KR100502695B1

KR100502695B1 - 형질전환 효율이 향상된 복제수정란의 대량 생산 방법

Info

Publication number: KR100502695B1
Application number: KR10-2002-0010746A
Authority: KR
Inventors: 한용만; 이경광; 박정선; 최영희; 위갑인
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2002-02-28
Filing date: 2002-02-28
Publication date: 2005-07-25
Also published as: KR20030071174A

Abstract

본 발명은 형질전환 효율이 향상된 복제수정란의 대량 생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 외래유전자와 항생제 내성 네오(neo) 유전자로 구성된 발현벡터를 제작하고 이 벡터를 소 체세포로 삽입 유도한 후, 삽입이 확인된 클론만을 선별하여 이를 공여세포로 제공함으로써 형질전환 복제수정란을 생산함과 동시에 나아가 형질전환 동물의 대량 생산체계 기반을 확립할 수 있는 복제수정란의 대량 생산방법에 관한 것이다.

Description

형질전환 효율이 향상된 복제수정란의 대량 생산방법{A method for mass production of cloned embryos for improving transgenesis in animals}

형질전환 동물이란 외래유전자를 인위적으로 동물의 염색체내에 도입시킨 유전자 변형 동물을 말하며, 이는 가축의 육질 개선과 성장속도에 따른 생산성 향상, 소나 양 등의 유즙으로부터 유용한 의약용 단백질의 대량 생산, 대체 장기 생산용 형질전환동물, 각종 질병과 생체 기작 구명을 위한 질환 모델 동물 개발, 그리고 선천적 또는 후천적 질병에 대한 유전자 치료 등에 이용될 수 있다. 이러한 형질전환 동물을 생산하는 방법으로는 미세주입법[Krimpenfort 등, Bio/Technology, 9, 844 (1991)], 정자벡터 이용법[Lavitrano 등, Cell, 57, 717 (1989)], 레트로바이러스 벡터법[Haskell 과 Bowen, Mol. Reprod. Dev., 40, 386 (1995)], 배아간세포를 이용한 유전자 적중법 등이 보고되어져 왔다[Strojek 등, Theriogenology, 33, 910 (1990)]. 그러나, 이들 방법들에 있어 미세주입법은 소에서는 0.7%, 산양 및 면양에서는 0.9%, 돼지에서는 0.9%로 그 실용효율이 1% 미만으로 극히 낮으며, 또한 심한 모자이크 현상이 문제시되고 있다[Bremel R.D., Theriogenology, 45, 51, (1996)]. 정자벡터 이용법은 가장 간단한 방법이긴 하지만 성공 정도의 변이가 너무 심하고 아직 효율적인 방법이 개발되어 있지 않아 그 방법에 대한 구체적인 기작 규명이 우선시 된다. 바이러스 벡터 이용법은 재조합된 레트로바이러스를 만들어야 하는 불편함이 있으며, 이 방법 또한 수정란에서의 낮은 감염율과 모자이크 현상으로 그 실용효율이 낮으며 도입하고자 하는 유전자 크기가 최대 4 ∼ 6 kb 밖에 넣을 수 없어 실용화에 제약을 받는 단점이 있다. 마지막으로 배아간세포 이용법은 생쥐의 경우 배아간세포의 확립으로 유전자 적중연구에 유용하게 사용되어지고 있으나 가축에서는 아직도 유용한 배아간세포의 개발이 어려운 상태이다. 따라서, 1997년 Schnieke 등[Science, 278, 2130 (1997)]에 의해 보고된 체세포 복제기법은 면양 태아섬유아세포에 외래유전자를 삽입시켜 핵이식을 통해 형질전환 면양을 생산하는데 성공함으로써 앞서 언급된 방법들의 문제점을 극복할 수 있는 토대가 되었다. 또한, 이 방법은 다른 방법들에 비해 원하는 유전자의 발현을 임의대로 조절할 수 있을 뿐만 아니라 유전자 적중 기법과 결합시 대동물에서 특정 유전자의 발현 양상과 기능연구에도 기여할 수 있을 것이다. 더욱이, 2000년 McGreath 등[Nature, 405, 1066 (2000)]에 보고된 핵이식 기법을 이용한 유전자 적중 면양의 등장은 체세포 복제기법의 활용 영역에 있어 그 확대 가능성을 시사하였다. 그러나, 체세포 복제기법 또한 불명확한 핵이식 기법과 외래유전자가 전이된 공여세포주의 부적절한 선별로 인해 산자 생산 효율이 저조할 뿐만 아니라, 산자가 생산되더라도 외래유전자가 도입되지 않을 가능성이 지극히 높았다.

따라서, 복제기법에 의해 형질전환 동물을 효과적으로 생산하기 위해서는 외래유전자의 체세포내 삽입에서부터 핵이식기법을 이용한 형질전환 복제수정란 생산까지의 전반적인 조건 확립의 효율성 증진이 요구된다.

이에, 본 발명자들은 상기에서 언급한 체세포 복제 기법의 단점을 보완하기 위하여 연구한 결과, 외래유전자로 인체 트롬보포이에틴 유전자와 항생제 내성을 지닌 네오 유전자를 이용한 발현벡터 제작 및 소 체세포로의 발현벡터 도입을 유도하여 삽입이 확인된 클론만을 선별, 핵이식에 있어 공여세포로 제공하여 복제수정란의 유전자 도입효율이 현저히 개선됨으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 유용 유전자가 도입된 형질전환 체세포의 선별 및 이들 체세포를 이용하여 형질전환 복제수정란의 대량생산 체제를 확립하는데 그 주된 목적이 있다.

본 발명은

1) 외래유전자 및 네오(neo) 유전자를 포함한 발현벡터를 제작하는 단계;

2) 상기 발현벡터를 소 체세포로 삽입 유도 후 삽입이 확인된 클론만을 선별하여 형질전환 세포주를 확보하는 단계; 및

3) 상기 세포주를 핵이식 공여세포로 이용하여 복제수정란을 재구성하고, 생산된 복제수정란의 형질전환 빈도를 PCR로 검증하는 단계를 포함하는 형질전환 효율이 향상된 복제수정란의 대량 생산방법을 그 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

우선, 본 발명은 소 체세포에 도입될 외래유전자로 인체 트롬보포이에틴 유전자를 사용하여 발현벡터를 제작하고, 리포펙타민(LIPOFECTAMINE)을 이용하여 체세포내에 이들 발현벡터의 도입을 유도한다. 발현벡터인 pBT-L 벡터는 유선 특이적 발현을 위한 소 베타 케이신 프로모터에 인체 트롬보포이에틴 cDNA 및 소 성장호르몬의 poly A 염기서열이 연결된 재조합 유전자이며[도 2A], 체세포용 발현벡터는 유전자 도입 후 형질전환 세포만을 선별하기 위해 항생제 내성 네오 유전자를 상기 발현벡터에 재조합하여 총 16.9 kb 크기로 구성한다[도 2B]. 소 체세포에 인체 트롬보포이에틴 유전자를 도입하기 위하여 리포펙타민과 SalⅠ또는 XhoⅠ에 의해 선형화된 발현벡터를 혼합하여 5시간 동안 배양을 실시한다.

다음 공정은 상기 공정에서 유전자 도입이 유도된 단일 세포로부터 콜로니 형성 후 인체 트롬보포이에틴 유전자 도입이 확인된 클론만을 선별하여 형질전환 세포주를 확보하는 공정으로, 인체 트롬보포이에틴 유전자 도입이 유도된 후 배양접시 바닥에 충분히 자란 체세포를 네오마이신이 들어있는 선별 배양액 하에서 배양하면서 상기 벡터가 도입되지 않은 세포들은 사멸시키는 방법으로 형질전환 세포들을 선별한다. 배양 후 13일째부터 형성되기 시작한 콜로니가 직경 1 ㎝ 가까이 되었을 때 채취하여 유전자 삽입 여부를 PCR로 평가하여 확인된 콜로니만을 선별 배양액 하에서 지속적으로 배양하며, 매 계대시마다 유전자 전이를 확인하여 배양접시에서 밀집으로 자랐을 때 동결 보존하며 핵이식시 공여세포로 제공한다. 이때 일반적으로 콜로니 채취를 하지 않고 선별배양액에서 자란 세포들을 모두 회수하여 핵이식시 공여세포로 제공하였을 때에는 재구성된 복제수정란에서 외래유전자 도입 효율이 낮은 문제가 있으나, 본 발명은 총 29개의 콜로니를 분석하여 그중 23 개가 유전자 삽입이 확인되었으며, 최종적으로 계대배양 능력을 가지고 있는 4개의 클론만을 공여세포주로 이용하였다.

다음으로는 상기 공정에서 확보된 세포주를 이용하여 인체 트롬보포이에틴이 도입된 복제수정란을 재구성하고, 생산된 복제수정란의 형질전환 빈도를 PCR로 검증한다. 미성숙 난포란을 체외에서 배양 후 제 1 극체가 도출된 성숙난자만을 선택하여, 제 1 극체와 핵을 제거하고 수핵난자로 사용한다. 미리 준비된 형질전환 체세포를 제핵된 난자의 위란강내로 하나씩 주입하고, 융합기에 정렬시킨 후 통전하여 난자의 세포질과 공여세포의 융합을 유도한 다음, 실체 현미경하에서 융합이 확인된 재구성난자만을 아이오노마이신(ionomycin)에서 처리하고 6-DMAP에서 처리하여 재구성란의 활성화를 유도한다. 재구성된 복제수정란은 0.3% 소 혈청알부민이 첨가된 CR1aa 배양액에서 3일, 10% 소 태아 혈청이 CR1aa 배양액에서 4일, 총 7일간 배양하여 복제수정란을 각 발육 단계별로 회수 후 인체 트롬보포이에틴 유전자의 게놈내 삽입 여부를 PCR로 확인한 결과, 배반포 단계에서의 90.9%가 형질전환 수정란임을 확인함으로써, 보고된 기존방식의 5 ∼ 54%에 비해 월등히 높은 형질전환 효과를 나타내었다[Behboodi 등, J. Dairy. Sci., 33, 165 (1993); Hyttinen 등, Mol. Reprod. Dev., 43, 150 (1996)].

이하, 본 발명을 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

1. 인체 트롬보포이에틴 발현벡터 제작

젖소 베타 카제인 유전자의 프로모터 부분을 포함하는 5 말단 영역의 10 kb에 5'-UTR 부위가 제거된 인체 트롬보포이에틴 cDNA(1065 bp)와 젖소 성장 호르몬 유전자의 poly(A) 첨가신호 300 bp를 pBluescript Ⅱ SK(+) 벡터(pSKⅡ, Stratagene)에 서브클로닝(subcloning)하여 pBT-L 벡터를 제작하였다[도 2A, 대한민국 출원번호 제 2000-21745호]. 또한, 유전자 전이된 체세포의 선별을 위해 pMAMneo 벡터[pMAMn대, Clontech]의 네오유전자(neo gene) 양쪽 부분을 BamHⅠ으로 절단, pBT-L 벡터에 삽입하여 pBT-Lneo 벡터를 구축하였다[도 2B]. 본 발명에서 형질전환 복제수정란 생산에 사용된 발현벡터의 모식도는 도 2B에 나타나 있다.

2. 소 귀조직 유래 세포로의 유전자 도입

6 웰 배양접시에 1 ∼ 3 ×10⁵/㎖ 농도의 체세포를 첨가하여 약 70% 정도 밀집될 때까지 성장 배양액에서 배양하였다. 이렇게 자란 세포를 무혈청배지로 2회 세척한 후, 배양접시 각 웰당 100 ㎕의 무혈청배지에 2 ㎍의 DNA와 다른 100 ㎕의 무혈청배지에 10 ㎕의 리포펙타민을 녹여 잘 섞은 다음, 45분간 실온에서 배양한 혼합물을 0.8 ㎖의 무혈청배지를 첨가하여 5시간동안 공배양함으로써 상기 벡터의 체세포내 삽입을 유도하였다. 여기에 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배양액을 웰당 2 ㎖씩 첨가하여 24시간 동안 추가배양을 실시하고, DNA와 리포펙타민 혼합 배지를 제거하기 위하여 신선한 배양액으로 교체하였다.

실시예 2

1. 유용유전자 도입된 체세포의 선별

인체 트롬보포이에틴 유전자를 체세포내 도입을 유도한 후 배양 72시간 후부터 형질전환 세포의 선별을 시작하였다. 선별 배양액으로는 ㎖당 600 ㎍의 제네티신(G418, GIBCOBRL)과 10% FBS가 첨가된 DMEM 배양액을 사용하였다. 선별 후 3일째부터 유전자가 들어있지 않은 세포들이 사멸되기 시작하여 9일째 몇 개의 형질전환 세포만이 남았으며 13일째부터 한 개의 세포로부터 분화되어 조그만 콜로니들이 생기기 시작하였다. 초기 콜로니는 도 3A에 나타냈으며, 이들 콜로니를 약 2주 이상 배양하여 콜로니가 충분히 자라도록 하였다[도 3B].

2. 유용유전자 도입 여부 확인 및 형질전환 세포주 확보

직경이 약 1 ㎝ 정도 자란 콜로니에 실린더를 씌워 3분간 0.25% 트립신/ EDTA를 처리하여 피펫팅(pipetting)에 의해 배양접시에서 각각의 콜로니 세포를 분리한 후 48 웰 배양접시의 각 웰로 옮겨 배양하였으며, 24 웰로 증식계대할 때 3 ∼ 5개의 세포를 채취한 다음 이들 세포들에 대해 중합효소 연쇄반응(PCR)법을 수행하여 외래유전자의 도입여부를 확인하였다. 중합효소 연쇄반응에 사용된 프라이머(primer)는 다음과 같다.

5'-프라이머(서열번호 1)

5'-GGAGCTGACTGAATTGCTCCTCGT-3'

3'-프라이머(서열번호 2)

5'-CCTGACGCAGAGGGTGGACCCTCC-3'

증폭된 DNA 크기는 500 bp이며, 반응조건은 먼저 세포 유래의 게놈 DNA를 94 ℃에서 3분 동안 1회 처리한 다음, 94 ℃에서 45초, 56 ℃에서 1분, 72 ℃에서 1분의 반응조건으로 46회 반복하여 PCR을 수행하였다. 인체 트롬보포이에틴 유전자가 삽입된 것으로 확인된 콜로니 세포주는 24 웰, 12 웰, 6 웰 및 직경 100 mm의 배양접시로 세포수를 늘려가면서 배양하였으며, 100 mm 배양접시에 도달하였을 때 핵이식시 공여세포로 공시하기 위해 동결보존하였다. 그 결과를 다음 표 1과 도 4에 나타내었다.

소 체세포내 인체 트롬보포이에틴 유전자의 도입 효율 및 클론의 형성효율

구 분	채취된 콜로니수	PCR분석된콜로니수(%)	확인된콜로니수(%)	확보된세포주수(%)
TS	40	16(40.0)	12(75.0)	2(16.7)
TX	17	13(76.5)	11(84.6)	2(18.2)
합 계	57	29(50.9)	23(79.3)	4(17.4)
TS: 구성된 벡터의SalI부위를 절단한 후 세포내로 유전자 도입을 유도한 것. TX: 구성된 벡터의XhoI부위를 절단한 후 세포내로 유전자 도입을 유도한 것.

상기 표 1에서 보는 바와 같이 선별 후 채취된 콜로니 수가 총 57개였고, 그 중 29(50.9%)개 콜로니에서 PCR에 의해 외래유전자 삽입여부가 분석되었다. 분석된 콜로니 중 인체 트롬보포이에틴 유전자 도입이 확인된 콜로니는 23개로 79.3%의 유전자 도입효율을 나타내었으며, 이 콜로니들 중 계대증식능력을 가진 4개(17.4%)의 형질전환 세포주를 확보하게 되었고 이들 세포들을 형질전환복제수정란 생산에 공시하였다.

실시예 3

1. 수핵 난자의 준비

도축장에서 공급된 난소로부터 회수된 미성숙 난포란을 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 소디움 피루베이트(sodium pyruvate) 56 ㎍/㎖, FSH 10 ㎍/㎖, 에스트라디올-17β(estradiol-17β) 1 ㎍/㎖ 및 L-시스테인(L-cysteine) 100 ㎍/㎖이 첨가된 체외성숙 배양액에 약 20시간 동안 배양하여, 0.1% 히알루로니데이즈(hyalruronidase)로 난구세포를 제거한 후 제 1 극체가 돌출된 난자만을 선별하여 수핵 난자로 공시하였다. 수핵 난자의 탈핵은 제 1 극체 부분을 절개 피펫으로 절개하여 20 ∼ 25 ㎛의 미세 피펫으로 극체와 주변의 세포질을 흡입, 핵물질을 제거하였다. 핵이 제거된 난자들은 체세포 이식을 실시하기 전까지 10% FBS가 함유된 F-12(Sigma) 배양액에서 보관하였다.

2. 재구성된 복제수정란 생산

상기 실시예 2의 제 2 공정에서와 같이 준비된 형질전환 세포들 중에서 크기가 작고 상태가 양호한 세포만을 골라 상기 제 1 공정에서 준비한 수핵 난자의 위란강에 하나씩 주입하였다. 이때 사용된 배양액은 7.5 ㎍/㎖의 싸이토칼라진 B, 10% FBS가 첨가된 칼슘이온과 마그네슘이온이 들어있지 않은 TL-Hepes 용액이었다. 이렇게 재구성된 복제수정란은 0.3 M 만니톨(pH 7.0) 용액(0.1 M MgCl₂, 0.1 M CaCl₂, 0.01% BSA 함유)에서 160 V/mm의 직류 전압을 20 μsec 동안 1회 통전하여 난자의 세포질과 공여 세포의 융합을 실시하였고, 융합이 확인된 재구성란들을 아이오노마이신(ionomycin) 5 μM/㎖에서 5분 동안 처리하고 6-DMAP(6-dimethylaminopurine) 2 mM/㎖에서 4시간동안 처리하여 활성화를 유도하였다.

3. 복제수정란의 체외 배양

상기 2 공정에서 활성화가 유도된 복제수정란을 0.3% 소혈청알부민(BSA; Sigma사)이 함유된 CR1aa 배양액에서 3일간, 10% FBS이 함유된 CR1aa 배양액에서 4일간 배양하였고, 배양 조건은 38.5 ℃, 5% CO₂의 공기 조건하에서 실시하였다. 배양 후 2일째에 난할율을 측정하였고, 7일째에는 배반포까지의 체외 발달율을 조사하였다. 그 결과를 다음 표 2에 체외 발달율로 나타내었다.

인체 트롬보포이에틴 유전자가 도입된 체세포로 재구성된 복제수정란의 체외발달

구 분	계대수	배양된수정란수	난할된수정란 수(%)	배반포수(%)
TS4	4	11	6(54.5)	3(27.3)
TS14	4 ∼ 5	97	76(78.4)	34(35.1)
TX3	4 ∼ 5	35	26(74.3)	6(17.1)
합 계	4 ∼ 5	143	108(75.5)	43(30.1)

상기 표 2에서 보는 바와 같이 인체 트롬보포이에틴 유전자가 도입된 형질전환 세포를 공여세포로 공시하였을 때 재구성란의 난할율은 75.5%를 보였고, 난할된 수정란의 배반포까지 체외 발달률은 30.1%로 나타났다. 이러한 결과로서 유용 유전자가 도입된 형질전환 체세포를 핵이식한 복제수정란도 정상적으로 배반포기까지 발달한다는 것을 알 수 있었다.

4. 복제수정란에서 형질전환 여부의 판정

배양 7일째에서 각 발육단계별 복제수정란을 회수하여 PCR을 수행하여 복제수정란의 형질전환 빈도를 판정하였다. 이때 제 1 차 PCR에서는 다음의 프라이머(primer)를 사용하여 DNA를 증폭하였으며 반응 산물의 크기는 500 bp가 되었다.

5'-프라이머(서열번호 3)

5'-GGAGCTGACTGAATTGCTCCTCGT-3'

3'-프라이머(서열번호 4)

5'-CCTGACGCAGAGGGTGGACCCTCC-3'

그리고, 제 2 차 포개어진(nested) PCR에서는 다음의 프라이머를 사용하였으며 증폭된 DNA의 크기는 300 bp가 되도록 하였다.

5'-프라이머(서열번호 5)

5'-GGAGCTGACTGAATTGCTCCTCGT-3'

3'-프라이머(서열번호 6)

5'-GAGACGGACCTGTCCAGAAAGCTG-3'

PCR 산물은 1.3% 아가로스 겔에서 전기영동을 실시하여 인체 트롬보포이에틴 유전자의 도입여부를 확인하여 다음 표 3과 도 5에 나타내었다.

재구성된 복제수정란의 발달 단계에 따른 외래유전자의 도입 효율

구 분	복제된 수정란수	유전자 도입이 확인된 수정란 수(%)
구 분	복제된 수정란수	1세포기	2세포기	4세포기	8세포기	배반포
TS4	7			0/1(0.0)	1/3(33.3)	3/3(100.0)
TS14	136	9/17(52.9)	11/13(84.6)	15/26(57.7)	40/59(57.8)	19/21(90.5)
TX3	23	5/12(41.7)	1/3(33.3)	2/2(100.0)	1/1(100.0)	5/5(100.0)
합 계	166	14/29(48.3)	12/16(75.0)	17/29(58.6)	42/63(66.7)	27/29(93.1)

상기 표 3에 나타낸 바와 같이 다양한 공여세포로부터 생산된 복제수정란의 형질전환 효율은 배반포기단계에서 93.1%로 매우 높았다. 이는 지금까지 알려진 가축의 형질전환방법에서의 5 ∼ 54%의 형질전환 수정란의 생산 효율보다 월등히 향상되는 결과를 보여 주고 있다[Behboodi 등, J. Dairy. Sci., 33, 165 (1993); Hyttinen 등, Mol. Reprod. Dev., 43, 150 (1996)].

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 외래유전자가 도입된 세포주의 확보에 있어서 콜로니 형성단계에서부터 유전자 도입 여부를 확인한 후 검정된 콜로니만을 하나의 클론으로 배양하여 형질전환 복제수정란 생산시 공여세포로 제공함으로써 배반포 단계에서의 외래유전자 도입효율을 93.1%로 향상시켰다. 따라서, 본 발명은 아직까지 그 생산효율이나 실용화 측면에서 미비한 단계에 머물고 있는 형질전환 가축의 생산성을 형질전환된 배반포를 이식함으로써 향상시킬 뿐만 아니라, 나아가 인체 유용한 단백질의 대량생산, 인공 대체 장기 생산 동물 개발 및 질환 모델 동물 개발에 기여할 수 있으며, 유전자 적중법과 더불어 특정 유전자 발현 양상 및 유전자기능연구에도 그 효용 가치가 크리라 기대된다.

도 1은 본 발명에 따른 형질전환 효율이 향상된 복제수정란을 대량 생산하는 방법을 나타낸 개략도이다.

도 2는 소 베타 카제인 프로모터와 인체 트롬보포이에틴(Thrombopoietin) 유전자의 재조합 발현벡터 pBT-L(A) 및 pBT-L에 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 발현벡터 pBT-Lneo(B)를 나타낸 모식도이다.

도 3은 선별 배양액 하에서 자란 형질전환 세포주의 초기 콜로니(A) 및 채취 직전의 콜로니(B)를 나타낸 사진이다.

도 4는 채취된 콜로니로부터 인체 트롬보포이에틴 유전자 도입여부를 판별하기 위한 중합효소연쇄반응(PCR) 분석 결과를 나타낸 것이다[M: DNA 사이즈 마커(size marker), #3 - #6: 콜로니 번호, P: 양성 대조군(positive control), N: 음성 대조군(negative control)]

도 5는 재구성된 복제수정란에서 발달 단계별로 형질전환 여부를 PCR 분석 결과를 나타낸 것이다[M: DNA 사이즈 마커, BL: 배반포기 수정란, TC: 인체트롬보포이에틴 유전자가 삽입된 세포, bF: 외래유전자 도입이 안된 정상 세포, P: 양성 대조군, N: 음성 대조군]

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A method for mass production of cloned embryos for improving transgenesis in animals <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-PRIMER <400> 1 ggagctgact gaattgctcc tcgt 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-PRIMER <400> 2 cctgacgcag agggtggacc ctcc 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-PRIMER <400> 3 ggagctgact gaattgctcc tcgt 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-PRIMER <400> 4 cctgacgcag agggtggacc ctcc 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-PRIMER <400> 5 ggagctgact gaattgctcc tcgt 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-PRIMER <400> 6 gagacggacc tgtccagaaa gctg 24

Claims

1) 인체 트롬보포이에틴 및 네오(neo) 유전자를 포함한 도 2의 B에서 salI 또는 xhoI에 의해 선형화된 발현벡터를 제작하는 단계;

2) 리포펙타민을 이용하여 상기 발현벡터를 소 귀조직 유래 체세포로 삽입 유도하는 단계;

3) 네오마이신이 들어 있는 배양액에서 배양하여 콜로니를 성장시켜 형질전환 체세포에 대해 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머로 중합효소연쇄반응(PCR)법을 수행하여 외래 유전자의 도입여부를 확인한 클론만을 선별하여 형질전환 세포주를 확보하는 단계; 및

4) 상기 세포주를 핵이식 공여세포로 이용하여 복제수정란을 재구성하고, 이 복제수정란을 배반포기 단계까지 체외 배양시킨 후, 생산된 복제수정란의 형질전환 빈도를 서열번호 3과 4의 프라이머로 중합효소연쇄반응(PCR) 및 서열번호 5와 6의 프라미어로 포개어진(nested) PCR 법으로 검증하는 단계

를 포함하는 형질전환 효율이 90.5% 이상으로 향상된 복제수정란의 대량 생산방법.

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