CN105238817B - 一种构建过量表达Leptin基因的克隆猪的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种构建过量表达Leptin基因的克隆猪的方法，属于分子生物学领域；该方法主要包括pLeptin‑IRES2‑EGFP1过量表达载体的构建、过量表达pLeptin‑IRES2‑EGFP1质粒的转染，筛选并获得过量表达Leptin基因的阳性细胞系，再利用体细胞核移植技术构建转Leptin基因的重构胚，将重构胚移植到代孕母猪体内继续发育后获得转Leptin基因的克隆仔猪，取转Leptin基因克隆猪组织做过量表达验证，后期再进行转Leptin克隆猪的病理学观察和鉴定。本发明实现了Leptin基因在猪上的过量表达，该方法操作性简单、可靠性高，具有较高的实用性，为人类研究与Leptin基因功能相关代谢疾病的分子机理提供了可靠的模型和重要的参考意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种构建过量表达Leptin基因的克隆猪的方法，属于分子生物学领域。
背景技术
Leptin蛋白是由肥胖基因(ob)编码，由脂肪细胞分泌的一种蛋白类激素，为非糖蛋白。它由167个氨基酸组成，进入机体血液循环后，N末端的21个氨基酸的信号肽被去除，形成含146个氨基酸的成熟瘦素，在血液中游离或参与瘦素结合蛋白结合，到达中枢和外周与多种受体结合而发挥生物学效应。从而在一定程度上可调节动物的摄食、能量利用、生长、繁殖和免疫机能。因此，研究Leptin基因对于阐明动物脂肪代谢和肌肉发育过程具有重要的意义。
基因过量表达就是采用加强启动子和增强子等调控元件的功能来增强基因的表达量，促使其特异地、高效地表达特定基因，为研究相关基因功能提供了一种可行的途径。
人类疾病的深入研究治疗也离不开实验动物疾病模型，尤其是在基因药物的开发方面，动物模型更具有重要的应用价值，而猪在体型大小、生理状况、器官发育以及疾病发展过程方面都与人类极为相似，价格也便宜，是一种合适可靠的动物疾病模型。
本发明以研究Leptin基因的表达量为切入点，通过体外构建Leptin基因的过量表达载体，利用实验室现有的克隆转基因技术，成功地实现了Leptin基因在猪上的过量表达，建立了Leptin基因过量表达的动物模型，为人类与Leptin相关基因表达量调控、分子代谢调控的致病机理以及治疗策略研究提供了重要的参考应用价值。
发明内容
为了克服现有动物模型的不足，针对上述问题，本发明提供了一种构建过量表达Leptin基因的克隆猪的方法，通过构建过量表达Leptin基因的载体，利用体细胞转基因克隆技术，使Leptin基因在猪体内实现过量表达，最终获得了过量表达Leptin基因的克隆猪。
为了达到上述目的，本发明提出如下技术方案：
一种构建过量表达Leptin基因的克隆猪的方法，主要按照以下步骤进行：
第一步、构建Leptin基因过量表达载体
1)用PCR法扩增目的Leptin基因并对胶进行回收，并将Leptin片段连接到pMD18-T载体上，得到重组质粒pMD18-Leptin；
2)酶切pIRES2-AcGFP1载体和pMD18-Leptin载体，利用胶回收试剂盒对所需的片段大小进行回收，将Leptin连接到pIRES2-AcGFP1载体上，得到重组质粒pLeptin-IRES2-AcGFP1；
3)采用试剂盒法制备无内毒素的质粒DNA，用于细胞转染，并对pLeptin-IRES2-AcGFP1载体进行回收和纯化，-20℃保存备用；
第二步、猪胎儿成纤维细胞转染、筛选
1)利用组织消化法建立猪30日龄胎儿成纤维细胞系，冻存备用；
2)复苏冻存备用的胎儿成纤维细胞系，进行G418毒性敏感性检测，得到10天内使细胞全部死亡的最适浓度500ng/ul；
3)再次复苏细胞，待细胞汇合度达到80-90％时收集细胞并计数，将细胞用电击缓冲液重悬，并加入30ug线性化转基因载体pLeptin-IRES2-AcGFP1，移入电击杯中进行转染；
4)电击完成后，将细胞悬液迅速转移到100mm培养皿中进行培养，48h后收集细胞进行初步鉴定和极度稀释培养；
5)根据步骤2)中得到的最适浓度，在极度稀释培养3天后换液，开始用加有适当浓度G418的含有10％FBS的DMEM完全培养基进行培养，每隔3天换一次液，10d后能得到牛津杯大小的单克隆点；
6)在显微镜下用记号笔画出单克隆点的位置，胰酶消化法抠出单克隆点放入48孔板中进行培养，第二天换加有一半浓度G418的DMEM完全培养基(含10％FBS)进行培养，每天观察细胞生长状况，将长满的细胞详细编号并传代至另外一个48孔板，一份用于鉴定是否是阳性，一份用于扩大培养；
7)待用于鉴定的细胞长满后，用胶原酶消化法收集细胞，提取基因组DNA，PCR鉴定是否是阳性,对鉴定出来的阳性细胞系进行扩大培养和冻存备用；
第三步、Leptin细胞的核移植及胚胎移植
1)受体卵母细胞的培养
a、从屠宰场采集猪的卵巢并在4h内运回实验室；
b、挑选直径为3-6mm的卵泡从中抽取卵丘-卵母细胞复合体，放入TCM-199成熟培养液滴中，在5％CO2，38.5℃的培养箱中培养38-42h；
2)构建过量表达Leptin基因的重构胚
a、取转入Leptin基因的成纤维细胞，用含有0.5％FBS的DMEM培养48h,使体细胞处于G0或G1期；
b、卵丘-卵母细胞复合体经体外成熟培养后，用0.1mg.mL-1透明质酸去除卵母细胞外围的卵丘细胞，将排出第一极体的卵母细胞放入预处理液中处理0.5-1h，在操作液中用显微注射针将极体及其周围胞质一起吸去，然后将转Leptin基因的成纤维体细胞导入到去核的卵母细胞的卵间隙中；
3)电融合和电激活重构胚
再将每批20枚重构胚胎，移入融合液中清洗三遍，进行重构胚的电融合处理；完成后移入NCSU23培养基中培养2h，再把待孤雌激活的卵母细胞在激活液中清洗三遍，然后进行电激活，重构胚移入含有2.2ug.mL-1CB的培养液中后放入含有5％CO2、5％O2、38.5℃的三气培养箱中平衡2h；
4)重构胚的体外培养
将已平衡好的重构胚胎移入到PZM3培养液中，置于三气培养箱中培养至胚胎移植；
5)将重构胚移植到自然发情的代孕母猪内继续发育，代孕母猪妊娠114天后获得转Leptin基因的克隆仔猪；
第四步、转Leptin基因克隆仔猪的过量表达验证
利用设计好的GFP引物和Leptin引物对转Leptin克隆仔猪的DNA和RNA进行验证；
作为优选，进一步，体外重组Leptin基因通过线性化过量表达质粒载体pLeptin-IRES2-AcGFP1来特异地增强基因的表达量。
作为优选，进一步，在第一步构建Leptin基因过量表达载体中，在重组Leptin基因过量表达载体pLeptin-IRES2-AcGFP1时，在对pIRES2-AcGFP1载体和pMD18-Leptin载体进行酶切重组时，采用SalⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，其具体步骤为：
a、PCR扩增体系：
b、pMD18-Leptin载体的构建按下列体系在16℃的恒温金属浴中连接2h进行：
c、SalⅠ和EcoRⅠ双酶切pIRES2-AcGFP1载体和pMD18-Leptin，时间为2h，其反应条件如下：
d、将Leptin和pIRES2-EGFP1连接反应体系如下，反应条件为16℃的恒温
金属浴中连接2h；
作为优选，进一步，在第二步猪胎儿成纤维细胞转染、筛选过程中，在第3)步中再次复苏细胞时，加入30ug leptin过量表达载体pLeptin-IRES2-AcGFP1后，移入电击杯中，按照如下参数进行转染：方波，电压250V，电击时间20ms，电击次数1次，电击间隔时间0s，电击杯厚度4mm。
作为优选，进一步，在第三步Leptin细胞的核移植及胚胎移植中，进行受体卵母细胞的培养时，挑选直径为3-6mm的卵泡从中抽取卵丘-卵母细胞复合体，放入添加0.1mg.ml-1丙酮酸、0.1mg.ml-1L-半胱氨酸盐酸、10％猪卵泡液、10ng.mL-1EGF的TCM-199成熟培养液滴中，在5％CO2，38.5℃的培养箱中培养38-42h。
作为优选，进一步，在第三步Leptin细胞的核移植及胚胎移植中，进行电融合和电激活重构胚时，，电融合参数为：25V/mm脉冲电压，脉冲时程20μs，脉冲次数1次；电激活参数为：150V/mm脉冲电压，脉冲时程100μs，脉冲次数1次，重构胚再移入含2.2ug.mL-1CB的培养液中后放入含有5％CO2、5％O2、38.5℃的三气培养箱中平衡培养。
本发明的最终目的是建立克隆猪动物模型进行与Leptin基因功能相关的研究，以研究Leptin基因的表达量为切入点，通过体外构建Leptin基因过量表达载体，利用体细胞核移植克隆转基因技术，成功实现了Leptin基因在猪体内的过量表达，用该种方法建立的动物模型为研究人类Leptin基因的表达调控及基因功能具有重要的参考意义。
本发明的有益效果：
1、本发明通过分子克隆相关技术构建出来的pLeptin-IRES2-AcGFP1真核表达载体，具有特异地、高效地增强基因表达量的效果，实现了Leptin基因的过量表达，操作方法简单，与传统的构建方法相比，简化了构建过程中目的基因编码蛋白系列的合成步骤；
2、本发明的最终目的是建立克隆猪动物模型进行与Leptin基因功能相关的研究，该发明以研究Leptin基因的表达量为切入点，通过体外构建Leptin基因过量表达载体，利用体细胞核移植克隆转基因技术，成功实现了Leptin基因在猪体内的过量表达，用该种方法建立的动物模型为研究人类Leptin基因的表达调控提供了重要的参考以及和应用前景；
3、本发明中选取猪作为Leptin基因过量表达的研究对象，而猪在体型大小、解剖结构、生理生化上与人极为相似，这就为人类Leptin基因功能所调控的疾病研究奠定了基础，对于由Leptin基因表达调控所建立的动物模型在人类相关疾病的治疗中的推广应用具有重要的指导意义。
4、本发明通过对现有的实验室技术进行创造性改进，在培养过程中实现参数进行优化选择，可快速高效的使Leptin基因在大约克猪体内实现过量表达，最终获得过量表达Leptin基因的克隆猪，成功率高，缩短培养周期，操作简单、可控性高，实用性强。
附图说明
图1为本发明的流程图。
图2为pLeptin-IRES2-AcGFP1表达载体的构建流程图。
图3为转Leptin基因载体的验证图，其中1为经过EcoRI和SalI双酶切后的胶图，2为PCR扩增后的胶图，大小均为530bp。
图4为转Leptin基因测序鉴定图。
图5为出生的14头转Leptin基因克隆猪基因组DNA的鉴定图。
图6为转Leptin基因克隆猪提起RNA反转录PCR鉴定图，其中A图是以β-actin基因作为目标进行扩增的结果，B图是以GFP基因作为目标进行扩增结果，C图是以leptin基因作为目标进行扩增结果。
图7为Leptin基因在肝脏、胰腺、肌肉、皮下脂肪、睾丸等组织中的表达情况。
图8为Leptin基因在大肠、空肠、回肠、十二指肠等组织中的表达情况。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种构建过量表达Leptin基因的克隆猪的方法，主要按照以下步骤进行：
第一步、构建Leptin基因过量表达载体
1)用PCR法扩增目的Leptin基因并对胶进行回收，并将Leptin片段连接到pMD18-T载体上，得到重组质粒pMD18-Leptin；
2)酶切pIRES2-AcGFP1载体和pMD18-Leptin载体，利用胶回收试剂盒对所需的片段大小进行回收，将Leptin连接到pIRES2-AcGFP1载体上，得到重组质粒pLeptin-IRES2-AcGFP1；
3)采用试剂盒法制备无内毒素的质粒DNA，用于细胞转染，并对pLeptin-IRES2-AcGFP1载体进行回收和纯化，-20℃保存备用；
第二步、猪胎儿成纤维细胞转染、筛选
1)利用组织消化法建立猪30日龄胎儿成纤维细胞系，冻存备用；
2)复苏冻存备用的胎儿成纤维细胞系，进行G418毒性敏感性检测，得到10天内使细胞全部死亡的最适浓度500ng/ul；
3)再次复苏细胞，待细胞汇合度达到80-90％时收集细胞并计数，将细胞用电击缓冲液重悬，并加入30ug线性化转基因载体pLeptin-IRES2-AcGFP1，移入电击杯中进行转染；
4)电击完成后，将细胞悬液迅速转移到100mm培养皿中进行培养，48h后收集细胞进行初步鉴定和极度稀释培养；
5)根据步骤2)中得到的最适浓度500ng/ul，在极度稀释培养3天后换液，开始用加有适当浓度G418的含有10％FBS的DMEM完全培养基进行培养，每隔3天换一次液，10d后能得到牛津杯大小的单克隆点；
6)在显微镜下用记号笔画出单克隆点的位置，胰酶消化法抠出单克隆点放入48孔板中进行培养，第二天换加有一半浓度G418的DMEM完全培养基(含10％FBS)进行培养，每天观察细胞生长状况，将长满的细胞进行详细编号并传代至另外一个48孔板，一份用于鉴定是否是阳性，一份用于扩大培养；
7)待用于鉴定的细胞长满后，用胶原酶消化法收集细胞，提取基因组DNA，PCR鉴定是否是阳性,对鉴定出来的阳性细胞系进行扩大培养和冻存备用；
第三步、Leptin细胞的核移植及胚胎移植
1)受体卵母细胞的培养
a、从屠宰场采集猪的卵巢并在4h内运回实验室；
b、挑选直径为3-6mm的卵泡从中抽取卵丘-卵母细胞复合体，放入TCM-199成熟培养液滴中，在5％CO2，38.5℃的培养箱中成熟培养38-42h；
2)构建过量表达Leptin基因的重构胚
a、取转入Leptin基因的成纤维细胞，用含有0.5％FBS的DMEM培养48h,使体细胞处于G0或G1期；
b、卵丘-卵母细胞复合体经体外成熟培养后，用0.1mg.mL-1透明质酸去除卵母细胞外围的卵丘细胞，将排出第一极体的卵母细胞放入预处理液中处理0.5-1h，在操作液中用显微注射针将极体及其周围胞质一起吸去，然后将转Leptin基因的成纤维体细胞导入到去核的卵母细胞的卵间隙中；
3)电融合和电激活重构胚
再将每批约20枚重构胚胎，移入融合液中清洗三遍，进行重构胚的电融合处理；完成后移入NCSU23培养基中培养2h，再把待孤雌激活的卵母细胞在激活液中清洗三遍，然后进行电激活，重构胚移入含有2.2ug.mL-1CB的培养液中后放入含有5％CO2、5％O2、38.5℃的三气培养箱中平衡2h；
4)重构胚的体外培养
将已平衡好的重构胚胎移入到PZM3培养液中，置于三气培养箱中培养至胚胎移植；
6)将重构胚移植到自然发情的代孕母猪内继续发育，代孕母猪妊娠114天后获得转Leptin基因的克隆仔猪；
第四步、转Leptin基因克隆仔猪的过量表达验证
利用设计好的GFP引物和Leptin引物对转Leptin克隆仔猪的DNA和RNA进行验证。
本发明实施例1可建立克隆猪动物模型进行与Leptin基因功能相关的研究，以研究Leptin基因的表达量为切入点，通过体外构建Leptin基因过量表达载体，利用体细胞核移植克隆转基因技术，成功实现了Leptin基因在猪体内的过量表达，用该种方法建立的动物模型为研究人类Leptin基因的表达调控提供了重要的参考以及和应用前景；本发明中选取猪作为Leptin基因过量表达的研究对象，而猪在体型大小、解剖结构、生理生化上与人极为相似，这就为人类Leptin基因功能所调控的疾病研究奠定了基础，对于由Leptin基因表达调控所建立的动物模型在人类相关疾病的治疗中的推广应用具有重要的指导意义。
实施例2：
一种构建过量表达Leptin克隆猪的方法，具体操作步骤的实施例如下：
第一步，构建Leptin基因过量表达载体
1)采用PCR法扩增目的Leptin基因
PCR扩增体系：
反应程序：预变性95℃5min，变性95℃30s，退火55℃45s，延伸72℃1min，终延伸72℃10min，循环30次。
2)将上述扩增得到的Leptin片段连接到pMD18-T载体上，得到重组质粒pMD18-Leptin
其反应体系为：
反应时间为2h。
3)用SalⅠ和EcoRⅠ双酶切pIRES2-AcGFP1载体和pMD18-Leptin载体，利用胶回收试剂盒对所需的片段大小进行回收，将Leptin连接到pIRES2-AcGFP1载体上，得到重组质粒pLeptin-IRES2-AcGFP1,图2为pLeptin-IRES2-AcGFP1表达载体构建流程图。
双酶切体系：
连接反应体系：
第二步、猪胎儿成纤维细胞转染、筛选
1)组织消化法建立猪30日龄胎儿成纤维细胞系，冻存备用；
2)复苏冻存备用的胎儿成纤维细胞系，进行G418毒性敏感性检测，得到10天内使细胞全部死亡的最适浓度500ng/ul；
3)再次复苏细胞，待细胞汇合度达到80-90％时收集细胞并计数，将细胞用电击缓冲液重悬，并加入30ug Leptin过表达载体，移入电击杯中，按照如下参数进行转染：方波，电压250V，电击时间20ms，电击次数1次，电击间隔时间0s，电击杯厚度4mm；
4)电击完成后，将细胞悬液迅速转移到100mm培养皿中进行培养，48h后收集细胞进行初步鉴定和极度稀释培养；
5)根据2中得到的最适浓度500ng/ul，在极度稀释培养3天后换液，开始用加有适当浓度G418的含有10％FBS的DMEM完全培养基进行培养，每隔3天换一次液10d后能得到牛津杯大小的单克隆点；
6)在显微镜下用记号笔画出单克隆点的位置，胰酶消化法抠出单克隆点放入48孔板中进行培养，第二天换加有一半浓度G418的含有10％FBS的DMEM完全培养基进行培养，每天观察细胞生长状况，将长满的细胞详细编号并传代至另外一个48孔板，一份用于鉴定是否是阳性，一份用于扩大培养；
7)待用于鉴定的细胞长满后，用胶原酶消化法收集细胞，提取基因组DNA，PCR鉴定是否是阳性,对鉴定出来的阳性细胞系进行扩大培养和冻存备用。
第三步、Leptin细胞的核移植
1)卵母细胞的成熟培养
a、从屠宰场采集猪的卵巢并在4h内运回实验室。
b、挑选直径约为3-6mm的卵泡从中抽取卵丘-卵母细胞复合体，放入添加0.1mg.ml-1丙酮酸、0.1mg.ml-1L-半胱氨酸盐酸、10％猪卵泡液、10ng.mL-1EGF的TCM-199成熟培养液滴中，在5％CO2，38.5℃的培养箱中培养38-42h。
2)构建转入Letin基因的重构胚
a、取转Leptin基因的成纤维细胞，用含有0.5％FBS的DMEM培养48h,使体细胞处于G0或G1期。
b、卵丘-卵母细胞复合体经体外成熟培养后，用0.1mg.mL-1透明质酸去除卵母细胞外围的卵丘细胞，将排出第一极体的卵母细胞放入预处理液中处理0.5-1h，在操作液中用显微注射针将极体及其周围胞质一起吸去，然后将转入Leptin基因的成纤维体细胞导入到去核的卵母细胞的卵间隙中。
3)电融合和电激活重构胚
将每批约20枚重构胚胎，移入融合液中清洗三遍，在25V/mm脉冲电压，脉冲时程为20μs，脉冲次数为1次的电融合参数下进行重构胚的电融合处理。完成后移入NCSU23培养基中培养2小时，再把待孤雌激活的卵母细胞在激活液中清洗三遍，然后在150V/mm脉冲电压，脉冲时程为100μs，脉冲次数为1次的电激活参数下进行电激活，重构胚移入含有2.2ug.mL- 1CB的培养液中后放入含有5％CO2、5％O2、38.5℃的三气培养箱中平衡2h。
4)重构胚的体外培养
将已平衡好的重构胚胎移入到PZM3培养液中，置于三气培养箱中培养至胚胎移植。
5)将重构胚移植到自然发情的代孕母猪内继续发育，代孕母猪妊娠114天后获得转Leptin基因的克隆仔猪。
第四步、转Leptin基因克隆仔猪的过量表达验证
利用设计好的GFP引物和Leptin引物对转Leptin克隆仔猪的DNA和RNA进行验证。
本实施例在实施例1的基础上，通过SalⅠ和EcoRⅠ双酶切pIRES2-AcGFP1载体和pMD18-Leptin构建出来的pLeptin-IRES2-AcGFP1载体，具有特异地、高效地增强基因表达量的效果，实现了Leptin基因的过量表达，操作方法简单，与传统的构建方法相比，简化了构建过程中目的基因编码蛋白系列的合成步骤；本发明还通过对现有的实验室技术进行创造性改进，在培养过程中实现参数进行优化选择，可快速高效的使Leptin基因在大约克猪体内实现过量表达，最终获得过量表达Leptin基因的克隆猪，成功率高，缩短培养周期，操作简单、可控性高，实用性强。
最终，以上实施例和附图仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (6)
1.一种构建过量表达Leptin基因的克隆猪的方法，其特征在于，主要按照以下步骤进行：
第一步、构建Leptin基因过量表达载体
1) 用PCR 法扩增目的Leptin基因并对胶进行回收，并将Leptin片段连接到pMD18-T载体上，得到重组质粒pMD18-Leptin；
2) 酶切pIRES2-AcGFP1 载体和pMD18-Leptin 载体，利用胶回收试剂盒对所需的片段大小进行回收，将Leptin 连接到pIRES2-AcGFP1载体上，得到重组质粒pLeptin-IRES2-AcGFP1 ；
3) 采用试剂盒法制备无内毒素的质粒DNA，用于细胞转染，并对pLeptin-IRES2-AcGFP1载体进行回收和纯化，-20℃保存备用；
第二步、猪胎儿成纤维细胞转染、筛选
1) 利用组织消化法建立猪30日龄胎儿成纤维细胞系，冻存备用；
2) 复苏冻存备用的胎儿成纤维细胞系，进行G418毒性敏感性检测，得到10天内使细胞全部死亡的最适浓度为500ng/ul ；
3) 再次复苏细胞，待细胞汇合度达到80-90％时收集细胞并计数，将细胞用电击缓冲液重悬，并加入30ug leptin 过量表达载体pLeptin-IRES2-AcGFP1，移入电击杯中进行转染；
4) 电击完成后，将细胞悬液迅速转移到100mm 培养皿中进行培养，48h后收集细胞进行初步鉴定和极度稀释培养；
5) 根据步骤2)中得到的最适浓度，在极度稀释培养3天后换液，开始用加有适当浓度为500ng/ul的G418的含有10％ FBS的DMEM完全培养基进行培养，每隔3天换一次液，10d后能得到牛津杯大小单克隆点；
6) 在显微镜下用记号笔画出单克隆点的位置，胰酶消化法抠出单克隆点放入48孔板中进行培养，第二天换加有一半浓度G418的含有10％FBS 的DMEM 完全培养基进行培养，每天观察细胞生长状况，将长满的细胞进行详细编号并传代至另外一个48孔板，一份用于鉴定是否是阳性，一份用于扩大培养；
7) 待用于鉴定的细胞长满后，用胶原酶消化法收集细胞，提取细胞基因组DNA，通过PCR 鉴定是否是阳性,对鉴定出来的阳性细胞系进行扩大培养和冻存备用；
第三步、Leptin 细胞的核移植及胚胎移植
1) 受体卵母细胞的培养
a、从屠宰场采集猪的卵巢并在4h内运回实验室；
b、挑选直径为3-6mm的卵泡从中抽取卵丘-卵母细胞复合体，放入TCM-199成熟培养液滴中，在5％CO2，38.5℃的培养箱中培养38-42h；
2) 构建过量表达Leptin 基因的重构胚
a、取转入Leptin基因的成纤维细胞，用含有0.5％FBS的DMEM 培养48h, 使体细胞处于G0或G1期；
b、卵丘-卵母细胞复合体经体外成熟培养后，用0.1mg.mL-1透明质酸去除卵母细胞外围的卵丘细胞，将排出第一极体的卵母细胞放入预处理液中处理0.5-1h，在操作液中用显微注射针将极体及其周围胞质一起吸去，然后将转Leptin 基因的成纤维体细胞导入到去核的卵母细胞的卵间隙中；
3) 电融合和电激活重构胚
再将每批20枚重构胚胎，移入融合液中清洗三遍，进行重构胚的电融合处理，完成后移入NCSU23 培养基中培养2h，再把待孤雌激活的卵母细胞在激活液中清洗三遍，然后进行电激活，重构胚移入含有2.2ug.mL-1CB的培养液中后放入含有5％CO2、5％O2、38.5℃的三气培养箱中平衡2h；
4) 重构胚的体外培养
将已平衡好的重构胚胎移入到PZM3培养液中，置于三气培养箱中培养至胚胎移植；
5) 将重构胚移植到自然发情的代孕母猪内继续发育，代孕母猪妊娠114天后获得转Leptin基因的克隆仔猪；
第四步、转Leptin基因克隆仔猪的过量表达验证
利用设计好的GFP引物和Leptin引物对转Leptin克隆仔猪的DNA 和RNA进行验证。
2.根据权利要求1 所述的一种构建过量表达Leptin基因的克隆猪的方法，其特征在于：在第一步中, 体外重组Leptin基因通过线性化过量表达质粒载体pLeptin-IRES2-AcGFP1 来特异地增强基因的表达量。
3.根据权利要求1 所述的一种构建过量表达Leptin基因的克隆猪的方法，其特征在于：在第一步构建Leptin基因过量表达载体中，在重组Leptin基因过量表达载体pLeptin-IRES2-AcGFP1时，在对pIRES2-AcGFP1载体和pMD18-Leptin载体进行酶切重组时，采用SalⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，其具体步骤为：
a、PCR 扩增体系：
Leptin-F（GGC CCC AGA AGC ACA TCC） 2ul
Leptin-R（TCA GCA GCC AGG GCT GAG） 2ul
Taq酶 25ul
Leptin cDNA模板 1ul
双蒸水 20ul
总体积 50ul
b、pMD18-Leptin 载体的构建按下列体系在16℃的恒温金属浴中连接2h进行：
Leptin基因 3ul
pMD18-T载体 1ul
双蒸水 1ul
SolutionⅠ 5ul
总体积 10ul
c、SalⅠ和EcoRⅠ双酶切pIRES2-AcGFP1载体和pMD18-Leptin，时间为2h，其反应条件如下：
SalⅠ酶 0.5ul
EcoRⅠ酶 0.5ul
10×H Buffer 2ul
质粒DNA 5ul
双蒸水 12ul
总体积 20ul
d、将Leptin和pIRES2-EGFP1 连接反应体系如下，反应条件为16℃的恒温金属浴中连接2h；
Leptin 4ul
载体pIRES2-EGFP1 1ul
SolutionⅠ 5ul
总体积 10ul。
4.根据权利要求1所述的一种构建过量表达Leptin 基因的克隆猪的方法，其特征在于：在第二步猪胎儿成纤维细胞转染、筛选过程中，在第3)步的再次复苏细胞时，加入30ugLeptin过量表达载体pLeptin-IRES2-AcGFP1后，移入电击杯中，按照如下参数进行转染：方波，电压250V，电击时间20ms，电击次数1次，电击间隔时间0s，电击杯厚度4mm。
5.根据权利要求1所述的一种构建过量表达Leptin基因的克隆猪的方法，其特征在于：在第三步Leptin细胞的核移植及胚胎移植中，进行受体卵母细胞的成熟培养时，挑选直径为3-6mm的卵泡从中抽取卵丘- 卵母细胞复合体，放入添加0.1mg.ml-1丙酮酸、0.1mg.ml- 1L-半胱氨酸盐酸、10％猪卵泡液、10ng.mL-1EGF 的TCM-199成熟培养液滴中，在5％CO2，38.5℃的培养箱中培养38-42h。
6.根据权利要求1所述的一种构建过量表达Leptin基因的克隆猪的方法，其特征在于：在第三步Leptin细胞的核移植及胚胎移植中，进行电融合和电激活重构胚时，再将每批20枚重构胚胎，移入融合液中清洗三遍，在25V/mm 脉冲电压，脉冲时程为20μs，脉冲次数为1次的电融合参数下进行重构胚的电融合处理，完成后移入NCSU23培养基中培养2小时，再把待孤雌激活的卵母细胞在激活液中清洗三遍，然后在150V/mm 脉冲电压，脉冲时程为100μs，脉冲次数为1次的电激活参数下进行电激活，重构胚移入含有2.2ug.mL-1CB 的培养液中后放入含有5％CO2、5％O2、38.5℃的三气培养箱中平衡2h。
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