JP4903392B2 - 遺伝子ホモ改変哺乳動物細胞、遺伝子ホモ改変非ヒト哺乳動物、及びそれらの樹立、作出方法。 - Google Patents
遺伝子ホモ改変哺乳動物細胞、遺伝子ホモ改変非ヒト哺乳動物、及びそれらの樹立、作出方法。 Download PDFInfo
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Description
本発明の実施例においては、ウシα1,3GTゲノミックDNAの触媒領域をコードしている部位を含んだクローンを用いた(Transplantation, 76, 900-903, 2003;特開2002−17360号公報)。本発明において用いられるTVの構築に際しては、構築されたTVの耐性遺伝子ユニットがターゲッティング操作後に脱離可能なように組込まれる。耐性遺伝子ユニットがターゲッティング操作後に脱離可能に組込まれたTVとしては、耐性遺伝子ユニットがloxP配列に挟まれて組込まれた構造を採用することができる。
TV(pGT−22)の構築はSendaiらの方法(Transplantation, 76, 900-903, 2003)により、黒毛和牛α1,3GTゲノムDNA(clone−JA8)からベクター構築に必要な領域をサブクローニングして行った。pGT−22ベクターはIRES/lacZ−neoユニット(IRES配列を持つβガラクトシダーゼ結合ネオマイシン耐性遺伝子)(pBIKS(-)IresBgeopAベクター(理化学研究所)由来)の5´側及び3´側にα1,3GTゲノムDNAが位置するように構築した。5´側には、α1,3GTゲノムDNAのエクソン8(E8)領域を含むEcoRV(タカラバイオ社製)消化断片(6.3kb)を使用し、3´側には、α1,3GTの酵素触媒領域のエクソン9(E9)のHindIII(タカラバイオ社製)−BamHI(タカラバイオ社製)消化断片(0.8kb)を使用した(図1)。
全農ETセンター所有の黒毛和種の雌牛(ふくみ)に凍結精液(黒毛和牛,第7糸桜)を人工授精し、7日後に得られた受精卵4卵を発情を同期化させた受卵牛に移植した。胎齢49日目、胎子を無菌的に回収し、頭部および消化器官を除去した後、解剖バサミで細かく切り刻み、0.1%トリプシン−EDTA(GIBCO BRL社製)処理(4℃、12時間)して細胞を分散・分離し、培養して増殖してくる線維芽細胞を初代培養(37℃、5%C02/95%空気)して細胞株とした(#906株)。この株を用いTVの導入・選別培養を実施した。
胎子由来線維芽細胞を10% FCSを含むMEMα培地(GIBCO BRL社製)2mlを培養液とし、2万細胞/穴となるよう6穴細胞培養プレート(greiner社製)4枚に播種した。播種後2日目、制限酵素Not I(タカラバイオ社製)消化し、直線化したTVを導入した。導入方法は、以下の通りである。まず、培養プレートより培養液を除去した後、そこへ1ml(1穴当たり)の遺伝子導入用培地(TransFast試薬(Promega社製)使用時:1ml MEMα培地に2μgのTV、6μlのTransFast試薬を使用、Lipofectamine−PLUS試薬(GIBCO BRL社製)使用時:1ml MEMα培地に2μgのTV、8μlのLipofectamine試薬、12μlのPLUS試薬を使用)を添加し、インキュベーター(タバイエスペック社製)(37℃、5% CO2/95%空気)内で60分(TransFast試薬使用時)若しくは180分(Lipofectamine-PLUS試薬使用時)間培養した。
48穴細胞培養プレート2枚に分割して継代したネオマイシン耐性細胞は、2〜3日後にコンフレントとなり、1枚をPCR法による相同組換え体の判定に使用した。48穴細胞培養プレートにDNA抽出バッファー(10mM Tris−HCl(pH8.5)、50mM KCl、2mM MgCl2、0.45% NP−40、0.45% Tween−20)を1穴当たり50μl加えた。そこにProteinase K(ナカライテクス社製)(100μg/ml)を加え、55℃で70分間インキュベートし、さらに100℃で10分間インキュベートした。インキュベート終了後、DNAサンプルは4℃で保持し、PCRに使用した。PCRは1サンプル当たり、テンプレート(DNA抽出サンプル)5μl、anti-Taq high用10×PCR buffer(TOYOBO社製)2.5μl、センスプライマー(10pmoles/μl)0.25μl、アンチセンスプライマー(10pmoles/μl)0.25μl、dNTPs mixture (2mM each) 2μl、anti-Taq high(TOYOBO社製)+ rTaq DNAポリメラーゼ(TOYOBO社製)混合液0.25μl、滅菌蒸留水にて計25μlになるように調整し実施した。
ヘテロ相同組換え細胞及びホモ相同組換え細胞のゲノム中からのIRES/lacZ−neoユニットの除去は、Cre/loxP組換えシステムを使用することにより行った。PCR陽性となった細胞と同一クローン由来の細胞を継代していく段階で、Cre組換え酵素を一過的に発現する組換えアデノウイルス(AxCANCre:理研ジーンバンク、RDB No.1748)を定法に従い感染処理することにより、細胞内にCre組換え酵素を発現し、loxP配列に挟まれたIRES/lacZ−neoユニットを除去した。IRES/lacZ−neoユニットの除去確認はPCR解析およびサザンブロット解析により行った(図2)。
PCR陽性となった細胞と同一クローン由来の細胞を、48穴細胞培養プレートから回収し、12穴細胞培養プレート(greiner社製) に継代、48時間後更に6穴細胞培養プレートの2穴に継代、その48時間後に75cm2細胞培養フラスコ(greiner社製)に継代してコンフルエントになった段階で一部を凍結保存,一部をサザンブロット解析のゲノム調整での確認用に75cm2細胞培養フラスコ2本に継代した。サザンブロット解析用ゲノムDNAの調整は、定法に従い行った。サザンブロット解析は、細胞より調整したゲノムDNAを制限酵素XbaI(タカラバイオ社製)で充分消化後、0.8%アガロース電気泳動、ナイロンメンブレンへの転写、プローブハイブリダイゼーション、BAS5000(富士フイルム社製)による視覚化の手順で行われた。
と蓄場由来のウシ卵胞卵子を体外成熟培養(5%ウシ胎子血清添加TCM199培地(GIBCO BRL社製)、5%CO2/95%空気、38℃)し、培養開始19〜20時間目に卵丘細胞を除去した後、第1極体側から卵細胞質を約1/3取り除き除核した。PCR及びサザンブロット解析でヘテロまたはホモKOが確定した細胞(#3−46Cre又は#H1−38Cre)を10%ウシ胎子血清添加D−MEM培地(GIBCO BRL社製)(5%CO2/95%空気、38℃)で3日間培養して核移植に使用した。細胞の処理方法及び核移植は、浦川らの方法(Theriogenology 62, 714-728, 2004:特開2003−523369号公報)に従って行った。
細胞表面のαGal糖鎖の解析は、αGal糖鎖を特異的に認識するバンデリアマメレクチン(BS-I Isolectin B4)を用いた蛍光標識レクチン−FACS解析により行った。培地を吸引除去し、PBSで2回洗浄した後、細胞を0.05%トリプシン−EDTA処理により単離・浮遊化する。浮遊化した細胞を、FITC標識−BS−I(B4)(SIGMA社製, L2895)で処理し、結合性をFACS解析装置(ベクトン・デッキンソン社製)で調べた。
樹立した細胞株(#270)の増殖能力の解析は、一定期間培養後の細胞数を#906株(オリジナル株)と比較することにより行った。24穴細胞培養プレートに、#B270細胞及び#906細胞をそれぞれ1穴あたり4000細胞播種し、播種後2日目、及び4日目の細胞数をトリプシン−EDTA処理で分散させた後、コールターカウンター(ベックマン-コールター社製)で算出した。
1.#906株(α1,3GT+/+)に対して4回のヘテロKO化の導入実験(TransFast試薬、2回:Lipofectamine−PLUS試薬、2回)をした結果、4個(4/1152)のPCR陽性細胞が得られた(表1)。順調な細胞増殖を示した細胞株に対してサザンブロット解析を行い、相同組換え体(#3−46株:α1,3GT+/−・IRES/lacZ−neo+)を同定した(図2:レーン2)。
Claims (10)
- 遺伝子ターゲッティングを用いた哺乳動物体細胞の任意遺伝子の改変において、耐性遺伝子ユニットがターゲッティング操作後に脱離可能に組み込まれたターゲッティングベクターを構築し、該ターゲッティングベクターを用いて第1のターゲッティング操作を行って、任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてヘテロに改変されたヘテロ改変哺乳動物細胞を取得し、該ヘテロ改変哺乳動物細胞から、耐性遺伝子ユニットを耐性遺伝子ユニット脱離操作によって脱離させた後、第1のターゲッティング操作に用いたターゲッティングベクターを用いて第2のターゲッティング操作を行って、任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてホモに改変されたホモ改変哺乳動物細胞を取得することを特徴とする体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法。
- 耐性遺伝子ユニットがターゲッティング操作後に脱離可能に組込まれたターゲッティングベクターが、耐性遺伝子ユニットがloxP配列に挟まれて組込まれたターゲッティングベクターであることを特徴とする請求項1記載の体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法。
- 耐性遺伝子ユニット脱離操作が、Cre組換え酵素発現処理による耐性遺伝子ユニットの組換体ゲノム中よりの除去操作であることを特徴とする請求項1又は2記載の哺乳動物体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法。
- 第1のターゲッティング操作を行って取得したヘテロ改変哺乳動物細胞から、耐性遺伝子ユニットを耐性遺伝子ユニット脱離操作によって脱離させた後、第1のターゲッティング操作に用いたターゲッティングベクターを用いて第2のターゲッティング操作を行って、任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてホモに改変されたホモ改変哺乳動物細胞を取得する操作が、第1のターゲッティング操作を行って取得したヘテロ改変哺乳動物細胞に対して、Cre組換え酵素発現処理を行って耐性遺伝子ユニットを除去した後、この細胞を用いて体細胞核移植を行い、ヘテロ改変胎子を作成し、該胎子由来線維芽細胞を取得し、続いて該胎子由来線維芽細胞に対して第2のターゲッティング操作を行うことにより任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてホモに改変されたホモ改変線維芽細胞を取得することを特徴とする請求項1〜3のいずれか記載の体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法。
- 哺乳動物体細胞の任意遺伝子の改変が、任意遺伝子のノックアウトであることを特徴とする請求項1〜4のいずれか記載の体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法。
- 哺乳動物体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞が、ウシ、ブタ、又はヒツジのホモ改変線維芽細胞であることを特徴とする請求項4又は5記載の体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法。
- 請求項1〜6のいずれか記載の哺乳動物体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法により体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞を樹立し、該哺乳動物体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞をドナーとし、クローン胚を形成した後、受卵動物に移植し、産子を出産することを特徴とする任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物の作出方法。
- 請求項7記載のホモ改変非ヒト哺乳動物の作出方法において、哺乳動物体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞をドナーとするクローン胚の形成、該クローン胚の受卵動物への移植、及び、産子の出産が、請求項1〜6のいずれか記載の哺乳動物体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法により樹立された体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞を、除核卵子に挿入することにより核移植を行い、該核移植胚を培養後、受卵哺乳動物に胚移植し、妊娠確定後飼養して産子を出産することにより行われることを特徴とする請求項7記載の任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物の作出方法。
- 哺乳動物体細胞の任意遺伝子の改変が、任意遺伝子のノックアウトであることを特徴とする請求項7又は8記載の任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物の作出方法。
- ホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物が、ウシ、ブタ、又はヒツジであることを特徴とする請求項7〜9のいずれか記載の任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物の作出方法。
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