KR100479704B1 - 녹색 형광단백질을 발현하는 형질전환 돼지의 제조 방법 - Google Patents

녹색 형광단백질을 발현하는 형질전환 돼지의 제조 방법 Download PDF

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박광욱
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Abstract

본 발명은 녹색 형광단백질을 발현하는 형질전환 돼지의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 1) 돼지 태아로부터 체세포를 분리하는 단계; 2) 형광단백질 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조한 후 단계 1의 체세포에 도입시키는 단계; 3) 상기 발현벡터가 도입된 클론 체세포를 선별한 후 배양하는 단계; 4) 모돈으로부터 채취한 난자의 핵을 제거하고 상기 체세포와 융합시키는 단계; 및 5) 상기 융합된 복제란을 대리모돈에 이식하고 자돈을 출산하는 단계를 포함하는 형광단백질을 발현하는 형질전환 돼지의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조 방법에 의하여 제조된 형광단백질을 발현하는 형질전환 돼지는 형질전환 동물을 이용하여 치료용 단백질을 생산하는 분야 및 세포치료에 관한 기초연구에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

녹색 형광단백질을 발현하는 형질전환 돼지의 제조 방법{Method of producing a transgenic pig expressing green fluorescent protein}
본 발명은 녹색 형광단백질을 발현하는 형질전환 돼지의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 형질전환 동물을 이용한 치료용 단백질 생산 및 세포치료에 관한 기초연구에 유용하게 사용될 수 있는 근육조직 특이적으로 녹색 형광단백질을 발현하는 형질전환 돼지의 제조 방법에 관한 것이다.
복제(cloning)는 유전적으로 동일한 개체를 만드는 것을 말하는데, 핵이식(nuclear transfer)은 진핵생물에 있어서의 복제의 한 방법으로 최근 분자생물학의 급격한 발달로 새로이 주목받게된 기술이다. 초기의 핵이식은 핵의 공급원으로 수정란의 할구를 이용하였으나(Prather, et al., Biol. Reprod., 1987, 37:856-866; Prather, et al., Biol. Reprod., 1989, 41:414-418), 최근에는 체세포의 핵을 이용하게 되었다.
체세포 복제는 분화된 체세포를 핵이 제거된 난자에 넣어 활성화시킨 다음에 일반 수정란과 동일한 방법으로 발생시키는 기술이다. 이와 같은 복제기술은 발생생물학 분야를 비롯한 기초과학 분야의 연구에 널리 이용될 수 있을 뿐만 아니라 유용 단백질의 생산, 질환 모델의 개발 및 장기 이식 분야 등 다양한 의학 및 의약 분야에 크게 기여할 것으로 예상되어 그 산업적 유용성이 매우 크다고 할 수 있다.
최초의 체세포 복제 동물인 돌리(Willmut, I. et al., Nature, 1997, 385:810-813)가 탄생한 이후, 체세포 복제 분야는 많은 발전을 거듭하여 소(Cibelli, JB. et al., Science, 1998, 280:1256-1258; Wells, DN. et al., Reprod. Fertil. Dev., 1998, 10:369-378), 생쥐(Wakayama, T. et al., Nature, 1998, 394:369-374), 산양(Bagusi, A. et al., Nat. Biotechnol., 1999, 17:456-461) 등의 복제에 성공을 하게 되었다. 그러나, 돼지는 다른 종에 비하여 수정란에 대한 연구가 상대적으로 적게 이루어졌고, 최소한 4마리의 태아가 자궁에 착상해야만 임신이 유지되는 생리적 특성 등 여러 가지 어려움 때문에 주요 가축 중에서는 비교적 늦게 복제에 성공을 하게 되었다(Poleajaeva, IA. et al., Nature, 2000, 407:86-90; Onishi, A. et al., Science, 2000, 289:1188-1190; Betthauser, J. et al., Nat. Biotechnol., 2000, 18:1055-1059). 그 후, 돼지 체세포에 외부 유전자를 주입시켜 복제에 성공함으로써 최초의 형질전환 복제 돼지가 탄생하였고(Park, KW. et al., Anim. Biotechnol., 2001, 12:173-181), 특정유전자를 체세포에서 결손(knockout)시킨 복제 돼지도 성공하였다(Lai, L. et al., Nat. Biotechnol., 2002 Mar, 20(3):251-255). 그러나, 돼지 체세포 복제 분야의 급속한 발전에도 불구하고 아직도 복제의 효율은 1-5%로 낮아 효율을 개선시키기 위한 많은 연구가 진행 중이다.
체세포 복제 기술은 통상적으로 세포질을 흡입하여 난자의 핵을 제거하고 핵이 제거된 난자에 체세포를 주입한 후 전기적 자극을 가하여 난자-체세포 복합체를 융합 및 활성화시키는 단계를 포함한다. 이러한 형질전환 기술에 있어서, 종래에 사용된 마이크로인젝션(microinjection) 방법은 형질전환 동물의 생산효율이 매우 낮다는 것이 문제점으로 지적되어 왔다.
GFP(Green fluorescent protein)는 아쿠오리아 빅토리아(Aequorea victoria)라는 해파리에서 분리된 단백질로서 자외선을 쬐었을 때 강한 형광을 나타내는 특성이 있어 미생물은 물론 동식물에서 유전자 발현의 표식자로 사용되어 왔다(Takada T et al., Nat. Biotechnol., 1997, 15:458-461; Perry AC et al., Science, 1999, 284:1180-1183; Chan AW et al., Mol. Reprod., 1999, 52:406-413). 최근에는 GFP 유전자가 주입된 돼지 체세포를 이용한 복제란이 정상적으로 발달하는 것이 확인되었고(Uhm SJ et al., Mol. Reprod. Dev., 2000, 57:331-337; Koo D-B et al., Mol. Reprod. Dev., 2001, 58:15-21; Park KW et al., Biol. Reprod., 2001, 65:1681-1685), 이를 이용하여 GFP 유전자가 발현되는 최초의 형질전환 복제돼지의 생산도 성공하였다(Park KW et al., Anim. Biotech., 2001, 12:173-181). 그러나, 이 보고에서 이용한 체세포는 클론(clonal) 체세포가 아니었기 때문에 태어난 개체마다 GFP 유전자의 염색체내 도입위치에 차이가 있었다. 또한, GFP 유전자를 세포에 주입시킬 때 레트로바이러스(retrovirus)를 이용하였는데, 상기 방법은 주입할 수 있는 유전자의 크기에 제한이 있으며 임상적으로 이용될 때에는 안정성을 확보하기 어려운 단점을 가지고 있다.
이에, 본 발명자들은 상기와 같은 형질전환 복제돼지 제조에 있어서의 문제점을 해결하기 위하여, 레트로바이러스가 아닌 지질(lipid)을 이용하여 외부 유전자를 도입시킨 클론 체세포주를 제조하였고, 상기 클론 체세포주를 핵이식에 이용하여 근육조직 특이적으로 녹색 형광단백질을 발현하는 형질전환 돼지를 생산할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 근육조직 특이적으로 녹색 형광단백질을 발현하는 형질전환 돼지의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의하여 제조된 근육조직 특이적으로 형광 단백질을 발현하는 형질전환 돼지를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 돼지 태아로부터 체세포를 분리하는 단계; 2) 형광단백질 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조한 후 단계 1의 체세포에 도입시키는 단계; 3) 상기 발현벡터가 도입된 클론 체세포를 선별한 후 배양하는 단계; 4) 모돈으로부터 채취한 난자의 핵을 제거하고 상기 체세포와 융합시키는 단계; 및 5) 상기 융합된 복제란을 대리모돈에 이식하고 자돈을 출산하는 단계를 포함하는 형광단백질을 발현하는 형질전환 돼지의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조된 근육조직 특이적으로 녹색 형광단백질을 발현하는 형질전환 돼지를 제공한다.
본 명세서에 있어서, "클론 체세포주"는 유전체에 도입된 벡터의 위치가 동일한 세포주를 가리킨다.
또한, "위란강"은 난자의 투명대와 난세포질 사이의 공간을 가리킨다.
또한, "난자-체세포 복합체"는 난자의 핵을 제거한 후 체세포를 위란강에 주입하고 세포융합이 일어나기 전 단계를 가리키며, "복제란"은 전기적 자극에 의하여 난자와 체세포가 융합된 단계를 가리킨다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
1) 돼지 태아로부터 체세포를 분리하는 단계;
2) 형광단백질 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조한 후 단계 1의 체세포에 도입시키는 단계;
3) 상기 발현벡터가 도입된 클론 체세포를 선별한 후 배양하는 단계;
4) 모돈으로부터 채취한 난자의 핵을 제거하고 상기 체세포와 융합시키는 단계; 및
5) 상기 융합된 복제란을 대리모돈에 이식하고 자돈을 출산하는 단계를 포함하는 형광단백질을 발현하는 형질전환 돼지의 제조 방법을 제공한다.
상기 단계 1에 있어서, 돼지 태아는 임신 20 내지 50일령의 태아를 사용하는 것이 바람직하며, 30 내지 40일령의 태아를 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 임신 35일령의 태아를 사용하여 돼지 체세포를 분리하였다. 체세포를 분리하기 위한 방법으로는 종래에 사용되는 일반적인 방법이 본 발명에 동일하게 적용될 수 있으며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 면도날을 이용하여 돼지 태아를 잘게 자른 후 트립신을 처리하여 계대배양함으로써 체세포를 분리하였다.
단계 2에 있어서, 형광단백질은 GFP인 것이 바람직하며, enhanced GFP (EGFP)인 것이 더욱 바람직하나 반드시 여기에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 형광단백질을 포함하는 발현벡터는 돼지 세포에서 발현시킬 수 있는 공지된 모든 발현벡터를 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 형광단백질 유전자를 포함하는 발현벡터로서 pCX-EGFP/neo 벡터를 사용하였다. 또한, 상기 형광단백질을 발현시키기 위한 프로모터로서 공지된 모든 프로모터를 제한없이 사용할 수 있으나, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 형광단백질을 조직 특이적으로 발현시키기 위하여 근육 특이적으로 발현을 유도한다고 알려진 치킨 베타-액틴 프로모터(chicken β-actin promoter)를 사용하였다.
단계 3에 있어서, 단계 2의 발현벡터가 도입된 체세포는 선별마커가 도입된 발현벡터를 사용함으로써 용이하게 선별할 수 있다. 이러한 선별마커로는 바람직하게는 항생제 내성 유전자가 사용될 수 있다. 상기 항생제 내성유전자에는 neor, pacr, bsrr, hphr 등이 사용될 수 있으며, 본 발명에서는 neor를 사용하였다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 G418을 처리하여 형광단백질 유전자를 포함하는 발현벡터가 도입된 체세포를 선별하였다.
본 발명에서는 상기와 같은 방법으로 돼지 체세포에 형광단백질 유전자로서 GFP 유전자를 효율적으로 주입하여 GFP를 발현하는 돼지 클론 체세포주를 선별하고 이를 핵을 제거한 돼지의 난자에 이식하여 녹색 형광단백질을 근육조직 특이적으로 발현하는 형질전환 돼지를 제조하였다.
최근의 연구 결과에 따르면 GFP를 도입한 돼지 체세포를 핵이식에 이용하여 배반포까지 배양에 성공하였고(Uhm SJ et al., Mol. Reprod. Dev., 2000, 57:331-337; Koo D-B et al., Mol. Reprod. Dev., 2001, 58:15-21; Park KW et al., Biol. Reprod., 2001, 65:1681-16859), 대리모에 복제란을 이식하여 GFP가 발현되는 돼지가 생산되었다(Park KW et al., Anim, Biotech., 2001, 12:173-181). 그러나, 상기와 같은 종래의 연구에서는 GFP 유전자를 세포에 주입할 때 레트로바이러스를 이용하였다는 문제점이 있었다. 레트로바이러스를 이용하게 되면 주입할 수 있는 유전자의 크기에 제한이 있으며, 임상적으로 이용될 때 안정성을 확보하기 어려운 문제점이 있다. 레트로바이러스를 사용함에 있어서의 이러한 단점은 형질전환동물을 생산하는 데 있어서 제한 요인이 될 수 있다. 본 발명에서는 돼지 체세포에 발현벡터를 도입시키기 위하여, 종래의 방법처럼 레트로바이러스를 사용하지 않고 지질(lipid)을 매개로 하여 형광단백질 유전자를 체세포에 주입하는데 성공함으로써 상기와 같은 종래 방법의 안정성 문제를 해소하였다. 본 발명의 방법을 사용하면 유전자를 체세포에 주입할 때 레트로바이러스보다도 도입시킬 수 있는 유전자의 크기에 제한이 적다.
종래의 연구에서는 형광단백질 유전자를 체세포에 도입하는 데는 성공하였으나 클론 체세포주를 만들지는 못하였다. 클론 체세포주는 유전체에 주입된 발현 벡터의 위치가 동일하다는 특징이 있다. 발현 벡터가 도입된 클론 체세포주를 만들지 않으면 형광단백질 유전자는 도입되어 있지만 형광단백질 유전자의 삽입부위가 각각의 체세포마다 다르게 된다. 형광단백질 유전자가 염색체의 어느 부위에 삽입되었는지 여부에 따라서 세포마다 단백질 발현 양상이 조금씩 다를 수 있기 때문에, 이러한 세포를 이용하여 돼지를 생산하게 되면 형광단백질의 발현양상이 개체에 따라 조금씩 다르게 나타나게 된다(Park KW et al., Anim. Biotech., 2001, 12:173-181). 본 발명에서는 상기와 같은 종래 방법의 문제점을 해결하여 클론 체세포주를 제조하였다. 이러한 기술은 체세포복제를 이용한 형질전환 동물의 생산효율을 증대시킬 것으로 기대된다. 즉, 유용단백질 유전자를 체세포의 게놈에 삽입시킨 후 유전자가 삽입된 부위에 따라 몇 종류의 서로 다른 클론 세포주를 만들 수 있을 것이다. 상기 세포주를 이용하여 복제동물을 생산한 후 단백질의 발현 양상을 검사하여 발현율이 좋은 개체를 선별할 수 있다. 왜냐하면 유전자가 게놈의 어느 부위에 삽입되는가에 따라 그 발현율에 차이를 보일 수 있기 때문이다.
또한, 종래의 연구에서는 CMV 프로모터를 이용하여 신체 전체에서 유전자가 발현되도록 하였다. 반면에 본 발명의 방법에 의하여 제조된 형질전환 돼지는 치킨-베타 액틴 프로모터를 이용하였기 때문에 주로 근육관련 조직 (발굽, 코, 심근, 장 등)에서 강한 형광발현을 유도함을 확인하였다(도 3과 4). 그러나 장을 제외한 내장, 뼈, 뇌 등에서는 형광이 발현되지 않았다. 상기와 같은 조직 특이적 발현 기술은 형질전환 동물에서 치료용 단백질을 생산하고자 할 때 유용하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 유용 단백질을 유선 특이적으로 발현하도록 유전자를 조작하면 유즙을 통하여 유용단백질을 생산할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에 의하여 제조된 형질전환 돼지는 신체 전체의 근육조직에서 GFP가 발현되므로 이 돼지로부터 채취되는 GFP 세포는 생명현상을 이해하는데 도움이 될 수 있다.
또한, 돼지의 장기는 생리적으로 사람과 상당히 흡사하므로, 사람에게 이식할 수 있는 돼지 장기를 개발하기 위하여 많은 노력을 하고 있으나, 돼지의 장기를 사람에게 이식할 때 일어나는 거부반응이 이종이식에 큰 걸림돌이 되고 있다. 최근 거부반응에 관여하는 돼지의 유전자를 제거한 형질전환 돼지를 제조함으로써 돼지를 이용한 이종이식의 가능성이 한층 높아졌다(Lai L et al., Science, 2002, 295:1089-1092; Dai Y et al., Nat. Biotechnol., 2002, 20:251-255.). 만약, 돼지의 장기를 이용한 이종이식이 가능하게 된다면 돼지 체세포의 이식도 가능하리라 기대되는데, 이럴 경우 이식된 돼지 체세포가 환자의 체내에서 어떻게 발달 및 분화되는지 확인하려고 할 때 본 발명의 형광단백질 유전자가 포함된 클론 체세포주를 이용하게 되면 관찰이 용이할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 돼지 체세포의 분리
임신 35일령의 돼지 태아를 면도날로 잘게 자른 후, 세포를 트립신-EDTA (Gibco. Inc)가 첨가된 DMEM 배지(bio-whittaka. Inc)에서 5분간 배양하였다. 상층액을 원심분리(1,000 rpm, 5분)한 후 10% FCS(Fetal Calf Serum, Hyclone. Inc)가 포함된 DMEM 배지에서 배양하고 세포가 90% 포화상태(confluency)에 이르면 트립신을 처리하여 계대배양하였으며, 이들 중 일부는 핵이식에 이용하고 나머지는 동결보존하였다.
<실시예 2> GFP를 발현하는 클론 세포주의 제조
GFP 유전자를 포함하는 벡터로는 pCX-EGFP 벡터(Kato M et al., Mol. Reprod. Dev., 1999, 54:43-48)에 neo 유전자를 접합시킨 pCX-EGFP/neo 벡터를 사용하였다(도 1). PCX-EGFP/neo 벡터는 pPNT 벡터(Tybulewicz VL et al., Cell. 1991, 65:1153-1163)의 neo 유전자를 분리한 후 상기 neo 유전자를 PCX-EGFP 벡터의 HindIII 부위에 접합시켜 제조하였다. 상기 PCX-EGFP/neo 벡터를 SalI (Roche. Inc) 부위를 절단하여 선형화시키고 페놀 추출법으로 DNA를 분리한 후 이를 체세포에 주입하기 위하여 지질개발법(Fu-gene6; Roche. Inc)을 실시하였다. 상기 지질개발법은 제조사(Sharon J.H. et al. Transgenic Research, 2002, 11:143-150)의 지침에 따라 수행하였고, 48시간 동안 세포를 배양한 후 G418(Geneticin; Gibco. Inc)을 첨가하여 형질전환된 체세포를 선별하였으며, 형광발현은 형광 현미경(Nikon)을 통하여 확인하였다. 이때 처리된 G418의 농도는 여러 가지로 실시하여 최적의 농도(250 ㎍/㎖)를 결정하였다. 상기 형질전환된 세포를 2주 동안 250 ㎍/㎖ 농도의 G418을 처리하여 콜로니가 형성된 세포주를 선별하였으며, 상기에서 제조된 클론 세포주를 동결시켜 핵이식에 이용하였다.
상기에서 선별한 클론 세포주에서의 GFP 발현을 형광현미경을 이용하여 관찰한 결과, GFP를 90% 이상 발현하는 세포주 PCX-8를 선발하였다(도 3 참조).
본 발명자들은 상기 PCX-8 클론 세포주를 2003년 5월 15일자로 한국 세포주 연구재단에 기탁하였다(수탁번호; KCLRF-BP-00079).
<실시예 3> 클론 체세포주를 이용한 핵이식
<3-1> 난자 채취 및 배양
도축장에서 미경산돈의 난소를 채취하여 35 내지 39??, 0.9% 생리적 식염수에 보관하였다. 10 ㎖ 주사기에 18 게이지 바늘을 연결하여 상기 난소의 직경 2 내지 6 ㎜ 난포에서 난포액을 흡입하여 난자를 채취하였다. 상기 난자를 성숙배양액에서 세척하고, 500 ㎕ 배양액에 50 내지 60개의 난자를 넣어 42 내지 46시간 동안 배양하였다.
이때, 상기 성숙 배양액은 TCM 199 (31100035; Gibco, Grand Island, NY)에 0.1% 폴리비닐알콜(polyvinylalcohol), 3.05 mM 포도당(D-glucose), 0.91 mM 소듐피루베이트(sodium pyruvate), 0.57 mM 시스테인(cysteine), 0.5 ㎍/㎖ LH(Sigma Chemical Co. St. Louis, MO), 0.5 ㎍/㎖ FSH(Sigma), 10 ng/㎖ 상피성장인자(epidermal growth factor, Sigma), 75 ㎍/㎖ 페니실린 G 및 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 첨가하여 제조되었다.
<3-2> 미세조작(micromanipulation)
실시예 <3-1>에서 채취된 난자를 미세조작용 배양액에서 5 내지 10 분간 배양한 후, 실시예 2에서 선별된 PCX-8 클론 세포주를 상기 배양액에 첨가하였다. 이때, 미세조작용 배양액은 TCM 199에 0.3% BSA 및 7.5 ㎍/㎖ CB(cytochalasin B)를 첨가하여 제조되었다.
난자의 핵을 제거하기 위하여, 선단이 30 내지 60°로 날카롭게 연마된 직경 30 ㎛의 미세유리관을 준비하였다. 먼저 난자의 극체를 1시 방향으로 고정시키고, 상기 미세유리관을 극체가 있는 방향으로 찔러 넣었다. 유압을 이용하여 극체와 극체 주위의 세포질을 약 10 내지 20% 정도 흡입하였으며, 대부분의 핵은 극체 주위에 위치해 있으므로 상기 과정에서 대부분의 난자의 핵이 제거되었다. 그 후에 상기 미세유리관을 이용하여 실시예 2에서 제조된 돼지 체세포를 흡입하고 상기 미세유리관을 핵이 제거된 난자의 위란강에 위치시킨 후 유압을 이용하여 체세포를 난자의 위란강에 주입시켰다.
<3-3> 세포융합 및 활성화
실시예 <3-2>의 미세조작이 끝나면 핵이식란을 활성화 배양액에 넣은 후 간격이 1 ㎜ 떨어진 백금 전기선 사이에 난자-체세포 복합체를 위치시키고, 융합기(BTX Electro-Cell Manipulation 2001)로 1.1 ㎸/㎝, 30 ㎲의 DC 펄스를 2회 가하여 세포융합 및 활성화를 유도하였다. 전기 자극을 가한 후 0.5 내지 1시간 후에 융합률을 검사하였다. 상기 활성화 배양액은 0.3 M 만니톨(mannitol)에 1 mM CaCl2ㆍH2O, 0.1 mM MgCl2ㆍ6H2O 및 0.5M HEPES 완충액을 첨가하여 제조되었다.
<3-4> 복제란의 배양 및 발생
실시예 <3-3>에서 제조된 융합 복제란을 선별한 후, 500 ㎕의 발생 배양액이 들어 있는 4-웰 용기에서 20 내지 30개의 복제란을 6일 동안 배양하였다. 배양완료 후에 5 ㎍/㎖의 헥스트 33342로 염색하고, 형광현미경 하에서 핵수를 검사하였다. 상기 발생 배양액은 NCSU-23(북캐롤리나주립대-23; Petters, RM. and Wells, KD., J. Reprod. Fertil. Suppl., 1993, 48:61-73) 배지에 0.4% BSA를 첨가하여 제조되었다.
상기 방법으로 PCX-8 세포주를 핵이식에 이용하여 체외에서 배반포까지의 발달율을 확인한 결과, 복제란의 융합율, 분할율 및 배반포 시기까지의 발달율은 각각 78.5%, 67.2% 및 12.9% 였으며, 배반포의 핵수는 23.8이었다(표 1). 배반포에서는 강한 GFP 발현이 나타났다(도 3).
복제란의 체외발생 능력
복제란 수 224
배반포 발생률(%) 29 (12.9%)
배반포 핵수 (범위) 23.8 ±2.0(10-40)
이식한 복제란 수 2578
대리모 수 18
50일 임신율 (%) 5(27.8%)
출산률 (%) 3(16.7%)
생존 자돈수 11
이식한 복제란중 생존 자돈수 (%) 0.4%
<실시예 4> 복제란의 이식 및 형질전환된 자돈의 생산
생산 후 1 내지 2일째 된 복제란을 발정이 확인된 날(D0) 또는 그 다음날(D1)에 20마리의 대리모돈에게 외과적인 방법으로 이식하였다. 이식수술 후 28일째에 초음파 검사를 하여 초기임신을 확인하였고 출산까지 매주 1회 초음파 검사를 통하여 임신을 확인하였다.
그 결과, 18마리의 대리모돈 중에서 3마리가 임신하였으며 자돈 11두를 출산하고 1두는 사산하였으며, 자돈의 체중은 평균 1094g이며 체중의 범위는 680-1580g이었다(표 2 및 도 5).
복제란의 이식결과
대리모돈 자 돈 생시 체중 비 고
#31-157 GF1-1 1000 사산
GF1-2 800 건강
GF1-3 950 건강
#19-55 GF2-1 680 건강
GF2-2 1250 건강
GF2-3 1160 건강
GF2-4 1180 희생시켜 해부
GF2-5 1580 건강
#34-135 GF3-1 890 건강
GF3-2 1070 건강
GF3-3 1440 건강
GF3-4 1130 건강
*총 18마리의 대리모돈에 복제란을 이식하였다.
<실시예 5> GFP 유전자의 도입 확인
상기의 자돈 및 PCX-8 클론 세포주에서 GFP 유전자의 존재 유무를 확인하기 위하여 PCR 분석을 실시하였다. 구체적으로, 대리모돈의 귀조직, 자돈의 귀조직, 및 PCX-8 세포주 각각에 프로티나제 K (Proteinase K, Gibco. Inc)를 처리하여 단백질을 분해시킨 후, 페놀로 단백질을 변성시켜 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 PCR 반응의 프라이머로는 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 사용하였으며, PCR 조건은 95℃에서 5분 동안 예비변성 시킨 후, 95℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 1분동안 30회 반복 실시하고 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켰다. 상기와 같이 PCR 실험을 수행하고 그 반응물을 아가로즈-겔에 전기영동하였다.
그 결과, 자돈 및 PCX-8 세포주에서 각각 500 bp 크기의 EGFP DNA 생성물이 존재하는 것을 확인하였으며 대리모돈의 귀조직에는 존재하지 않았다(도 2의 A). 또한, 자돈의 염색체 분석한 결과 정상임이 밝혀졌고 FISH 방법을 통하여 GFP 유전자가 자돈의 7번 염색체에서 확인되었다(도 2의 B). 상기 결과로 자돈이 GFP 유전자를 도입시킨 PCX-8 세포주로부터 유래되었으며, 실제 GFP 유전자가 존재하고 이를 발현하는 형질전환 돼지임을 다시 한번 확인하였다.
다음으로, 상기 실시예 1 내지 실시예 4를 통해 얻은 자돈 및 모돈의 조직에서의 라스-3000 인텔리전트 다크 박스(Fuji Film, 일본)에 고성능 cooled CCD 카메라가 장치된 기기를 이용하여 형광 발현을 검사하였다. 구체적으로, 상기 다크 박스에 자돈 또는 조직 시료를 넣고 청색광(460nm)을 조사하여 형광을 발현시킨 후 510DF10 필터를 이용하여 검사하였다.
그 결과, 자돈의 몸의 외부에서는 특히, 혀, 눈 주위, 앞다리 위쪽, 옆구리 및 발굽에서 강한 형광발현이 확인되었다(도 3). 또한, 사산한 GF1-1과 출산 후 4주경의 GF2-4를 희생시켜 장기별로 형광발현을 검사한 결과, 주로 근육관련 조직(발굽, 코, 심근, 혀, 피부, 귀, 근육 및 장)에서 강한 발현이 검출되었다. 그러나, 뼈, 골수, 뇌 및 장을 제외한 대부분의 내장에서는 발현이 검출되지 않았다(도 4).
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 제조 방법에 의하여 제조된 형광단백질을 발현하는 형질전환 돼지는 형질전환 동물을 이용하여 치료용 단백질을 생산하는 분야 및 세포치료에 관한 기초연구에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 pCX-EGFP/neo 벡터의 개열지도를 보여주는 개략도이다.
도 2는 형질전환 돼지의 게놈 DNA에 GFP 유전자가 존재하는지 확인하기 위한 PCR 분석결과를 보여주는 DNA 전기영동 사진(A) 및
복제돼지의 염색체 분석 및 복제돼지의 염색체 상 GFP 유전자의 주입위치를 분석한 FISH 사진(B)이다.
도 3은 체세포, 복제란 및 자돈에서의 녹색 형광 발현 사진으로 배양된 체세포(A, B), 6일간 배양한 복제란(C, D), 및 GFP가 발현하는 돼지(E)이고, 상기에서 B, D, E는 형광을 이용하여 GFP의 발현을 검사한 사진이다.
도 4는 복제돼지의 각 조직에서 GFP의 발현을 검사한 결과를 보여주는 사진이다. 상기에서, A 내지 U는 일반 백색광을 이용한 사진이고, A'내지 U'는 형광을 이용한 GFP 발현사진이다.
A, A': 발굽, B, B': 코, C, C': 갈비뼈에 붙은 근육,
D, D': 심장, E, E': 혀, F, F': 신장,
G, G': 근육 (일반 돼지, 음성 대조구), H, H': 뇌,
I, I': 피부, J, J': 흉선, K, K': 난소,
L, L': 귀, M, M': 척수, N, N': 근육,
O, O': 제대, P, P': 머리뼈, Q, Q':췌장,
R, R': 간, S, S': 갑상선, T, T': 폐,
U, U': 장,
도 5는 형질전환 돼지 2마리의 사진이다.
<110> MGenbio Co., Ltd. PARK, Kwang-Wook <120> Method of producing a transgenic pig expressing green fluorescent protein <130> 3p-09-13 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP forward <400> 1 gctgaccctg aagttcatct g 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP reverse <400> 2 tgctcaggta gtggttgtcg 20

Claims (7)

1) 돼지 태아로부터 체세포를 분리하는 단계;
2) 형광단백질 유전자를 포함하는 도 1의 계열지도를 갖는 발현벡터 pCX-EGFP/neo를 제조한 후 단계 1의 체세포에 도입시키는 단계;
3) 상기 발현벡터 pCX-EGFP/neo가 도입된 클론 체세포를 선별한 후 배양하는 단계;
4) 모돈으로부터 채취한 난자의 핵을 제거하고 상기 체세포와 융합시키는 단계; 및
5) 상기 융합된 복제란을 대리모돈에 이식하고 자돈을 출산하는 단계를 포함하는 EGFP(enhanced green fluorescent protein)를 발현하는 형질전환 돼지의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 단계 1의 돼지 태아는 임신 30내지 40일령의 태아인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 돼지 태아는 임신 35일령의 태아인 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 단계 3의 클론 체세포는 PCX-8 클론 세포주(수탁번호; KCLRF-BP-00079)인 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
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