CN103074294A

CN103074294A - 一种可提高猪胚胎体外发育效率的猪胚胎培养液及其制备方法

Info

Publication number: CN103074294A
Application number: CN2013100226840A
Authority: CN
Inventors: 张运海; 李运生; 随刘才; 章孝荣; 方富贵; 杨阳; 刘亚; 曹祖兵
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2013-01-22
Filing date: 2013-01-22
Publication date: 2013-05-01

Abstract

本发明公开了一种可提高猪胚胎体外发育效率的猪胚胎培养液，其以PZM-3培养液为基础培养液，并在PZM-3培养液中添加有肌醇。其中，猪胚胎培养液中肌醇的浓度为0.005g/L～0.020g/L；猪胚胎培养液中肌醇的优选浓度为0.010g/L。本发明通过在PZM-3培养液中添加合适浓度的肌醇，能够使孤雌胚或者核移植胚胎激活的过程中，帮助内源性钙离子反复振荡，模拟了自然受精胚胎时的激活状态。PZM-3培养液中添加了肌醇后的胚胎发育状况优于没有添加前的胚胎，这对于猪胚胎的体外生产和培养，建立良好的动物模型等有重要的意义。

Description

一种可提高猪胚胎体外发育效率的猪胚胎培养液及其制备方法

［技术领域］

本发明涉及动物胚胎体外培养液，尤其涉及一种可提高猪胚胎体外发育效率的猪胚胎培养液及其制备方法。

［背景技术］

　　猪的内脏器官大小，生理构造和人的最为接近，随着科学技术的发展，转基因打靶技术的成熟，能够有效的消除物种间的免疫排斥反应（Lai, L., Kolber-SimondsｂProduction of a-1,3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfer cloning. Science　295, 1089–1092），该动物是人工器官移植的最佳供体因此猪已经成为各实验室的主要动物模型，猪体外胚胎的生产和培养体系也日益完善。

体外培养主要包括猪的卵母细胞成熟和胚胎的培养体系。为了确保实验的效果，实验中所使用的培养液的成分和培养的环境（包括温度，气体浓度和湿度），都是尽量模拟母畜生殖道的内环境。

但是由于毕竟是模拟的，所以猪的体外培养体系仍不能完全模仿母畜生殖道的内环境，因此体外胚的培养效果与体内胚的发育效果仍然有一定的差距。母畜生殖道内的液体成分较为复杂，含有大量的激素和生长因子，且这些成分并非恒定，或多或少对猪的胚胎的后期发育有积极地调控作用，而实验室常用的培养液成分相对单一，固定，无法完全模拟母畜生殖道内的液体成分，这也解释了为什么动物的克隆效率比较低。因此实验室内常用的培养液还需通过添加或者调节生长因子，激素等，使其能最佳模拟自然母畜的生殖道内液体，从而使猪胚胎的体外培养体系进一步完善，在实验室内能够得到足够多的优质胚胎，为该动物的后期实验研究提供好的素材。

据研究，肌醇是一种低分子有机物，最初在肌肉中发现，后来已在微生物、动物中广泛发现。几乎所有生物都含有游离态或结合态的肌醇。具有类似微生物B1和生物素的作用，是人和动物正常生理功能的调节中不能缺少的。

有研究表明，在兔自然胚胎的发育过程中，发现随着胚胎的发育，对肌醇的摄取量呈线性上升，胚胎卵裂时对肌醇的运输是通过肌醇钠运输蛋白来实现的（Warner, S. M., F. V. Conlon, Inositol transport in preimplantation rabbit embryos: effects of embryo stage, sodium, osmolality and metabolic inhibitors. Reproduction 125: 479-493）。肌醇可促进兔子孤雌胚的卵裂率和囊胚发育率显著提高（Mitalipov, S.M., K. L. White, Development of nuclear transfer and parthenogenetic rabbit embryos activated with inositol 1,4,5-trisphosphate.Biol Reprod 60: 821-82）。电激活（激活液里含有肌醇和钙离子）后，用6-DMAP处理三小时的激活步骤处理兔子的核移植胚胎时，也得到了较高的囊胚率，且胚胎的总细胞计数多，胚胎凋亡少（Liu, S. Z., M. X. Jiang, Parthenogenetic and nuclear transfer rabbit embryo development and apoptosis after activation treatments. Mol Reprod Dev 72: 48-53）。肌醇能够促进胚胎的后续发育，原因可能是激活时候肌醇能够使重构胚的内源性钙离子反复震荡，这与其自然受精胚胎的激活原理相似，而添加高浓度的钙离子只能使重构胚的内源性钙离子浓度升高，激活效果下降，继而影响胚胎的着床和后期发育（Inoue, K, N.Ogonuki,Improved postimplantation development　of rabbit nuclear transfer embryos by activation with inositol 1,4,5-trisphosphate. Cloning Stem Cells 4: 311-317）。在牛上，肌醇也表现出可以改善牛胚胎体外发育能力（Lim, K. T., G. Jang　Improved in vitro bovine embryo development and increased efficiency in producing viable calves using defined media　Theriogenology 67: 293-302）。由于肌醇成分简单明确，无生物学危害，说明肌醇也许可以作为猪胚胎培养液的一种添加物。

［发明内容］

本发明要解决的技术问题是提供一种用于猪胚胎体外培养且可提高猪胚胎体外发育效率的培养液。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种可提高猪胚胎体外发育效率的猪胚胎培养液，猪胚胎培养液以PZM-3培养液为基础培养液，并在PZM-3培养液中添加有肌醇。

作为优选，猪胚胎培养液中肌醇的浓度为0.005g/L～0.020g/L。

作为优选，猪胚胎培养液中肌醇的浓度为0.010g/L。

本发明要解决的另外一个技术问题是提供一种猪胚胎培养液制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，分别取胚胎培养水50mL溶解0.0096g硫酸镁和0.1232g乳酸钙，待完全融合后将二者混合，并按顺序加入1.2624g氯化纳、0.4212g碳酸氢钠、0.1492g氯化钾、0.0096g磷酸二氢钾、0.0044g丙酮酸钠、0.0292g L-谷氨酸钠、0.1092g亚牛磺酸、0.0020g肌醇、0.0132g青霉素G、0.0100g链霉素、4.0mL氨基酸液、2.0mL非必需氨基酸液、1‰（V/V）酚红，充分混合均匀后用容量瓶添加超纯水定容至200mL，最后添加3mg/mL的BSA，调pH为7.2～7.4，4℃保存。

本发明的有益效果是：

在PZM-3中添加肌醇，然后用于培养体外生产的猪孤雌胚胎和核移植胚胎，进而建立了与对照组相比，胚胎发育能力得到提高的培养系统。

实验结果表明，与对照组培养液（不含肌醇的PZM-3）培养效果对比，当胚胎培养液中添加10μg/mL肌醇时，能够显著提高猪孤雌胚胎的囊胚率(76.1% vs 42.7%，P<0.05)，且孤雌囊胚总细胞数目略有提高；添加了肌醇的培养液也能明显提高猪核移植囊胚所拥有的总细胞数目（45±21 vs 37±19，P<0.05），说明添加肌醇能够显著改善核移植囊胚的质量。综上所述，在胚胎培养液中添加肌醇优化了猪体外胚胎的培养条件，这种含有添加剂的培养体系是成功的。

本发明的关键是在普通胚胎培养液（即PZM－3培养液）中添加了适宜浓度的肌醇（10μg/mL），能够使孤雌胚胎或者核移植胚胎在激活的过程中，帮助内源性钙离子反复振荡，模拟了自然受精胚胎时的激活状态。胚胎培养液中添加了肌醇后的胚胎发育状况优于没有添加前的胚胎，这对于猪胚胎的体外生产和培养，建立良好的动物模型等有重要的意义。

［附图说明］

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明一种猪胚胎培养液实施例的流程方框图。

［具体实施方式］

如图1所示，本实施例通过以下步骤得以实现：体外成熟获得的发育到MⅡ期的卵母细胞孤雌得到孤雌胚胎或者通过核移植技术获得克隆胚胎，将这些胚胎激活后，移入加有10μg/mL肌醇的胚胎培养液中，置于38.5℃，5％CO₂，100％湿度的培养箱中培养，于培养的第二天观察卵裂率，第七天取出胚胎，记录囊胚率，同时用Hoechst 33258染色，记录囊胚总细胞数目。最后通过对数据进行分析，在PZM-3培养液中添加肌醇是否能够促进猪的孤雌胚和核移植胚胎的后期发育，以及是否提高胚胎的质量。

以下是猪体外胚胎培养过程的具体步骤：

（１）猪卵母细胞成熟液的配制：在基础液TCM-199（Earle’s salts）中加入10% PFF（猪卵泡液）、5% FBS、10IU/mL PMSG、10IU/mL hCG、10 ng/mL EGF、100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素配制而成。

（２）猪卵母细胞的获取：将从屠宰场刚摘取的猪卵巢，放入37℃含青霉素和硫酸链霉素的生理盐水中，2h 内运回实验室；取回的卵巢用酒精喷洒消毒一次，无菌生理盐水洗涤3遍，然后用配有18号针头的10 mL一次性塑料注射器抽取卵巢上2～6 mm直径的卵泡，将抽取液注入置于38.5℃恒温水浴锅中的15mL离心管内，抽卵结束后，将离心管放置在38.5℃恒温热台上静置15min，让卵丘卵母细胞复合体（Cumulus-Oocyte Complexes, COCs）自然沉降；弃除离心管中的上清液，并加入洗卵液（DPBS-0.01％PVA）稀释沉淀并混匀，在带有热台的体视镜下捡迅速捡取取胞质均匀，有2层以上且包裹完整的卵丘细胞COCs；

（３）猪卵母细胞的体外成熟：将获得的COCs用成熟液洗3遍后转入在38.5℃，5%CO₂，100％湿度培养箱中平衡4h以上的石蜡油覆盖的成熟培养滴中培养42 ±2 h，每50μL成熟液滴培养 15枚COCs；

（４）猪MⅡ期的卵母细胞的获得：将成熟培养42h后的COCs移入已用37℃预热的含1 mg/ml Hya透明质酸酶的DPBS中，再用移液器轻轻并反复吹打200次（或3min）左右，之后在镜下检查COCs周围卵丘细胞是否已脱除干净，将脱完卵丘的卵母细胞移入T2（含2% FBS的TCM199）液滴洗涤3次，移进矿物油覆盖的T2滴中；挑选卵周隙明显，卵细胞膜完整，且排出第一极体的卵母细胞，即为MⅡ期卵母细胞；

（５）核移植供体细胞的准备：供核细胞采用培养第3～9代胎儿成纤维细胞或耳成纤维细胞体细胞，选择汇合度在60%～90%的细胞，于显微操作前1 h前，按正常细胞传代后，并保在4 ℃冰箱中待用；

（６）核移植胚胎的制备：用T2洗涤冰箱中准备的体细胞，将挑出的MⅡ卵母细胞和体细胞一起放入显微操作皿的核移植操作液中，该核移植操作液为HEPES缓冲的含7.5μg/mL细胞松驰素B（CB）及2%FBS的TCM199，并将操作皿置于38.5℃恒温热台的显微操作台；吸取第一极体及其周围约1/5～1/4可能含有卵母细胞核的胞质，之后用去核针吸取体细胞（直径约15～20 μm，折光性强，圆形，光滑的），从去核切口进入卵母细胞透明带下注核，轻轻点压透明带，使体细胞与胞质膜紧密接触；操作完后将重构卵转移到石蜡油覆盖好的T2液滴中，在38.5℃的恒温箱中中恢复30min；将T2中已恢复好的重构卵移入融合/激活液中洗涤3遍，每批10枚放入已经铺满融合液的融合槽内，使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与与电场方向垂直，用CF-150B融合仪（BLS，匈牙利）施加单个156V/mm，100μs的直流电脉冲(DC)诱导融合同时电激活，随后用PZM-3培养液洗涤3遍，立即转入盖矿物油的PZM-3培养液中，38.5℃，5％CO₂，100％湿度培养1 h后取出，在体视显微镜下判定融合；将判定融合的胚胎，移入化学辅助激活液（PZM-3+10μg /mL CHX+10μg/mL CB）激活4h；

（７）孤雌胚胎的制备：选取MⅡ期的卵母细胞，用38.5℃预热的激活液洗涤3遍，并在其中平衡1～2min；再将平衡好的卵母细胞移入已经铺满激活液，电极宽度为1.0 mm的融合槽中，用1个156V/mm, 100μs的DC进行孤雌激活；电激活后,将卵母细胞用PZM-3+10μg/mL CHX+10μg/mL CB洗涤3～5遍，然后将卵母细胞转移入矿物油覆盖并预先在CO₂培养箱中平4h的的PZM-3+10μg/mL CHX+10μg/mL CB液滴内38.5℃，5% CO₂，100%激活4h；

（８）猪胚胎培养液（以下称为mPZM-3胚胎培养液）的配制：分别取胚胎培养水50mL溶解0.0096g硫酸镁和0.1232g乳酸钙，待完全融合后将二者混合，并按顺序加入1.2624g氯化纳、0.4212g碳酸氢钠、0.1492g氯化钾、0.0096g磷酸二氢钾、0.0044g丙酮酸钠、0.0292g L-谷氨酸钠、0.1092g亚牛磺酸、0.0020g肌醇（Myo-Inositol，实验组添加，对照组不添加）、0.0132g青霉素G、0.0100g链霉素、4.0mL氨基酸液、2.0mL非必需氨基酸液、1‰（V/V）酚红，充分混合均匀后用容量瓶添加超纯水定容至200mL；最后，添加3mg/mL的BSA，调pH为7.2～7.4，4℃保存；

（９）猪体外胚的胚胎培养：将已进行孤雌并激活4h的胚胎或激活后的克隆胚胎，用mPZM-3胚胎培养液洗涤3遍后转入预平衡4h以上的mPZM-3胚胎培养液内，每个培养液50μL，移入10～15个胚胎；在38.5℃，5% CO₂，100%湿度条件下继续培养；

（10）胚胎在培养箱中培养48 h和168 h时后分别记录卵裂和囊胚情况。

通过将本实施例的对照组与实验组的实验结果进行对比，其数据统计结果分别见表1和表2。

表1：在猪的胚胎培养液中添加肌醇(Myo-Inositol)

对猪孤雌胚发育能力的影响

Figure 2013100226840100002DEST_PATH_IMAGE001

注：卵裂率：卵裂数/胚胎数；囊胚率：囊胚数／胚胎数；同一列中含有相邻不同字母上标的表示差异显著(P<0.05)。

表2：在猪的胚胎培养液中添加肌醇(Myo-Inositol)

对猪克隆胚发育能力的影响

实验结果表明，与对照组PZM-3培养液培养效果对比，当PZM－3培养液中添加10μg/mL肌醇时，能够显著提高猪孤雌胚胎的囊胚率(P<0.05)，且孤雌囊胚拥有的总细胞数目略有提高；添加肌醇的培养液能显著提高猪核移植胚胎囊胚的总细胞数目（P<0.05），说明添加肌醇能够提高核移植囊胚的质量。综上所述，在胚胎培养液中添加肌醇优化了猪体外胚胎的培养条件，这种培养体系是成功的。

Claims

1.一种可提高猪胚胎体外发育效率的猪胚胎培养液，其特征在于，所述猪胚胎培养液以PZM-3培养液为基础培养液，并在PZM-3培养液中添加有肌醇。

2.根据权利要求1所述的猪胚胎培养液，其特征在于，所述猪胚胎培养液中肌醇的浓度为0.005g/L～0.020g/L。

3.根据权利要求1所述的猪胚胎培养液，其特征在于，所述猪胚胎培养液中肌醇的浓度为0.010g/L。

4.一种如权利要求1所述的猪胚胎培养液的制备方法，其特征在于，分别取胚胎培养水50mL溶解0.0096g硫酸镁和0.1232g乳酸钙，待完全融合后将二者混合，并按顺序加入1.2624g氯化纳、0.4212g碳酸氢钠、0.1492g氯化钾、0.0096g磷酸二氢钾、0.0044g丙酮酸钠、0.0292g L-谷氨酸钠、0.1092g亚牛磺酸、0.0020g肌醇、0.0132g青霉素G、0.0100g链霉素、4.0mL氨基酸液、2.0mL非必需氨基酸液、1‰（V/V）酚红，充分混合均匀后用容量瓶添加超纯水定容至200mL，最后添加3mg/mL的BSA，调pH为7.2～7.4，4℃保存。