CN105755047A - 一种通过连续克隆获得经基因修饰过的克隆猪的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通过连续克隆获得经基因修饰的克隆猪的方法，属于动物繁殖生物学领域。本发明以已获得的基因修饰猪的组织成纤维细胞为供体，利用体细胞核移植技术把供体细胞导入到去核的猪卵母细胞内构建基因修饰猪重构胚，然后进行电融合和电激活，并在猪胚胎体外培养液中培养3h后移植到发情的代孕母猪输卵管膨大部内，待代孕母猪妊娠约114d后分娩获得批量的基因修饰猪个体。本发明可克服利用基因编辑技术获得的基因修饰个体过程中出现目的基因修饰个体效率低且目的基因修饰个体间差异大的难题，以能够高效批量地生产目的基因表达及表型稳定的基因修饰克隆猪个体。

Description

一种通过连续克隆获得经基因修饰过的克隆猪的方法
技术领域
本发明涉及一种通过连续克隆技术生产经基因修饰过的克隆猪的方法，属于繁殖生物学领域。
背景技术
近年来，基因修饰猪作为人类疾病模型的深入研究构建尚未全面，且存在构建效率低、应用范围狭窄的不足，从动物基因修饰的克隆猪角度建立的动物疾病模型有利于深入地探索人类相关疾病的发病机制、致病机理以及诊疗途径，对人类疾病的临床模型的构建及临床转化应用具有重要的参考价值，尤其通过连续克隆方法获得的经基因修饰的克隆猪作为动物疾病模型的研究更具有来源的可重复性、研究的可靠性以及遗传的稳定性，猪体内的病理环境、生理状况、生化机制以及在疾病的发生发展过程机制方面都与人类十分接近，利用该方法建立的基因修饰克隆猪模型为人类相关疾病的研究提供了重要的模型参考。
目前，猪的基因打靶技术虽能改变动物特定基因表达模式，但是操作极为困难，猪的转基因技术虽然操作简单，周期短，但是获得经目的基因修饰过的猪个体效率低，且个体间差异大，很难达到预期的效果。
因此，需对现有的技术进行改进，设计出一种效率高、重复性好、实用性强、能高效批量生产目的基因表达和表型稳定的基因修饰猪个体的方法。
发明内容
针对以上技术问题，本发明提供了一种通过连续克隆获得经基因修饰过的克隆猪的方法，本方法通过连续克隆技术对经目的基因修饰过的猪进行连续克隆，成功批量地获得了经目的基因修饰过的克隆猪，该方法技术可靠，效率高、重复性好、实用性强、能高效批量生产目的基因表达和表型稳定的基因修饰猪个体，便于建立可靠的动物疾病模型及科学地验证相关基因的功能。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种通过连续克隆获得经基因修饰过的克隆猪的方法，按照以下步骤进行：
第一步、基因修饰猪成纤维供体细胞的培养与细胞系的建立
获取刚出生的基因修饰猪的组织，建立基因修饰猪成纤维细胞系并进行传代培养；
第二步、卵母细胞的准备
从屠宰场收集的母猪卵巢，保存在适温生理盐水中运送回实验室，挑取猪的卵母细胞并进行体外成熟培养；
第三步、重构胚的构建
卵母细胞经过体外成熟培养后，用0.1mg.mL-1的透明质酸钠去除卵母细胞外围的卵丘细胞，将排出第一极体的卵母细胞放入预处理液中处理0.5～1h后移入卵母细胞操作液中，用显微注射针将极体及其周围胞质一起去除，然后将经基因修饰的猪成纤维供体体细胞导入去核的卵母细胞的卵间隙中，移出注射针，并轻轻按压供体细胞上方的透明带，使供体细胞与卵母细胞膜紧贴，获得重构胚；
第四步、重构胚的电融合、电激活及体外培养
1)重构胚的电融合和电激活；
2)重构胚的体外培养；
第五步、胚胎移植及基因修饰克隆猪的获取
选取自然发情的母猪作为胚胎移植的代孕母猪，将重构胚用胚胎移植管移植到即将排卵或已排卵的两侧输卵管膨大部位后进行发育，妊娠114d后代孕母猪分娩获得基因修饰的克隆猪。
进一步，作为优选，在第一步基因修饰猪成纤维供体细胞的培养与细胞系的建立中，进行细胞传代培养前细胞消化离心转速为1000rpm，时间为5min。
进一步，作为优选，第三步中预处理液为NCSU23中含0.1μg.mL-1秋水仙胺、0.05mol.L-1蔗糖和4mg.mL-1BSA。操作液为10μmol.L-1Hepes和0.3％聚乙烯吡咯烷酮含有0.1μg.mL-1秋水酰胺、5μg.mL-1细胞松弛素。
进一步，作为优选，第四步1)中，重构胚的电融合参数为：25V/mm×20μs×1次，电激活参数为：150V/mm×100μs×1次，电融合液的组成为：0.25mol/LD-山梨醇、0.05mmol/LMg(C2H3O2)2、20mg/mlBSA、0.5mmol/LHEPES，电激活液的组成为：0.25mol/LD-山梨醇、0.01mmol/LCa(C2H3O2)2、0.05mmol/LMg(C2H3O2)2、0.1mg/mlBSA。
本发明的有益效果：
本发明通过体细胞的连续克隆技术获得了经基因修饰过的克隆猪，在一定程度上克服了现有的基因编辑重组技术修饰效率低、个体差异大的难题，而且可以实现目的基因表达个体猪的批量生产和稳定遗传表达，具有了基因修饰猪个体基因表型的稳定性和可重复性，为深入的相关目的基因的功能及致病机理的研究提供了可靠的模型，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为本发明的结构示意图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
如图1所示，一种通过连续克隆获得经基因修饰过的克隆猪的方法，具体操作过程按以下步骤进行：
第一步、基因修饰猪成纤维供体细胞的培养与细胞系的建立
基因修饰猪刚出生时，用酒精对耳部擦拭消毒，挑选耳组织上血管较细少的部位，用手术剪取一块猪耳组织，在细胞超菌工作台上经过前期处理后建立基因修饰猪成纤维细胞系并进行传代培养。
第二步、卵母细胞的准备
从屠宰场收集的母猪卵巢，保存在适温生理盐水中运送回实验室，挑取猪的卵母细胞并进行体外成熟培养。
第三步、重构胚的构建
卵母细胞经过体外成熟培养后，用0.1mg.mL-1的透明质酸钠去除卵母细胞外围的卵丘细胞，将排出第一极体的卵母细胞放入预处理液中处理0.5～1h后移入卵母细胞操作液中，用显微注射针将极体及其周围胞质一起去除，然后将经基因修饰的猪成纤维供体体细胞导入去核的卵母细胞的卵间隙中，移出注射针，并轻轻按压供体细胞上方的透明带，使供体细胞与卵母细胞膜紧贴，获得重构胚。
第四步、重构胚的电融合、电激活及体外培养
1)重构胚的电融合和电激活
将重构胚移入融合液中清洗三遍，进行重构胚的电融合处理，完成后移入NCSU23培养基中培养2h，再把待孤雌激活的卵母细胞在激活液中清洗三遍，然后进行电激活，完成后重构胚移入CB培养液中后放入含有5％CO2、5％O2、38.5℃的三气培养箱中平衡2h。
2)重构胚的体外培养
将已平衡好的重构胚胎移入到PZM3培养液中，置于三气培养箱中培养至胚胎移植。
第五步、胚胎移植及基因修饰克隆猪的获取
选取自然发情的母猪作为胚胎移植的代孕母猪，将重构胚用胚胎移植管移植到即将排卵或已排卵的两侧输卵管膨大部位后进行发育，妊娠约114d后代孕母猪分娩获得基因修饰的克隆猪。
实施例2
如图1所示，一种通过连续克隆获得经基因修饰过的克隆猪的方法，具体操作过程按以下步骤进行：
第一步、基因修饰猪成纤维供体细胞的培养与细胞系的建立
新生的转Leptin基因猪刚出生时，用酒精对耳部擦拭消毒，挑选耳组织上血管较细少的部位，用手术剪取一块猪耳组织，放入含200IU/mLPencillin-StreptomycinSolution的PBS中，立即带回实验室。
在细胞超菌工作台上浸入70％的酒精中处理10～30s后置于无菌培养皿中去毛，再用含100IU/mLPencillin-StreptomycinSolution的无菌PBS清洗5～10遍后充分剪碎，加入PBS冲洗后转入50ml培养瓶中，使剪碎的组织块均匀铺在培养瓶底部并去除多余的液体，翻转培养瓶加入适量的含有10％FBS的DMEM/F12培养基，放入37℃、5％CO2的培养箱中培养4-6h，取出并翻转培养瓶，使培养基没过组织块，再放回培养箱中继续培养，待细胞增殖至接近汇合时，吸出培养液，用PBS冲洗3遍，向瓶内加入适量0.25％的胰蛋白酶，5min后加入适量含2％FBS的DMEM/F12培养液终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，离心(1500rpm，5min)后去上清液，用适量DMEM/F12培养液制成细胞悬液，按5×104个/mL的密度传代培养。
第二步、卵母细胞的准备
从屠宰场收集的母猪卵巢并在4h内运回实验室。挑选直径约为3～6mm的卵泡从中抽取卵丘-卵母细胞复合体，放入添加0.1mg.ml-1丙酮酸、0.1mg.ml-1L-半胱氨酸盐酸、10％猪卵泡液、10ng.mL-1EGF的TCM-199成熟培养液滴中，在5％CO2，38.5℃的培养箱中培养38-42h。
第三步、重构胚的构建
卵母细胞经过体外成熟培养后，用0.1mg.mL-1的透明质酸钠去除卵母细胞外围的卵丘细胞，将排出第一极体的卵母细胞放入预处理液中处理0.5～1h后移入卵母细胞操作液中，用显微注射针将极体及其周围胞质一起去除，然后将经基因修饰的猪成纤维供体体细胞导入去核的卵母细胞的卵间隙中，移出注射针，并轻轻按压供体细胞上方的透明带，使供体细胞与卵母细胞膜紧贴，获得重构胚。
第四步、重构胚的电融合、电激活及体外培养
1)重构胚的电融合和电激活
将重构胚移入融合液的参数设定为脉冲电压25V/mm、脉冲持续20μs、脉冲次数1次，进行重构胚的融合。移入PZM3培养基中培养2h，然后放入激活液中，在脉冲电压150V/mm、脉冲时间持续100μs、脉冲次数1次参数下进行电激活。重构胚移入含有2.2ug.mL-1CB的PZM3培养液中后放入于5％CO2、5％O2、38.5℃的三气培养箱中平衡2h。
2)重构胚的体外培养
将已平衡好的重构胚胎移入到PZM3培养液中，置于三气培养箱中培养至胚胎移植。
第五步、胚胎移植及基因修饰克隆猪的获取
选取自然发情的母猪作为胚胎移植的代孕母猪，将重构胚用胚胎移植管移植到即将排卵或已排卵的两侧输卵管膨大部位后进行发育，妊娠约114d后代孕母猪分娩获得基因修饰的克隆猪。
在第一步中，进行细胞传代培养前细胞消化离心转速为1000rpm，时间为5min。
在第三步中预处理液为NCSU23中含0.1μg.mL-1秋水仙胺、0.05mol.L-1蔗糖和4mg.mL-1BSA。操作液为10μmol.L-1Hepes和0.3％聚乙烯吡咯烷酮含有0.1μg.mL-1秋水酰胺、5μg.mL-1细胞松弛素。
在第四步1)中，重构胚的电融合参数为：25V/mm×20μs×1次，电激活参数为：150V/mm×100μs×1次，电融合液的组成为：0.25mol/LD-山梨醇、0.05mmol/LMg(C2H3O2)2、20mg/mlBSA、0.5mmol/LHEPES，电激活液的组成为：0.25mol/LD-山梨醇、0.01mmol/LCa(C2H3O2)2、0.05mmol/LMg(C2H3O2)2、0.1mg/mlBSA。
本实施例在实施例1的基础上，通过对一些关键技术参数的限定和优化，使实验方法更加科学合理，实验的成功率更高，更利于相关技术人员理解，同时，在这个参数的选择下，能够批量地获得经目的基因修饰的克隆猪个体，对于相关基因功能验证研究及相关动物模型的建立具有重要的参考意义，在一定程度上克服了现有的基因编辑技术中存在的效率低、基因表型稳定性差甚至不表达的难题，为开展基因相关功能的研究提供了可靠的方法。
本发明通过体细胞的连续克隆技术获得了经基因修饰过的克隆猪，在一定程度上克服了现有的基因编辑重组技术修饰效率低、个体差异大的难题，而且可以实现目的基因表达个体猪的批量生产和稳定遗传表达，具有了基因修饰猪个体基因表型的稳定性和可重复性，为深入的相关目的基因的功能及致病机理的研究提供了可靠的模型，具有重要的应用价值。
最终，以上实施例和附图仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (4)

1.一种通过连续克隆技术生产经基因修饰过的克隆猪的方法，其特征在于，通过连续克隆获得经基因修饰过的克隆猪按照以下操作步骤进行：
第一步、基因修饰猪成纤维供体细胞的培养与细胞系的建立
获取刚出生的基因修饰猪的组织，建立基因修饰猪成纤维细胞系并进行传代培养；
第二步、卵母细胞的准备
从屠宰场收集的母猪卵巢，保存于适温生理盐水中运送回实验室，挑取猪的卵母细胞并进行体外成熟培养；
第三步、重构胚的构建
卵母细胞经过体外成熟培养后，用0.1mg.mL-1的透明质酸钠去除卵母细胞外围的卵丘细胞，将排出第一极体的卵母细胞放入预处理液中处理0.5～1h后移入卵母细胞操作液中，用显微注射针将极体及其周围胞质一起去除，然后将经基因修饰的猪成纤维供体体细胞导入去核的卵母细胞的卵间隙中，移出注射针，并轻轻按压供体细胞上方的透明带，使供体细胞与卵母细胞膜紧贴，获得重构胚；
第四步、重构胚的电融合、电激活及体外培养
1)重构胚的电融合和电激活
将重构胚移入融合液中清洗三遍，进行重构胚的电融合处理，完成后移入NCSU23培养基中培养2h，再把待孤雌激活的卵母细胞在激活液中清洗三遍，然后再进行电激活，完成后重构胚移入CB培养液中后放入含有5％CO2、5％O2、38.5℃的三气培养箱中平衡2h；
2)重构胚的体外培养
将已平衡好的重构胚胎移入到PZM3培养液中，置于三气培养箱中培养至胚胎移植；
第五步、胚胎移植及基因修饰克隆猪的获取
选取自然发情的母猪作为胚胎移植的代孕母猪，将经过电融合和电激活培养后的重构胚用胚胎移植管移植到即将排卵或已排卵的两侧输卵管膨大部位后进行发育，妊娠114d后代孕母猪分娩获得基因修饰的克隆猪。
2.根据权利要求1所述的一种通过连续克隆技术生产经基因修饰过的克隆猪的方法，其特征在于：在第一步中，进行细胞传代培养前细胞消化离心转速为1000rpm，时间为5min。
3.根据权利要求1所述的一种通过连续克隆技术生产经基因修饰过的克隆猪的方法，其特征在于：在第三步中预处理液为NCSU23中含0.1μg.mL-1秋水仙胺、0.05mol.L-1蔗糖和4mg.mL-1BSA。操作液为10μmol.L-1Hepes和0.3％聚乙烯吡咯烷酮含有0.1μg.mL-1秋水酰胺、5μg.mL-1细胞松弛素。
4.根据权利要求3所述的一种通过连续克隆技术生产经基因修饰过的克隆猪的方法，其特征在于：在第四步1)中，重构胚的电融合参数为：25V/mm×20μs×1次，电激活参数为：150V/mm×100μs×1次，电融合液的组成为：0.25mol/LD-山梨醇、0.05mmol/LMg(C2H3O2)2、20mg/mlBSA、0.5mmol/LHEPES，电激活液的组成为：0.25mol/LD-山梨醇、0.01mmol/LCa(C2H3O2)2、0.05mmol/LMg(C2H3O2)2、0.1mg/mlBSA。
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