KR100790514B1 - Ｃｓｆ를 유선에서 발현하는 형질전환 복제 돼지 및 그의제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 ＧＭ-ＣＳＦ를 유선에서 발현하는 형질전환 복제 돼지 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 1) 돼지 태아로부터 체세포를 분리하는 단계; 2) 유선(mammary gland) 특이적 프로모터 및 CSF(Colony stimulating factor, 세포집락 자극 인자)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제조한 후 상기 체세포에 도입시키는 단계; 3) 상기 발현 벡터가 도입된 클론 체세포를 선별한 후 배양하는 단계; 4) 모돈으로부터 채취한 난자의 핵을 제거하고 상기 체세포와 융합시키는 단계; 및 5) 상기 융합된 복제란을 대리모돈에 이식하고 자돈을 출산하는 단계를 포함하는 CSF 단백질을 발현하는 형질전환 돼지 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 형질전환 돼지는 기존 방법의 후-번역 수정(post-translational modification) 또는 대량 생산등의 문제점을 극복할 수 있으며, hGM-CSF를 유선에서 발현함으로써 쉽게 획득할 수 있는 잇점과 함께 이를 백혈병 치료 보조제 및 면역 강화제 등으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
Description
도 1은 pBC1 유 발현 벡터(Milk Expression Vector, Invitrogen, USA)를 나타낸 것이고,
도 2는 인간 GM-CSF의 유선(mammary grand) 특이적 발현을 위한 형질전환 컨스트럭트(transgenic construct)를 나타낸 것이고,
도 3은 형질전환된 HC11 세포주에서 도입된 hGM-CSF 유전자(transgene)의RT-PCR 결과이고,
M; 마커(Marker);
1; RT-PCR 양성 대조군;
2 : 비형질전환 HC11 세포주에서의 G3PDH;
3~6 : 형질전환 HC11 세포주에서의 G3PDH;
7 : 비형질전환 HC11 세포주에서의 hGM-CSF;
8~11 : 형질전환 HC11 세포주에서의 hGM-CSF,
도 4는 마우스 HC11 세포주에서 hGM-CSF의 유선 특이적 발현을 나타내는 웨 스턴 블랏(Western blot) 분석을 나타낸 것이고,
Mock : 비-형질전환 대조군(non-transgenic control) HC11 세포;
GM-CSF : 형질전환 HC11 세포,
도 5는 GM-CSF 및 NEO PCR 스크린 결과이고,
M : 마커;
1 : 양성 대조군;
2 : 음성 대조군;
3~10 : 샘플,
도 6은 서던 블랏(Southern blot) 결과이며,
M : 마커;
P : 양성 대조군;
1: 클론번호 27-4;
2 : 클론번호 27-28;
3 : 클론번호 27-32,
도 7은 형질전환 돼지의 자손에 대한 PCR 결과이다.
M ; 마커(Marker);
1 : 양성 대조군;
2 : 형질전환된 세포주(27-32);
3 : 대리모(surrogate mother);
4 : D.W;
5 : 형질 전환 돼지(Transgenic pig) 1;
6 : 형질 전환 돼지 2;
7 : 형질 전환 돼지 3.
본 발명은 인간 GM-CSF를 유선에서 발현하는 형질전환 복제 돼지 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
생물 형질전환 기술은 동식물의 개량, 생산성 향상 및 산업 의학적으로 유용한 산물을 얻기 위하여 외래 유전자를 인위적인 방법으로 생물의 염색체상에 전이시켜 발현시키는 기술과 내인성 유전자의 과발현을 유도, 조작하는 기술 및 염색체상의 특정 유전자의 기능을 삭제함으로써 그 유전자의 발현에 따른 표현형의 변화와 유전자의 기능을 규명하는 등의 일련의 기술을 총칭한다.
생물체에 외래유전자를 전이하는 기술은 형질전환 동물의 경우, 수정란에 미세주입기를 통한 미세주입방법, 여러 가지 형태의 바이러스를 이용하는 방법, 전자 기장을 이용하는 방법, 지질 등의 화합물을 이용하는 방법 등 추구하는 목적에 따라 이용방법이 다양하다. 외래유전자의 발현을 유도하는 프로모터에 따라 특정 조직, 즉 유선, 간, 혈액등에 국한되게 발현시키거나 생물체의 발달 단계에 따라 외래유전자의 발현 유도가 가능하다.
동물에서의 형질전환 이용분야는 많은 연구결과에 의해 실용화 단계에 있으며, 특히 형질전환된 복제 동물은 가축의 개량 및 신품종 창출, 가축에 있어 다발하는 질병에 대한 내병성 향상, 가축에서 얻을 수 있는 부산물의 질 향상, 질환 모델 동물 생산, 사람의 질병 또는 재해로 인한 장기의 손실을 대체해 줄 수 있는 장기생산동물 개발, 생체 반응기(bioreactor) 시스템을 통한 유용물질 생산 등에 이용되고 있다.
복제(cloning)는 유전적으로 동일한 개체를 만드는 것을 말하는데, 핵이식(nuclear transfer)은 진핵생물에 있어서의 복제의 한 방법으로 최근 분자생물학의 급격한 발달로 새로이 주목받게 된 기술이다. 초기의 핵이식은 핵의 공급원으로 수정란의 할구를 이용하였으나(Prather, et al., Biol . Reprod ., 1987, 37:856-866; Prather, et al., Biol . Reprod ., 1989, 41:414-418), 최근에는 체세포의 핵을 이용하게 되었다.
체세포 복제는 분화된 체세포를 핵이 제거된 난자에 넣어 활성화시킨 다음에 일반 수정란과 동일한 방법으로 발생시키는 기술이다. 이와 같은 복제기술은 발생생물학 분야를 비롯한 기초과학 분야의 연구에 널리 이용될 수 있을 뿐만 아니라 유용 단백질의 생산, 질환 모델의 개발 및 장기 이식 분야 등 다양한 의학 및 의약 분야에 크게 기여할 것으로 예상되어 그 산업적 유용성이 매우 크다고 할 수 있다. 즉, 상기와 같은 기술을 이용한 생산 시스템은 경제성이 매우 높아, 현재 고가로 판매되는 생리활성 물질을 저렴하게 공급할 수 있을 뿐만 아니라, 인체와 생리학적으로 가장 가까운 동물 자체를 생리활성 물질 생산 시스템으로 활용하기 때문에 고품질의 생리활성물질을 생산할 수 있고, 동물의 생체내 단백질 생산 시스템을 활용하기 때문에 대량 생산이 가능하고, 특히 섭취 백신과 같은 의약품 개발은 별도의 정제과정이 필요하지않는 등의 잇점이 있다.
그러나, 이를 실현하기 위해서는 먼저 목적으로 하는 유전자의 확보가 선행되어야 하며, 발현의 정도와 부위를 결정하기 위해 조직 특이적 프로모터의 확보가 필요하다. 또한 동물의 경우에서는 배발생 단계에서 유전자를 이식해야 하므로 수정란의 배양 및 외래 유전자 핵내 미세 주입기술이 필수적이다. 그리고 외래 유전자가 주입된 수정란을 대리모에게 이식하는 기술이 요구되며, 여기서 태어난 산자에 대해서 염색체상에 외래 유전자 삽입 여부와 발현 정도를 검정하는 기술이 필요하다.
최초의 체세포 복제 동물인 돌리(Willmut, I. et al., Nature, 1997, 385:810-813)가 탄생한 이후, 체세포 복제 분야는 많은 발전을 거듭하여 소(Cibelli, JB. et al., Science, 1998, 280:1256-1258; Wells, DN. et al., Reprod. Fertil . Dev., 1998, 10:369-378), 생쥐(Wakayama, T. et al., Nature, 1998, 394:369-374), 산양(Bagusi, A. et al., Nat. Biotechnol., 1999, 17:456-461) 등의 복제에 성공을 하게 되었다.
그러나, 돼지는 다른 종에 비하여 수정란에 대한 연구가 상대적으로 적게 이루어졌고, 최소한 4마리의 태아가 자궁에 착상해야만 임신이 유지되는 생리적 특성 등 여러 가지 어려움 때문에 주요 가축 중에서는 비교적 늦게 복제에 성공을 하게 되었다(Poleajaeva, IA. et al., Nature, 2000, 407:86-90; Onishi, A. et al., Science, 2000, 289:1188-1190; Betthauser, J. et al., Nat. Biotechnol., 2000, 18:1055-1059). 그 후, 돼지 체세포에 외부 유전자를 주입시켜 복제에 성공함으로써 최초의 형질전환 복제 돼지가 탄생하였고(Park, KW. et al., Anim . Biotechnol., 2001, 12:173-181), 특정유전자를 체세포에서 결손(knockout)시킨 복제 돼지도 성공하였다(Lai, L. et al., Nat. Biotechnol., 2002 Mar, 20(3):251-255). 그러나, 돼지 체세포 복제 분야의 급속한 발전에도 불구하고 아직도 복제의 효율은 1-5%로 낮아 효율을 개선시키기 위한 많은 연구가 진행 중이다.
CSF(Colony stimulating factors, CSF)는 조혈모세포의 생존, 증식, 분화를 위해 필요한 당단백질(glycoprotein)이다. 혈구생성과정(hematopoiesis)을 촉진하는 사이토카인들은 골수의 전구세포에 작용하여, 특정한 세포의 분화 및 성장을 촉진하는 단백질 인자로서 발견되었다. 골수의 전구세포를 소프트 아가(soft agar)가 들어있는 배지에서 키우면서, 단백질 인자를 넣어주게 되면, 아가위에 특정한 세포의 집단이 콜로니(colony)를 이루어 자라게 된다. 이러한 콜로니 중에 있는 세포를 조사하게 되면 넣어준 단백질이 그러한 세포 타입의 분화에 관여하는 것을 알 수 있다. 이와 같이 전구세포에 작용하여 특정한 세포 집단의 분화를 촉진하는 사이토카인을 CSF라고 부른다.
이러한 CSF에는 과립세포(granulocyte CSF, G-CSF), 과립세포-대식세포 CSF(granulocyte-macrophage CSF, GM-CSF), 대식세포 CSF(M-CSF), 인터루킨-3(interleukin-3, IL-3 또는 multi-CSF), IL-7 등이 있다.
M-CSF(monocytes-macrophage CSF)는 대식세포, 내피세포(endothelial cells), 섬유아세포에 의해 만들어져, 단구세포가 될 세포들에 작용한다. IL-3는 CD4 T cell에 의해서 생산되어, 대부분의 미성숙 골수 세포(immature bone marrow cell)에 작용하여 여러 타입의 혈구를 생산해내는 사이토카인이다(multilineage CSF). IL-7은 골수 스트로마세포(bone marrow stromal cell)에 의해 생산되어, B 림프세포가 될 세포에 작용한다. G-CSF는 활성화된 T 세포(activated T cell), 대식세포, 혈관내피 세포, 섬유아세포에 의해 만들어져, 과립세포가 될 세포들에 작용한다. GM-CSF는 활성화된 T 세포(activated T cell), 대식세포, 혈관 내피세포(vascular endothelial cells), 섬유아세포(fibroblasts)등에 의해 만들어져, 과립세포와 단구세포(monocyte) 계통의 세포들이 분화되도록 조절한다.
전 세계적으로 G-CSF와 GM-CSF만이 재조합 치료용 단백질로 사용되고 있을 뿐이다(표 1 참조).
<표 1> 재조합 G-
CSF
및 GM-
CSF
의 상업적으로 이용가능한 제형 및 그 승인된 용도
G-CSF와 GM-CSF는 내인성(endogenous) 상태에서 다양한 형태의 당화(glycosylation) 양상을 보여주고 있다(표 2 참조).
<표 2> G-
CSF
및 GM-
CSF
의 생화학적 성질
GM-CSF의 염색체상의 위치는 IL-3와 나란히 연결되어있으며, IL-4, IL-5, 그리고 M-CSF와는 가깝게 존재한다. hGM-CSF는 사이토카인이나 면역 및 감염 등의 자극을 받은 T-세포, B-세포, 대식세포, 비만세포(mast cell), 내피세포 및 섬유아세포등의 다양한 세포에 의하여 생산된다(표 3 참조).
<표 3> G-
CSF
및 GM-
CSF
의 세포 출처
G-CSF가 호중구와 이의 전구세포에 대하여 제한적인 작용을 하는 반면, GM-CSF는 단구와 대식세포에 대한 많은 작용을 보여준다. 그러한 작용중에는 식균작용(phagocytosis)나 세포내 병균을 죽이는 식균작용등에 일부 관여한다. 또한, 직접적으로는 엔도톡신(endotoxin)이나 다른 염증반응등에 의하여 발현되는 조혈성장 인자(hematopoietic growth factor, M-CSF & G-CSF)나 IL-6, IL-1, TNF 등의 유전자 발현을 항진시키거나, 이러한 것들을 발현하는 세포들의 염증 및 면역반응에 대한 참여를 촉진한다. 특히, GM-CSF의 여러가지 작용들은 염증성 사이토카인(인터페론-γ)이나 조혈 인자(M-CSF)등과 함께 동반 상승 작용 효과를 보인다(표 4 참조).
<표 4> 성숙
이펙터
(
effector
)
세포상에서
G-
CSF
및 GM-
CSF
의 생물학적 효과
최근 hGM-CSF는 치료를 목적으로 한 재조합 DNA 기술을 이용한 다양한 방법에 의하여 생산되고 있다. 효모(yeast)와 조직세포 배양(tissue culture system)방법은 현재까지도 가장 폭넓게 사용되고 있는 방법이다. 하지만, 효모에서의 적절한 후-번역 수정 장치의 결여와 동물세포에서 대량생산의 어려움 때문에 수요량을 충분히 충족시킬 수 없는 상황이다.
상기와 같은 문제점들을 극복하고자 본 발명자들은 성체 체세포를 이용한 형질전환 복제 돼지 생산기술 및 유선 조직 특이적 발현에 의한 돼지 유즙을 통한 재조합 hGM-CSF의 생산하고자 노력한 결과, 염소의 β-카제인 프로모터(casein promoter) 및 hGM-CSF를 코딩하는 폴리펩티드를 포함하는 발현 벡터로 돼지 태아 세포를 형질전환시킨 다음 상기 형질전환된 세포와 탈핵 난자를 융합시켜 복제란을 제조하고 상기 복제란을 대리모돈에 이식하여 hGM-CSF가 유선에서 발현되는 복제 돼지가 생산됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 유선 조직 특이적으로 CSF를 발현하는 형질전환 복제 돼지의 제조 방법 및 상기 방법에 의하여 형질전환 돼지를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 돼지 태아로부터 체세포를 분리하는 단계;
2) 유선(mammary gland) 특이적 프로모터 및 CSF(Colony stimulating factor, 세포집락 자극 인자)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제조한 후 상기 체세포에 도입시키는 단계;
3) 상기 발현 벡터가 도입된 클론 체세포를 선별한 후 배양하는 단계;
4) 모돈으로부터 채취한 난자의 핵을 제거하고 상기 클론 체세포와 융합시키는 단계; 및
5) 상기 융합된 복제란을 대리 모돈에 이식하고 자돈을 출산하는 단계를 포함하는 CSF 단백질을 발현하는 형질전환 돼지의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조되는 유선조직에서 특이적으로 CSF를 발현하는 형질전환 돼지를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질 전환 돼지의 클론 세포주를 제공한다.
본 발명에 있어서, "클론 세포주"는 유전체에 도입된 벡터의 위치가 동일한 세포주를 가리킨다.
또한, "위란강"은 난자의 투명대와 난세포질 사이의 공간을 가리킨다.
또한, "복제란"은 전기적 자극에 의하여 난자와 체세포가 융합된 단계를 가리킨다.
<약어 설명>
SS : 재생불량 빈혈(aplastic anemia),
AL : 급성 빈혈(acute leukemia),
BMT : 골수 이식(bone marrow transplantation),
CIN : 화학요법-유도 호중성 백혈구 감소증(chemotherapy-induced neutropenia),
MDS : 골수 형성 이상 증후군(myelodysplastic syndrome),
PBPC : 말초 혈액 전구 세포 이식(peripheral blood progenitor cell transplantation),
SCN : 중증 만성 호중성 백혈구 감소증(severe chronic neutropenia),
HIV : 인간 면역 결핍 바이러스(human immunodeficiency virus)
ADCC : 항체-의존성 세포내 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity),
sTNFR : 용해성 종양 괴사 인자 수용체(soluble tumor necrosis factor receptor),
IL-1 Rap : 인터루킨-1 수용체 대항제 단백질(interleukin-1 receptor antagonist protein),
LTB4R : 루코트리엔 B4 수용체(leukotriene B4 receptor),
LPS : 리포폴리사카라이드( lipopolysaccharide).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
1) 돼지 태아로부터 체세포를 분리하는 단계;
2) 유선(mammary gland) 특이적 프로모터 및 CSF(Colony stimulating factor, 세포집락 자극 인자)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제조한 후 상기 체세포에 도입시키는 단계;
3) 상기 발현 벡터가 도입된 클론 체세포를 선별한 후 배양하는 단계;
4) 모돈으로부터 채취한 난자의 핵을 제거하고 상기 클론 체세포와 융합시키는 단계; 및
5) 상기 융합된 복제란을 대리 모돈에 이식하고 자돈을 출산하는 단계를 포함하는 CSF 단백질을 발현하는 형질전환 돼지의 제조 방법을 제공한다. 상기 단계 1)의 돼지 태아는 임신 40-80일령의 태아인 것이 바람직하며, 단계 1)의 돼지 태아는 임신 50-70일령의 태아인 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 60일령의 태아를 사용하여 돼지 체세포를 분리하였다. 체세포를 분리하기 위한 방법으로는 종래에 사용되는 일반적인 방법이 본 발명에 동일하게 적용될 수 있으며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 면도날을 이용하여 돼지 태아를 잘게 자른후 트립신을 처리하여 계대 배양함으로써 체세포를 분리하였다.
상기 단계 2)의 CSF는 hGM-CSF인 것이 바람직하나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 CSF 단백질을 포함하는 발현벡터는 유선 세포에서 발현시킬 수 있는 공지된 모든 발현벡터를 제한 없이 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 pBC1-neo 벡터를 사용하였다. 또한 상기 CSF 단백질을 발현시키기 위한 프로모터로서 소 αs1-카제인, β-카제인, β-락토글로불린 및 유청 산성 단백질(whey acidic protein) 등의 조절 서열과 같은 유선에서 특이적으로 발현하는 것으로 알려진 프로모터는 모두 제한 없이 사용할 수 있으나, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 염소의 β-카제인 프로모터(casein promoter)를 사용하였다.
상기 단계 3)에 있어서, 단계 2)의 발현 벡터가 도입된 체세포는 선별마커가 도입된 발현 벡터를 사용함으로써 용이하게 선별할 수 있다. 이러한 선별 마커로는 바람직하게는 항생제 내성 유전자가 사용될 수 있다. 상기 항생제 내성 유전자에는 neor,pacr, bsrr, hphr 등이 사용될 수 있으며, 본 발명에서는 neor을 사용하였다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 G418을 처리하여 CSF 유전자를 포함하는 발현 벡터가 도입된 체세포를 선별하였다. 상기 방법에 의하여 최종 확인된 클론 세포주를 한국 세포주 연구 재단에 2005년 7월 19일자로 기탁하였다(기탁번호 : KCLRF -BP-00115).
본 발명에서는 상기와 같은 방법으로 돼지 체세포에 CSF 유전자로서 hGM-CSF 유전자를 효율적으로 주입하여 hGM-CSF를 발현하는 돼지 클론 체세포주를 선별하고, 이를 핵이 제거된 돼지 난자에 이식하여 CSF를 유선 특이적으로 발현하는 형질전환 돼지를 제조하였다.
따라서, 본 발명에 의하여 hGM-CSF를 돼지의 유선을 통하여 대량생산하고 생리적으로 인간과 가까운 돼지를 이용하여 인간과 유사한 당화 형태의 단백질을 얻을 수 있을 것으로 기대된다. 이를 위하여, pBC1 유발현 벡터 키트(Milk Expression Vector kit, Invitrogen, USA)을 이용하여 돼지의 유선에서 hGM-CSF를 발현할 수 있도록 유도하였다. hGM-CSF를 발현하는 형질전환 세포주 개발을 위하여 pBC1 벡터를 변형하여 pBC1/neo-hGM-CSF를 제작하였고, 이를 선형화(linearlization)하여 랜드레이스(Landrace) 돼지 체세포에 트랜스펙션하였다. 이때, 인간 게놈에서 PCR을 통하여 얻은 hGM-CSF 유전자의 ORF(Open reading frame)를 증폭하였고, 염기서열 분석(sequencing)을 통하여 염기서열이 게놈 유전자와 100% 일치하는 것을 사용하였다. 또한, 완성된 pBC1/neo-hGM-CSF 벡터가 효율적으로 발현하는지 확인하기 위하여 생쥐의 유선 세포에 트랜스펙션하였고, RT-PCR(도 3 참조)과 웨스턴 블랏(Western blot, 도 4 참조)을 통하여 RNA와 단백질의 발현을 확인하였다.
돼지 태아 섬유아세포(Fetal fibroblast cell)를 이용하여 hGM-CSF 유전자의 형질전환(transfection)하고, G418로 선별된 체세포는 우선 PCR을 통하여 hGM-CSF와 neo 유전자(도 5 참조)을 확인하였다. PCR을 통하여 확인된 세포는 서던 블랏을 통하여 hGM-CSF가 삽입된 것을 재확인하였다(도 6 참조). 형질전환이 확인된 체세포를 이용하여(도 7 참조) 체세포 복제 방법을 이용하여 hGM-CSF를 갖는 형질전환 복제돼지를 생산하였다.
최근, hGM-CSF는 치료를 목적으로 한 재조합 DNA 기술을 이용한 다양한 방법에 의하여 생산되고 있다. 효모(Yeast)와 조직세포배양(tissue culture system)방법은 현재까지도 가장 폭넓게 사용되고 있는 방법이다. 하지만 효모에서의 적절한 후-번역 수정 장치(post-translational modification machinery)의 결여와 동물세포에서 대량생산의 어려움 때문에 수요량을 충분히 충족시킬 수 없는 상황이다. 따라서, 이러한 문제점들을 극복하고자 이제까지 많은 연구자들이 형질전환동물을 이용한 치료용 단백질의 대량 생산에 많은 노력을 기울여 왔다. 이러한 노력 중에는 원하는 유전자를 주요한 유단백질 유전자를 통하여 유선에서 직접적으로 발현하도록 하는 전략이 사용되어 왔다. 지금까지 소 αs1-카제인, β-카제인, β-락토글로불린 및 유청 산성 단백질(whey acidic protein) 등의 조절 서열들을 이용하여 유선에서 이종 단백질(heterologous protein)을 생산하는 마우스, 토끼 또는 가축들이 이용되어 왔다.
본 발명에서는 돼지를 이용하여 인간 치료 단백질(therapeutic protein)을 생산하기 위하여 돼지의 체세포에 hGM-CSF를 효율적으로 주입하여 형질전환된 세포주를 확립하고 형질 전환 복제 돼지를 생산하였다. 이를 위하여, 염소 β-카제인 프로모터를 이용하여 돼지의 유선에서 hGM-CSF를 발현하도록 하는 형질전환돼지를 생산하였다. 따라서, 인간 조혈 성장인자(hematopoietic growth factor)와 유사한 재조합 hGM-CSF의 생산이 가능할 것으로 여겨진다. 그러므로, 돼지에 의하여 발현되는 hGM-CSF 양이 규모화(scaling up) 된다면 본래의 인간 단백질과 유사한 특징을 갖고, 치료용으로 사용가능한 재조합 인간 GM-CSF의 좋은 원천이 될 것으로 여겨진다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1> 돼지 체세포의 제작
임신 60일령의 돼지 태아를 면도날로 잘게 자른 후 세포를 트립신(trysin)-EDTA(Gibco. Inc)가 첨가된 DMEM(bio-whittaka. Inc)에서 5분간 배양하였다. 상층액을 원심분리(1000 rpm, 5분)한 후 10% FBS가 포함된 DMEM에서 배양하고 세포가 90% confluency에 이르면 트립신 처리 후 계대배양하여 일부는 핵이식에 이용하고 나머지는 동결보존하였다.
<
실시예
2>
hGM
-
CSF
발현 벡터의 제작
hGM-CSF 벡터는 pBC1 유 발현 벡터(Milk Expression Vector, Invitrogen, 도 1 참조)에 neo를 붙인 pBC1-neo를 이용하였다. Neo 내성 유전자는 pPNT 벡터를 NotⅠ이 포함된 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하고, pGEM-T-easy 벡터에 클로닝하였다. 이때 사용한 프라이머는 서열번호 1로 기재되는 Neo-Forward-5'-ATG CGG CCG CGA GGG CCC CTG CAG GTC AAT-3' 및 서열번호 2로 기재되는 Neo-Reverse-5'-GAG CGG CCG CTC GGT ACC CGG GGA TCC TCT-3’이다. pGEM-T-Neo 벡터와 pBC1 벡터를 NotⅠ으로 잘라 클로닝하여 pBC1-neo 벡터를 제작하였다. hGM-CSF는 인간 게놈 DNA에서 hGM-CSF 유전자의 ORF부분을 PCR로 증폭하고 이를 pGEM-T-easy 벡터에 클로닝하여 염기서열 분석으로 확인하였다. 이때 사용한 프라이머에는 XhoⅠ이 포함되었으며, 프라이머의 서열은 서열번호 3으로 기재되는 hGM-CSF-Forward-5'-GAC TCG AGA GGA TGT GGC TGC AGA GCC -3‘이며, 서열번호 4로 기재되는 hGM-CSF- Reverse-5'-GAC TCG AGC ATC TGG CCG GTC TCA CT-3' 이다. pGEM-T-hGM-CSF와 pBC-neo를 각각 XhoⅠ으로 잘라 클로닝하여 pBC/neo-hGM-CSF 벡터를 제작하였다(도 2 참조).
<
실시예
3>
hGM
-
CSF
재조합 단백질 확인
pBC/neo-hGM-CSF 벡터가 유선조직에서 효율적으로 hGM-CSF를 발현하는지 확인하기 위하여 생쥐의 유선 암세포주인 HC11을 이용하였다. 형질전환 시약(LipofectamineTM 2000, Invitrogen)을 이용하여 DNA와 10 ㎕ : 4㎍ 의 비율로 6웰에서 20시간 동안 트랜스펙션을 실시하였다. 트리졸(Gibco)을 이용한 전체 RNA를 추출하고, One Step RNA PCR 키트(TaKaRa, Japan)를 이용하여 RT-PCR을 실시하였다(도 3 참조). 이때 사용한 프라이머의 서열은 서열번호 3으로 기재되는 hGM-CSF-Forward 프라이머 및 서열번호 5로 기재되는 Reverse-5'-ATC TGG GTT GCA CAG GAA GT-3'이다. 또한, 인간 게놈에서 PCR을 통하여 얻은 hGM-CSF 유전자의 ORF(Open reading fram)를 증폭하였고, 염기서열 분석(sequencing)을 통하여 염기서열이 게놈 유전자와 100% 일치하는 것을 사용하였다. 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 RT-PCR 및 아가로스 젤 전기영동에 의하여 hGM-CSF의 밴드를 확인함으로써 pBC/neo-hGM-CSF 벡터가 유선조직에서 제대로 작동함을 확인할 수 있었다.
또한, hGM-CSF(N-19, sc-1321, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) 항체를 이용, 웨스턴 블랏팅을 실시하여 hGM-CSF 단백질이 발현함을 확인함으로써 hGM-CSF의 유선 특이적 발현이 이루어짐을 나타내었다(도 4 참조).
<
실시예
4>
hGM
-
CSF
발현 클론 세포주 제작 및
hGM
-
CSF
유전자의 유무 확인
<4-1>
hGM
-
CSF
발현 클론 세포주 제작
hGM-CSF 발현을 위해 제작된 pBC1/neo-hGM-CSF 벡터를 AatⅡ로 잘라 선형화하였다. 이렇게 준비된 DNA를 돼지 체세포 내에 주입하기 위하여 형질전환 시약(LipofectamineTM 2000, Invitrogen)을 사용하였다. 트랜스펙션 후 24시간 배양하고, G418(Genecitin, Gibco)을 300㎍/㎖로 약 3주간 처리하여 콜로니가 형성된 것을 채취하여 클론 세포주를 제작하였다.
<4-2>
PCR
분석에 의한 1차 확인
선별된 체세포 중 일부는 게놈 DNA를 분리하여 hGM-CSF 유전자의 유무를 확인하였다. 상기 체세포에 프로테이나제(Proteinase) K(Gibco. Inc)를 처리하여 단백질을 분해시킨 후 페놀로 단백질을 변성시켜 게놈 DNA를 분리하였다. PCR의 프라이머는 hGM-CSF의 경우 서열번호 6으로 기재되는 pBC1-Forward-5'-GAT TGA CAA GTA ATA CGC TGT TTC CTC-3’및 서열번호 7로 기재되는 pBC1-Reverse-5'-CAT CAG AAG TTA AAC AGC ACA GTT AG-3'이다. Neo 유전자에 대한 프라이머는 서열번호 8로 기재되는 5’-GGA TTG CAC GCA GGT TCT CCG-3' 및 서열번호 9로 기재되는 5‘-ATT CGG CAA GCA GGC ATC GCC-3' 이며, hGM-CSF 유전자에 대한 PCR 조건은 94℃, 4 분 과 94℃, 1 분, 59℃ 1 분, 72℃ 1 분 30 회 및 72℃ 10 분, 4℃이고, Neo 유전자에 대한 PCR 조건은 94℃, 4 분과 94℃, 1 분, 60℃ 1 분, 72℃ 1 분 30 회 및 72℃ 10 분, 4℃이었다.
상기 PCR 방법을 아가로스 젤 전기영동으로 GM-CSF 및 NEO 유전자 밴드를 확인함으로써 hGM-CSF 유전자가 존재함을 나타내었다(도 5 참조).
<4-3>서던
블랏
(Southern blot) 분석에 의한 2차 확인
선별된 세포를 프로테이나제 K(Gibco. Inc)로 처리하여 단백질을 분해시킨 후 페놀로 단백질을 변성시켜 게놈 DNA를 분리하였다. 분리된 게놈 DNA를 EcoRI으로 잘라 서던 블랏 분석을 시행하였다. 프로브는 hGM-CSF 유전자(2kb)를 pBC1/neo-hGM-CSF에서 XhoⅠ으로 잘라 사용하였고, 표지(labeling) 키트(Gene Image Random Prime Labelling Module, Amersham, INC)를 사용하여 표지화하였다. 그 결과, PCR을 통하여 확인된 세포는 서던 블랏을 통하여 hGM-CSF가 삽입된 것을 재확인하였다(도 6 참조).
상기 방법에 의하여 최종 확인된 클론 세포주를 한국 세포주 연구 재단에 2005년 7월 19일자로 기탁하였다(기탁번호 : KCLRF -BP-00115).
<
실시예
5> 체세포 복제 방법을 이용한
hGM
-
CSF
를 갖는 형질전환 복제 돼지 생산
<5-1>배양액
성숙 배양액은 TCM199(31100035; Gibco, Grand Island, NY)에 0.1% 폴리비닐 알콜(polyvinylalcohol), 3.05mM D-글루코스, 0.91 mM 소듐 피루베이트(sodium pyruvate), 0.57mM 시스테인(cysteine), 0.5 g/ml LH(Sigma, USA), 0.5 g/ml FSH(Sigma, USA), 10 ng/ml 내피 성장 인자(epidermal growth factor, Sigma, USA), 75 g/ml 페니실린 G(Sigma, USA) 및 50 g/ml 스트렙토마이신(Sigma, USA)을 첨가했다.
미세 조작용 배양액은 TCM199에 0.3% BSA와 7.5 g/ml 사이토칼라신(cytochalasin B, CB)를 첨가하였다. 활성화 배양액은 0.3 M 만니톨에 1.0 mM CaCl2H2O, 0.1 mM MgCl2·6H2O, 0.5 mM HEPES를 첨가하였다. 복제란의 발생 배양액은 NCSU(North Carolina State University)-23 배지에 0.4 % BSA를 첨가하였다.
<5-2>난자의 채취 및 미세 조작(
Micromanipulation
)
도축장에서 미경산돈의 난소를 채취하여 35-39℃, 0.9% 생리적 식염수에 넣어 실험실까지 운반하였다. 난자는 일회용 10-ml 주사기에 18-게이지(gauge) 바늘을 연결하여 직경 2-6 mm 난포에서 난포액을 흡입하여 채취하였다. 난자를 성숙배양액에서 세척하고 500μl 배양액이 들어있는 4-웰 플레이트에 50-60개 넣어 42-44 시간 배양하였다.
상기 난자를 미세조작용 배양액에서 5-10분간 배양한 후 체세포를 배양액에 첨가하였다. 직경 30 μm의 미세 유리관으로 난자의 제1 극체와 그 주위의 세포질을 제거하고 이 유리관을 이용하여 체세포를 난자의 위란강에 주입시켰다.
<5-3>세포융합 및 활성화
미세조작 후 간격이 1 mm 떨어진 플레티넘(platinum) 전기선 사이에 핵이식란을 위치시켰다. 세포융합 및 활성화는 2회의 DC 펄스 1.0-1.2 kV/cm, 30 μsec을 융합기(BTX Electro-Cell Manipulation 2001, BTX, USA)로 공급하여 유도한 다음 0.5-1시간 후 융합률을 검사하였다.
<5-4>
복제란의
배양
융합된 복제란만을 골라 500μl의 배양액이 들어있는 4-웰 플레이트에서 20-30개의 복제란을 6일간 배양하였다. 배양이 끝나면 5μg/ml 비스벤지미드(bisbenzimide, Hoechst 33342)로 염색하여 형광현미경 하에서 복제란의 핵수를 검사하였다.
<5-5>복제란 이식에 의한 형질전환 돼지 생산
상기에서 검사한 융합된 복제란은 500μl의 배양액이 들어있는 4-웰 플레이트에서 1 내지 2일간 배양한 후 같은 배양액 2ml이 들어있는 동결튜브에 복제란을 넣고 39℃로 가온되어 있는 수정란 운송 장치(embryo transfer kit, Minitube, USA)로 수정란 이식 장소까지 수송하였다. 복제란 이식을 위한 대리모는 발정이 시작된 개체를 선별하여 준비한 후, 펜토탈 소듐(pentothal sodium, 중외제약) 0.5g을 귀정맥에 투여하여 일시 마취시킨다. 마취된 대리모를 수술대에 고정한 후 5% 이소플로레인(Isoflurane, 일성신약)을 공급하여 2차적으로 흡입마취를 실시하였다. 마취된 대리모는 복중선을 따라 약 5cm 가량 절개 후 자궁과 난소를 체외로 노출시켜 준비한다. 이때 복제란을 카테터(Tom-Cat catheter, Monoject, USA) 에 흡입하고 난관의 협부까지 밀어넣어 복제란을 이식한다. GM-CSF 형질전환 복제돼지 생산을 위하여 6마리의 대리모에 총 1243개의 복제란을 이식하였다. 복제란 이식이 완료된 대리모는 30일째 초음파를 이용하여 임신 검정을 실시하고 임신이 확인된 개체는 114일 후 분만을 유도하였다. 이 중, 4마리의 대리모가 임신하여 3마리가 정상적으로 분만하였으며, 10마리의 형질전환 복제 돼지를 생산하였다. 태어난 복제 돼지는 이표와 단미를 통하여 확보된 조직을 프로테이나제 K(Gibco. Inc., USA)로 처리하여 단백질을 분해시킨 후 페놀로 단백질을 변성시켜 게놈 DNA를 분리하였다. 분리된 게놈 DNA를 GM-CSF 유전자의 경우 서열번호 6 및 서열번호 7, 그리고 Neo 유전자의 경우 서열번호 8 및 서열번호 9를 이용하여 형질전환 여부를 확인한 결과, 10마리의 산자 모두 형질전환이 확인되었다(도 7 참조).
인간 GM-CSF는 조혈모세포 및 과립세포, 대식세포, 적혈구, 거대핵세포(megakaryocytes) 및 조혈모세포의 전구체 등의 증식, 분화 및 생존을 조절하는 중요한 조절자이다. 형질전환 복제돼지에서 hGM-CSF가 발현된다면, 이러한 hGM-CSF의 기작은 암이나 장기이식 등의 치료에 의하여 백혈병 치료 보조제 및 면역 강화제 등 면역력이 약화된 환자들에게 보조치료제로써 큰 역할을 할 것이며, 세포주의 핵이식을 통한 hGM-CSF 형질전환 돼지 개발은 발생공학 분야의 연구 및 산업적 이용성이 매우 클 것으로 기대된다.
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- 수탁번호 KCLRF-BP-00115로 기탁된 CSF(colony stimulating factor, 세포 집락 자극 인자) 단백질을 발현하는 형질전환 돼지 클론 세포주.
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