CN102943093B - 一种提高猪体细胞核移植效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高猪体细胞核移植效率的方法，包括以下步骤：S1、选择和培养卵母细胞；S2、分离和培养供体细胞；S3、采用盲吸法去除成熟卵母细胞核及第一极体，注入一个供体细胞于卵周隙中；电融合重构胚并激活重构胚；S4、将重构胚置于含有浓度为100-200μM的RG108和浓度为100-500nM的Scriptaid的PZM-3培养液中培养14-16小时，再将重构胚置于PZM-3培养液中培养；本发明能显著提高猪克隆早期胚胎的发育囊胚率和囊胚质量；同时调节存在紧密联系和协同作用的基因甲基化和乙酰化两大表观遗传修饰，比单独用Scriptaid处理的效果更好，能调节胚胎早期基因表达趋于正常，最终提高猪体细胞核移植效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种动物克隆的方法，具体涉及一种提高猪体细胞核移植效率的方法。
背景技术
体细胞核移植技术是通过显微操作和细胞融合技术，将供体细胞移入去核卵母细胞而构成重构胚，激活重构胚后进行培养和移植，最后达到扩繁同基因型种群的目的。自1997年"Dolly"羊出生以来，体细胞核移植技术相继在多种哺乳动物中获得成功，2000年，Betthauser等优化了猪体细胞核移植的各个步骤，包括卵母细胞来源和体外成熟培养、供体细胞培养、卵的激活、胚胎体外培养和胚胎移植技术，建立了一套相对成熟的猪体细胞核移植程序。但至今，猪体细胞核移植的效率还很低（出生数／所用卵数约为1%-2%），克隆猪常出现不健全的异常表型，如畸形、肺部发育不全、大舌头和早衰等。
在核移植中，体细胞核的基因表达模式必须经历从高度分化的体细胞状态转变成全能性胚胎状态，即表观遗传重编程。主要包括DNA去甲基化和从头甲基化、印记基因模式重编、基因羟甲基化和乙酰化修饰改变等。表观遗传调节分子机制主要通过DNA序列甲基化和组蛋白修饰两大机制来实现。两者能调控染色质的结构和功能从而影响基因的表达。在自然受精过程中，精子会在卵胞质的作用下进行重编程，启动其正常发育。体细胞的表观遗传构造不同于成熟配子，但在受体卵胞质的作用下可明显逆转其高度分化的基因表达模式。检测克隆胚胎时发现一些与胚胎发育相关的关键基因没有被激活或表达水平过低，胚胎呈现DNA过度甲基化和低乙酰化水平，表明基因组重编程不完全。研究已发现供体核不完全重编程造成基因表达异常，是核移植效率低的主要原因。
目前，大量研究采用甲基转移酶抑制剂5-aza-2'-deoxycytidine或去乙酰化酶抑制剂TSA处理核供体细胞或克隆早期胚胎，但这两种药物都具有一定的毒副作用。此法在提高小鼠的体细胞核移植效率上有一定效果，对猪克隆胚胎的发育能力没有显著提高。Scriptaid是一种人工合成的低毒性去乙酰化酶抑制剂，已有相关研究发现培养液中添加500nM的Scriptaid处理猪的克隆早期胚胎能显著提高其体外发育的囊胚率。
发明内容
本发明的发明目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种提高猪体细胞核移植效率的方法。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：一种提高猪体细胞核移植效率的方法，包括以下步骤：
S1、选择和培养卵母细胞；
S2、分离和培养供体细胞；
S3、采用盲吸法去除成熟卵母细胞核及第一极体，注入一个供体细胞于卵周隙中；电融合重构胚并激活重构胚；
S4、将重构胚置于含有浓度为100-200μM的RG108和浓度为100-500nM的Scriptaid的PZM-3培养液中培养14-16小时，再将重构胚置于PZM-3培养液中培养；
本发明筛选到一定浓度的RG108和Scriptaid联合处理克隆早期胚胎，能显著提高猪克隆早期胚胎的发育囊胚率和囊胚质量；同时调节存在紧密联系和协同作用的基因甲基化和乙酰化两大表观遗传修饰，比单独用Scriptaid处理的效果更好，能调节胚胎早期基因表达趋于正常，最终提高猪体细胞核移植效率。
本发明的优选方案，在S2步骤中选取猪耳皮成纤维细胞作为供体细胞；在猪的体细胞核移植中，耳皮成纤维细胞是最为常用的核供体，因为它易于取材和分离，在体外能够进行相对较长时间的传代培养。
本发明的优选方案，分离猪耳皮成纤维细胞包括以下步骤：将猪耳皮组织块剪碎；用DMEM清洗组织碎末后用胎牛血清重悬并转移到培养皿中,37℃、5%CO2、饱和湿度环境中培养；5-7h后添加含10%胎牛血清的DMEM培养液；待细胞长至90%汇合时传代培养；用第3-5代的接触抑制的耳皮成纤维细胞作为核供体。
本发明的优选方案，在S4步骤中，所述RG108的浓度为100-150μM。
本发明的优选方案，在S4步骤中，所述RG108的浓度为100μM。
本发明的优选方案，在S4步骤中，所述Scriptaid的浓度为100-150nM。
本发明的优选方案，在S4步骤中，所述Scriptaid的浓度为100nM。
本发明的优选方案，在S4步骤中，将重构胚置于含有RG108和Scriptaid的PZM-3培养液中培养14小时，再移入PZM-3培养液中培养。
本发明的有益效果，本发明通过在PZM-3培养液添加一定浓度的RG108和Scriptaid联合处理克隆早期胚胎，能显著提高猪克隆早期胚胎发育的囊胚率和囊胚内细胞数。研究中对囊胚等级划分多从轮廓清晰度，细胞质是否致密均匀和形态是否典型来加以评估。囊胚内细胞数多是优质囊胚的一个必备条件。RG108和Scriptaid同时调节存在紧密联系和协同作用的基因甲基化和乙酰化两大表观遗传修饰，比单独用Scriptaid处理的效果更好，能调节胚胎早期基因表达趋于正常，最终提高猪体细胞核移植效率。
附图说明
图1为注入一个供体细胞于卵母细胞卵周隙示意图；(A固定针固定卵母细胞及极体的位置；B去核针去除极体及附近的胞质；C注核针吸取供体细胞；D注核针将供体细胞注入卵周隙中)
图2为荧光显微镜下观察一个囊胚的总细胞数。（A囊胚在白光下的图像；B囊胚的荧光图像）
具体实施方式
未注明具体方法的实验，都按照常见的体细胞克隆技术所述的方法进行操作。
1：猪卵母细胞的体外成熟培养
从屠宰场收集猪卵巢，放入生理盐水中送回实验室。用注射器抽吸直径2-6mm卵泡中的液体。在实体显微镜下挑选卵丘致密且包裹3层以上的卵丘细胞-卵母细胞复合体，39℃、5%CO2、饱和湿度环境中培养42-44h。采用透明质酸酶去除卵丘细胞，挑选排出第一极体的卵母细胞作为核移植受体。
2：猪耳皮成纤维细胞培养
简要无菌操作如下：将猪耳皮组织块剪碎，用DMEM（Gibco）清洗组织碎末后用适量胎牛血清重悬并转移到培养皿中,37℃、5%CO2、饱和湿度环境中培养。5-7h后添加含10%胎牛血清的DMEM培养液，观察组织块周围细胞爬出情况，待细胞长至90%汇合时传代培养。用第3-5代的接触抑制的耳皮成纤维细胞作为核供体。
3：体细胞核移植
采用盲吸法去除成熟卵母细胞核及第一极体，注入一个体细胞于卵周隙中(图1)。150v/mm,100μs,2DC的直流电脉冲诱导融合并激活重构胚，39℃，低氧（5%O2+5%CO2+90%N2）的饱和湿度环境下培养，对照组的胚胎培养于PZM-3中。实验组则在PZM-3培养液添加Scriptaid，或者同时添加RG108和scriptaid。药物处理14-16h后换成PZM-3培养。
4：克隆胚胎发育情况观察
胚胎培养至48h和168h时记录卵裂数和囊胚数。在发育第7天收集囊胚，放入含10μg/mL Hoechst33342的DPBS中染色10min后转移到载玻片上，轻盖上盖玻片使囊胚受压后膨大，用指甲油封片。荧光显微镜下观察囊胚内细胞数,蓝色为囊胚内细胞的核（图2）。采用SAS软件对实验数据进行方差分析，比较不同药物处理组的胚胎早期发育情况，包括其囊胚率和囊胚内细胞数的差异(表1)。
表1
注：统计分析3次重复试验的数据，计算其平均值±标准差。同一列中的不同小写字母代表差异显著（P＜0.05）。
结果表明，使用Scriptaid处理猪克隆胚胎的囊胚率和囊胚内细胞数显著高于对照组。使用100μM RG108和100nM Scriptaid同时处理猪克隆胚胎的囊胚率和囊胚内细胞数显著高于Scriptaid处理组和对照组。使用200μM RG108和500nM Scriptaid同时处理胚胎的囊胚率与Scriptaid处理组差异不显著，但两组间囊胚内细胞数差异显著。
Claims (7)
1.一种提高猪体细胞核移植效率的方法，其特征在于包括以下步骤：
S1、选择和培养猪卵母细胞；
S2、分离和培养供体细胞；
S3、采用盲吸法去除成熟卵母细胞核及第一极体，注入一个供体细胞于卵周隙中；电融合重构胚并激活重构胚；
S4、将重构胚置于含有浓度100-200μM的RG108和浓度100-500nM
的Scriptaid的PZM-3培养液中培养14-16小时，再将重构胚置于PZM-3培养液中培养；
在S2步骤中选取猪耳皮成纤维细胞作为供体细胞。
2.如权利要求1所述的提高猪体细胞核移植效率的方法，其特征在于，选取猪耳皮成纤维细胞作为供体细胞包括以下步骤：将猪耳皮组织块剪碎；用DMEM清洗组织碎末后用胎牛血清重悬并转移到培养皿中, 37℃、5%CO2、饱和湿度环境中培养；5-7h后添加含10%胎牛血清的DMEM培养液；待细胞长至90%汇合时传代培养；用第3-5代的接触抑制的耳皮成纤维细胞作为供体细胞。
3.如权利要求1所述的提高猪体细胞核移植效率的方法，其特征在于：在S4步骤中，所述RG108的浓度为100-150μM。
4.如权利要求1所述的提高猪体细胞核移植效率的方法，其特征在于：在S4步骤中，所述RG108的最佳浓度为100μM。
5.如权利要求1所述的提高猪体细胞核移植效率的方法，其特征在于：在S4步骤中，所述Scriptaid的浓度为100-150nM。
6.如权利要求1所述的提高猪体细胞核移植效率的方法，其特征在于：在S4步骤中，所述Scriptaid的最佳浓度为100nM。
7.如权利要求1所述的提高猪体细胞核移植效率的方法，其特征在于：在S4步骤中，将重构胚置于含有RG108和Scriptaid的PZM-3培养液中培养14小时，再移入PZM-3培养液中培养。
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