薬品は体細胞で再構成されたウシの卵母細胞を活性化
するのに用いられてきた。ブタの場合、一部再構成された卵子はチメロサール／
ジチオトレイトールに晒して活性化すると胚盤胞になることを示した (Tao et a l., Cloning,1:55-62 (1999))。

【０００６】また、電気刺激は、ブタの卵母細胞において効果がある活性化剤として知られ
ている(Jolliff and Prather, Biol. Reprod., 56:544-548 (1997); Wang et al ., Mol. Reprod. Dev., 51:346-353 (1998))。繊維芽細胞で核移植されたブタの
卵子が電気刺激によって活性化され、同時に融合された場合、一部の胚は胚盤胞
に発展した(Du et al., Theriogenology, 51:201 (1999))。

【０００７】受精卵細胞や体細胞を用いた核移植において、卵母細胞の細胞質の一部が核除
去過程中に消失することが容易に観察される。結果として、体積が減少した細胞
質はまた動物の核移植胚細胞数も減少させるだけでなく、その発展性のある潜在
能力の減少ももたらす（Peura et al., Mol. Reprod. Dev., 50:185-191 (1998) ）。ウシの場合、繊維芽細胞を注入した核移植胚は実験結果胚盤胞期に達するま
で体外発達率が約１２％と比較的低かったが（Cibelli et al., Science, 280:1 256-1258 (1998)）、これに対し、壁あるいは卵丘顆粒膜細胞を注入した胚は胚
盤胞期に達するまで受精卵の体外発達率が約５０％と比較的高かった(Kato et a l., Science, 282:2095-2098 (1998); Wells et al., Biol. Reprod., 60:996-1 005 (1999))。この二つの異なる実験設定結果の差は、各々異なる種類の細胞が
すべてドナー細胞であるものの、相異する発達能力を有していることを示す。し
かし、ブタの核移植胚の体外発達能力に関する詳細はまだ明確に解決されず、依
然として解くべき宿題として残っている。

【０００８】体細胞核移植は形質転換動物、特に形質転換家畜を生産するのに必要な強力な
方法となってきた。複製形質転換動物はまたトランスフェクトされた繊維芽細胞
から生産された(Schnieke et al., Science, 278:2130-2133 (1997); Cibelli e t al., Science, 280:1256-1258 (1998))。しかし、体細胞における遺伝子変形
は、前述の核移植技術を用いて形質転換ブタを生産するのに必須的であることを
認知しなければならない。最近、ヒツジ、ウシ、マウス、ヤギ、そしてブタ実験
において核供与細胞として様々な体細胞を用いて成功したが、体細胞核移植効率
は依然として２％未満と非常に低い。したがって、動物産業および生体医療分野
に広範囲に適用されるさらに進歩した核移植技術を開発することの必要性が長く
待望されていた。

【０００９】発明の開示したがって、本発明は、体細胞核移植によるクローン胚を大量生産する改善方法
を提供することである。体細胞核移植方法に従って作製されたクローン卵母細胞
の比較的低い体外発達率を向上するために、本発明の発明者らはクローン胚の生
産方法を新たに発展させた。ここで、核が取除かれた成熟した卵母細胞は培養さ
れた体細胞から電気刺激によって得られた核と融合し、１〜２時間再構成時間を
付与した後、２次電気刺激によってさらに活性化することにより、前記胚の生存
力を向上させ、体外発達率を連続的に達成させた。本発明は今後クーロンブタの
着床方法を確固にするのに役立てるだけでなく、形質転換動物を生み出し、また
ヒトに代替臓器を提供するのにも使用できる。

【００１０】発明を実施するための最良の形態本発明は、体細胞核移植によるブタクローン胚の改善された大量生産方法に関す
るものであって、次の段階で構成されている。（ａ）レシピエント卵母細胞の核
除去、（ｂ）核ドナー細胞である体細胞の体外培養、（ｃ）核が取除かれた卵
母細胞への体細胞の注入、（ｄ）核が取除かれた卵母細胞とドナー体細胞との
電気融合、（ｅ）２次電気刺激による再構成された胚の活性化、（ｆ）核移植胚
の体外培養と核移植胚のレシピエントブタへの移植。

【００１１】本発明をさらに詳細に説明すると次の通りである。まず、本発明は卵母細胞の核を取除き、該卵母細胞と体細胞を電気刺激で融合
させた後、１〜２時間の卵母細胞の再構成時期を有することを特徴とする。一般
に、ヒトを除いた哺乳類の体細胞を核供与細胞として用いることを推奨するが、
さらに好ましくは、ブタ、ウシ、ヒツジ、マウスのような動物から得られた繊維
芽細胞や卵丘細胞を用いる。本発明において、レシピエント卵母細胞は幼い雌ブ
タの卵巣から得られたものであり、未成熟卵母細胞は成熟するときまで体外で培
養される。その後、第１極体を有する成熟卵母細胞のみを選択し、核を取除いた
卵母細胞を使用する。ドナー細胞である体細胞は一つずつ核が取除かれた卵母細
胞に注入され、１６０Ｖ／ｍｍの１次電気刺激に３０μsecの間露出させて核が
取除かれた卵母細胞の細胞質とドナー細胞である体細胞の核が各々融合するよう
に誘導する。このように得られた卵母細胞はその後、１〜２時間の間ウシの胎児
血清を含有するリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で培養して再構成するようにする。

【００１２】前記再構成された卵子は２次電気刺激を与えて活性化するが、この際の卵母細
胞を１２０〜１５０Ｖ／ｍｍの電気パルスに３０μsecの間露出させる。仮に、
電気刺激が１２０Ｖ／ｍｍ未満である場合活性化比率は低くなり、１５０Ｖ／ｍ
ｍを超える場合は卵母細胞が損傷するおそれが増加する。これらの卵母細胞をさ
らに発達できるように体外培養させる。通常の核移植方法においては、核が取除
かれた卵母細胞に１回の電気刺激のみを適用したので、体外発達率が通常５％未
満であったのに対し、本発明は２次電気刺激を導入することにより、卵母細胞の
発達率を１１．６％まで引き上げて著しい効果をもたらし、これは従来の方法に
比べて１３０％向上したものである。

【００１３】再構成された卵子は、体細胞の核をレシピエント細胞質に移植した後から活性
化される。カルシウム−イオノフォーア／6-DMAPやエタノール／シクロヘキシミ
ド／サイトカラシンＢのような様々な混合化合処理法はウシの体細胞核移植卵
母細胞を活性化するのに用いられた。しかし、ブタの核移植卵母細胞をA23187
単独で用いるかA23187/6-DMAPの混合試薬で処理したとき活性化比率が比較的低
いことが分かった。一般に、ブタの卵母細胞は単一の化学薬品を使用した場合活
性化比率が低い反面、混合化学薬品であるチメローサル／ＤＴＴで処理した場合
発達速度は遅いがブタの卵子が胚盤胞に発達することが分かる。他の報告では、
スルフヒドリル(sulfhydryl)基薬品によって活性化されると卵割速度が遅くなり
、したがって、結果としてブタの核移植卵母細胞の胚盤胞への発達比率が低くな
る。本発明によって、電気刺激によって活性化されたブタの核移植胚は化学薬品
で処理した胚より比較的高い発達率を示した。

【００１４】電気融合後、異なるレベルの電圧で誘導した核移植胚の発達能力を調べたとこ
ろ、電気パルス（120V/mm DC pulse）がブタの体細胞核移植胚の活性化に非常に
効果的であることが分かった。ブタの繊維芽細胞を用いて再構成されたおおよそ７０％の胚はチメローサル／
ジチオトレイトールで処理して活性化したとき卵割されなかった (Tao et al., Cloning, 1:55-62 (1999))。本発明において、電気刺激のみを用いて活性化した
ブタの核移植卵子の平均卵割率は単為生殖的であり、体外受精された胚（ＩＶＦ
）と類似した。したがって、本発明は、電気刺激のみでブタの体細胞核移植胚の
発達に役立つのに十分であることを示す。

【００１５】本発明においては、電気融合した後体細胞で再構成された卵子の最適の活性化
時間が与えられる。ウシの場合、供与細胞とMII細胞質を融合してから４〜８時
間後に活性化された核移植胚はさらによく発達した(Stice et al., Biol. Repro d., 54:100-110 (1996); Wells et al., Reprod. Fertil. Dev., 10:369-378 (1 998))。また、卵子の細胞質要素に核が移植された後長時間露出させる場合核の
再構成および再プログラムが容易になった(DiBerardino et al., Science, 224: 946-952 (1984); Ware et al., Gamete Res., 22:265-275 (1989))。したがって
、再構成された卵母細胞が活性化する前に２〜３時間の間置くように遅延時間を
与えることは、たとえそのメカニズムがまだ明らかに理解されないが、核の再構
成および再プログラムをより容易にする。卵母細胞の適切な活性化条件を決定す
るために、電気融合された後異なる活性化時間を与えて誘導したブタの核移植卵
子の発達能力を試験した。本発明は、融合されてから１〜２時間後活性化された
ブタの核移植胚が異なる時間条件、すなわちより短時間（０時間と０．５時間）
、あるいはより長時間（４時間と６時間）に露出された場合に比べてさらに発達
することを示す。これは、異種間の遺伝的活性化時間が異なるからである。胚の
ゲノムの活性化はブタの場合、４細胞期に示される反面、ヒツジやウシの場合は
、８細胞期から１６細胞期に起こる（Kopscny, Reprod. Nutr. Dev., 29:589-60 0 (1989)）。したがって、これは、電気融合された後の再構成されたブタの卵母
細胞の活性化時間が体細胞核移植された後生きている胚を生産するのに決定的な
役割をすることを示す。また、これは、融合された後ドナー核がレシピエント細
胞質において再構成され、再プログラムするのに必要な時間は種によって異なり
得ることを示す。

【００１６】本発明は、核を移植した後体外で成熟させた卵母細胞から複製したブタの胚
を成功裏に生産することについても開示している。ウシを除いた大部分のクロー
ン動物、すなわち、ヒツジ、ヤギ、マウス、ブタは体内から得た、核を取除いた
卵母細胞に体細胞の核を移植して生産した核移植胚から発達したものである。体
内から得られた卵母細胞は動物に性腺刺激ホルモンを注入して過剰排卵されて
いる卵管を洗浄して得たものである。しかし、体内から得られた卵母細胞の数は
通常ある程度に制限されるが、これは、その過程が実験室で行われているからで
あり、また、多くの時間がかかるからである。その代わりに、レシピエント細胞
質として用いられる多くの卵母細胞は体外で準備することができる。良質の未
成熟卵子は屠畜場から得た卵巣から得られ、体外で成熟させ、核を取除いた後レ
シピエント細胞質として用いられる。最近、体内で得られた卵子でブタを複製で
きるという報告があった (Onishi et al., Science, 289:1188-1190 (2000); Po lejaeva et al., Nature, 407:505-509 (2000))。しかし、本発明は、体細胞核
移植後体外で得られた卵母細胞を用いてブタの核移植胚を生産する方法を提示す
る。

【００１７】体細胞核移植胚の発達能力は哺乳動物の細胞種類によって異なり得ることも提
案された (Kato et al., Science, 282:2095-2098 (1999), Zakhartchenko et a l., Mol. Reprod. Dev., 54:264-272 (1999))。本発明においては、卵丘細胞と
胎児繊維芽細胞はすべて核ドナー細胞として用いられた。これにより前着床段階
までブタの核移植胚が発達することを支持し、これは、核移植に関する本発明の
活性化システムが様々な細胞種類にも適用できることを示す。

【００１８】ブタの体細胞核移植が成功したことはこの技術が異種移植のための形質転換ブ
タを開発するのに有用であり、または疾病誘発モデルとして開発するのに有用で
ある。事実、本発明においては、外来ＤＮＡをブタの体細胞に成功裏に導入した
。本発明において、トランスフェクション細胞で核移植された胚はトランスフェ
クトされていないドナー細胞の胚と比較したとき発達能力は類似した。さらに、
形質転換遺伝子はすべてのトランスフェクションされた細胞で核移植された胚の
初期発達期間の間強く発現され、このような現象は核移植以降トランスフェクシ
ョンされた細胞で核移植された胚から形質転換胚や形質転換動物を生産できる可
能性を高める。

【００１９】＜実験細部事項＞体外成熟（ＩＶＭ）と体外受精（ＩＶＦ）幼い雌ブタの卵巣を一般の屠畜場から得、実験室に移送して７５μｇ／ｍｌ
のカリウムペニシリンＧと５０μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシンを含む０．
９％（ｗ／ｖ）の生理食塩水に２５〜３０℃で使用前まで保管した。卵丘細胞
−卵母細胞複合体（ＣＯＣ）は、１０ｍｌの使い捨て注射器に付いている１８ゲ
ージ針を用いて直径３〜６ｍｍのブタ卵胞から得た。ＣＯＣはＴＬ（Tyrode’s lactate）-Hepes溶液で３回洗浄した後体外成熟培養液５００μｌが入っている
シャーレ(4 well multidish) (Nunc, Roskilde, Denmark) の各ウェル約５０
ＣＯＣをに入れ、空気中５％ＣＯ_２、３９℃で保持して培養した。２０時
間〜２２時間培養した後に卵母細胞をＴＬ-Hepes溶液で３回洗浄し、妊娠した雌
の血清性腺刺激ホルモン（PMSG）やヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(hCG)を含まな
い成熟培養液で２２時間培養した。培養液は暖かいパラフィン油（鉱油）で覆っ
て使用する前に少なくとも２時間３９℃、５％のＣＯ_２で平衡状態を保たせた。
卵子を成熟させるために用いられた培養液は、ブタの卵胞液１０％（ｖ／ｖ）
と０．５７ｍＭシステイン、ゲンタマイシン２５μｇ／ｍｌ、上皮成長因子（Ｅ
ＧＦ）１０ｎｇ／ｍｌ、ＰＭＳＧ１０ＩＵ／ｍｌ、ｈＣＧ１０ＩＵ／ｍｌが
添加されたウシ血清アルブミン（bovine serum albumin ，BSA）を含まないＮＣ
ＳＵ（ North Carolina State University）２３番培養液とした。ブタの卵胞液
は直径３〜６ｍｍの卵胞から得、これを１，６００ｘｇで４℃で３０分間遠心分
離した後、１．２μｍのシリンジフィルターで濾過して使用前まで−２０℃で貯
蔵した。

【００２０】ＩＶＦに用いられた基本培養液はAbeydeeraとDayが記述したものと実質的に同
とした(Biol. Reprod., 57:729-734 (1997))。このＩＶＦ培養液は改質されたト
リス緩衝溶液（Tris-buffered medium; mTBM）として呼ばれ、１１３．１ｍＭ
ＮａＣｌ、３ｍＭＫＣｌ、７．５ｍＭＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、２０ｍＭト
リス(結晶フリー塩基：crystallized free base; Fisher Scientific, Fair Law n, NJ)、１１ｍＭグルコース、５ｍＭピルビン酸ナトリウムからなり、抗生剤は
添加されていない。新鮮なブタの精液は Darby Pig AI Center (安城、韓国)か
ら１回／週提供され、これを５日間１７℃で保管した。前記精液はＢＳＡ１ｍ
ｇ／ｍｌ(Fraction V)、ペニシリン１００μｇ／ｍｌ、ストレプトマイシン７５
μｇ／ｍｌを含むDulbecco’sリン酸緩衝溶液と混合した後、３回遠心分離して
洗浄した。洗浄の最後には精子をトリス緩衝溶液(pH7.8)にさらに懸濁した。Ｉ
ＶＭを行った後、卵母細胞の卵丘細胞はNCSU23培養液中の０．１％（ｗ／ｖ）ヒ
アルロニダーゼで処理して取除いた。露出された卵子はカフェイン２．５ｍＭと
ＢＳＡ４ｍｇ／ｍｌを含むｍＴＢＭで３回洗浄し、パラフィン油で覆われたｍ
ＴＢＭ５０ｍｌに入れた。稀釈された精子５０μｌを卵子が入っている５０μ
ｌの受精培養液に添加し、最終精子の濃度を５ｘ１０^５ cell/mlにした。卵子は
精子とともに６時間３９℃の温度で５％のＣＯ_２を含む大気で培養した。

【００２１】体細胞の準備卵丘細胞を準備するために、一つのブタの卵巣からＣＯＣを得た。ＩＶＭの
ために４６時間培養後、０．１％（ｗ／ｖ）ヒアルロニダーゼが添加されたTL-H epes培養液でＣＯＣを処理して卵丘細胞を分散させた。マイクロ遠心機Microcen trifuge(Vision Scientific Co., Korea)を用いて７００ｘｇで５分間卵丘細胞
を遠心分離して沈殿させた。沈殿した細胞ペレットをＣａ^２＋、Ｍｇ^２＋のな
いリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ(−)）に再懸濁し、細胞懸濁液を核ドナー物質とし
て使用する前２時間の間室温で保管した。妊娠４０日齢の韓国産の韓国産再来ブ
タ（Sus scrofa domesticus L.）の子宮から胎児繊維芽細胞を回収した。簡単に
ブタの胎児をＤＰＢＳ（−）で３回洗浄した。胎児の頭は手術用はさみ（ iris scissors）を用いて取除き、肝臓と腸から軟組織を２つのピンセットで分離し、
残ったものは捨てた。胎児組織をＤＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、その死骸を
手術用ナイフで細かく切り、直径１００ｎｍの培養用皿に移した。細く切った組
織を０．２５％（ｗ/ｖ）トリプシン／３．６５ｍＭＥＤＴＡ溶液１０ｍｌに
入れて３９℃で３０分間培養した。１５％のウシの胎児血清 (FBS; Gibco, Life Technologies Inc., Grand Island, NY)を含む細胞培養液を前記と同量添加し
てトリプシン活性が抑制させた。細胞培養液はDulbecco’s改質されたEagle’s
培養液(DMEM; Gibco)と１５％ＦＢＳ、ペニシリン１，０００ユニット、ストレ
プトマイシン１０００μｇ／ｍｌ(Gibco)で構成されている。激しくピペッティ
ングした後、上澄液を１５０ｘｇで５分間遠心分離した。細胞を懸濁し、最終濃
度が２ｘ１０^６ cell/mlになるように調整した後、１７５ｃｍ^２の組織培養用
フラスコで温度３９℃、５％ＣＯ_２で１０ｍｌの培養液で培養した。胎児繊
維芽細胞を核供与細胞のソースとして使用する前に３回継代接種した。

【００２２】外来ＤＮＡの体細胞へのトランスフェクションポリブレン／ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）−仲介トランスフェクショ
ン（Kawai and Nishizawa, Mol. Cell Biol., 4:1172-1174 (1984)）は次の通り
行われた。１０μｇのプラスミドpLNβ−eGFP DNAと３０μｇ／ｍｌのポリブレ
ン（Aldrich, Milwaukee, WI, USA）を含む１ｍｌ培養液にテナガザル白血病ウ
イルス（ Gibbon Ape leukemia virus）からなるPG13 packing cellをその前日
プレーティングした（５ｘ１０^５ cell/60mm dish）。３７℃の５％ＣＯ_２雰
囲気下で培養してから６時間後に、ＤＮＡ−培養液混合物をアスピレーションし
、２５％ＤＭＳＯを含む培養液２ｍｌを加えてパッキング細胞に衝撃を与えた
後１分間培養した。培養液で３回洗浄してからトランスフェクションした細胞
を分離する前に細胞に５ｍｌの培養液を入れ、一晩培養した。胎児繊維芽細胞標
的細胞が次のMillerとRosmanの改質過程中に感染された（Biotechniques, 7:980 -982 (1989)）。ポアサイズが０．２２μｍのフィルタに通して濾過したウイル
ス含有培養液３ｍｌとポリブレン（最終濃度５μｇ／ｍｌ）を前日板状に作った
標的細胞に添加した。標的細胞はただ１時間の間混合物に露出させた。ウイルス
含有培養液は非選択培養液を前日入れたウイルス生産細胞から収穫した。感染さ
せてから１日後感染された細胞はトリプシン処理を行い、非選択培養液から分離
した。トランスフェクションと感染過程において、Ｇ４１８選択培養液（６００
μｇ／ｍｌ）は分離した翌日加えた。トランスフェクト細胞は核供与細胞として
用いる前に１４回継代接種した。

【００２３】ブタ卵母細胞の核除去ＩＶＭを誘導してから４４〜４６時間後、卵母細胞は０．１％ヒアルロニダー
ゼを含む５００μｌのＴＬ−ヘプス（TL-Hepes）培養液に移し、ボールテキシン
グ(voltexing)を行って卵丘細胞を取除いた。卵母細胞の透明帯(zona pellucida )をTsunodaらによって記述されたように非常に小さいガラス針で部分的に切開し
た（ J. Exp. Zool., 240:119-125 (1986)）。倒立顕微鏡付きのマイクロマニ
ピュレータを用いて核除去と細胞注入を含む卵母細胞の操作を行った(Leitz, E rnst Leitz Wetzlar GmbH, Germany)。卵母細胞操作の際に用いられた培養液は
サイトカラジンＢ７．５μｇ／ｍｌを含むＤＰＢＳ（−）であった。第１極体
とメタフェイズIIを含む細胞質の一部を内径２０μｍの微細ピペットを用いてと
もに取除いた。核を取除いてから卵子を５μＭビスベンズイミド（Hoechst 33 342）に５分間染色し、蛍光顕微鏡(オリンパス, 東京、日本)で観察した。

【００２４】細胞注入、電気融合および活性化繊維芽細胞を核が取除かれた卵母細胞に各々移植した。柔らかい表面を有し
ている小さいこの細胞は核供与細胞として用いられた。再構成された胚を５０μ
ｌの細胞融合培養液で１０秒〜２０秒間平衡状態を保った。その後細胞融合培養
液中に１ｍｍ間隔の二つの電極で構成された融合チャンバーに移した。細胞融合
培養液は０．３Ｍマンニトール、０．５ｍＭ Hepes、０．０１％ＢＳＡ、０．
１ｍＭＣａＣｌ_２、０．１ｍＭＭｇＣｌ_２で構成されていた。細胞融合は
ＢＴＸ Electro-cellマニピュレータ2001 (BTX, San Diego, CA, USA)を用いて
１６０Ｖ／ｍｍのＤＣパルスを３０μsecの間与えて誘導した。電気融合後、胚
に３Ｖ／ｍｍのＡＣパルスを５秒間、そして１２０Ｖ/ｍｍＤＣパルスを３０
μsec与えて活性化させた。

【００２５】ブタ卵母細胞の単為生殖的な活性化ブタ卵母細胞の単為生殖的な活性化は前述のように行われた（ Wang et al., Mol. Reprod. Dev., 51:346-353 (1998)）。簡単に述べると、卵丘細胞のない卵
母細胞は１分間０．５ｍＭ Hepes、０．０１％ＢＳＡ（脂肪酸を含まない）、
０．０１ｍＭＣａＣｌ_２、０．０１ｍＭＭｇＣｌ_２を含む０．３Ｍマンニ
トール溶液で平衡状態にし、そして、活性化溶液中に１ｍｍ間隔で重ねた二つの
電極で構成された融合チャンバーに移した。卵母細胞を３V／ｍｍのＡＣパルス
に５μsecの間露出させた後、１８０Ｖ／ｍｍのＤＣパルスに３０μsecの間露出
させた。

【００２６】核移植胚の体外培養すべての実験において、活性化された卵子をＢＳＡ４ｍｇ／ｍｌを含むＮ
ＣＳＵ２３培養液５０μｌの滴に、３９℃、空気中５％ＣＯ_２雰囲気下で培養
させた。培養７２時間後、卵割段階にある胚を選択した。４０：５０の比率で卵
割された胚を１０％ＦＢＳを含むＮＣＳＵ２３培養液５０μｌの滴に、３９℃、
空気中５％ＣＯ_２雰囲気下で３日間ともに培養させた。培養６日後、胚盤胞の
形成が観察されたが、その胚盤胞の細胞数をヘキスト 33342 (2.5 ±g/ml)染色
を行った後、蛍光顕微鏡で計数した。

【００２７】核移植胚の細胞数体細胞核移植胚から発達したすべての胚盤胞はヘキスト染色後核を計数した
。胚をＰＢＳ中の１％ホルムアルデヒドで１０分間室温で固定した後、スライド
に固定溶液を一滴滴下した。固定溶液はＰＢＳに２５％（ｖ／ｖ）グリセロール
とアジド化ナトリウム２．５ｍｇ／ｍｌ、そしてヘキスト 33342 ２．５μｇ／
ｍｌで構成されている。胚上にカバースリップを載せ、スライドの端を爪光沢剤
で封じた。核の数は蛍光顕微鏡で計数した（(Olympus, Japan)。

【００２８】以下、本発明を下記実施例によってさらに詳細に説明する。しかし、本発明は
これらによって限定されるものではない。

【００２９】実施例１電気融合後の異なる活性処理がブタの核移植胚の胚盤胞期への体外発達率に影
響を及ぼすかどうかを試験した。電気融合してから２〜３時間後、再構成された
胚の約１／３が同時に異なる活性群に分割された。１）３V／ｍｍＡＣパルス
を５秒間露出した後、１２０Ｖ／ｍｍのＤＣパルスを３０μsecの間与えた胚、
２）カルシウムイグノフォア（ A23187, 5 μM for 5 min）で処理して活性化さ
れた胚、３）A23187（5 μM for 5 min）で処理した後、２ｍＭ６−ＤＭＡＰ
を含むＮＣＳＵ２３で４時間培養した胚。活性化処理後、各群から再構成された
胚を４回洗浄し、ＢＳＡ４ｍｇ／ｍｌを含むＮＣＳＵ２３培養液で培養した。
表１から分かるように、各群間（Ｐ＜０．０５）の卵割比率（58.1±13.9、60.7 ±6.3および74.9±7.5%）および胚盤胞への発達率（2.2±2.8、2.2±1.5および1 1.0±4.1%）は差異を示した。しかし、胚盤胞の平均細胞数(20.5±3.5、26.6±4 .5および26.3±10.3)は著しい差が観察されなかった。このような結果は、核移
植胚の体外発達率において電気パルスがA23187やA23187/6-DMAPで処理したとき
より遥かによい効果をもたらすことを示す。

【００３０】

【表１】試験された胚の数は括弧に示した。

【００３１】実施例２ブタの核移植胚の胚盤胞期への体外発達に対する活性化電圧の影響を試験した。
電気融合してから２〜３時間後、再構成された胚は５秒間３Ｖ／ｍｍＡＣパルス
を与えて活性化した後、１２０Ｖ／ｍｍあるいは１５０Ｖ／ｍｍＤＣパルスに
３０μsecの間露出させた。この２つの群において卵割比率は大差がなかった。
核移植胚の胚盤胞発達率の場合１２０Ｖ／ｍｍ群（ 11.6±1.6%, 14/121）が１
５０Ｖ／ｍｍ群（6.5±2.3%, 8/121）に比べて遥かに高かった（Ｐ＜０．０５）
。しかし、胚盤胞の平均細胞数（ 29.5±11.3、27.6±10.5）は二つの群が同様
であった（Ｐ＜０．０５）。続く実験において、１２０Ｖ／ｍｍＤＣパルスの
みを与えたとき活性化が起こった（表２）。この実験は、電気融合後に最適の活
性化タイミングを決定するために行った（表３）。また、電気融合後活性化タイ
ミングが核移植胚の発達能力に影響を及ぼすかどうかについても調査した。融合
された卵子の約１／３が電気融合後相異する時間（２、４、６時間）で５秒間３
Ｖ／ｍｍＡＣパルスを与え１２０Ｖ／ｍｍＤＣパルスで３０μsecの間露出
させたとき活性化された。核移植胚の卵割比率において２、４時間群が６時間群
より遥かに高かった。また、４時間群（6.6±2.3%, 11/190）や６時間群（8.1±
3.3%, 14/184）に比べて、電気融合してから２時間後活性化された核移植胚群(1 1.6±2.9%, 20/187)のより高い比率でこの胚盤胞期へ発達した。２、４、６時間
群の核移植胚の平均細胞数は各々30.4±10.4、24.6±10.1および16.5± 7.4であ
った。２時間群と６時間群の間で著しい差異を示した（Ｐ＜０．０５）。再構成
された胚が電気融合してから０、３０分、１時間後に活性化されたとき、胚の胚
盤胞期への発達率は各々２．１％（２／９７）、３．２％（２／８５）、１０．
４％（１１／１０６）であった。このような結果は、電気融合後活性化タイミン
グがブタの核移植卵子の発達潜在力に影響を及ぼすことを示す。

【００３２】

【表２】試験された胚の数は括弧に示した。

【００３３】

【表３】試験された胚の数は括弧に示した。

【００３４】実施例３ブタ胎児繊維芽細胞の核移植胚の発達能力は単為生殖的胚やＩＶＦによって得
たブタの胚と比較した。また、ブタの胚丘細胞や繊維芽細胞核移植胚の発達能力
はＩＶＦによって得た胚と比べることができる。繊維芽細胞を用いた核移植胚（9.4く±0.9%, 20/289）は胚盤胞期への発達比
率がＩＶＦによって得た胚（21.4±1.9%, 43/201）や単為生殖的胚（22.4±7.2% , 43/189）より低かった(P<0.01)。しかし、実験群間の胚の卵割比率においては
大差はなかった（表４）。培養６日後、核移植胚から始まった大部分の胚盤胞（
１６／２０）は後にハッチングされた（図１）。しかし、平均核数はＩＶＦによ
って得た胚盤胞のそれより少なかった（図２）。核移植胚盤胞の初期ハッチング
が起こる理由は、核除去過程中透明帯の一部が取除かれたからと思われる。核移
植胚の平均細胞数(28.9±11.5, ranging from 14 to 61, n=18)はＩＶＦによっ
て得た胚盤胞より少なかった(36.2±9.7, ranging from 18 to 67, n=22) (P<0. 05)。これに対し、単為生殖的胚の平均細胞数(29.9±12.1, ranging from 13 to 50, n=24)とは類似した（表４）。この結果は、たとえＩＶＦによって得た胚よ
り発達能力は劣るが、繊維芽細胞を用いたブタの核移植胚が体外で胚盤胞へ発達
できるということを示すものである。ブタ卵母細胞の発達能力をＩＶＦによって得た胚のそれと比較したが（表５）、
ここで、卵丘細胞を用いた核移植はＮＴ^＋、繊維芽細胞を用いた核移植はＮＴ⁺ ⁺ で行った。電気融合後、卵丘細胞および繊維芽細胞と再構成された、核が取除
かれた卵子の融合比率は各々６７％（257/374）と６９％(273/396)であった。し
たがって、この２つのドナー細胞類型間の核移植胚の卵割は大差がなかった。し
かし、２つの細胞類型に由来する核移植胚はＩＶＦによって得た胚より胚盤胞期
への発達比率が低かった（Ｐ＜０．０１）。ＩＶＦによって得た胚盤胞の平均核
数、ＮＴ^＋およびＮＴ⁺⁺ 胚盤胞の平均核数は各々38.6±10.4 (23から65に渡る
)、28.9±11.4 (17から51に渡る)、そして30.2±9.9(１８から５１に渡る)であ
った。このように核移植胚はＩＶＦによって得た胚より少ない核で構成されてい
る(P<0.05)。

【００３５】

【表４】試験された胚の数は括弧に示した。

【００３６】

【表５】ＮＴ^＋は、胚丘細胞を用いた核移植、ＮＴ⁺⁺ は繊維芽細胞を用いた核移植をい
う。表のカラム中の上付き（ａ、ｂ）が異なることは明らかな差異があることを意味
する(胚盤胞：P<0.01、核数：5P<0.05)。試験された胚の数は括弧に示した。

【００３７】実施例４トランスフェクションした細胞核移植胚が胚盤胞に発達し、発達初期に形質転
換を示すかどうかを試験した。ＧＦＰ遺伝子を発現する繊維芽細胞を核が取除か
れた卵母細胞に移植し、再構成された胚に１６０Ｖ／ｍｍＤＣパルスを３０μ
secの間与えて融合した。融合した卵母細胞が活性化し始めると実施例２で述べ
たように培養した。高蛍光顕微鏡(Olympus)で観察したとき、核移植胚において
ＧＦＰの発現が観察された。トランスフェクションされた細胞のブタ核移植卵母
細胞の発達能力は非トランスフェクション細胞のそれと比較した。

【００３８】また、ブタにおいて核移植後トランスフェクション細胞が体外発達能力に影響
を及ぼすかを試験した。ブタの繊維芽細胞に外因性β−アクチンプロモータ/GFP 遺伝子をレトロウイルス感染させ、約２週間G418を処理した後、コロニーが生存
したかどうかを観察した。トランスフェクションした繊維芽細胞におけるＧＦＰ
の発現を高蛍光顕微鏡を用いて確認した（図１Ａ）。トランスフェクションした
繊維芽細胞核移植卵母細胞の融合比率 (67%, 195/292)は非トランスフェクショ
ンした繊維芽細胞のもの (71%, 197/277)と類似した。核移植胚の胚盤胞への発
達比率もまたトランスフェクション細胞と非トランスフェクション細胞の間で大
差はなかった（表６）。図１Ｃに示すように、トランスフェクション細胞に由
来する核移植胚は強いＧＦＰ発現を示した。この結果は、ブタのトランスフェク
ション細胞核移植胚の発達能力が非トランスフェクション細胞核移植胚の発達能
力と類似することを示す。したがって、核移植胚の活性化方法に関する本発明は
、トランスフェクションした細胞から形質転換された核移植胚を生産するのに適
用できる。

【００３９】

【表６】試験された胚の数は括弧に示した。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明によるブタクローン胚の生産過程を示す概略図である。

【図２】形質転換細胞株と複製された形質転換胚を作製するための本発明の実
施態様を示す。（Ａ）は繊維芽細胞のＧＦＰ、（Ｂ）核移植胚盤胞、（Ｃ）光学
顕微鏡で観察した核移植胚である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者イキョンクワン大韓民国テジョン 300−200 ドン−クヨンジョン−ドンシンドンガアパートメント６−1101 (72)発明者クトクボン大韓民国テジョン 305−345 ユソン− クシンソン−ドンラッキーハナアパートメント 110−308 (72)発明者パクジョンソン大韓民国テジョン 305−345 ユソン− クシンソン−ドン 152−１デーリムドーレアパートメント 105−403 (72)発明者カンヨンクック大韓民国テジョン 305−345 ユソン− クシンソン−ドン 152−１デーリムドーレアパートメント 105−403 (72)発明者チェヨンヒ大韓民国テジョン 302−792 ソー−クウォールピョン−ドンワンシル−タウン 103−402 (72)発明者ユデーユル大韓民国テジョン 305−333 ユソン− クウフン−ドンハンビットアパートメント 111−702 Ｆターム(参考） 4B024 AA10 BA80 CA01 DA02 GA11 GA14 HA20 4B065 AA90X AA90Y AB01 BA01 CA60

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】核が取除かれた卵母細胞に電気刺激によってドナー体細胞、ある
いはドナー体細胞核を注入して融合した、核が取除かれたブタ卵母細胞の再構成
工程、および２次電気刺激による前記再構成されたブタ卵母細胞の活性化工程を
含む、体細胞核移植によるブタクローン胚の大量生産方法。
【請求項２】前記核が取除かれた卵母細胞に注入された前記ドナー体細胞、あ
るいはドナー体細胞核が、ヒトを除いた哺乳動物の繊維芽細胞と卵丘細胞からな
る群から得られたトランスフェクションされた体細胞またはトランスフェクショ
ンされた体細胞核であることを特徴とする、請求項１記載の体細胞核移植による
ブタクローン胚の大量生産方法。
【請求項３】前記哺乳動物が、ブタ、ウシ、ヒツジ、マウスであることを特徴
とする請求項２記載の体細胞核移植によるブタクローン胚の大量生産方法。
【請求項４】前記再構成時期が１〜２時間であることを特徴とする、請求項１
記載の体細胞核移植によるブタクローン胚の大量生産方法。
【請求項５】レシピエント細胞質としての前記ブタ卵母細胞は、核を取除く前
に体外成熟させることを特徴とする、請求項１記載の体細胞核移植によるブタク
ローン胚の大量生産方法。
【請求項６】前記ドナー細胞またはドナー細胞核が、胎児組織または成人組織
から得られたものであることを特徴とする請求項１〜３記載の体細胞核移植によ
るブタクローン胚の大量生産方法。
【請求項７】前記２次電気刺激が１２０〜１５０Ｖ／ｍｍＤＣパルスで３０
μsecの間与えることを特徴とする、請求項１記載の体細胞核移植によるブタク
ローン胚の大量生産方法。
【請求項８】ブタの前記ドナー体細胞またはドナー体細胞核が、韓国再来ブタ
（Sus scrofa domesticus L.）から得られたものであることを特徴とする、請求
項１〜３および６記載の体細胞核移植によるブタクローン胚の大量生産方法。