KR100769291B1

KR100769291B1 - 유선 특이적 인간 에리트로포이에틴 발현 벡터, 이를이용한 형질전환 동물 및 이를 이용한 인간에리트로포이에틴의 생산 방법

Info

Publication number: KR100769291B1
Application number: KR1020060013485A
Authority: KR
Inventors: 김진회
Original assignee: 조아제약주식회사
Priority date: 2006-02-13
Filing date: 2006-02-13
Publication date: 2007-10-24
Also published as: KR20070081531A

Abstract

본 발명은 유선 특이적으로 인간 에리트로포이에틴(hEPO) 단백질을 발현하는 벡터, 이를 이용한 형질전환 동물 및 이를 이용한 인간 에리트로포이에틴을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 hEPO 발현 형질전환동물은 유선 특이적으로 에리트로포이에틴을 발현하며, 기존의 방법에 비해 매우 높은 농도로 유즙 중에 에리트로포이에틴을 발현한다.

또한, 본 발명의 형질전환동물로부터 생산된 hEPO 단백질은 시판되는 동종 단백질이 나타내는 것 이상의 안정성 및 우수한 생리활성을 나타낸다.

따라서 본 발명의 hEPO 발현 벡터 및 형질전환동물은 기존의 hEPO 보다 우수한 생리활성을 갖는 hEPO 단백질을 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

유선 특이적 인간 에리트로포이에틴 발현 벡터, 이를 이용한 형질전환 동물 및 이를 이용한 인간 에리트로포이에틴의 생산 방법{Mammary gland-specific human erythropoietin expression vector, transgenic animal and method for producing human erythropoietin using same}

도 1은 본 발명의 pBC1/hEPO/NEO 발현벡터의 구조를 나타낸 도이다.

도 2a는 본 발명의 pBC1/hEPO/NEO 발현벡터 구조이고, 도 2b는 이를 확인한 PCR 결과도이다.

도 3은 실험용 생쥐의 유선, 간, CHO 세포에서 글리코실화에 관여하는 유전자의 발현양상을 분석한 결과이다.

도 4는 본 발명의 hEPO 발현벡터로 형질전환시킨 생쥐에서의 hEPO 발현여부를 관찰한 도이다.

도 5는 본 발명의 형질전환 생쥐의 유선 조직에서 hEPO 단백질 발현을 관찰한 결과도이다.

도 6은 본 발명의 형질전환 생쥐의 유즙에서 생산된 hEPO 단백질 발현을 관찰한 결과도이다.

도 7은 본 발명의 형질전환 생쥐의 유즙에서 생산된 hEPO와 환자의 혈청내 EPO의 2차원 전기영동 젤 사진이다.

도 8은 본 발명의 형질전환 생쥐의 유즙에서 생산된 hEPO와 이포에틴알파의 올리고당 분석결과이다.

도 9는 본 발명의 형질전환 생쥐의 유즙에서 생산된 hEPO의 in vitro 활성측정결과이다.

도 10은 본 발명의 형질전환 생쥐의 유즙에서 생산된 hEPO의 in vivo 활성측정결과이다.

본 발명은 유선 특이적 인간 에리트로포이에틴(hEPO) 발현 벡터, 이를 이용한 형질전환 동물 및 이를 이용한 EPO의 생산 방법에 관한 것이다.

에리트로포이에틴(erythropoietin, EPO)은 태아의 간이나 성인의 신장에서 주로 생성되는 당단백질로 적혈구 생성(erythropoiesis)을 촉진하고, 적혈구 수를 유지하는 데에 중요한 역할을 하는 조혈 호르몬이다.

천연형 인간 EPO는 분자량이 약 34~38kd 이고, 24, 38, 83번 아미노산에 N-linked 당쇄첨가부위를 가지고 있으며, 또한 126번 아미노산에 O-linked 당쇄첨가결합부위를 가지고 있는데, 이 당쇄 부분은 EPO의 생체 내 활성에 필수적인 역할을 수행한다.

EPO는 적혈구 형성에 필수적이이 때문에 빈혈, 특히 신장성 빈혈 치료에 유효하며, HIV-감염환자의 AZT 치료와 관련된 빈혈, 화학치료중인 비-골수암 환자의 빈혈 등의 치료에 EPO를 이용할 수 있다.

이러한 의약 분야에서 경제적 부가가치가 높은 EPO 등의 생산을 극대화하는 방법으로서, 세포배양법에 의한 대량생산방법이 주로 사용되어 왔다. 그러나, 이 방법은 동물의 혈액을 배양 배지로 이용하기 때문에 생산 비용이 높아지고, 배양기술에 있어서 전문적인 지식이 요구된다. 또한 배지 성분에 함유된 동물의 EPO와 새로 생산한 EPO를 완전히 분리하는 것이 불가능하기 때문에 최종적으로 얻는 EPO의 순도가 낮고, 현재까지 동물의 세포에서 생산한 재조합 인간 EPO의 경우는 상기한 천연형 EPO 단백질과 글리코실화(glycosylation)의 상태가 동일하지 않아 생리활성도 낮은 문제점을 가지고 있다.

반면 형질전환동물을 이용한 유용단백질 생산 방법은, 동물이 분비하는 체액 중에 목적단백질이 포함되므로 기존의 세포배양법에 비해 목적단백질의 분리ㆍ정제가 용이하며, 활성 또한 우수하게 유지되므로 이 분야에 대한 관심이 급증하고 있다.

현재까지의 형질전환동물 생산기술에서 목적 단백질을 생산하는 조직은 주로 단백질 발현율이 높은 것으로 알려진 유선 조직이었다. 그러나 지금까지 개발된 유선 특이적 프로모터를 이용하여 형질전환된 동물의 단백질 생산 효율은 실제로 매우 낮은 수준에 머무르고 있으며, 또한, 기존에 보고된 유선 특이적 벡터의 경우 정규 장소 밖의(ectopic) 발현을 보이는 등 여러 가지 문제점이 있다.

국내공개특허 특2001-81456호는 생쥐의 유선으로부터 분리한 WAP 프로모터 및 인간의 EPO 게놈유전자를 포함하는 EPO 형질전환 발현 벡터 및 그 형질전환 돼 지에 대하여 개시하고 있다.

또한, 국내공개특허 제10-2004-101793호는 소의 베타-카제인 프로모터를 사용하여 유선에서 사람 에리트로포이에틴(hEPO)을 발현하는 형질전환 복제소에 대하여 개시하고 있다. 그러나, hEPO의 유즙 내 농도 및 생산된 EPO의 활성에 대한 결과는 전혀 없으므로, 이러한 방법으로 생산된 hEPO가 실용화될 수 있는지 전혀 알 수 없다.

이에 본 발명자는 유선에서만 특이적으로 인간 EPO를 높은 효율로 생산하는 발현벡터를 제작하고, 이를 도입한 형질전환동물이 높은 생리활성을 갖는 인간 EPO를 생산함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 유선 특이적으로 인간 에리트로포이에틴(hEPO) 단백질을 발현하는 벡터를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터를 도입한 형질전환 동물을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터를 이용한 형질전환 동물 생산방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 동물을 이용한 인간 에리트로포이에틴을 생산하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 유선 특이적으로 인간 에리트로포이에틴(hEPO) 단백질을 발현하는 발현벡터를 제공한다.

본 발명은 유선 특이적 프로모터인 베타-카제인 프로모터 염기서열, 그 3' 쪽으로 인간 에리트로포이에틴(hEPO)을 코딩하는 DNA 서열 및 hEPO 유전자의 3'쪽으로 WPRE DNA 서열을 포함하는 pBC1-hEPO-WPRE 벡터를 제공한다.

본 발명의 pBC1-hEPO-WPRE 벡터에서, 상기 hEPO을 코딩하는 DNA 서열은 서열번호 1 에 기재된 것이 바람직하고, 상기 베타-카제인 프로모터 DNA 서열은 서열번호 2 에 기재된 것이 바람직하며, 상기 WPRE DNA 서열은 서열번호 3 에 기재된 것이 바람직하다.

구체적으로, 본 발명에서는 염소의 베타-카제인 프로모터를 포함하는 pBC1 발현벡터에 서열번호 1의 인간 EPO 유전자를 삽입시켜, EPO의 유선 특이적 발현을 가능하게 하는 발현 벡터 pBC1-hEPO를 제공한다.

본 발명의 발현 벡터 pBC1-hEPO는 필요에 따라 인슐레이터(insulator), 또는 WPRE(woodchuck hepatitus virus post-transcriptional regulatory element), 네오마이신 저항성 유전자(neomycin-resistant gene) 등을 추가로 포함함으로써, 형질전환 세포주의 구축을 용이하게 하며, 목적 단백질 발현량의 극대화 및 발현의 안정성을 도모할 수 있다.

인슐레이터는 프로모터 부근에 존재하는 조절인자의 영향을 돕고, 위치 비의존적인 (position-independent) 발현을 도와주는 인자로, 베타-카제인 프로모터의 조절 하에 단백질을 안정적으로 발현할 수 있게 한다.

WPRE는 mRNA의 안정화에 기여하여 단백질 합성량을 증대시킬 수 있는 조절인자로, 베타-카제인 프로모터의 조절 하에 단백질을 대량으로 발현할 수 있게 한다. WPRE의 염기서열은 서열번호 3에 기재된 바와 같다.

네오마이신 저항성 유전자는 세포주 구축시 사용되는 G418 시약에 대해 저항성을 나타내는 유전자로, 베타-카제인 프로모터의 조절 하에 단백질을 발현하는 동물세포주(animal cell line) 구축시 효율적인 선택적 표지 유전자로서 작용할 수 있다. 네오마이신 저항성 유전자의 염기서열은 서열번호 4에 기재된 바와 같다.

본 발명은 상기 조절인자들을 추가로 포함하는 발현 벡터의 바람직한 예로, WPRE를 포함하는 pBC1-hEPO-WPRE 벡터 및 상기 pBC1-hEPO-WPRE 벡터에 네오마이신 저항성 유전자를 추가로 포함하는 pBC1/hEPO/NEO 벡터를 제공한다.

상기 벡터들은 본 발명의 pBC1-hEPO 벡터 내 EPO 유전자의 3' 쪽에 WPRE를 삽입하거나, 여기에 다시 네오마이신 저항성 유전자를 삽입함으로써 제조된다.

이러한 본 발명의 발현 벡터 pBC1/hEPO/NEO는 2005년 12월 2일 한국 농업미생물자원센터 유전자은행에 기탁번호 KACC 95043P로 기탁하였다.

또한, 본 발명의 발현벡터는 필요에 따라 조절인자들, 즉 또 다른 프로모터, 인핸서(enhancer), 선택적 표지 유전자(selective marker), 5'-UTR(untranslated region), 3'-UTR, 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signal), 리보솜 결합 서열, 게놈의 특정 부위로 삽입될 수 있는 염기서열, 또는 인트론을 적절한 위치에 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 발현 벡터를 이용하여 형질전환시킨 체세포를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 발현 벡터를 이용하여 형질전환시킨 체세포를 탈핵된 난자에 핵이식하여 만든 수정란을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 발현 벡터를 이용하여 형질전환시킨 동물을 제공한다.

본 발명의 발현 벡터로 형질전환될 수 있는 동물은 유즙을 분비하는 모든 동물, 즉 돼지, 생쥐, 소, 염소, 양 또는 닭 등을 포함한다.

본 발명의 발현 벡터를 이용한 형질전환동물의 생산 방법은 통상적인 방법에 의한다.

형질전환하고자 하는 동물이 생쥐일 경우, 건강한 개체로부터 수정란을 채취하고, 수정란에 본 발명의 발현 벡터를 도입한 후, 정관결찰 생쥐를 이용하여 위임신 생쥐를 얻고, 이를 대리모로 하여 난관 내에 수정란을 이식한 후, 대리모로부터 얻은 자손 중 형질전환된 개체를 선별하는 과정으로 이루어진다.

형질전환하고자 하는 동물이 돼지일 경우, 먼저 건강한 개체로부터 난포란을 채취하고 체외성숙용 배양액에서 배양한다. 또한, 돼지 태아로부터 채취, 배양한 공여체세포로 본 발명의 발현 벡터를 도입한 후 벡터가 도입된 체세포를 선별, 배양한다. 상기 체외성숙된 난자에서 핵을 제거하고, 이 공간에 공여세포를 주입한 다음, 전기융합을 통해 핵이식이 완료된 난자의 공여세포와 세포질을 융합시킨 후 체외배양한다. 이 복제수정란을 과배란을 유도한 수란돈에 이식한 후, 수란돈으로부터 얻은 자손 중 형질전환된 개체를 선별하는 과정으로 이루어진다.

이후 형질전환된 것으로 확인된 개체로부터 유즙을 수집한 후, 목적 단백질을 분리ㆍ정제함으로써 유용 단백질을 생산하게 된다(A. Gokana, J.J. Winchenn , A. Ben-Ghanem, A. Ahaded, J.P. Cartron, P. Lambin(1997) Chromatographic separation of recombinant human erythropoietin isoforms, Journal of chromatography, 791, 109-118).

또한, 본 발명은 형질전환동물로부터 생산된 유즙 중 발현된 에리트로포이에틴을 분리, 정제하는 방법으로 이루어진 인간 에리트로포이에틴의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 인간 에리트로포이에틴 생산방법에서, 분리ㆍ정제 방법은 통상적으로 사용되는 방법을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 여과법 또는 크로마토그래피법 등이 될 수 있다.

이렇게 하여 제조되는 본 발명의 형질전환동물은 유선 특이적으로 에리트로포이에틴을 발현하며, 기존의 방법에 비해 매우 높은 농도로 유즙 중에 에리트로포이에틴을 발현한다. 또한 특이적으로 수유기 동안의 알비올라 세포에서만 EPO 단백질을 발현한다.

그 예로, 본 발명의 발현 벡터 pBC1/hEPO/NEO로 형질전환된 생쥐의 경우, 200,000 IU~ 400,000 IU/㎖ 수준의 높은 EPO 발현율을 나타낸다. 원래 EPO는 태아의 조기 사망을 유발하기 때문에 발현시키기 어려운 단백질임에도 불구하고, 본원발명의 형질전환 동물에서는 기존의 유선 특이적 프로모터를 이용하여 제조된 형질전환동물의 유즙 내 단백질 발현율에 비해 1000배 이상의 높은 발현율을 나타낸다.

또한 본 발명의 형질전환동물로부터 생산된 EPO 단백질은 시판되는 동종 단 백질이 나타내는 것 이상의 안정성 및 우수한 생리활성을 나타낸다.

그 예로, 본 발명의 발현 벡터 pBC1/hEPO/NEO로 형질전환된 생쥐로부터 얻은 EPO는, 시알릭산(sialic acid)을 많이 함유하고 있어 RBC 전구세포에 작용하여 우수한 단백질 활성을 나타낸다.

또한, 본 발명의 형질전환동물로부터 생산된 EPO 단백질을 투여시 혈액 내 혈소판, 적혈구, 혈색소, 헤마토크릿(hematocrit)을 증가시키는 작용효과를 나타낸다.

따라서 본 발명의 EPO 발현 벡터 및 형질전환동물은 기존의 EPO 보다 우수한 생리활성을 갖는 EPO 단백질을 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 본 발명의 최적의 유선특이적 인간 에리트로포이에틴(hEPO) 발현 벡터 제작

본 발명은 유선(mammary gland)에서 hEPO를 분비하는 최적 벡터를 구축하였다.

1) pBC1-hEPO 벡터 구축

본 발명의 유선 특이적 발현벡터를 제작하기 위해, 염소의 베타-카제인 프로 모터(goat beta-casein promoter)를 갖고 있는 Invitrogen사의 pBC1을 사용하여, 이의 제한효소 XhoI 위치에 인간 에리트로포이에틴 genomic DNA (서열번호 1)을 클로닝하였다.

2) pBC1-hEPO-WPRE 벡터 구축

hEPO의 발현량을 증가시키기 위하여, 상기 pBC1-hEPO 벡터에 WPRE 유전자를 삽입하였다.

WPRE(woodchuck hepatitis virus post-transciptional regulatory element)는 mRNA의 안정화에 기여하여, 최종 단백질 합성을 증대시키는데 관여한다고 보고된 조절인자이다.

이 WPRE 조절인자를 hEPO 바로 뒤에 연결하여 EPO가 전사될 때 함께 mRNA가 만들어지도록 하기 위하여, 상기 1)의 pBC1-hEPO 벡터에서 XhoI 제한효소 위치에 삽입하였다.

WPRE는 Hepatitis virus 로부터 정방향 프라이머(forward primer) 5'-ACCAGGTTCTGTTCCTGTTAATCAACCTC-3'(서열번호 5)과 역방향 프라이머(reverse primer) 5'-CTCGAGGAGCCCGAGGCGAAACAGGCG-3' (서열번호 6)을 이용하여 0.6 kb 길이의 PCR 산물을 증폭하였고 이를 pGEM T-easy 벡터에 클로닝하였다. T-벡터에 클로닝된 0.6 kb WPRE를 SalI 및 XhoI 제한효소로 절단하여 삽입조각(insert) 부위를 준비하였고, pBC1-hEPO을 Xho1 제한효소로 절단하여 준비한 벡터와 라이게이션(ligation) 하여 23975 bp인 pBC1-hEPO-WPRE 벡터를 구축하였다.

3) pBC1/hEPO/NEO 벡터 구축

유선 특이적인 베타 카제인 프로모터의 조절 하에 hEPO 생산을 극대화할 수 있는 벡터만을 가진 세포들을 효과적으로 선택하기 위해, neo 유전자(neomycin-resistance gene)를 클로닝하였다.

G418 drug에 저항할 수 있는 neo' 유전자는 pEGFP-N1 벡터(Clontech, Catalog #6085-1)로부터 정방향 프라이머 5'-GCGGCCGCGCGCGTCAGGTGGCAC-3'(서열번호 7)와 역방향 프라이머인 5'-CGATCGGACGCTCAGTGGAACGAAAACTC-3'(서열번호 8)을 이용하여 1.9 kb PCR 산물을 증폭하여 수득하였으며, 이 후 pGEM T-easy 벡터에 클로닝하였다.

T-벡터에 클로닝된 1.9 kb neo 유전자는 NotI과 PvuI 제한효소로 절단하여 삽입 부위를 준비하였다. 또한, 상기 2)의 pBC1-hEPO-WPRE 벡터의 amp' 유전자 (ampicillin-resistance gene) 부위를 NotI과 PvuI 제한효소로 절단하여 제거한 후 벡터 부위를 준비하였다.

이렇게 준비된 두 삽입조각 및 벡터 부위를 라이게이션을 통해, 기존에 구축된 pBC1-hEPO 벡터에 WPRE 조절인자와 neo 유전자(neomycin-resistance gene)가 삽입된 pBC1/hEPO/NEO 벡터를 구축하였다.

이 결과 얻은 본 발명의 발현벡터의 구조는 도 1에 나타나 있으며, 유선 특이적 프로모터인 베타-카제인 프로모터의 조절 하에서 hEPO를 발현하게 된다.

이를 pBC1-5' + WPRE-R 프라이머쌍 및 hEPO3+WPRE-R 프라이머쌍을 이용한 PCR을 통해 3kb 및 1.5 kb의 PCR 산물을 얻음으로써 pBC1/hEPO/NEO 벡터 제작이 제대로 되었음을 확인하였다(도 2a 및 2b).

이러한 본 발명의 발현 벡터 pBC1/hEPO/NEO는 2005년 12월 2일 농업생명공학연구원에 기탁번호 KACC 95043P로 기탁하였다.

pBC1/hEPO/NEO는 WPRE 조절인자의 도입으로 EPO 단백질 합성이 매우 증가되고, 또한 neo' 유전자의 삽입은 세포주 구축에 매우 효율적인 선택적 표시 유전자로 활용된다.

[실시예 2] hEPO 발현 형질 전환 동물 제작 및 발현된 hEPO 단백질 분석

본 발명의 유선 특이적 hEPO 발현 형질전환 생쥐의 생산에 의한 생리활성 확인 및 안정성 평가를 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

1) 생쥐의 유선에서 글리코실화에 관여하는 유전자의 발현양상 분석

단백질의 글리코실화(glycosylation)는 단백질의 번역 후 변형(post-translational modification)의 한 과정으로, 단백질의 기능을 강화하고 결정하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 글리코실화는 대장균을 포함한 원핵생물, 효모, 동물세포 또는 생쥐 등의 실험동물에서 단백질 발현시 각각 다른 양상으로 나타난다. 이 중 인간과 진화단계가 비슷한 실험동물에게서 생산된 단백질의 글리코실화정도가 인간 생체 내에서 생산된 단백질의 글리코실화와 유사하다고 알려져 있다.

따라서 In vivo에서 재조합된 인간 EPO 단백질의 글리코실화 관여하는 글리코실 트랜스퍼라제(glycosyltransferase)의 발현을 생쥐의 유선, 간 및 EPO의 생산에 유용하게 이용되고 있는 CHO 세포주에서 확인하였다.

먼저, 생쥐의 유선과 간 그리고 CHO 세포주로부터 전체 RNA를 분리한 후, 3종류의 글리코실 트랜스퍼라제(GnT-V, GnT-III 와 Fuc-TIV)의 프라이머쌍(표 1)을 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.

	프라이머 서열	서열번호
mouse GnT-V Forward primer	5'-CACTGTTAATTCGCCCACCT-3'	9
mouse GnT-V Reverse primer	5'-GCTTGGTCCTCCTGACTCTG-3'	10
CHO GnT-V Forward primer	5'-GTACAGAGTGACCTGCCAAA-3'	11
CHO GnT-V Reverse primer	5'-GTCTTTGCATAGGGCCACTT-3'	12
mouse GnT-III Forward primer	5'-GCTCAGGCCTCTAGTAATCT-3'	13
mouse GnT-III Reverse primer	5'-TCCTGACCCCTAACCTACTC-3'	14
CHO GnT-III Forward primer	5'-GCATCTACTTCAARCTCGTG-3'	15
CHO GnT-III Reverse primer	5'-GTGCTCRTGGGCTCCCGGTA-3'	16
mouse & CHO Fuc-TIV Forward primer	5'-CACACDGTGGCCCGCTACAA-3'	17
mouse & CHO Fuc-TIV Reverase primer	5'-TCCCAGAARGARGTGATGTG-3'	18

그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, 세 종류의 글리코실 트랜스퍼라제(GnT-III, GnT-V, Fuc-TIV)는 간이나 CHO 세포주보다 유선(M.G.)에서 상대적으로 높게 발현됨을 알 수 있었다.

따라서 유선 유래 재조합된 인간 EPO는 현재 CHO 세포주에서 생산되어 시판되고 있는 EPO와 비교시 단백질의 글리코실화가 탁월하여, 단백질의 생리활성 뿐만 아니라 질이 구별됨을 확인할 수 있다.

2) 형질 전환 생쥐의 생산

상기 실시예 1에서 구축한 유선 특이적인 베타-카제인 프로모터의 조절 하에 EPO를 발현하는 23kb pBC1/hEPO/NEO 발현벡터(도 1)를 사용하여 현미미세주입에 의하여 형질전환 생쥐를 제작하였다(마크로젠에서 제작).

형질전환 생쥐는 BDF1(C587BL/6 DBA)을 사용하였고, 738개의 수정란에 pBC1/hEPO/NEO를 주입하고, 이 중 700 개의 수정란을 30마리의 대리모에게 이식하였다. 몇 주 후 태어난 총 85마리의 산자 중 9 마리가 형질전환되었음을 PCR과 Genomic Southern blot 결과를 통해 확인하였다(표 2 및 도 4B).

PCR에 사용된 프라이머는 TG check용 정방향 프라이머 5'-CTCCTTGGCAGAAGGAAGCC-3'(서열번호 19)과 TG check용 역방향 프라이머 5'-CAGCCATGGAAAGGACGTCA-3'(서열번호 20)이며 이의 PCR 예상 산물 크기는 600 bp 이었다.

서던 블롯에 사용한 프로브는 hEPO genomic DNA로 서열번호 1의 서열을 포함하는 2.3kb 전체 유전자를 사용하였다.

도 4b는 라인 6 및 라인 37에서 확인된 EPO 유전자 PCR 및 서던블롯 결과이다. 도 4b는 유선 특이적으로 EPO를 발현하는 형질전환 생쥐 중 대표적인 두 라인을 선택하여 분석한 결과 염색체내 10-30 copy 정도 삽입되었으며 생식세포를 통해 다음 세대까지 EPO 유전자가 전달됨을 확인하였다.

Mouse strain	No. of embryos injected	No. of embryos transferred	No. of recipients	No. of mice born	No. of transgenic mice (%)
BDF1 (C57BL/6xDBA)	738	700	30	85	9 (10.6)

3) 형질전환 생쥐에서 EPO의 유선 특이적 발현 확인

상기 2)에서 제작한 형질전환 생쥐에서 EPO 유전자가 유선 특이적으로 발현되는지를 확인하였다.

먼저, 상기 형질전환된 생쥐로부터 수립한 라인 6 및 라인 37 생쥐의 여러 조직(유선, 뇌, 신장, 심장, 비장, 간, 자궁, 폐)에서 각각 RNA를 추출한 후 당업계에 통상적인 방법으로 RT-PCR과 노던 블롯 (Northern blot) 분석을 하였다.

EPO cDNA를 탐지하기 위하여, RT-PCR에서는 hEPO 특이적 프라이머로 정방향 프라이머 5'-GTAGAAGTCTGGCAGGGCCT-3'(서열번호 21)과 역방향 프라이머 5'-TCATCTGTCCCCTGTCCTGC-3'(서열번호 22)을 사용하였다.

노던 블롯 분석에서 사용한 프로브는 EPO full genomic DNA로 서던 블롯 분석에서 사용한 2.3kb 동일한 프로브를 사용하였다.

도 4C를 보면, RT-PCR 결과에서는 유선(mammary gland: M.G.)에서는 강하게 발현되는 반면, 신장(kidney:K)에서 아주 약하게 발현이 되는 것으로 확인되었다. 또한, 도 4D의 Northern blot 분석결과에서는 EPO 유전자가 다른 조직에서는 전혀 발현되지 않고 오직 유선(M.G.)에서만 특이적으로 발현되는 것을 확인하였다.

(도면 중 B: brain, 뇌; H: heart, 심장; S: spleen, 비장; L: liver, 간; U: uterus, 자궁; Lu: lung, 폐를 의미함)

또한, 형질전환 생쥐에서 EPO 단백질 발현 여부 및 발현하는 세포종류를 알아보기 위해 조직에 대하여 면역조직화학법(immunohistochemistry)을 수행하였고, 이 때 EPO 항체는 Anti-human antibody (AB-286-NA, R&D system)를 사용하였다.

그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5A의 대조군 생쥐의 임신 16일째 유선에서는 EPO의 발현을 확인할 수 없었다. 반면, 형질전환 생쥐의 임신 16일(도 5B)과 분만 후 5일(도 5C)에서는 유선폐포 세포(alveolar cell)에서 EPO가 발현하는 것을 확인할 수 있었으며, 분만 후 16일(도 5D)에서는 유선폐포 세포가 퇴행하여 EPO의 발현이 없어지는 것을 확인하였다.

도 5와 같이 본 발명의 hEPO 형질전환 생쥐에서는 수유기 동안의 유선 폐포 세포에서만 EPO 단백질이 특이적인 발현을 보이는 것을 확인할 수 있었다.

4) 발현되는 EPO 단백질 분석 및 안정성 확인

상기 2)에서 제작한 형질전환 생쥐의 유즙에 발현되는 EPO 단백질 및 그 농도를 당업계의 통상적인 웨스턴 블롯 분석법(Anti-human antibody 사용(AB-286-NA, R&D system))으로 확인하였다.

그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6A는 형질전환 생쥐의 유즙을 이용한 웨스턴 블롯 분석결과로, 레인 1과 2 는 양성 대조군으로써 GST가 결합(tagging)되어 있는 EPO 항원 5ng, 10ng을 나타낸 것이며, 레인 3은 대조군 생쥐의 유즙, 레인 4와 5는 각각 형질전환 생쥐 라인 6과 37의 유즙 내 EPO을 나타낸 것이다.

도 6A의 결과 본 발명의 형질전환 생쥐 유즙에서 34 KDa 분자량을 가진 단백질이 발현됨을 확인했으며, 전체 단백질 중 0.7-1.4%를 차지하였다.

또한, 형질전환 생쥐의 유즙유래 EPO의 글리코실화 패턴을 확인하기 위하여 N-글리코시다제-F(N-glycosidase F) 또는 N-글리코시다제-F와 O-글리코시다제로 자른 후 웨스턴 블롯을 실시하였다.

도 6B에서 레인 1은 유즙유래 EPO, 레인 2는 N-글리코시다제-F로 자른 EPO, 레인 3은 N-글리코시다제-F 와 O-글리코시다제로 자른 EPO를 나타낸 것이다.

도 6B 결과를 통해 N-글리코실화 부위 3개와 O-글리코실화 부위가 잘려 최종적으로 18KDa의 EPO를 확인함으로써 후변형(post-modification)이 제대로 일어났음을 확인하였다.

또한, 본 발명의 hEPO 형질전환 생쥐의 유즙 내 EPO의 농도를 확인하기 위하여 ELISA 키트(Human Erythropoietin ELISA, #01630, stem cell technology사)를 사용하여 정량분석한 결과, 수유기 1-5일 사이 약 200,000-400,000 IU/㎖ 이 발현됨을 확인하였다(표 3).

형질전환 생쥐의 유즙 내 EPO의 정량적인 분석

	mice	ELISA Kit (Stem Cell Technology)
Line	Days of lactation
6	1	456 ± 33 IU/㎕
6	3	383 ± 28 IU/㎕ Transgenic
6	5	233 ± 24 IU/㎕
37	3	384 IU/㎕
* rhEPO concentration was measured after complete N- and O- digestion (18 kDa).

또한, EPO의 안정성을 확인하기 위해 형질 전환된 생쥐의 유즙에서 생산된 인간 EPO와 신부전증 환자의 혈액을 이용해 2D 분석을 수행하였다.

도 7에 나타난 2D 분석결과를 통해 형전전환 생쥐 유래 EPO는 전하(charge)와 크기(size)가 heterogeneous 나타남을 알 수 있다. 일반적으로 단백 말단에 시알릭산과 같은 당사슬(sugar chain)이 많을수록 PI값이 낮게 되는데, 도 7에서 형질 전환된 라인 6과 37의 생쥐의 유즙에서 재조합된 인간 EPO는 대조군과 신부전증 환자 혈청보다 acidic 상태로 나타나, 시알릭산을 많이 함유하고 있음을 확인할 수 있다.

반면, 대조군과 신부전증 환자의 혈액은 asialic 상태임을 확인하였다.

시알릭산과 같은 당사슬은 단백질의 구조와 기능에 영향을 미치며 sialic 상태는 RBC 전구세포에 작용해 단백질 활성을 가지며 asialic 상태는 liver receptor와 결합해 오줌으로 배출되어 활성을 가지지 못한다고 보고되어 있다(Parekh RB, et al. (1989) N-glycosylation and in vitro enzymatic activity of human recombinant tissue plasminogen activator expressed in Chinese hamster ovary cells and a murine cell line. Biochemistry 28: 7670-7679; Tam RC, et al. (1991) Comparisons of human, rat and mouse erythropoietins by isoelectric focusing: differences between serum and urinary erythropoietins. Br J Haematol 79: 504-511).

따라서 본원발명의 EPO 발현 형질전환 생쥐로부터 생산된 hEPO는 RBC 전구세포에 작용해 hEPO 단백질 활성을 가질 것으로 사료된다.

5) 형질전환 생쥐의 유즙으로부터의 hEPO 분리

먼저 본 발명의 형질전환 생쥐의 유즙 3 ㎖을 10mM 트리스 완충액 (pH 6.8) 20 ㎖에 현탁하여 막필터(membrane filter)에 담아 4 ℃, 10mM 트리스 완충액 (pH 6.8) 1,000 ㎖로 2회 밤새 투석하였다. 투석을 마친 현탁액을 원심분리관에 옮겨 담아 4,000rpm으로 30분간 냉장원심분리하여 침전물을 제거하였다.

상등액 약 20 ㎖을 pM 100막 (Amicon) 필터로 여과하고 그 여액을 10mM 트리스 완충액 (pH 6.8) 300 ㎖에 현탁한 다음 미리 10mM 트리스 완충액 (pH 6.8)로 충분히 평형화시킨 DEAE sephadex column(2Φ× 15cm, bed volume 40 ㎖)에 3 ㎖/min 유속으로 주입하였다. 그 다음 10mM 트리스 완충액 (pH 6.8) 500 ㎖로 칼럼을 충분히 세척한 후 0 mM에서 325mM NaCl을 함유한 10mM 트리스 완충액으로 각 분획의 사이즈는 3 ㎖, 유속은 21 ㎖/h로 gradient 용출시켰다.

상기 용출된 각 분획 중 EPO를 함유한 분획을 모은 후, 이를 pM 10막에 넣고 0.15M NaCl을 함유한 10mM 트리스 완충액 (pH 7.2)으로 3배 세척하여 3 ㎖로 농축하였다. 이 액을 앞서와 동일한 완충액으로 미리 평형화시킨 Sephadex G-100(2Φ× 100cm)에 주입한 후 유속 24 ㎖/h, Fraction size 3m로 용출시켰다.

상기 용출된 각 분획 중 EPO를 함유한 분획을 다시 모아 pM 10막으로 농축한 후 0.15M NaCl을 함유하는 10mM 트리스 완충액(pH 7.5)에 희석하여 아래와 같이 면역정제법(Immunopurification)을 실시하였다.

① IgG의 분리하기 위해서, 채취한 복수액을 Protein-G agarose affinity system을 이용하여 정제하였다.

먼저 복수액을 5배의 결합 완충액(0.1M NaH₂PO_4,0.15M NaCl, 5mM EDTA, pH 7,0)에 희석한 다음 Protein-A agarose 컬럼에 천천히 흘러 보낸 다음, 같은 완충액으로 세척하였다. 충분히 세척이 끝난 후 용출완충액(0.1M glycine/HCl, 0.01% sodium azide, pH 2.7)으로 용출하였다. 용출물은 동량의 중성화 완충액(1M Tris, 0.01% sodium azide, pH 9)이 들어있는 튜브에 용출하였다. 이 일련의 과정은 12% SDS-PAGE로 수행하여, 쿠마시블루 염색으로 확인하였다. 이 항체용액은 3L의 PBS 용액에서 투석을 3일 동안 6회 반복한 다음 항체량을 정량한 다음 실험에 사용하였다.

② 면역친화컬럼(Immunoaffinity column)의 제조

상기에서 정제된 IgG 50mg를 수소카보네이트 완충용액 (0.1M NaHCO₃, 0.5M NaCl, pH 8.3)으로 4 ℃에서 하룻밤 투석하였다. CNBr로 활성화된 3g의 Sepharose 4B (Pharmacia)를 1mM 염산으로 여러 번 씻었다. 대략 12 ㎖ 정도의 젤을 컬럼에 부어 수소카보네이트 완충액으로 씻어 평형상태로 만든 후 IgG를 넣고 하룻밤 천천히 저어주어 반응하도록 하였다. 그 다음 1M 에탄올아민 (pH 8.8) 용액으로 상온에서 3시간 동안 흔들어 주어 반응하지 않고 남아 있는 활성화 잔기를 중화시켰다. 최종적으로 30 ㎖의 카보네이트 완충용액으로 3번, 그리고 30 ㎖의 0.1M 글리신-염산 (pH 2.5)용액으로 한번 씻어주었다. 0.2% NaN₃를 함유하는 PBS 완충용액으로 바꿔주고 사용할 때까지 4 ℃에서 보관하였다.

③ Immunopurification

준비된 컬럼을 0.15M NaCl을 함유하는 10mM 트리스 완충용액(pH 7.5)으로 전처리하여 평형을 유지시켰다. 희석한 샘플용액 20 ㎖을 4 ℃에서 하룻밤동안 부드럽게 교반시키며 젤에 흡착시키고, 젤을 칼럼에 부은 후, 전처리 완충용액으로 충분히 씻고, 0.1M 아세테이트 완충용액(pH 4.5)을 60 ㎖/h의 속도로 흘려 씻어주었다. 젤에 결합한 EPO를 30 ㎖의 0.1M 글리신-염산(pH 2.5) 용액으로 용출시켰다. 용출된 분획은 바로 1M 트리스 용액(pH 9)을 가하여 빠른 시간 내에 pH 7.5까지 적정하였다. 그 후 pM 10막 (Amicon)을 가지고 용출된 분획을 농축하여 hEPO 단백질을 수득하였다.

6) EPO 분자의 올리고당(oligosaccharide) 분석

본 발명의 형질전환 생쥐의 유즙 내 hEPO의 올리고당 구조(oligosaccharide structure)를 분석하기 위하여, 글리코단백질의 대조군으로 소 페투인(bovine serum fetuin, Glycosciences), 상품화된 에리트로포이에틴인 이포에틴 알파(epoetin α, LG생명과학), 그리고 형질전환 생쥐의 유즙 내 hEPO을 HPLC를 이용하여 분석하였다.

도 8의 결과에서 A는 소 페투인, B는 형질전환 생쥐 유래 hEPO, C는 epoetin α를 나타낸다.

도 8에서와 같이, 형질전환 생쥐의 유즙 유래 EPO는 CHO 세포주 유래 epoetin α와 비교시 비슷한 mono-, di-, tri-acidic oligosaccharide를 가지지만, 첨가된 tetra-acidic oligosaccharide 구조를 갖는 것을 확인하였다. 이는 글리코실화에 관여하는 효소에 의해 형질전환동물에서 EPO 발현시 번역 후 변형(post-translational modification)이 정상적으로 이루어졌으며, 따라서 유선에서 생산된 EPO는 의약용으로 사용하는데 용이하다라는 것을 의미한다.

그리고 그 수치를 표 4에 나타내었다.

사람의 혈청 내 EPO와 형질전환 생쥐의 유즙 내 EPO의 N-linked charge 분석

Source	Natural glycan %	Mono-acidic glycan %	Di-acidic glycan %	Tri-acidic glycan %	Tetra-acidic glycan %	Comments
Human serum EPO	20	9	48	23	0	Venke kibeli, et al. (2001), BLOOD, 98(13), 3626-3634
Milk-derived rhEPO	nd	3.82±0.2	26.75±1.0	40.05±1.9	29.38±3.12^a
Epoetin α	nd	2.73±	36.79 ±0.4	40.23±0.7	20.60±0.17^b
-Quantitative data were obtained from experiments performed in triplicate, and presented as means ㅁ S.D. Rows of different superscripts within a column are significantly different (P<0.05). -nd represents 'not detectable'

7) 형질전환 생쥐의 유즙 내 hEPO의 활성 확인

7-가) 형질전환 생쥐의 유즙 내 hEPO의 in vitro 활성 확인

본 발명의 형질전환 생쥐의 유즙 내 hEPO의 in vitro 활성을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

EPO는 EPO 수용체(EPO receptor, EPOR)와 결합하여 전사인자인 STAT5를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 그래서 STAT5가 포함되어 있는 BCL-XL 루시퍼라제(lucifease) 발현 벡터를 구축한 후, EPOR가 발현되는 MCF-7 세포주(인간 유방암 세포주)에 안정하게 발현될 수 있도록 BCL-XL 루시퍼라제 발현 벡터를 도입하였다. 이 세포(2 ×10⁵/35 mm plate)에 본 발명의 형질전환 생쥐의 rhEPO를 포함한 유즙 단백질을 각각 0 ng, 10 ng, 100 ng, 1 ㎍을 16 시간 동안 처리하였다.

음성대조군으로는 일반 유즙단백질 1 ㎍을 세포(2 ×10⁵/35 mm plate)에 처리하고, 양성대조군으로 이포에틴 알파는 10 IU, 100 IU로 처리하였다. 처리 16 시간 후, 상대적인 루시퍼라제 활성을 Microplate Luminometer (Perkin Elmer)를 이용하여 측정하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9의 결과에서, MCF-7 세포에 농도별로 형질전환 생쥐의 유즙 유래의 EPO를 첨가한 결과 용량 의존적(dose-dependent) 방식으로 루시퍼라제의 활성이 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 증가 정도는 이포에틴 알파 처리시 루시퍼라제 활성도 증가와 유사하므로, 본원발명의 형질전환 생쥐의 유즙 유래의 hEPO가 우수한 in vitro 활성을 나타냄을 알 수 있었다.

7-나) 형질전환 생쥐의 유즙 내 EPO의 in vivo의 생리활성 확인

또한, 본 발명의 형질전환 생쥐의 유즙 내 EPO의 in vivo의 생리활성을 확인하기 위하여 형질전환 생쥐의 유즙 유래 EPO를 대조군 마우스에 주입한 후(200 ng/Kg, 1회 정맥주사) 시간별로 혈액을 채취하여 성분을 분석하였다.

그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에서 보는 바와 같이 형질전환 생쥐의 유즙 유래의 EPO를 첨가한 결과 시간 의존적(time-dependent) 방식으로 혈소판, 적혈구, 혈색소, 헤마토크릿(Hematocrit)이 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 증가 정도는 이포에틴 알파 처리시의 증가 정도와 유사한 것을 알 수 있어, 본원발명의 형질전환 생쥐의 유즙 유래의 EPO가 우수한 in vivo 활성을 나타냄을 알 수 있었다.

[실시예 3] 본 발명의 EPO 발현벡터를 도입한 체세포를 이용한 형질전환 복제돼지의 생산 제조

상기 실시예 1에서 제조한 본 발명의 발현벡터 pBC1/hEPO/NEO를 도입하여 체세포를 이용한 형질전환 복제돼지를 다음과 같이 제조하였다.

가) 배양액 준비

난포란의 체외성숙에 사용한 배양액은 NCSU 23 배양액을 기본배양액으로 하여 Baxter (Baxter Healthcare Co., U.S.A.)의 물 1리터로 제조하여 0.2 ㎛ filter (Gelman Sci., U.S.A.)로 여과한 후 pH 7.2~7.3으로 조정하여 50 ㎖ tissue culture flask (Falcon, U.S.A.)에 45 ㎖씩 분주하여 4 ℃의 냉장고에 보관하면서 약 2 주간 사용하였다.

체외성숙용 배양액은 NCSU 23 배양액에 10% 난포액, 0.1 ㎎/㎖ cysteine, 0.01 ㎍/㎖ EGF, 10 IU/㎖ eCG 그리고 10 IU/㎖ hCG를 첨가하여 제조하였다. 체외배양액은 NCSU 23 배양액에 0.4% BSA를 첨가하여 사용하였다.

돼지 난포액은 2~7 ㎜ 크기의 난포에서 난포액을 채취하여 1,900 × g로 3회 원심분리하고, 최종 0.2 ㎛ 필터로 거른 후 -20℃ 냉장고에 보관하여 사용하였다.

나) 난포란의 채란

본 실시예에서 사용한 난소는 도축장에서 도살 직후 난소를 적출하여 페니실린 G (100 units/㎖)와 스트렙토마이신 (100 ㎍/㎖)이 함유된 생리식염수(30~35℃)가 들어있는 보온병에 담아 3~4시간 내에 실험실로 운반하였고, 미성숙 난포란을 채란하기 전 난소주위의 지방과 결합조직을 제거하고, 생리식염수로 3~4회 세척한 후, 18-G needle이 부착된 20 ㎖ 주사기를 이용하여 2~7 ㎜의 가시난포를 흡입하여 난포란을 채란하였다. 난포란의 채취시 사용된 배양액은 0.1 ㎎/㎖ PVA가 첨가된 TALP-HEPES (Prather, R. S., et al. 1995. In vitro development of embryos from sinclair miniature pigs: A preliminary report. Theriogenology, 43:1001-1007)를 사용하였다.

흡입된 난포액은 5~10 분간 정치시킨 후 침전된 하부액을 5 ㎖의 피펫으로 흡입하여 직경 60 ㎜ 배양접시에 옮겨 40×배율의 도립현미경(Olympus Co., Japan)에서 난포란을 수집한 후 체외성숙용 기본배양액 NCSU 23으로 4~5회 세척하면서 선발하였다. 난포란의 선발은 난구세포의 부착 정도와 세포질의 충실도에 따라 실시하였으며, 최소한 2층 이상의 난구세포층으로 되어 있고, 세포질이 균일하고 충실한 것을 선발하여 하기 실시예에 사용하였다.

다) 난포란의 체외성숙

난포란의 체외성숙은 체외성숙용 배양액을 4-well dish (Nunc, Denmark)에 500 ㎕씩 분주하여 18 시간 이상 전 배양을 실시하여 평형을 유도한 다음, 체외성숙용 배양액에 난구세포가 2층 이상이고 세포질이 충실한 100~150 개의 난포란을 넣고 5％ CO₂, 98~99％ 습도, 39℃ CO₂ incubator에서 20~22시간 동안 호르몬이 첨가된 체외성숙용 배양액에서 배양하였다. 이어서, 다음 20~22시간은 호르몬이 되지 않은 배양액에서 배양하여 총 40~44시간 동안 배양하였다.

라) 인간 에리트로포이에틴(hEPO)을 발현하는 유전자의 도입 및 적중을 위한 벡터의 제조

상기 실시예 1에 기재된 방법을 따라 인간 에리트로포이에틴(hEPO)을 발현하는 pBC1/hEPO/NEO 발현벡터를 제작하였다.

마) 공여체세포의 채취, 배양 및 세포라인 확립

본 실험에 사용된 공여체세포는 임신 30일령 된 돼지 태아의 조직을 채취하여 이용하였다.

채취한 태아의 머리, 사지 및 내장을 제외한 나머지 전체조직을 미세하게 세절하여 0.05% 트립신(trypsin, Gibco, USA)과 EDTA (Sigma, USA)가 첨가된 D-PBS로 3분간 처리한 후, D-PBS로 원심분리를 실시하여 트립신과 EDTA를 제거하였다.

분리된 세포는 10% FBS가 첨가된 DMEM을 가하고, 25 ㎤ 플라스크 (Falcon, USA)에 분주하여 CO₂ 인큐베이터에서 배양하였으며, 배양 12시간 후 바닥에 붙지 않은 세포는 제거하고, 10% FBS가 첨가된 신선한 DMEM으로 교체하면서 3~5일간 배양하였다. 계대배양은 공여세포가 플라스크에 80% 이상 자랐을 때, 0.05% 트립신과 EDTA를 처리하여 부유시킨 다음, 1/3~1/4씩 나누어 10회 이상 계대해서 배양하였다.

계대배양한 공여세포는 10% DMSO가 첨가된 DMEM 배양액으로 동결 보존해 두고, 핵이식에 사용할 때는 38~39℃ 온수에 융해하여 동결보호제를 제거한 다음 10% FBS가 첨가된 신선한 DMEM 배양액으로 1회 계대배양한 후 세포가 배양디쉬(culture dish)에 단층(monolayer)을 충분히 형성하여 confluency 상태로 2~3일 정도 배양함으로써 세포주기상의 G0나 G1단계로 유도한 다음 공여세포로 사용하였다.

바) 확립된 체세포로의 외래 유전자 도입

상기 실시예 1에서 제조하여 -20℃에서 보관한 pBC1/hEPO/NEO DNA를 꺼내 녹인 후, 쓰기 직전에 냉장 보관한 이펙틴(Effectene, Qiagen사)을 사용하여 각각 섞이지 않도록 주의하여 e-tube에 DNA 농도가 2 ㎍/㎖가 되도록 담아 표시한 후, Qiagen kit 내의 Enhancer 8 ㎕을 각각 튜브에 천천히 넣어 주었다.

DNA+Enhancer+Buffer EC 양이 Total 150 ㎕이 되도록 계산하여 Buffer EC를 넣어 주고, 이것을 1초간 볼텍싱한 다음 RT에서 2~5분간 두었다. 여기에 이펙틴 25㎕을 각각 넣어 준 후 파이펫팅(pipetting)하여 RT에서 5~10분간 두었다.

또한, 상기 마)에서 준비된, 배양 디쉬에 50~80% 깔린 섬유아세포(Fibroblast)는 D-PBS로 2~3번 가량 10분 동안 세척하여 준 다음, FBS가 첨가되지 않은 DMEM 배지를 4 ㎖씩 각각 넣어준 후 인큐베이터에 넣어두었다.

10분 후 각각 E-tube에 FBS가 첨가되지 않은 DMEM을 1 ㎖까지 채워 파이펫팅하여 잘 섞어준 후, 섬유아세포 및 DMEM이 4 ㎖ 들어있는 디쉬에 넣어 유전자 세포내 도입(transfection)시킨 후, 인큐베이터에서 다시 12~18시간 방치하였다. 12~18시간 후 D-PBS로 세척하여 준 후 다시 FBS가 10% 첨가된 DMEM으로 교체해 주었다.

사) EPO가 도입된 체세포 라인의 선별, 계대배양 및 동결보존

상기에서 바)에서 유전자 세포내 도입시킨 날로부터 72시간 후부터 G418 농도 600~800 ㎍/㎖ 정도를 사용하여 약 2주간 네오마이신 저항성을 갖는 세포를 선별(selection)하였다. 이렇게 선별된 섬유아세포는 보통 3~5일 정도면 깔리게 하여 계대배양 해주었다.

자세하게는, 분리할 세포의 배양용기(bottle)에서 배양배지를 제거하고, 그 배양용기에 Trypsin+EDTA 0.25%를 1.5 ㎖ 가량 넣어 인큐베이터에 약 3~5분가량 넣어 두었다. 현미경으로 관찰하여 약 70% 가량 세포들이 떨어져 있는 상태일 때 인큐베이터에서 꺼내어, Transfer pipette를 이용해 미리 준비해 놓은 D-PBS가 10 ㎖정도 들어 있는 15 ㎖ 튜브에 넣어 1500 RPM에서 3분가량 원심분리하였다. 상층액 제거 후 밑의 펠렛에 10% FBS+DMEM+G418을 3 ㎖정도 넣고 충분히 펠렛을 풀어준 후, 배양용기(bottle)에 넣어 인큐베이터에서 배양하였다.

세포의 동결보존을 위해서는 상기 원심분리 후 수득한 펠렛에 DMSO를 1 ㎖정도 넣고 충분히 펠렛을 풀어 준 후, Cryotube에 넣어 -70 ℃ Deep Freezer에 24시간 보관 후 -196℃ 액체 질소 탱크에 넣어 보관하였다.

아) 핵이식에 공여될 동결 체세포의 융해 및 준비

1. 융해: 해동(Thawing)할 세포를 저장고에서 꺼내어 37℃ 수조(water bath)에서 해동시켰다. 미리 준비해놓은 D-PBS가 10 ㎖정도 들어 있는 15 ㎖ 튜브에 넣어 1500 RPM에 3분가량 원심분리하였다. 상층액 제거 후 펠렛에 10% FBS+DMEM+G418을 3 ㎖정도 넣고 충분히 펠렛을 풀어 준 후 bottle에 넣어 인큐베이터에 넣어 배양하였다.

2. 공여핵 준비: 보통 공여세포(Donor cell) 준비는 4-well Dish에 하는데 분리할 세포의 배양배지를 제거하고, Dish에 Trypsin+EDTA 200 ㎕ 가량 넣어 인큐베이터에 약 3~5분가량 넣어 두었다. 현미경으로 관찰하여 약 70% 가량 세포가 떨어져 있는 상태일 때 인큐베이터에서 꺼내어 200 ㎕ 파이펫으로 세포를 분리하여 공여세포 준비용 배양배지가 약 3 ㎖ 정도 들어있는 dish에 넣어 세포를 풀어 준 후 쓰기 전까지 인큐베이터에 넣어 두었다.

자) 핵이식

핵이식에 사용된 파이펫은 직경이 1 mm인 capillary tube (Narishige, Japan)를 사용하여 보정용(holding), 탈핵용(enucleation) 및 주입용(injection) 파이펫을 각각 제작하였다. Holding 파이펫의 외경은 150~180 ㎛, 탈핵과 주입용 파이펫은 외경이 30~40 ㎛로 조절하였다. 제작이 완료된 파이펫은 PVP로 코팅처리한 후 사용하였다. 체외성숙된 수핵난자를 0.1% 히알우로니다제(hyaluronidase, Sigma, USA)가 첨가된 D-PBS에 넣어 난구세포를 제거하고, 3회~4회 PVA-TALP-HEPES로 세척한 다음, 0.05 M 슈크로즈 (sucrose, Sigma, USA) 및 0.4% BSA가 첨가된 배양액에서 세포질이 양호하고 제1극체가 뚜렷하게 보이는 난자만을 선별하여 사용하였다.

핵이식은 NCSU-23에 0.4% BSA가 첨가된 배양액 소적에 7.5 ㎍/㎖의 사이토칼라신 B (cytochalasin B, Sigma, USA)와 0.05 M 슈크로즈를 첨가하여 30% 정도의 세포질을 흡입함으로써 핵을 제거하였다.

상기에서 탈핵한 난자는 세포질이 제거된 공간에 G0기나 G1기로 유도한 공여세포를 loading하여 세포질과 부착되게 주입하였다. 공여세포가 주입된 난자는 전기융합을 하기 전까지 NCSU-23에 0.4% BSA가 첨가된 IVC 배양액에 처리하였다.

차) 핵이식 수정란의 융합 및 활성화

핵이식이 완료된 난자의 공여세포와 세포질의 융합은 전기세포융합장치(BTX, USA)로 실시하였다. 이때 전기융합 배양액은 0.1 mM CaCl₂(Sigma, USA) 및 0.1 mM MgCl₂ (Sigma, USA)가 첨가된 0.28 M Mannitol (Sigma, USA) 용액을 사용하고, 여기에서 2~3분간 평형을 실시한 다음, 핵이식란을 전기 융합용 chamber로 옮겨 양 전극 사이에 일렬로 주입하여 핵은 전극의 양극(+)쪽으로 향하게 하고 세포질은 음극(-)쪽으로 향하게 하여 전기자극을 가하였다. 전기융합 및 활성화는 150 V, 50 μsec, 2 pulse를 주어, 수정란의 융합과 전기활성화를 동시처리하였다.

핵이식 수정란의 융합과 활성화를 유도한 다음 사이토칼라신 B에 4시간 처리 후, 0.4% BSA가 첨가된 배양액에서 체외배양을 실시하였다.

카) 수란돈 준비

복제 수정란을 이식하기 위하여 임신 30~40일된 수란돈에 PGF2α를 근육주사하여 유산을 유도한 후 24시간이 경과되었을 때 PGF2α와 PMSG를 동시에 주사하였다. 그 후 72시간이 경과되었을 때 hCG를 근육 주사하여 과배란을 실시하였다. 48시간 후에 복제수정란을 이식하였다.

타) 수정란 이식 및 임신진단

돼지의 복제 수정란을 이식하여 산자를 생산할 목적으로 외과적인 방법에 의해서 수정란 이식을 하였다. 먼저 호르몬 처리된 수란돈은 케타민과 럼푼을 귀 정맥에 주입하여 전신 마취를 실시하였다. 마취된 수란돈의 정중선을 중심으로 광범위하게 면도기를 이용하여 털을 제거하고 소독을 한 다음 정중선을 따라 약 10~15cm를 절개하여 자궁을 노출시킨 후 난소 표면의 출혈체 혹은 난포상태를 확인한 후, 복제된 수정란을 난관 팽대부에 주입하였다. 일부 수란돈은 복제 수정란의 체내 발달 여부를 확인하기 위하여 이식 후 7일째에 외과적 방법으로 개복하여 이식된 수정란의 발달률을 조사하였다. 또한 수란돈의 임신 여부는 수정란 이식 후 27~30일째에 초음파진단기를 이용하여 확인하였다.

생산된 자돈에서 PCR과 genomic Southern blot으로 확인하여, 유선 특이적으로 EPO를 발현하는 형질전환돼지가 생산됨을 확인하였다.

또한, 본 발명의 형질전환동물로부터 생산된 hEPO 단백질을 투여시 혈액 내 혈소판, 적혈구, 혈색소, 헤마토크릿(hematocrit)을 증가시키는 작용효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 hEPO 발현 벡터 및 형질전환동물은 기존의 hEPO 보다 우수한 생리활성을 갖는 hEPO 단백질을 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

유선 특이적 프로모터인 서열번호 2의 베타-카제인 프로모터 염기서열, 그 3'쪽으로 인간 에리트로포이에틴(hEPO)을 코딩하는 서열번호 1의 DNA 서열 및 hEPO 유전자의 3'쪽으로 서열번호 3의 WPRE(woodchuck hepatitus virus post-transcriptional regulatory element) DNA 서열을 포함하는 pBC1-hEPO-WPRE 벡터.
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제 1항의 벡터에 선택적 표지 유전자로 네오마이신 저항성 유전자를 추가로 포함하는 pBC1/hEPO/NEO 벡터.
제5항에 있어서, 상기 네오마이신 저항성 유전자는 서열번호 4에 기재된 것인 pBC1/hEPO/NEO 벡터.
제6항에 있어서, 기탁번호 KACC 95043P로 기탁된 것인 pBC1/hEPO/NEO 벡터.
제 1항, 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 발현 벡터를 도입시켜 형질전환시킨 인간을 제외한 동물의 체세포.
제 1항, 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 발현 벡터를 도입시켜 형질전환시킨 인간을 제외한 동물의 체세포를 탈핵된 인간을 제외한 동물의 난자에 핵이식하여 만든 수정란.
제 1항, 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 발현 벡터를 도입시켜 형질전환시킨 인간을 제외한 형질전환 동물.
제10항에 있어서, 상기 인간을 제외한 형질전환 동물은 돼지, 생쥐, 소, 염소 및 양 중 선택된 하나인 인간을 제외한 형질전환 동물.
제10항의 인간을 제외한 형질전환 동물로부터 생산된 유즙 중 발현된 에리트로포이에틴을 분리, 정제하는 단계로 이루어진 인간 에리트로포이에틴의 생산방법.
제12항에 있어서, 상기 인간을 제외한 형질전환 동물은 돼지, 생쥐, 소, 염소 및 양 중 선택된 하나인 인간 에리트로포이에틴의 생산방법.