KR20040016426A - 사람 프로유로키나제를 생산하는 형질전환 복제 소 및이의 생산 방법 - Google Patents

사람 프로유로키나제를 생산하는 형질전환 복제 소 및이의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자를 성숙한 소 유래의 체세포에 도입 및 적중시키는 단계; 및 사람 프로유로키나제를 발현하는 외래 유전자가 도입 및 적중된 체세포를 이용하여 복제 소를 생산하는 단계를 포함하는 사람 프로유로키나제를 생산하는 형질전환 복제 소의 생산 방법 및 이 방법에 의해 생산된 형질전환 복제 소에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 유전자 도입 및 적중 기술과 체세포 복제 기술을 접목하여 사람 프로유로키나제를 용이하게 얻는 방법에 관한 것으로 더 구체적으로, 성숙한 소에서 유래한 체세포에 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자를 도입 및 적중시키고, 이를 체세포 복제하여 유선에서 사람 프로유로키나제를 발현하는 형질전환 복제 소를 생산함으로써 소의 우유로부터 사람 프로유로키나제를 수득할 수 있는 방법에 관한 것이다.

Description

사람 프로유로키나제를 생산하는 형질전환 복제 소 및 이의 생산 방법 {TRANSGENIC CLONED COW PRODUCING HUMAN PROUROKINASE AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME}
본 발명은 유전자 도입(transfection) 및 적중(targeting) 기술과 체세포 복제 기술을 접목한 형질전환동물(transgenic animal)의 생산방법 및 이러한 방법에 의해 생산된 형질전환동물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 형질전환동물을 이용하여 인간유용단백질 또는 생물의약품을 생산하는 방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 사람 프로유로키나제(human prourokinase)를 발현하는 유전자를 성숙한(adult) 소 유래의 체세포에 도입 및 적중시키는 단계; 및 사람 프로유로키나제를 발현하는 외래 유전자가 도입 및 적중된 체세포를 이용하여 복제 소를 생산하는 단계를 포함하는 사람 프로유로키나제를 생산하는 형질전환 복제 소의 생산 방법 및 이 방법에 의해 생산된 형질전환 복제 소에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 유전자 도입 및 적중 기술과 체세포 복제 기술을 접목하여 사람 프로유로키나제를 용이하게 얻는 방법에 관한 것으로 더 구체적으로, 성숙한 소에서 유래한 체세포에 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자를 도입 및 적중시키고, 이를 체세포 복제하여 유선에서 사람 프로유로키나제를 발현하는 형질전환 복제 소를 생산함으로써 소의 우유로부터 사람 프로유로키나제를 수득할 수 있는 방법에 관한 것이다.
일반적으로 심장 또는 혈관 내에 혈액이 응집하여 형성된 덩어리를 혈전이라 하고, 이러한 혈전의 형성과 관련된 병리 현상을 혈전증이라 한다. 혈전증으로는 뇌경색, 심근 경색, 폐 경색 등과 같은 각종 병태가 존재한다.
혈전 형성은 어떠한 원인으로 인해 혈관에 장해를 입은 경우 또는 혈관 장애 부분으로부터 혈액이 누출되는 것을 방지하기 위한 기전이다. 혈전 형성은 혈액 성분의 변화, 혈류의 이상 및 혈관벽의 성상의 변화와 밀접하게 연관되어 있다. 즉, 혈관이 어떤 이유로 손상된 경우, 혈소판이 손상 부분에 점착하여 응집되어 응집물을 형성함으로써 출혈을 방지한다. 더욱이, 혈소판은 혈소판의 응집에 의해 혈액 내에 존재하는 응고 인자를 활성화시키는 물질을 방출시켜 보다 견고한 혈전 형성을 유발하고 촉진한다. 많은 응고 인자들이 존재하는데, 이는 한 효소가 다음 효소를 활성화시키는 캐스케이드(cascade) 방식으로 반응을 진행시키는 복잡한 활성화 기전으로 구성된다 (혈액응고계). 또한, 응고 인자 중에는 상처나 손상 조직에 의해 직접적으로 활성화되는 것이 있는 등 응고는 다양한 방법으로 진행된다.
그러나, 응고의 진행을 억제 시키는 물질도 혈액 내에 많이 존재함으로써 비정상적인 응고의 진행을 억제한다. 혈액 응집은 필요에 따라 형성되지만 지혈 작용이 더 이상 필요치 않은 경우에 혈액 내 응집을 용해 시키는 효소 (선용계 효소)에 의해서 용해되어, 혈관은 원상태로 되돌아 간다 (선용계).
이와 같이 혈전 형성에는 각종 인자들이 관여하지만 가장 직접적으로 혈전 형성에 포함되는 인자는 혈소판, 혈액 응고 인자, 선용해 인자 등이고, 혈전 치료를 위해 상기 언급된 혈전 형성 성분들에 영향을 주는 통상적인 약제들이 개발되었다.
혈전증 치료 방법은 작용 기전에 의해서 크게 두 개의 군으로 나뉘는데, 혈전의 형성을 방지하는 항-혈전 요법 및 형성된 혈전을 용해 시키는 혈전 용해 요법이 그것이다. 또한, 상기 전자의 항-혈전 요법은 두 가지로 분류되는데, 항-혈소판 요법 및 항-응고 요법이 그것이다.
항-혈소판 요법은 혈전 형성의 초기 단계에 포함되는 혈소판의 기능을 억제하는 것을 목적으로 하는데, 아스피린과 같은 약제 및 경구 투여 될 수 있는 기타 많은 약제들이 개발되었다. 한편, 항-응고 요법은 응고인자를 억제함으로써 혈전 형성을 저해하는 것을 목적으로 하며, 응고인자의 활성을 억제하는 약제 및 응고인자의 형성을 억제하는 약제로 분류된다. 전자로는 헤파린, 효소 저해제 등이 포함된다.
한편, 항-혈전 요법과는 상이한 작용 기전으로 혈전증을 치료하는 방법이 혈전 용해 요법이다. 이 요법의 목적은 혈전 형성의 기전을 억제하는 것이 아니라 혈관 내의 형성된 혈전을 용해시켜 혈관의 폐색을 제거하여 혈류를 재관통 시키는 것이다. 이 요법의 작용 기전에서, 여러 타입의 플라스미노겐 활성 인자에 의해 혈액 선용계 조절 인자의 선구체인 플라스미노겐을 플라스민으로 활성화시키는데(Collen, D. and Lijnen, H.R. CRC Critical Reviews in oncology/hematology, 1986, Vol.4, n.3, p249), 플라스민은 혈관 내에서 혈전의 피브린을 분해하는 중요한 분해효소이다 (Rakoczi, I. Wiman, B. and Collen, D. Biochim. Biophys. Acta, 540, 1978, p295; Robbins, K.C. et al. Biol.Chem. 242, p2333, 1967; Wiman, B. Eur. J. Biochim,76,p129, 1997).
상기 혈전 용해 요법에서 사용되는 약제로는, 플라스미노겐을 플라스민으로 활성화시키는 플라스미노겐 활성화 인자인 조직 플라스미노겐 활성화제(tissueplasminogen activator, 이하 't-PA'라 칭함), 유로키나제(urokinase, 이하 'UK'라 칭함), 프로유로키나제(prourokinase, 이하 'proUK'라 칭함) 등과 같은 생체 내 물질, 스타필로키나제, 스트렙토키나제 등과 같은 균체 생산 물질 및 그의 유전자 재조합 제제가 알려져 있다.
유로키나제 및 스트렙토키나제는 사람의 혈전 용해 치료에 일반적으로 사용되는 플라스미노겐 활성 인자이지만, 피브린에 대한 특이적 활성이 없음으로 유로키나제 및 스트렙토키나제는 순환하는 플라스미노겐 또는 피브린에 결합된 플라스미노겐을 무차별적으로 활성화시키는 문제점이 있다(Zamarron, C., Lijnen, H.R., Van Hoef, B., and Collen, D., Thromb. Haemostas. 52, p19 ,1984; Samama, M., and Kher, A.Sem. Hop. Paris. 61, 1985, n.20. p1423). 따라서, 유로키나제 및 스트렙토키나제로 치료하는 동안에 전신 지혈 장애가 종종 유발되는 문제점이 있었다(Samama, M. and Kher, A. Sem. Hop. Paris, 1985, 61, n. 20. p1423; Maizel, A.S. and Bookstein, J.J. Cardiovsac. Intervent. Radiol.,9, 1986, p236; Bell, W.R. Thromb. Haemostas.,35, 1976, p57; Acar, J., Vahanian, A., Michel, P.L., Slama, M., Cormier, B. and Roger, V., Seminars in Thromb. and Haemost., 13, 1987, n. 2, p186).
반면에, t-PA (Hoylaerts, M., Ryken, D.C., Lijnen, H.R. and Collen, D.J. Biol. Chem., 257, n.6, p2912, 1982) 및 proUK (Husain, S.S. et al. Arch. Biochem. Biophys. 220. p31, 1983)는 피브린에 대한 특이 활성이 있어 현재 많이 사용되고 있다. 특히, proUK는 피브린에 대한 특이 활성을 가지면서도 t-PA보다뇌출혈 경향이 적어 뇌졸증 치료제로 많이 연구되고 있다.
이와 같이 혈전 치료제로 proUK가 각광을 받고 있는데, 이는 사람의 뇨, 혈장 및 다양한 세포주의 배양 배지에서 얻을 수 있음이 알려져 있다. 사람의 뇨, 혈장 또는 배지에서 proUK를 얻기 위해서는 반드시 정제 과정을 거쳐야 하며, 또한 수득할 수 있는 양에 한계가 있어 다량의 proUK를 경제적으로 얻을 수 있는 방법이 요구되었다.
이에 새로운 방법으로 대두된 것이 미생물을 이용한 방법으로 사람 proUK를 발현하는 유전자를 삽입한 재조합 플라스미드를 작제하여 미생물을 형질전환시킴으로써 미생물로부터 사람 proUK를 수득한 바 있었다 (PCT/EP89/01168, US 5,866,358 등). 하지만 이 방법은 미생물로부터 proUK를 얻음으로써 낮은 수율, 안전성, 관리상의 문제점, 생물학적 활성의 소실 등의 문제점이 있었다.
또 다른 방법으로 형질전환동물을 이용한 방법이 연구되었는데, 레트로바이러스 벡터를 이용한 방법, DNA 미세주입방법 및 배아 줄기 세포를 이용한 방법 등이 사용되었다. 레트로바이러스 벡터를 이용한 방법은 크기가 큰 유전자(8kb 정도)를 감당하지 못하는 단점이 있었으며, 레트로바이러스의 감염이 문제가 되었다.
상기의 형질전환동물을 이용한 구체적인 사례로는, 사람 t-PA를 형질전환 마우스의 젖(milk)에서 수득한 예가 있으며 (Gordon et al. Bio/Technology 5, 1987, p1183; US PAT. NO.4,873,316), 이 외에도 형질전환 마우스 (예를 들면, 미국 특허 제4,736,866 등), 형질전환 돼지 (예를 들면, Miller, K.J. et al. J. Endocrin. 120, 1989, p481 등), 형질전환 양 (예를 들면, Nancarrow, et al. Theriogenology27, 1987, p262 등), 형질전환 토끼 (예를 들면, Hannover, S.V., et al., Deutsche Tierarztliche Wochenschrift 94, 1987, p476 등), 형질전환 소 (예를 들면, Agner, et al., Theriogenology 21, 1984, p29 등)이 사례가 있었다.
하지만, 상기의 방법들은 형질전환동물 생산을 위한 외래 유전자의 도입 방법으로 전핵 내 미세주입법을 사용함으로써 극히 낮은 생산 효율(5% 이하) 및 모자이키즘이 나타나 원하는 단백질을 경제적으로, 그리고 원하는 성상의 단백질을 얻을 수 없다는 문제점이 있었다. 즉, 전핵 내 미세주입법은 원하는 유전자를 수정 후 약 18~24시간 내에 전핵에 삽입함으로써 이루어지는데, 이렇게 생산된 동물은 키메라(chimera)를 형성하게 되어 원하는 완전한(homologous) 형질전환 동물을 얻기 위해서는 또 다시 수정을 통하여 산자를 얻어야 한다는 비효율적인 점이 있고, 특히 소와 같은 임신 기간이 긴 동물의 경우 (200일 이상)에는 형질전환동물을 얻기까지는 너무 많은 시간이 소요된다는 문제점이 있다. 따라서 원하는 고순도의 단백질을 경제적으로 빠른 시간 내에 생산할 수 있는 요구가 여전히 있어 왔다.
최근에는 양의 프라이머리(primary) 태아 섬유아세포를 네오마이신 저항 마커 유전자 및 인간 응고 인자 Ⅸ으로 형질전환시킨 뒤 탈핵된 난자에 융합시킴으로써 양의 젖(milk)에서 상기의 유전자로 인코드된 단백질을 발현하는 복제 양을 생산한 예가 있다(Angelika, E. et al. Science, Vol. 278, 1997, p2130). 또한, 마커 유전자로 인간 항트롬빈 Ⅲ 유전자를 함유한 형질전환 태아로부터 공여 핵 세포를 분리하고 이를 이용하여 탈핵된 난자에 융합시켜 유용한 단백질을 생산할 수 있는 복제 동물에 관하여 밝힌 바가 있었다(Brett C. Reggio, et al. Biology ofreproduction. 65, 2001, p1528). 이 방법에서는, 복제동물의 생산을 위해 핵 공여 세포들을 태아로부터 유래된 것을 사용하였고, 특히 후자의 경우 형질전환된 태아로부터 핵 공여 세포를 분리하여 복제 동물을 생산하였다.
위 방법들과 같이, 핵 공여 세포를 태아에서 유래되는 것을 사용하면 세포분화 정도를 고려할 때 체세포 핵 이식에 의한 복제 동물을 생산하기에 용이한 점이 있고, 기술적으로도 손쉽게 복제 동물을 생산할 수 있다는 장점을 가진다. 하지만, 고-능력을 가진 동물의 형질을 그대로 유지하는 복제 동물을 생산하고자 하는 경우에는 그 능력이 확인된 동물로부터 유전 형질을 받아야 하는 바, 태아의 경우에는 아직 그 능력을 알 수 없다는 한계점이 있고, 또한 태아에서는 유전 형질이 확인되지 않는 상태이고, 특히 암수의 성 구별이 안된 상태에서 이용하게 된다는 문제점이 있다.
이에 본 발명자는 동물의 성체로부터 유래된 체세포를 이용하여 태아 유래의 체세포에 비하여 복제 성공의 어려움을 극복하면서도, 고-능력을 가진 성체를 확인하고 이로부터 우수한 유전형질을 이어받음과 동시에 원하는 단백질을 우유로부터 얻을 수 있도록 자성(female)으로 확인된 것을 이용함으로써 고-능력을 가진 동물로부터 원하는 단백질을 고-순도로 경제적으로 얻을 수 있음을 확인하고 본 발명에 이르게 된 것이다.
본 발명은 유전자 도입 및 적중 기술을 이용하고 체세포 복제 기술을 접목함으로써 형질전환동물을 생산하고, 이를 이용하여 원하는 단백질을 얻을 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
더 구체적으로, 본 발명은 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자를 성숙한 소 유래의 체세포에 도입 및 적중시키고, 상기 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자가 도입 및 적중된 소의 상기 체세포를 이용하여 형질전환 복제 소를 생산하는 방법 및 사람 프로유로키나제를 발현하는 형질전환 복제 소를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 소에서 유래한 체세포에 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자를 도입 및 적중시키는 단계 및 소의 난자를 탈핵하여 상기 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자가 도입 및 적중된 체세포를 탈핵된 난자로 도입하는 단계를 포함하는 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자가 도입된 형질전환 핵 이식란 및 이의 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자를 성숙한 소의 체세포에 도입 및 적중시키고, 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자가 도입 및 적중된 상기 체세포를 이용하여 형질전환 복제소를 생산함으로써 소의 유선으로부터 사람 프로유로키나제를 생산하는 방법을 제공하고자 한다.
도 1은 본 발명의 체세포에 사람 프로유로키나제를 도입 및 적중시키기 위한 p베타2-프로유로키나제 플라스미드의 작제도이다.
도 2는 본 발명의 외래 유전자가 도입 및 적중된 세포의 GFP 발현을 나타낸 사진이다.
도 3은 본 발명에서 사용되는 고정용 피펫(1)과 절개용 피펫(2)으로 수핵난자(3)의 투명대를 절개하는 과정을 나타낸 사진이다.
도 4는 탈핵 과정으로 고정용 피펫과 절개용 피펫으로 수핵 난자의 제 1극체와 핵을 제거하는 과정을 나타낸 사진이다.
도 5는 본 발명에서 사용되는 고정용 피펫과 이식용 피펫(4)으로 탈핵된 난자에 체세포를 이식하는 과정을 나타낸 사진이다.
본 발명은 유전자 적중 및 도입 기술과 체세포 복제 기술을 접목한 것이다. 즉, 본 발명은 체세포 단계에서 체세포에 특정 유전자를 도입 및 적중하는 단계 및상기 특정 유전자가 도입 및 적중된 체세포를 이용하여 체세포 단계에서 형질전환된 형질을 그대로 보유한 형질전환동물을 생산하게 체세포 복제 기술을 적용하는 단계를 포함한다.
즉, 본 발명은 성숙한 소에서 유래한 체세포에 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자를 도입 및 적중시키는 단계; 상기 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자가 도입 및 적중된 체세포를 이용하여 복제 소를 생산하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 형질전환 핵 이식란을 생산하는 방법은 소에서 유래한 체세포에 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자를 도입 및 적중시키는 단계; 소의 난자를 탈핵하여 상기 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자가 도입 및 적중된 체세포를 탈핵된 난자로 도입하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 형질전환 핵 이식란 및 복제 소는 사람 프로유로키나제를 발현하는 외래 유전자가 삽입되어 있는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 사람 프로유로키나제를 발현하는 형질전환 복제 소로부터 사람 프로유로키나제를 용이하게 생산하는 방법을 제공한다.
용어의 정의
본 발명에 따른 특성상 본원 명세서에 사용되는 용어의 정의를 명백히 할 필요가 있다. 일반적으로는 본 발명에서 별도로 정의하지 아니한 모든 기술적 및 과학적인 관련 용어는 이 발명이 속한 기술 분야에서 통상적으로 통용되는 의미를 가진다. 그러나 다음의 용어들은 통상적인 의미를 나타내지만 그 의미를 명확히 하고 또한 본 발명의 범위를 명백히 하고자 다음과 같이 정의한다.
본원 명세서에 사용된 용어 "벡터"는 사람 프로유로키나제를 암호화하는 핵산의 삽입, 전달 또는 발현을 허용하는 플라스미드, 코스미드, 파아지, 바이러스, 레트로바이러스 또는 다른 담체를 말한다.
본원 명세서에 사용된 용어 "프로모터"는 사람 프로유로키나제 cDNA의 전사를 조절하는 조절 DNA 서열을 말한다.
본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환(transformation)"은 어떤 생물이 원래는 지니고 있지 않은 외부 유전자를 염색체상에 인위적으로 삽입해서 그 생물의 유전적 형질 일부를 변화시키는 것이다. 형질전환의 방법은 여러 가지가 있으나 가장 많이 사용되는 방법으로는 수정란 미세주입법과 본원에서 사용된 체세포 복제법이 대표적이다.
본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환 동물(transgenic animal)"은 '유전자 이식 동물' 이라 불리우기도 하며, 동물 자신이 원래 가지고 있지 않은 외래의 유전자를 재조합하여, 이를 동물의 염색체 상에 인공적으로 삽입시킴으로써 그 형질의 일부가 변화된 동물을 말한다. 따라서, 본원에서 형질전환 동물은 인간이 필요로 하는 생리활성 물질을 생산하는 생물반응기(Bioreactor), 특정 질환을 유전적으로 나타내는 질환모델 동물, 인간의 이식용 장기 등을 생산할 수 있는 형질전환 동물 등을 의미한다.
본원 명세서에 사용된 용어 "핵 이식"은 핵이 없는 난자와 인공적으로 결합시켜 동일한 우량형질을 갖는 여러 마리의 복제동물을 생산하기 위한 유전자 조작기술을 의미한다. 이렇게 생성된 수정란을 본 발명에서는 '핵 이식란'이라 한다.
구체적으로, 본 발명은 체세포 복제 기술을 이용하여 형질전환 동물을 생산하기 위해서 원하는 유전자를 체세포에 도입 및 적중하는 단계; 및 상기 형질전환된 체세포를 이용하여 복제 동물을 생산하는 단계를 포함한다.
좀 더 구체적으로, 본 발명의 사람 프로유로키나제를 발현하는 형질전환 복제소의 생산방법은 소에서 유래한 체세포주에 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자를 도입 및 적중시키는 단계를 포함하는 공여핵 세포를 준비하는 단계; 수핵 난자의 난구 세포를 제거하고, 수핵 난자의 제1 극체를 포함한 세포질을 제거하여 난자를 탈핵하는 과정을 포함하는 소 유래의 수핵 난자를 준비하는 단계; 상기 단계에서 준비된 공여핵 세포를 탈핵된 난자에 이식하고 융합시켜 핵 이식란을 작제하는 단계; 및 상기 핵 이식란을 대리모에 이식하여 산자를 출산하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자가 도입된 형질전환 핵 이식란의 생산방법은 소에서 유래한 체세포주에 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자를 도입 및 적중시키는 단계를 포함하는 공여핵 세포를 준비하는 단계; 수핵 난자의 난구 세포를 제거하고, 수핵 난자의 제1 극체를 포함한 세포질을 제거하여 난자를 탈핵하는 과정을 포함하는 소 유래의 수핵 난자를 준비하는 단계; 및 상기 단계에서 준비된 공여핵 세포를 탈핵된 난자에 이식하고 융합시키는 단계를포함한다.
또한, 본 발명의 사람 프로유로키나제를 생산하는 방법은 소의 유선에서 사람 프로유로키나제를 발현하는 형질전환 복제소의 우유로부터 사람 프로유로키나제를 수득하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명의 형질전환 핵 이식란 및 복제소는 사람 프로유로키나제를 발현하는 외래 유전자를 포함한다.
이하에서는, 소의 우유로부터 사람 프로유로키나제를 얻을 수 있는 형질전환 복제소를 생산하는 방법을 단계별로 나누어 구체적으로 설명한다.
사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자를 체세포에 도입 및 적중하여 체세포를 형질전환하는 단계
본 발명에서 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자를 체세포에 도입하는 방법으로 생화학적 방법, 물리적 방법, 바이러스 매개 형질감염방법 등을 사용할 수 있다.
생화학적인 방법으로는 칼슘을 매개체로 하는 칼슘 침전법, 세포막 성분인 양이온 리피드를 매개체로 하는 리포펙션 또는 리피드는 아니지만 양전하를 지니는 폴리머를 매개체로 하는 방법 등을 사용할 수 있는데, 이는 실험의 용이성과 효율성 및 안정성 측면에서 많이 이용되는 방법이기도 하다. 물리적인 방법으로 일렉트로포레이션, 유전자 총, 세포 내 직접 미세주입법 등을 사용할 수 있다. 바이러스 매개 방법으로는 아데노바이러스 또는 레트로바이러스의 바이러스 게놈에 원하는 DNA를 클로닝하여 세포에 감염시키는 방법이 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에서는 유전자의 도입을 위한 벡터를 작제하여 생화학적인 방법으로 유전자를 도입 및 적중하는 방법을 사용할 수 있다. 더 바람직하게는, 유전자의 도입을 위한 벡터를 작제하고 리피드-매개 방법(lipid-mediated method)을 이용하여 사람 프로유로키나제를 도입 및 적중할 수 있다.
제 1 단계: 사람 프로유로키나제(proUK)를 발현하는 유전자의 도입 및 적중을 위한 벡터의 작제
본 발명에 사용되는 플라스미드들은 표준 DNA 클로닝 과정과 PCR 방법에 의해 작제될 수 있다. 사람 proUK를 발현하는 유전자의 도입 및 적중에 있어서 사용되는 벡터를 작제하기 위한 pcDNA3는 상업적으로 시판되고 있는 것(Invitrogen, Groningen, Netherlands)을 사용할 수 있다 .
사람 proUK를 발현하는 유전자의 도입 및 적중을 위한 벡터는 소의 유방에서 타겟 유전자가 발현할 수 있도록 소 β-카세인 프로모터가 포함될 수 있다. 타겟 유전자로 사람 proUK 유전자가 포함될 수 있고, 또한 마커 유전자가 더 포함될 수 있다. 마커 유전자로는 녹색 형광을 발광하는 단백질인 GFP 유전자가 사용될 수 있다.
PCR 증폭으로 준비한 타겟 유전자, 소 β-카세인 프로모터 및 GFP 유전자는 TA 클로닝 방법으로 벡터 내로 삽입될 수 있다.
제 2 단계: 체세포주의 확립
본 발명에는 성숙한 소에서 수득한 세포를 배양한 세포주를 공여세포로 사용할 수 있다. 이때, 소의 품종이 특별히 제한되는 것은 아니나, 한우 또는 홀스타인(Holstein)종의 젖소를 사용함이 바람직하다.
소에서 수득한 세포는 소의 자궁관류액, 자궁내막, 난관, 귀 또는 근육으로부터 분리된 세포, 난구세포 또는 태아섬유아세포이며, 이들을 마더(Mather)와 바네스(Barnes)의 방법 (참조: Mather & Barnes, Methods in Cell Biology, Vol.57, 1998, Animal Cell Culture Methods, Academic Press)을 응용하여 배양함으로써 세포주를 작제할 수 있다.
예를 들어, 자궁관류액에 P/S 항생제(페니실린 10000IU, 스트렙토마이신 10mg)가 함유된 인산염 완충 식염수(PBS)를 첨가하고, 원심분리하여 세척한 다음, 소 태아 혈청(FBS, fetal bovine serum), 비필수 아미노산(NEAA, non-essential amino acid) 및 P/S 항생제가 첨가된 DMEM (Dulbecco's modified Eagles medium)에서 39℃ , 5% CO2의 조건으로 배양된다.
자궁내막의 일부 또는 난관으로부터 난관상피 조직을 채취하여, 상기 PBS로 세정하고, 트립신과 EDTA가 포함된 용액에서 정치한 다음, 이를 원심세정하고, 상기한 조건에서 배양될 수 있다.
난구-난모세포 복합체를 하이알루로니다제(hyaluronidase)로 처리하여 난자를 둘러싸고 있는 난구 세포층을 분리하고, 난구 세포층에 상기 트립신-EDTA 용액을 첨가하여 39℃, 5% CO2의 포화습도 배양기 내에 정치시킨 후, 원심 세정하고, 상기한 조건에서 배양할 수 있다. 귀의 피부 조직으로부터 채취된 연골 조직, 면한 피부 내측의 조직, 근육조직 또는 태아의 동체와 사지 부위에서 연골 조직을 포함하지 않는 부위의 조직을 세정하고 세절한 다음, 상기 트립신-EDTA 용액 및 콜라게나제(collagenase type II) 용액을 첨가하여 39℃, 5% CO2의 포화습도 배양기 내에 정치시킨 후, 원심세정시키고, 상기한 조건에서 배양되어 준비될 수 있다.
이처럼 작제된 세포주는, 일정 시간 간격으로 세포주의 배양액을 제거하고 트립신-EDTA 용액을 첨가하여 정치한 다음, 새로운 배양액으로 교체하며 배양하는 계대 배양, 윌머트(Wilmut) 등의 방법을 응용하여 배양 중인 세포주의 배양액을 소 태아 혈청이 첨가된 DMEM으로 교체하여 배양하는 혈청기아배양 (참조: Wilmut et al., Nature, 385:810-813, 1997) 또는 동결보존 등의 방법을 통하여 보존되며, 보존된 세포주는 공여세포로서 제공될 수 있다.
제 3 단계: 외래 유전자의 체세포로의 도입
본 발명에서 외래 유전자의 세포 내로의 도입은 작제된 발현 플라스미드를 체세포 내로 도입시키는 방법으로 행하는 것을 포함한다. 외래 유전자를 세포 내로 도입시키는 방법으로는 생화학적 방법, 물리적 방법, 바이러스 매개 형질감염방법 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서는 생화학적인 방법으로 FuGene6 (Roche Molecular Biochemicals, IN, USA), 리포펙타민 플러스 (LipofectAmine Plus, Life Technologies) 및 엑스진 500 (ExGen 500, MBI Fermentas)을 사용할 수 있다.
FuGene6는 다성분 지방계 시약으로서 다양한 세포 타입에서 높은 도입 효율을 가지고 세포 독성이 없으며, 혈청 첨가 여부에 관계 없이 기능을 발휘하고 최소한의 최적화 작업이 쉬운 장점을 가진다. 리포펙타민 플러스는 양전하 지질(cationic lipid)이며, 엑스진 500은 비지방 양전하 중합체로 여러 가지 세포 타입에서 높은 효율이 보고 되어 있다.
본 발명에서는 사람 proUK 유전자의 도입 및 적중을 위하여 바람직하게는 FuGene6을 이용할 수 있다. 즉, 사람 proUK 유전자를 리포좀 형성 성분과 혼합하여 생성된 리포좀-DNA 구조 복합체를 세포 배양액에 첨가하여 일정시간 배양하고, 이 복합체의 DNA 구조가 세포 내로 도입되도록 50-70% 정도 증식한 체세포에 형질감염을 실시할 수 있다. FuGene6을 통한 효과적인 도입을 위해서는 세포마다 최적 방법을 선정하고 각 변수들을 최적화하여 유전자를 도입함으로써 사람 proUK 발현을 극대화할 수 있다.
구체적으로, 제 3 단계에서는 상기 제 2 단계에서 준비된 세포주에 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자를 도입 및 적중시킬 수 있다. 즉, 상기 제 1 단계의 발현 플라스미드와 시약을 혼합하여 배양 배지에 함께 배양한다. 유전자의 도입 및 적중 후, 도입 및 적중된 세포를 자외선 하에서 표준 플루오레세인 이소티오사이아네이트(FITC) 필터 셋을 이용하여 검사한다.
제 4 단계: 사람 proUK를 발현하는 유전자가 도입된 세포의 선별, 증식 및 동결 보존
사람 proUK 유전자가 도입된 세포의 선별은 항생제 또는 마커 유전자를 이용하여 선별할 수 있다. 사람 proUK 유전자 벡터에 이용된 양성 마커(positive marker)인 암피실린(ampicillin) 항생제에 대한 저항성 유전자는 사람 proUK 유전자가 세포에 도입되면 저항성 유전자도 발현된다.
사람 proUK 도입으로 세포 내로 유입된 DNA 구조체(construct)에 의해 적중된 세포는 항생제를 포함하여 배양하면 생존하게 되고, 그 외의 세포들은 항생제의 독성에 의해 사멸되어 일정 시간 후 배양 용기에는 유전자가 적중된 세포만 증식한다. 그러므로, 전 단계에서 도입 후 정상 배양을 통한 일정 기간의 회복기가 지난 다음 사람 proUK가 도입되지 않은 세포들은 제거하고 도입된 세포들만 선별 마커의 항생제를 사용하여 선별할 수 있다.
이 같은 항생제에 의한 선별은 항생제의 적정 선별 농도를 정함으로써 효과적으로 이루어지도록 할 수 있다. 세포의 종류에 따라 차이가 있으나, 적중된 세포는 하나의 세포로부터 증식을 시작하게 되므로 다음 단계의 확인을 위해서는 일정 수 이상으로 증식시켜야 한다. 항생제를 통한 선별 과정이 이루어지면 정상 배양으로 전환하고, 세포의 신속한 증식과 배양 시 세포 사멸에 의한 불필요한 손실을 감소시키기 위해 적절한 성장인자와 세포사멸 억제제 등을 첨가하는 방법을 적용할 수 있다.
또한, 마커 유전자로 녹색 형광을 발광하는 단백질인 GFP를 코딩하는 유전자를 이용하여 형질전환된 세포를 선별할 수 있다. 사람 proUK 유전자의 도입으로 세포 내로 유입된 DNA 구조체로 적중된 세포는 GFP 유전자에 의해 현미경 하에서 자외선 필터를 이용하여 관찰하면 초록색을 띄는 세포만을 선별할 수 있다.
GFP 유전자 도입 세포의 증식 배양 및 동결 보존은 전술한 항생제 선별 및 GFP 발현유무로 선별한 형질전환 세포를 대상으로 한다. 핵 이식용 세포로 사용할 세포는 선별된 하나의 세포로부터 증식시키며, 특히 섬유아세포는 다수의 세포로 증식되기까지 상당한 시간이 소요되고 세포가 노화되어 증식이 둔화되면서 성장을 멈추기 때문에, 단 시간 내 건강한 다수의 적중된 세포를 배양해야 한다. 증식 배양한 세포의 효율적 보존을 위하여 각 단계마다 동결 보존한다. 특히 소수의 세포를 동결 보존하여 융해했을 때 생존성과 핵 이식 시 핵 공여세포로서의 안정성에 적합토록 해야 한다.
외래 유전자가 도입 및 적중된 체세포의 핵 이식을 통한 형질전환 복제란 및 형질전환 복제 동물을 생산하는 단계
본 발명에서는 형질전환 복제 소를 생산하기 위한 방법으로 동물복제 기술을 이용할 수 있다. 상기 단계의 외래 유전자가 도입 및 적중된 체세포의 형질을 동물 복제 기술을 이용하여 복제되는 산자에 그대로 발현되도록 함으로써 모자이크현상이 없는 100% 형질전환 복제 소를 효율적으로 생산할 수 있다.
본 발명에서의 체세포 복제 기술은 본 발명의 발명자가 이미 출원한 바 있는 국제특허출원 PCT/KR00/00707 "체세포 복제동물 및 그 생산 방법"(황 등, 2000.6.30)의 기술을 이용할 수 있다. 즉, 체세포 핵 이식은 탈핵 과정을 통해 미수정란으로부터 유전 물질(genetic material)을 포함한 핵을 제거하고 다른 체세포의 핵(nucleus)을 주입함으로써 이루어질 수 있다. 또한 이렇게 생산된 핵 이식란을 '재구성된 핵 이식란(reconstructed embryo)'이라고 하고, 상기 핵 이식된 재구성 핵 이식란을 체외 배양하여 발육시켜 대리모에 이식하여 체세포 복제 동물을 생산할 수 있다.
제 1 단계: 수핵 난자의 준비, 생체 외 성숙
본 발명에서 소의 난소에서 미성숙 난자를 채취 및 배양하여 성숙한 수핵 난자로 사용할 수 있다. 예를 들면, 헤페스 (HEPES, N-[hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid]) 완충용액에 TCM199 (Tissue Culture Medium 199)가 용해된 세정용 TCM199 배지에서 채취된 미성숙 난자를 선별한 후, 5% CO2의 조건 하에 16 내지 22시간 동안 배양하여 난자를 성숙시킬 수 있다.
이때, 사용되는 배양액은 TCM, 나트륨-피루브산 및 P/S 항생제가 포함된 배양용 TCM199 배양액에 에스트라디올(Estradiol, E2), 난포자극호르몬(FSH, follicle stimulating hormone) 및 소 태아 혈청을 포함한다.
제 2 단계: 수핵 난자의 탈핵
상기 제 1 단계에서 준비된 성숙한 수핵 난자의 난구 세포(cumulus cell)를 제거한 다음, 수핵 난자의 투명대의 일부를 절개하고 제 1 극체를 포함한 세포질을 제거하여 탈핵된 난자를 작제할 수 있다.
먼저, 성숙한 수핵 난자를 하이알루로니다제가 용해된 세정용 TCM199 배양액에 넣고, 난구 세포를 물리적으로 제거한 후, 세정용 TCM199 배양액으로 세정하여 준비할 수 있다. 그런 다음, 난구 세포가 제거된 난자를 사이토칼라신 B(cytochalasin B) 용액으로 옮기고, 미세작업장치(micromanipulator)를 이용하여 난자의 투명대를 절개하여 절개창을 형성시킨 후, 이를 통하여 난자의 전체 세포질의 10 내지 15%에 해당하는 양의 제 1 극체를 포함한 세포질을 제거하여 탈핵할 수 있다. 이어, 탈핵된 난자를 세정용 TCM199 배양액으로 세정하고, 배양용 TCM199 배양액에 정치시킨다. 이때 사용되는 사이토칼라신 B 용액은 사이토칼라신 B를 DMSO(dimethylsulfoxide)에 용해시키고, 이를 소 태아 혈청이 첨가된 세정용 TCM199 배양액으로 희석한 것이다.
자외선 하에서 Hoechst 33342 (Sigma Co.)로 염색된 세포질체를 관찰함으로써 탈핵을 확인할 수 있다.
제 3 단계: 공여 핵 세포의 준비
공여 핵 세포의 준비를 위해 상기에서 형질감염된 세포를 PBS에서 세척할 수 있다. 그 후, 단일 세포 현탁을 위해 0.1% 트립신-EDTA를 사용하여 배양된 세포들을 트립신 처리하여, 세포들을 펠릿화하고 0.5% (v/v) FBS가 포함된 200㎕ PBS에서 재현탁화시키고 핵 이식에 사용하기 전에 마이크로원심관으로 옮겨 준비할 수 있다.
제 4 단계: 공여핵 세포와 수핵 난자의 융합 및 활성화
상기에서와 같이 준비된 형질감염된 공여 핵 세포를 탈핵된 난자에 이식하고, 이식된 핵 이식란을 전기융합을 통해 활성화시킬 수 있다.
먼저, 형질감염된 공여 핵 세포를 탈핵된 난자에 이식하여 핵 이식란을 작제할 수 있다. 배양용 TCM199 배양액에 정치된 탈핵된 난자를 세정용 TCM199 배양액으로 세정하고 PHA-P (phytohemagglutinin) 용액으로 이동시킨 다음, 이식용 피펫을 사용하여 공여 핵 세포를 PHA-P 용액에 있는 난자의 투명대에 형성된 절개창으로 주입시켜서 핵 이식란을 작제할 수 있다. 이어, 세정용 TCM199 배양액으로 세정하고 정치시킨다. 이때, 사용되는 PHA-P 용액은 PHA-P를 세정용 TCM199 배양액에 용해시킨 것이다.
상기 정치된 핵 이식란을 세포 조작기를 이용하여 전기융합시킬 수 있다. 먼저, 핵이식란을 세정용 TCM199 배양액이 첨가된 만니톨(mannitol) 용액에 넣고, 이를 세포 조작기에 연결시킨 2 개 전극 사이에 분주된 만니톨 용액에 넣은 다음, 공여세포가 (+)전극을 향하도록 핵 이식란을 위치시킨다. 그런 다음, 전압은 0.75 내지 2.00kV/cm, 시간은 10 내지 20㎲, 횟수는 0.01 내지 10초, 바람직하게는 1초 간격으로 1 내지 5회, 바람직하게는 2회의 조건으로 직류전류를 통전하여 핵 이식란을 전기융합시킬 수 있다. 융합된 핵 이식란을 만니톨 용액과 세정용 TCM199 배양액으로 세정하고, 전기 사이토칼라신 B 용액에서 정치한 후 활성화시킬 수 있다. 이때 사용하는 만니톨 용액은 HEPES 완충용액에 MgSO4또는 MgCl2, BSA 및 만니톨이 용해된 pH 7.2 내지 7.4의 용액으로서 Ca2+가 포함되어 있다면 융합과 동시에 활성화되지만, Ca2+가 포함되어 있지 않다면 활성화시키는 과정을 수행한다.
Ca2+가 포함되지 않은 만니톨 용액을 사용하여 세포 융합을 수행한 경우, 활성화시키는 과정은 융합된 핵 이식란을 암실에서 이오노마이신(ionomycin) 용액에 정치하여 활성화시킨 후, 소 태아 혈청 또는 BSA가 첨가된 세정용 TCM199 배양액으로 세척하고 정치하여 이오노마이신을 제거하여 행할 수 있다. 이때, 이오노마이신 용액은 DMSO에 이오노마이신을 용해시켜서 원액을 만들고 사용할 때, BSA가 첨가된 세정용 TCM199 배양액으로 희석하여 사용할 수 있다.
제 5 단계: 핵 이식란의 후활성화 및 체외 배양
활성화된 핵이식란을 후활성화시킨 후, 체외 배양한다.
소 태아 혈청 또는 BSA가 첨가된 세정용 TCM199 배양액에 정치된 활성화된 핵 이식란을 사이클로헥시미드(cycloheximide) 용액 또는 디엠에이피(DMAP, 4-dimethylaminopurine) 용액에 침지하여 배양하여 후활성화시킨 다음, 체외 배양용 배지에서 5% CO2배양기 또는 5% CO2, 7% O2, 88% N2배양기를 사용하여 배양할 수있다.
이때, 사이클로헥시미드 용액은 에탄올에 사이클로헥시미드를 용해시킨 용액으로서, 체외 배양용 배지에 첨가하여 사용하고, DMAP 용액은 DMAP를 체외 배양용 배지에 용해시켜 사용할 수 있다. 또한, 체외 배양용 배지는 NaCl, KCl, NaHCO3, NaH2PO4, CaCl2, Na-락테이트, 포도당, 페놀 레드, BSA, 카나마이신, 필수 아미노산, 비필수 아미노산, 글루타민 등을 포함하는 mSOF 배지(참조: 표 1)를 사용할 수 있다.
선택적으로, 상기의 체외 배양된 핵 이식란을 동결 보존한 후, 필요한 때에 이를 융해시켜서 사용할 수도 있다. 핵 이식란을 동결할 경우, 먼저 동결할 수정란을 소 태아 혈청이 첨가된 PBS로 세정하고, P/S 항생제, CaCl2, 포도당, MgCl2, Na-피루베이트 및 PBS를 포함하는 동결액에 넣은 다음, 온도를 천천히 저하시킨 후, 액체 질소로 동결시킬 수 있다.
이처럼 동결된 핵 이식란을 융해시킬 때는 액체질소에서 꺼낸 핵 이식란을 상온에서 일정기간 동안 정치했다가 온수에 넣어 융해시킬 수 있다. 융해된 핵 이식란을 글리세롤, 자당, BSA 및 PBS가 포함된 융해용 배지에 넣고, 글리세롤의 양이 많은 배지에서 적은 배지로 차례대로 정치시켜서 핵 이식란 내의 동결액을 제거할 수 있다.
상기의 성숙한 홀스타인종의 소에서 유래한 형질 전환된 체세포를 공여 핵 세포로 하여 재조한 핵 이식란을 SNU-B1로 명명하여, 이를 2002년 6월 20일자로 국제기탁기관인 생명공학연구소(KRIBB) 유전자 은행(KCTC, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52 소재)에 기탁번호 KCTC 10286BP로 기탁하였다.
성 분 농 도
NaCl 99.1∼106mM
KCl 7.2mM
NaHCO3 25mM
NaH2PO4 1.2mM
Na-락테이트 5mM
CaCl2·2H2O 1.7mM
MgCl2·6H2O 0.5mM
Na-피루베이트 0.3mM
포도당 1.5mM
페놀레드 10㎍/ℓ
BSA 8㎎/㎖
카나마이신 0.75㎍/㎖
필수아미노산 2%
비필수아미노산 1%
L-글루타민 1mM
ITS 0.5%
제 6 단계: 형질전환 복제소의 출산
상기의 체외 배양된 핵 이식란을 대리모에 이식하여 송아지를 생산할 수 있다. 이때, 핵 이식란은 소 태아 혈청이 첨가된 PBS에 침적된 상태로 대리모의 자궁에 이식될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 사람 프로유로키나제(proUK)를 발현하는 유전자의 도입 및 적중을 위한 벡터의 작제
(1) 중합효소연쇄반응(PCR)
PCR은 사이키(Saiki) 등(1985)에 의해 처음으로 사용된 것의 변형 방법으로 수행되었다. PCR 증폭은 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM dNTP (Takara Shuzo, Japan), 50 pmol의 업스트림 및 다운스트림 프라이머 및 2.5 유니트(unit)의 TaKaRaTA Taq 폴리머라제 (Takara)를 포함하는 50㎕ 반응 혼합물 내에서 10ng의 주형(template)과 함께 33 내지 49 사이클 동안 수행되었다.
반응 사이클은 94℃ 에서, 30초간 변성(denature), 55℃ 에서 33초간 어닐링(annealing), 72℃ 에서 90초간 연장(extension) 및 72℃ 에서 15분간 마지막 연장(final extension)시키는 과정으로 수행되었다.
(2) 발현 플라스미드 작제
모든 플라스미드들은 표준 DNA 클로닝 과정 (Maniatis 등, 1982) 및 PCR 방법에 의해 작제되었다. 벡터를 작제하기 위한 pcDNA3는 Invitrogen (Groningen,Netherlands)로부터 구입하였다. p베타(pbeta)3.7 플라스미드를 위한 3.7 kb의 소 베타 카세인 프로모터는 주형으로 다음의 소의 게놈 DNA를 사용하여 PCR 증폭으로 제조하였다.
정 방향 프라이머(서열번호 1):
GTCGGTACCAACATGT CGAATCCATCTCTATCAATTAATGTAATT;
역 방향 프라이머(서열번호 2):
GACGGATCCT CATTATCTCAATTCCAGGGAATGGGAAGATGAGGA
상기에서 작제된 소 베타 카세인 프로모터는 pcDNA3의 KpnI-BamHI 자리에 삽입되었다. 또한, p베타 2.1-proUK 플라스미드의 작제를 위한 사람 proUK 유전자(서열번호 3)는 주형으로 사람 게놈 DNA로 PCR 증폭하여 제조하여 p베타3.7 벡터의 XhoI-ApaI 자리에 삽입하였다. p베타 2-ProUK는, 주형으로 pEGFP-N1 벡터(Clontech)로 PCR 증폭하여 제작한 GFP ORF의 SmaI-BstBI 단편을 p베타2.1-proUK 플라스미드 내로 삽입함으로써 작제되었다. 모든 작제된 플라스미드는 시퀀싱 킷(U.S. Biochemical Co.)을 사용하여 DNA 시퀀싱에 의하여 확인되었다.
p베타 2-ProUK의 작제도는 도 1에서와 같다. 즉, 도 1은 소 β-카세인 프로모터, 사람 프로유로키나제 유전자(5,000bp), 암피실린 저항 유전자 및 마커 유전자로 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터의 특징을 나타내는 개략도이다. PCR 증폭으로 준비한 타겟 유전자(사람 프로유로키나제), 소 β-카세인 프로모터 및 GFP는 TA 클로닝 방법으로 P베타-2 플라스미드 벡터 내로 삽입되었다. 발현 플라스미드의 Xho I 및 Apa I 부위로 원하는 유전자 등이 올바르게 삽입되었는지를 분석하기 위해 제한 효소로 절단하여 아가로즈겔 전기영동하였다.
(3) 뉴클레오티드 서열 분석(Nucleotide sequencing)
뉴클레오티드 서열은 디데옥시 체인 종결 방법(dideoxy chanin termination method)에 의해 확인되었다(Sanger 등, 1997). 서열은 35S-dATP (800 Ci/mmol, Amersham)이 삽입된 시쿼나제(sequenaser)로 분석되었다. DNA는 완충-구배(buffer-gradient) 또는 전해질-구배(electrolyte-gradient) 방법을 사용하여 6% PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)에 의해 분리되었다. 모든 서열분석 방법은 US Biochemicals에 의해 제공되는 서열분석 키트(Sequencing kit)의 안내문에 따라 수행되었다.
실시예 2: 체세포주의 확립
먼저, 소의 귀에서 채취한 피부 내측의 조직을 인산염 완충 식염수(PBS, Gibco BRL, Life Technologies, USA)로 세정하고 100 메시(mesh)의 크기로 세절한 다음, 이를 상기 인산염 완충 식염수에 넣고 0.25% 트립신, 1mM EDTA 및 1mg/ml 콜라게나제(collagenase type II)를 첨가하여 39℃, 5% CO2의 포화습도 배양기 내에 1시간 동안 정치시킨 후, 원심세정시킨다. 그런 다음, 10% 소 태아 혈청(FBS, fetal bovine serum), 1% 비필수 아미노산 용액 및 P/S 항생제가 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagles medium, Gibco BRL, Life Technologies, USA) 배양액에서 부유시키고, 이를 세포 배양용 디쉬로 옮겨 39℃ , 5% CO2의 조건 하에 포화습도 배양기 내에서 배양하여, 세포주를 수득하였다. DMEM에서 배양 중인 세포주를 0.5% 소 태아 혈청이 첨가된 DMEM에서 7일간 배양한 다음, 배지를 제거하고 0.25% 트립신, 1mM EDTA 용액을 첨가하여 2분간 정치시켰다. 그런 다음, 1% 소 태아 혈청이 첨가된 PBS에 재부유시켜서 세포의 수가 2000개/0.1ml가 되도록 조절하고, 이를 에펜돌프(eppendorf) 시험관에 분주하여 공여세포를 준비하였다.
실시예 3: proUK 유전자의 도입 및 적중을 통한 체세포의 형질감염
작제된 p베타2.1-proUK 발현 플라스미드를 FuGene6(Cat. No. 1814443; Roche Molucular Biochemicals, IN, USA)을 사용하는 리피드-매개 방법으로 공여핵 세포 내로 삽입하였다.
세포들은 형질전환 전 1일 동안 2차 배양되었다. 세포들은 35㎜ 디쉬에서 2㎖ 당 1~3 ⅹ 105세포의 수로 플레이팅되고, 50~80%의 컨플런시(confluency)에 도달할 때까지 밤새 배양되었다. 그 후, p베타2.1-proUK 발현 플라스미드는 실험자 프로토콜에 따른 FuGene6를 사용하여 세포주 내로 삽입되었다. 간단히 말해서, p베타2.1-proUK 유전자(1㎍) + 형질전환 시약(3㎍) + DMEM(96㎕)의 혼합물을 상온에서 15분간 배양한 후에 배양 배지상에 오버레이(overlay)하였다.
실시예 4: 사람 proUK를 발현하는 유전자가 도입된 세포의 선별, 증식 및 동결 보존
사람 proUK 유전자를 도입된 세포주는 항생제 또는 GFP의 발현을 관찰함으로써 선별하였다. 유전자 적중시 DNA 구조체에 이용된 양성 마커인 암피실린 등 항생제에 대한 저항성 유전자는 세포 내에서 재조합이 정확하게 이루어지면 저항성 유전자 및 GFP 유전자가 발현된다.
본 발명에는 암피실린(ampicillin) 항생제를 통한 선별 과정이 이루어졌으며, 3-4일 간격으로 3주간 선별하였다. 또한, 형질감염 2일 후에 형질감염된 각 세포를 자외선 하에서 표준 플루오레세인 이소티오사이아네이트 (FITC; 여기 파장: 450-490 ㎚; B-mode filter, Nikon, Japan) 필터 셋을 사용하여 검사하여 GFP의 발현 여부를 검사하여 형질감염된 세포를 선별하였다(도 2).
전술한 항생제 선별 또는 GFP 발현 여부로 유전자 적중이 확인된 사람 proUK 유전자가 도입된 세포는 핵 이식용 세포로 증식 배양하였다. 특히 섬유아세포는 다수의 세포로 증식되기까지 상당한 기간이 소요되고 점차 세포가 노화되어 증식이 둔화되면서 성장을 멈추기 때문에 단시간 내 건강한 다수의 적중된 세포를 배양하는 것이 관건이다. 암피실린 항생제 선별 후 세포들은 하나의 집락(colony)으로 자라게 되는데 이를 트립신으로 처리하여 96-웰의 배양용기로 옮겨 배양한 후 이들이 증식되면 이후 24-웰로 옮겨 배양하고 더 나아가서 12-웰과 6-웰까지 증식 배양을 실시하였다.
증식 배양한 세포의 효율적 보존을 위하여 각 단계마다 동결 보존하였다. 특히 소수의 세포를 동결 보존하여 융해했을 때 생존성과 핵 이식 시 핵 공여세포로서의 안정성에 적합토록 해야 한다.
실시예 5: 수핵 난자의 준비
도축장에서 채취된 소의 난소로부터 18G 주사침(needle)이 장착된 10ml 주사기를 사용하여 직경 4mm 내외의 난포를 흡입한 다음, 1cm 간격의 격자 눈금을 그은 100mm 디쉬에 난포를 옮긴 후, 난구 세포가 충분히 부착되어 있고 세포질이 균질한 난자를 선별하였다.
선별된 난자를 세정용 TCM199 배양액(참조: 표 2)이 2ml씩 분주된 35mm 디쉬에서 3회에 걸쳐 세정하고, 배양용 TCM199 배양액(참조: 표 3)으로 최종적으로 세정한 다음, 에스트라디올(Estradiol) 용액 (참조: 표 4) 0.5㎕, 난포자극호르몬 용액 (참조: 표 5) 12.5㎕, 배양용 TCM199 배양액 450㎕ 및 10% 소 태아 혈청이 포함된 배지에서 5% CO2의 조건 하에 20시간 동안 배양하여 수핵 난자를 준비하였다.
세정용 TCM199 배양액
성 분 농 도
TCM 분말 Gibco 31100-027
HEPES 10mM
NaHCO3 2mM
BSA 0.5% W/V
P/S항생제 1% (페니실린 10000IU, 스트렙토마이신 10mg)
배양용 TCM199 배양액
성 분 농 도
TCM 액체 Gibco 11150-059
Na-피루베이트 1mM
P/S항생제 1% (페니실린 10000IU, 스트렙토마이신 10mg)
에스트라디올 용액
성 분 농 도
에스트라디올 5mg
에탄올 10ml
난포자극호르몬 용액
성 분 농 도
난포자극호르몬 2AU
배양용 TCM199배양액 10ml
실시예 6: 체세포의 핵 이식
상기 실시예 5에서 준비된 수핵 난자를 세정용 TCM199 배양액에서 1회 세정하고, 5ml의 세정용 TCM199 배양액에 하이알루로니다제(Sigma Chemical Co., USA) 0.0500g을 용해시킨 용액 111㎕과 세정용 TCM199 배양액 1ml을 혼합하여 최종 농도를 0.1%로 적정한 하이알루로니다제 용액 내에 난자를 옮긴 다음, 난구 세포를 제거하고 세정용 TCM199 배양액에서 3회 세정하고 정치시켰다. 이어, 7.5mg/ml의 농도가 되도록 DMSO에 사이토칼라신 B (Sigma Chemical Co., C-6762, USA)를 용해시킨 용액 1㎕와 10% 소 태아 혈청이 첨가된 세정용 TCM199 배양액 1ml을 혼합한 사이토칼라신 B 용액으로 난자를 옮기고, 미세작업장치(Narishige, Japan)를 사용하여 정치된 수핵 난자의 투명대를 절개하여 절개창을 형성시킨 후, 이를 통하여 전체 세포질의 10 내지 15%에 해당하는 량의 난자의 세포질을 제거함으로써 난자를 탈핵시켰다.
좀 더 구체적으로 탈핵 과정을 설명하면, 작업용 디쉬를 미세작업장치의 미세작업판 위에 놓고, 미세작업장치의 왼쪽 암(arm)에는 고정용 피펫을, 오른쪽 암에는 절개용 피펫을 장착하였다. 그런 다음, 고정용 피펫은 9시 방향에 위치시키고 절개용 피펫은 3시 방향에 위치시켰다. 피펫 조정기를 중립에 놓아 피펫이 상하 좌우로 자유롭게 움직일 수 있도록 조정하였다. 두 피펫을 작업용 미소적에서 상하 유동시키면서, 피펫이 디쉬의 테두리에 닿지 않도록 각도를 조정하고, 피펫 끝을 미소적의 중앙에 위치시켰다. 내경 200㎛ 이상의 세정용 마우스 피펫을 이용하여 세정용 TCM199 배양액에서 난자를 사이토칼라신 B 용액으로 이동시켰다. 이어, 미세작업장치의 조동나사와 미동나사를 이용하여 난자에 먼저 초점을 맞추고, 2개의 피펫을 상하로 움직여 초점을 조정하였다. 2개의 피펫을 움직여서 고정용피펫의 12시 방향에 제 1극체가 위치하도록 하고, 고정용 피펫을 난자의 9시 방향에 밀착시킨 뒤, 유압을 걸어 난자를 고정시켰다.
도 3은 고정용 피펫과 절개용 피펫으로 수핵 난자의 투명대를 절개하는 과정을 나타낸다. 도 3에서 보듯이, 절개용 피펫(2)을 1시 방향에서 찔러서 투명대를 통과시킨 후, 세포질에 손상을 가하지 않도록 주의하며 11시 방향으로 관통시켰다. 고정용 피펫(1)에 압력을 걸어 난자(3)를 분리하고, 절개용 피펫이 통과한 제 1극체 상단부의 투명대에 고정용 피펫을 접촉시킨 다음, 두 피펫을 마찰하여 투명대를 절개하였다.
도 4는 수핵 난자의 제 1 극체와 핵을 제거하는 탈핵 과정을 나타낸다. 도 4에서 보듯이 난자(3)를 회전시켜 절개창을 수직으로 위치시키고, 고정용 피펫(1)을 난자의 밑 부위에 위치시켜 난자가 아래쪽으로 움직이지 못하도록 지지한 다음, 절개용 피펫(2)을 난자의 위에서 가볍게 눌러 난자를 탈핵시켰다. 이처럼 탈핵된 난자를 세정용 TCM199 배양액으로 3회 세정하고, 배양용 TCM199 배양액에 정치시켰다.
그런 다음, 미세작업장치를 사용하여 탈핵된 수핵 난자에 준비된 공여세포를 이식하였다. 먼저, 5mg의 PHA-P를 10ml의 세정용 TCM199 배양액에 용해시킨 용액 100㎕과 400㎕의 세정용 TCM199 배양액을 혼합한 PHA-P 용액으로 작업용 디쉬 상단 중앙에 4㎕의 이식용 미소적을 만들고, 1% 소 태아 혈청이 첨가된 PBS로 이식용 미소적 위 아래에 각각 1개씩의 4㎕의 공여세포 미소적을 만들었다. 이들 미소적을 미네랄 오일로 도포한 후, 작업용 디쉬를 미세작업판에 위치시켰다.
미세작업장치에 장착된 절개용 피펫을 이식용 피펫으로 교체한 후, 정치된 탈핵된 난자를 세정용 TCM199 배양액으로 3회 세정하고, 이식용 미소적으로 이동시킨 다음, 이식용 피펫을 사용하여 공여세포를 이식용 미소적으로 이동시켰다.
도 5는 탈핵된 난자에 체세포를 이식하는 과정을 나타낸다. 도5에서 보듯이, 탈핵된 난자(3)의 절개창을 양 피펫과 1시 방향으로 놓고 고정용 피펫(1)으로 고정한 다음, 이식용 피펫(4)을 절개창으로 주입하고, 유압으로 공여세포를 주입하여 핵이식란을 작제하였다. 이처럼, 작제된 핵 이식란을 세정용 TCM199 배양액으로 옮겨서 3회 세정 후, 정치시켰다.
실시예 7: 세포 융합 및 활성화
BTX-세포 조작기(ECM 2001, BTX, USA)를 사용하여 핵 이식란을 전기 융합하여 활성화시켰다.
0.5mM HEPES 완충용액(pH 7.2)에 0.1mM MgSO4, 0.05% BSA 및 0.28M 만니톨을 용해시킨 만니톨 용액 15㎕을 세정용 마우스 피펫으로 핵 이식란이 있는 세정용 TCM199 배양액에 첨가하고, 1분간 정치시켰다. 그런 다음, 세정용 마우스 피펫을 이용하여 핵 이식란을 세정용 TCM199 배양액이 첨가된 만니톨 용액에 주입하여 다시 1분간 정치시키고, 세정용 마우스 피펫을 이용하여 핵 이식란을 만니톨 용액에 넣었다. 이어, 핵 이식란을 BTX-세포 조작기에 연결시킨 2개 전극(3.2mm chamber No. 453) 사이에 분주된 만니톨 용액에 넣고, 공여세포가 (+)전극을 향하도록 핵 이식란을 위치시켰다. 전압은 1kV/cm, 시간은 15㎲, 횟수는 1초 간격으로 2회의조건에서 직류전류를 통전하여 핵 이식란을 전기융합시켰다. 융합된 핵 이식란을 만니톨 용액을 거쳐 세정용 TCM199 배양액으로 옮긴 후, 3회 세정하였다.
DMSO 1.34ml에 이오노마이신(Sigma Chemical Co., USA) 1mg을 용해시키고, 최종농도가 5 M이 되도록 1% BSA가 첨가된 세정용 TCM199 배양액을 첨가하여 제조된 이오노마이신 용액에 융합된 핵 이식란을 암조건에서 4분간 정치하여 활성화시킨 후, 융합된 핵 이식란을 10% 소 태아 혈청이 첨가된 세정용 배지가 분주된 35mm 디쉬 내에서 5분간 정치시켜서 이오노마이신을 제거하였다.
실시예 8: 융합된 핵 이식란의 후활성화 및 배양
에탄올 100ml에 사이클로헥시미드(Sigma Chemical Co., USA) 1g을 용해시키고, 최종농도가 10㎍/㎖가 되도록 체외 배양용 배지인 mTALP (참조: 표 1)과 혼합한 사이클로헥시미드 용액 25㎕에 전기 활성화된 핵 이식란을 침지하고, 4시간 동안 배양하여 후활성화시켰다. 그런 다음, 검란하여 선별된 핵이식란을 mTALP에 넣고, 5% CO2 배양기에서 7일간 배양하였다.
본 발명자들은 상기 실시예에 따라 제조한 핵 이식란을 SNU-B1로 명명하여, 이를 2002년 6월 20일자로 국제기탁기관인 생명공학연구소(KRIBB) 유전자 은행(KCTC, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52 소재)에 기탁번호 KCTC 10286BP로 기탁하였다.
실시예 9: 핵 이식란의 동결보존, 융해 및 이식
상기 핵 이식란을 장기간 보존하기 위하여, 동결 보존을 수행하였다. 먼저, 동결용 배지(참조: 표 6, 표 7)를 35mm 디쉬에 분주하고, 동결기를 가동하여 -5 를 유지시킨 다음, 동결할 핵 이식란을 선발하여 10% 소 태아 혈청이 첨가된 PBS로 세정하고 동결용 배지에 넣어 20분간 정치시켰다. 이어, 0.25ml 스트로우(straw)의 양 끝단에 공기층을 2층씩 만들어, 가운데에 수정란이 포함된 동결용 배지를 흡입하여 수정란을 장착하고, 가열한 집게(forcep)를 사용하여 열 밀봉(heat sealing)하였다. 그런 다음, -5℃ 에서 동결기에 스트로우를 장착하고, 5분간 이 온도를 유지시킨 다음, 액체질소로 예냉한 집게로 스트로우의 하단을 살짝 집어주어 식빙(seeding)시켰다. 식빙한 직후, -0.3/min의 속도로 -30℃까지 온도를 하강시킨 다음, -30℃가 되면 10분간 온도를 유지시키고, 이를 액체질소 탱크에서 동결보존하였다.
동결용 PBS
성 분 농 도
PBS(1x) Gibco 14190-144
Na-피루베이트 0.033mM
포도당 0.15mM
CaCl2·2H2O 0.171mM
P/S항생제 1% (페니실린 10000IU, 스트렙토마이신 10mg)
MgCl2·6H2Om 0.049mM
동결용 배지
성 분 농 도
동결용 PBS(표 8) 2.25ml(45%)
소 태아 혈청 2.25ml(45%)
글리세롤 0.5ml(10%)
이처럼 동결 보존한 핵 이식란을 융해시키기 위하여, 먼저 20% 소 태아 혈청이 첨가된 PBS와 융해용 배지를 35mm 디쉬에 3ml씩 분주하고, 각각에 글리세롤을 첨가하여 포함된 글리세롤 농도가 0%, 3% 및 6%가 되도록 제조하였다 (참조: 표 6 및 표 8). 그런 다음, 액체질소 탱크로부터 동결된 스트로우를 꺼내 공기 중에서 5초간 노출시킨 후, 직경 20cm 이상인 용기에 담겨진 30℃의 온수에 30초간 담가서 융해시켰다. 이어, 무균적으로 스트로우의 양 끝단 공기층을 절단하여, 스트로우 내의 배지를 디쉬에 밀어내고, 현미경 하에서 수정란을 확인한 다음, 차례대로 핵 이식란을 6% 글리세롤의 융해용 배지에서 5분간 정치하고, 3% 글리세롤의 융해용 배지에서 5분간 정치하며, 글리세롤이 없는 융해용 배지에서 5분간 정치시킴으로써, 핵 이식란에 함유된 동결용 배지를 제거하였다.
융해용 배지
성 분 6% 글리세롤 PBS 3% 글리세롤 PBS 0% 글리세롤 PBS
PBS (표 8) (표 8) (표 8)
BSA 0.5% 0.5% 0.5%
글리세롤 6% 3% 0%
자당 0.3M 0.3M 0.3M
실시예 10: 핵 이식란의 대리모에의 이식
상기 핵 이식란을 20% 소 태아 혈청이 첨가된 PBS에 침적시키고, 이를 스트로우에 장착한 다음, 대리모의 자궁각내 심부에 이식하였다.
실시예 11: 사람 proUK 유전자를 발현하는 복제 소의 산자 생산 및 산자의 유전자 확인
상기의 실시예를 통해 생산된 형질전환 복제소는 육안적 방법 및 분자생물학적 방법으로 유전자 분석을 하였다. 사람 proUK 유전자가 도입된 GFP 발현 복제소는 외견 관찰 및 조직을 이용한 서던블랏, 웨스턴 블랏 및 세포배양을 통하여 GFP 발현 및 사람 proUK 유전자 도입을 분석하였다.
육안적 관찰로 GFP의 발현 유무를 육안적으로 GFP 산자의 피부조직, 구강조직, 혀 등을 관찰하여 초록빛이 관찰되는지를 조사하였다. 분자생물학적 검사로 서던 블랏으로 산자의 게놈 DNA를 분석하였으며 웨스턴 블랏으로 산자 조직의 단백질을 분석하여 사람 proUK 발현 복제소임을 확인하였다.
이후 산자의 조직을 실시예 2의 방법으로 배양하여 세포주를 확립한 후 현미경의 자외선 필터을 이용하여 GFP 단백질의 발현 여부를 분석하였다. 또한 분자생물학적 방법인 서던 블랏으로 복제 소의 DNA를 분석하여 사람 proUK를 발현하는 복제 소임을 확인하였다.
실시예 12: 공여핵 세포의 종류에 따른 형질전환 핵 이식란의 발육률 및 발현율
상기의 실시예와 동일한 과정을 공여핵 세포를 달리하여 형질전환 핵 이식란의 발육률 및 발현율을 비교하였다. 3 개의 세포주로 40~50일령의 태아에서 유래한 소 태아의 섬유아세포, 성숙한 소의 귀 섬유아세포 및 성숙한 소의 난구 세포를 사용하였다.
준비된 3개의 세포주에 사람 프로유로기키나제를 도입 및 적중하고, 외래 유전자가 도입 및 적중된 세포를 탈핵 난자와 융합하여 발생되는 경과를 살펴 보았다. 그 결과는 다음의 표 9 및 표 10에 나타내었다.
3 개의 다른 세포주로부터 유래한 형질전환된 핵이 이식된 핵 이식란의 발달율
공여핵 세포의 종류 엠브리오의 수
주입 융합(%) 분할(%) 배반포로의 발생(%) 배반포에서의 발현(%)
태아 섬유아세포 363 214(59.0) 109(50.9) 15(7.0) 4(26.7)
난구 세포 426 334(78.4) 245(73.4) 96(28.7) 52(54.2)
귀 섬유아세포 379 303(79.9) 203(67.0) 46(15.2) 13(28.3)
3개의 다른 세포주로부터 유래한 형질전환된 핵이 이식된 엠브리오의 임신율
공여핵 세포의 종류 이식된 엠브리오의 수 대리모의 수 임신된 수(%)
태아 섬유아세포 3 2 0
난구 세포 31 28 1(3.6)
귀 섬유아세포 27 24 2(8.3)
상기의 결과로부터 태아 섬유아세포보다는 성숙한 소로부터 유래한 난구 세포 또는 귀 섬유아세포를 핵 공여세포로 한 경우에 배반포에서의 발현률이 높고, 또한 핵 이식란의 임신 성공율이 높다는 것을 알 수 있었다.
본 발명은 체세포에 외래 유전자를 도입 및 적중하는 기술 및 체세포 복제 기술을 접목함으로써 복제 동물로부터 생물의약품을 경제적이며 효율적으로 생산하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명의 형질전환 복제 소는 소의 유선에서 사람 프로유로키나제를 발현함으로써 소의 우유로부터 사람 프로유로키나제를 용이하게 수득하는 것을 가능하게 한다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계에 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 기술은 단지 바람직한 실시예 뿐이며, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (29)

  1. 소에서 유래되고 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자가 도입 및 적중된 체세포의 핵과 소에서 유래한 탈핵된 난자가 융합된 핵 이식란.
  2. 제1항에 있어서, 상기 소는 성숙한 개체임을 특징으로 하는 핵 이식란.
  3. 제1항에 있어서, 상기 핵 이식란이 SNU-B1(KCTC 10286BP)인 것을 특징으로 하는 핵 이식란.
  4. 소의 유선에서 사람 프로유로키나제를 발현하는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소.
  5. 제4항에 있어서, 상기 복제 소의 형질이 제1항 내지 제3항의 어느 한 항의 핵 이식란의 형질과 동일한 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소.
  6. (a) 소에서 유래한 체세포주에 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자를 도입 및 적중시키는 단계를 포함하는 공여핵 세포를 준비하는 단계;
    (b) 수핵 난자의 난구 세포를 제거하고, 수핵 난자의 제1극체를 포함한 세포질을 제거하여 난자를 탈핵하는 과정을 포함하는 소 유래의 수핵 난자를 준비하는단계; 및
    (c) 상기 (a)단계에서 준비된 공여핵 세포를 탈핵된 난자에 이식하고 융합시키는 단계를 포함하는 소의 핵 이식란 작제 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 (a)단계의 체세포주가 성숙한 소에서 유래된 것을 특징으로 하는 소의 핵 이식란 작제 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 체세포주에 사람 프로유로기키나제를 발현하는 유전자를 도입 및 적중시키는 단계가 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자, 발현 프로모터, 마커 유전자를 포함하는 벡터를 작제하여 수행되는 것을 특징으로 하는 소의 핵 이식란 작제 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 발현 프로모터가 β-카세인 프로모터인 것을 특징으로 하는 소의 핵 이식란 작제 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 마커 유전자가 GFP 발현 유전자 및/또는 암피실린 저항 유전자인 것을 특징으로 하는 소의 핵이식란 작제 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 벡터는 생화학적 방법을 사용하여 도입되는 것을 특징으로 하는 소의 핵이식란 작제 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 생화학적 방법이 FuGene6를 사용하는 것을 특징으로 하는 소의 핵 이식란 작제 방법.
  13. 제6항에 있어서, 상기 체세포주가 소의 자궁관류액, 자궁내막, 난관, 귀 또는 근육으로부터 분리된 세포 또는 난구 세포로부터 유래된 것을 특징으로 하는 소의 핵 이식란 작제 방법.
  14. 제6항에 있어서, 상기 핵 이식란이 SNU-B1(KCTC 10286BP)인 것을 특징으로 하는 소의 핵 이식란 작제 방법.
  15. (a) 소에서 유래한 체세포주에 사람 프로유로키나제를 발현하는 유전자를 도입 및 적중시키는 단계를 포함하는 공여핵 세포를 준비하는 단계;
    (b) 수핵 난자의 난구 세포를 제거하고, 수핵 난자의 제1극체를 포함한 세포질을 제거하여 난자를 탈핵하는 과정을 포함하는 소 유래의 수핵 난자를 준비하는 단계;
    (c) 상기 단계에서 준비된 공여핵 세포를 탈핵된 난자에 이식하고 융합시켜 핵 이식란을 작제하는 단계; 및
    (d)상기 핵 이식란을 대리모에 이식하여 산자를 출산하는 단계를 포함하는 소의 유선에서 사람 프로유로키나제를 생산하는 형질전환 복제 소의 생산방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 (a) 내지 (c) 단계가 제7항 내지 제14항의 어느 한 항의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 핵 이식란이 SNU-B1(KCTC 10286BP)인 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법.
  18. 제15항에 있어서, 상기 (a)단계가 세포주를 계대배양, 혈청기아배양 또는 동결에 의해 보존하는 과정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법.
  19. 제15항에 있어서, 상기 (b)단계의 난자를 탈핵하는 과정은 미세작업장치를 이용하여 전처리된 난자의 투명대를 절개하여 절개창을 형성시킨 후, 절개창을 통하여 난자의 제 1극체를 포함한 세포질을 10 내지 15% 제거하는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법.
  20. 제15항에 있어서, 상기 (c)단계의 수핵 난자의 난구 세포는 수핵 난자를 하이알루로니다제로 처리한 다음, 물리적으로 제거되는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법.
  21. 제15항에 있어서, 상기 (c)단계의 공여핵 세포를 탈핵 난자에 이식하는 과정이 공여세포를 난자의 투명대에 형성된 절개창으로 주입하는 것임을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법.
  22. 제15항에 있어서, 상기 (c)단계가 작제된 핵 이식란을 대리모에 이식하기 전에 활성화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 핵 이식란의 활성화가 전기 융합을 통해 이루지는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 전기융합이 직류전압을 0.75 내지 2.00kV/cm, 시간을 10 내지 20㎲, 횟수를 0.01초 내지 10초 간격으로 1 내지 5회에 걸쳐 실시하는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법.
  25. 제22항에 있어서, 상기 단계가 사이클로헥시미드 용액 또는 디엠에이피(DMAP) 용액에 핵이식란을 침지하고 배양하는 후활성화 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 핵 이식란의 후 활성화 단계가 활성화된 핵이식란을mSOF 배지에 배양하는 체외배양 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법.
  27. 소의 유선에서 사람 프로유로키나제를 발현하는 형질전환 복제 소의 우유로부터 사람 프로유로키나제를 수득하는 것을 특징으로 하는 사람 프로유로키나제를 생산하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 형질전환 복제 소는 상기 제15항 내지 제26항 중의 어느 한 항의 형질전환 복제 소의 생산방법으로 생산된 것을 특징으로 하는 사람 프로유로키나제를 생산하는 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 형질전환 복제 소가 소의 핵이식란 SNU-B1(KCTC 10286BP)로부터 생산된 것을 특징으로 하는 사람 프로유로키나제를 생산하는 방법.
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