KR20100013227A - 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터 및그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 상동 재조합 방법으로 돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자를 제거할 수 있는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터에 관한 것으로, 구체적으로는 (1)핵 국재화 신호(nuclear localization signal, nls) 영역; (2) 돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 핵산 서열에 상동인 4 내지 6 kb 길이의 핵산 서열로서 돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 인트론 8 일부 및 엑손 9의 일부를 포함하는 제1영역; (3)양성 선별마커 영역; (4)돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 핵산 서열에 상동인 0.5 내지 2 kb 길이의 핵산 서열로서 돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 엑손 9의 일부를 포함하는 제2영역; 및 (5)음성 선별마커 영역을 가지며, 상기 (1) 내지 (5)영역들이 5'말단에서부터 순서대로 구성되는 것을 특징으로 하는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터, 상기 벡터가 도입된 세포 및 상기 벡터에 의해 넉 아웃된 형질전환 동물, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제, 상동 재조합, 유전자 타겟팅 벡터

Description

알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터 및 그의 용도 {alpha 1,3-galactosyltransferase gene targeting vector and uses thereof}
본 발명은 상동 재조합 방법으로 돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자를 제거할 수 있는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터에 관한 것으로, 구체적으로는 핵 국재화 시그널을 포함하여 타겟팅 효율이 증대된 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터, 상기 벡터가 도입된 세포 및 상기 벡터에 의해 넉 아웃된 형질전환 동물, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
동물 유전학의 꾸준한 진보는 특정 유전자를 제거 또는 삽입함으로써 각 유전자의 역할 규명과 함께 상업적으로 유용한 형질전환 동물 생산을 가능케 하였다. 형질전환된 동물 제조를 위한 방법으로는 미세주입법(microinjection) 또는 바이러스 감염법(viral transfection) 등을 이용한 무작위적인 유전자 조작법과 배아줄기세포(embrynic stem cells) 또는 체세포(somatic cells)를 이용하여 특정 유전자를 타겟팅 시킬 수 있는 유전자 적중법이 있다.
미세주입법은 외래 DNA를 수정란의 전핵에 삽입하는 고전적인 방법으로 형질전환 동물을 생산하기 위해 널리 이용되어 왔다(Harbers et al., Nature., 293(5833); 540-2, 1981: Hammer et al., Nature., 315(6021);680-683, 1985; van Berkel et al., Nat Biotechnol., 20(5);484-487, 2002; Damak et al., Biotechnology(NY), 14(2);185-186, 1996). 그러나 미세주입법으로 외래 DNA가 삽입된 수정란 유래의 형질전환된 산자의 생산 비율은 2 내지 3 % 로 효율이 매우 낮으며(Clark et al., Transgenic Res., 9;263-275, 2000), 외래 유전자의 삽입 위치 및 특정 내부 유전자의 제거가 불가능하다.
바이러스감염법 또한 동물의 유전자 조작을 위해 널리 사용된다(Soriano et al., Genes Dev., 1(4);366-375, 1987; Hirata et al., Cloning Stem Cells., 6(1);31-36, 2004). 바이러스 감염법은 삽입하고자 하는 유전자가 바이러스 벡터를 통하여 동물의 유전자로 도입되므로 미세주입법보다 좀더 효율적이나, 여전히 특정 위치로의 외래 유전자 삽입 및 특정 내부 유전자의 제거가 불가능하다. 또한, 삽입 하고자 하는 유전자의 최대 사이즈는 7 kb로 제한되며, 바이러스에 의해 발현되는 단백질이 문제된다(Wei et al., Annu Rev Pharmacol Toxicol., 37;119-141, 1997; Yanez et al., Gene Ther., 5(2);149-159, 1998).
위에서 언급한 문제점들 극복하기 위해서, 특정 유전자를 제거 또는 삽입할 수 있는 유전자 타겟팅 기술이 이용될 수 있다. 유전자 타겟팅 기술은 마우스 배아 줄기세포를 이용한 유전자 기능 연구에서 처음으로 사용되었다. 상동 재조합을 이용하여 특정 유전자가 타겟팅된 마우스 배아 줄기세포를 배반포 단계에 있는 배아 에 삽입함으로써 결국 특정 유전자가 조작된 산자 생산이 가능하게 된다. 이러한 마우스 배아줄기세포에 유전자 타겟팅법을 이용하면서, 많은 수의 특정 유전자 타겟팅된 마우스가 생산되었다(Brandon et al., Curr Biol., 5(6);625-634, 1995; Capecchi et al., Science, 244(4910);1288-1292, 1989; Thompson et al., Cell, 56(2);313-321, 1989; Hamanaka et al., Hum Mol Genet., 9(3);353-361, 2000; Thomas et al, Cell, 51(3);503-512, 1987; te Riele et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89(11);5182-5132, 1992; Mansour et al., Nature, 336(6197), 348-352, 1988; Luo et al., Oncogene, 20(3);320-328, 2001). 유전자 타겟팅법이 가축에 적용될 때, 대량의 치료 단백질을 생산하는 동물생체 반응기(animal bioreactor) 또는 이종간 장기이식에 사용될 수 있는 질병 모델 동물 생산이 가능하며, 이는 산업적으로 큰 경제적인 이익을 가져올 것이다.
유전자 타겟팅된 동물을 생산하기 위해서, 배아줄기세포의 사용이 필수적인 요소로 여겨져 왔다. 그러나 돼지와 소를 포함한 가축에서 배아줄기세포와 유사한 세포주들이 보고되었음에도 불구하고, 현재까지 가축에서 배아 줄기 세포의 사용은 제한된다(Doetschman et al., Dev Biol., 127(1);224-227, 1988; Stice et al., Biol Reprod., 54(1);100-110, 1996; Sukoyan et al., Mol Reprod Dev., 36(2);148-158, 1993; Iannaccone et al., Dev Biol., 163(1);288-292, 1994; Pain et al., Development, 122(8);2339-2348, 1996; Thomson et al., Proc Natl Acad Sci USA., 92(17)7844-7848, 1995; Wheeler et al., Reprod Fertil Dev., 6(5);563-568, 1994). 대신에, 핵 공여 세포로서 일반 체세포가 유전자 타겟팅에 사용될 수 있다는 가능성이 제시되면서, 형질전환된 복제 가축 생산이 가능하게 되었다(Brophy et al., Nat Biotechnol., 21(2);157-162, 2003; Cibelli et al., Science, 280(5367);1256-1258, 1998; Campbell et al., Nature, 380(6569);64-66, 1996; Akira Onishi et al., Science, 289;1188-1190, 2000 Denning et al., Cloning stem cells, 3(4);221-231, 2001 McCreath et al., Nature, 405(6790);1066-1069, 2000).
또한, 유전자의 넉 아웃(knock-out)은 유전자 타겟팅 기술의 하나로서 생쥐에서 처음 위치 특이적으로 특정 유전자에 변이를 도입할 수 있는 기술로 보고되었다(Thomas, K.R. and Capecchi, M.R. Cell, 51, 3, 503-512(1987)). 이러한 기술은 다양한 유전자 변이 생쥐의 생산(Fujino, T 등, Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 1, 229-234(2003))에 이용되고 있으며 이러한 기술은 가축의 양(McCreath, K.J. 등, Nature, 405, 1066-1067(2000))에서도 적용되고 있다.
한편, 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자는 이종간 이식시 급속한 면역거부반응을 일으키는 원인 유전자로서, 이 유전자가 제거될 경우 생체거부반응이 제거된 이종간 장기 이식용 질환모델동물 개발이 가능하다. 2002년 영국의 PPL사로부터 세계 최초로 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 이형접합적으로(heterozygous) 제거된 체세포 복제 돼지가 생산되었다(Yifan Dai et al., Nat Biotechnology, 20;251-255, 2002). 2003년에 동 회사에서 알파 1,3-갈락토실트랜 스퍼라아제 유전자가 동형접합적으로(homozygous) 제거된 체세포 복제에 성공함으로써 현 장기부족현상을 해결해줄 수 있는 장기 이식용 질환모델동물 생산을 위한 획기적인 진보를 가져왔다(Carol J. Phelps, Science, 299;411-414, 2003). 이후, 좀 더 효율적으로 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자를 제거할 수 있는 프로모터-트랩(promoter trap)의 원리를 이용한 타겟팅법 등이 소개되었다(Sharon Harrison et al., Cloning and stem cells, 6(4);327-331, 2004). 2005년 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제가 제거된 복제 돼지 유래의 장기는 원숭이로 이식되었으며, 그 결과 급성 면역 거부반응 없이 이식 후 2-6 개월까지 생존이 지연됨을 보고하였다(Kenji Kuwaki et al., Nature medicine, 11(1);29-31, 2005).
한편, 유전자 타겟팅은 상동유전자 재조합 현상을 이용하여 세포에 유전자 타겟팅 벡터를 도입하는 것으로 원하는 유전자 위치에 상동유전자 재조합이 일어난 세포를 선별할 수 있는 양성 선별마커와 상동유전자 재조합이 일어나지 않고 무작위적으로 벡터가 삽입된 세포를 선별하는 음성 선별마커를 사용하는 것이 일반적이다(Suzanne, L. 등, Nature, 336, 348-352(1988)). 이러한 양성 및 음성 선별마커를 이용한 방법은 주로 마우스 줄기세포를 이용하여 유전자 타겟팅 마우스 개발에 많이 이용되고 있으며 그 효율은 높은 것으로 알려져 있다(Templeton, N.S. 등, Gene Therapy, 4, 700-709(1997)).
그러나 가축인 양과 돼지에서의 유전자 타겟팅 효율은 유전자 종류와 동물 종에 따라 다양하게 보고되고 있다. 양의 α1(I) 프로콜라겐 유전자 위치를 넉 아 웃(knock-out)한 실험에서는 프로모터가 없는 neo 선별 마커를 이용하여 7.1-13.8%의 효율을 얻고 있으며 또한 똑같은 벡터에 양의 베타-락토글로불린 프로모터에 사람 α1-안티트립신을 발현시키기 위하여 neo 선별 마커 뒤에 삽입한 벡터에서는 67%의 유전자 타겟팅 효율을 나타내었다(McCreath, K.J. 등, Nature, 405, 1066-1069(2000)). 그러나 동일한 프로모터가 없는 neo 선별마커를 이용하여 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자와 프리온 단백질 유전자 위치를 양에서 유전자 타겟팅 하였을 경우 그 효율은 1.7%와 1%로 매우 낮았다(Denning, C. 등, Nature Biotechnology, 19, 559-562(2001)).
그러나, 현재까지 돼지의 체세포에서 유전자 타겟팅 방법에 의하여 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자를 knock-out 시키는 효율은 5% 미만인 것으로 알려져 있다(Denning, C. and Priddle, H. Reproduction, 126, 1-11(2003)). 또한, 돼지에 있어서 양성 선별마커만을 이용하여 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자를 유전자 타겟팅한 경우에도 그 효율이 1.5 내지 5%인 것으로 보고되어 있다(Denning, C. and Priddle, H. Reproduction, 126, 1-11(2003)).
이에, 본 발명자는 본 발명자는 핵 국재화 신호(nuclear localization signal, nls), 양성 선별마커 및 음성 선별마커를 동시에 포함하는 유전자 타겟팅 벡터를 제조하였고, 이러한 벡터를 이용할 경우 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 타겟팅 효율을 현저하게 높일 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 (1)핵 국재화 신호(nuclear localization signal, nls) 영역; (2) 돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 핵산 서열에 상동인 4 내지 6 kb 길이의 핵산 서열로서 돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 인트론 8 일부 및 엑손 9의 일부를 포함하는 제1영역; (3)양성 선별마커 영역; (4)돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 핵산 서열에 상동인 0.5 내지 2 kb 길이의 핵산 서열로서 돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 엑손 9의 일부를 포함하는 제2영역; 및 (5)음성 선별마커 영역을 가지며, 상기 (1) 내지 (5)영역들이 5'말단에서부터 순서대로 구성되는 것을 특징으로 하는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터로 유전자 타겟팅된 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터가 도입되어 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 넉 아웃된 형질전환 동물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터를 이용하여 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 타겟팅된 돼지의 체세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터를 이용하여 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 넉 아웃된 형질전환 돼지를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 (1)핵 국재화 신호(nuclear localization signal, nls) 영역; (2) 돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 핵산 서열에 상동인 4 내지 6 kb 길이의 핵산 서열로서 돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 인트론 8 일부 및 엑손 9의 일부를 포함하는 제1영역; (3)양성 선별마커 영역; (4)돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 핵산 서열에 상동인 0.5 내지 2 kb 길이의 핵산 서열로서 돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 엑손 9의 일부를 포함하는 제2영역; 및 (5)음성 선별마커 영역을 가지며, 상기 (1) 내지 (5)영역들이 5'말단에서부터 순서대로 구성되는 것을 특징으로 하는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "유전자 타겟팅 벡터" (gene targeting vector)란 게놈의 특정 유전자 위치로 목적하는 유전자를 제거 또는 삽입할 수 있는 벡터를 말하며, 상동 재조합 (homologous recombination)이 일어나도록 타겟팅하고자 하는 특정 유전자에 상동 염기 서열을 포함한다. 본 발명의 유전자 타겟팅 벡터는 벡터를 구성하는 유전자가 상동 재조합에 의해 게놈상의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자에 5'→3' 배열로 삽입되는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 타겟팅 벡터이며, 원형(circular) 또는 선형(linear) 형태일 수 있다.
본 발명의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터는 핵 국재화 신호(nuclear localization signal, nls) 영역을 포함한다.
상기 핵 국재화 신호 영역은 벡터의 5' 말단 쪽에 포함됨을 특징으로 한다. 전사 인자의 핵 중으로의 유입은 다양한 외부 및 내부 자극뿐 아니라 발생 신호에 반응하여 일어나는 과정이다. 그러므로, 벡터 내에 삽입된 핵 국재화 신호는 벡터가 세포 내로 도입된 후, 본 발명의 벡터가 핵 내로 유입될 수 있도록 이동을 돕게 되는데, 이를 통해 핵 내에 존재하는 게놈 상의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자에 대한 타겟팅 효율을 높일 수 있다. 또한, 유전자 타겟팅 벡터를 세포에 도입시켜 세포 내 유전자를 타겟팅 할 때, 핵으로의 유입 효율을 높이기 위해 직접적인 전기천공법을 이용하게 되는데, 본 발명의 벡터는 핵 국재화 신호 영역을 포함하고 있어 세포 내에서 핵으로의 수송이 용이하므로, 통상적인 세포의 형질전환법인 리포좀 방법으로도 효율적으로 벡터를 도입시켜 유전자를 타겟팅시킬 수 있다. 특히, 본 발명자들은 핵 국재화 신호 영역이 벡터의 5' 말단에 포함되는 경우에, 핵 국재화 신호 영역을 포함하지 않거나 또는 3' 말단에 포함되는 경우보다 유전자 타겟팅 효율을 현저하게 높인다는 것을 입증하였다(도 5).
본 발명의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 핵산 서열에 상동인 서열을 가지는 제1영역과 제2영역을 포함한다.
본 발명의 "제1 영역"은 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 핵산 서열에 상동인 4 내지 6 kb 길이의 핵산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다. 제1 영역의 길이는 유전자 타겟팅 효율을 결정하는 중요한 요소로, 바람직하게는 4.8 kb의 길이를 가진다. 또한, 제1 영역은 바람직하게 돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 중 인트론 8의 일부 및 엑손 9의 일부를 포함한다. 여기서 일부란, 5' 말단 쪽 인트론 8의 제한효소 SmaI 인식부위부터 3' 말단 쪽 엑손 9의 제한효소 EcoRV 인식부위까지가 바람직하다.
본 발명의 "제2 영역" 은 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 핵산 서열에 상동인 0.5 내지 2kb 길이의 핵산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 1.9kb의 길이를 가진다. 이때, 제1 영역이 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 핵산 서열의 5'→3'배열에 있어 상부(upstream)에 해당하고 제2 영역이 하부(downstream)에 해당한다. 또한, 제2 영역은 바람직하게 돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 중 엑손 9의 일부를 포함한다. 여기서 일부란, 엑손 9의 5'말단 쪽의 제한효소 EcoRV 인식부위부터 엑손 9의 3' 말단 쪽의 제한효소 PstI 까지가 바람직하다. 돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자는 엑손 1 내지 엑손 9 및 인트론 일부가 알려져 있는데, 효소 활성의 대부분은 엑손 9 부위와 관련되어 있으므로, 이러한 부위가 타겟팅으로 제거되면 좀 더 효과적으로 효소 활성을 제거시킬 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명에서 용어 "상동(homologous)"이란 제1 영역 또는 제2 영역과 이에 해당하는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 핵산 서열과의 동일성 정도를 나타내는 것으로, 적어도 90% 이상 동일하고, 바람직하게는 95% 이상 동일하다.
또한, 상기 벡터로 타겟팅되는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자는 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 소, 양, 염소, 돼지, 말, 토끼, 개, 원숭이 등의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자고, 보다 바람직하게는 미니어쳐 돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자이다.
또한, 본 발명의 벡터는 선별마커 영역을 포함하며, 바람직하게는 양성 선별마커 및 음성 선별마커를 동시에 포함한다.
본 발명에서 용어 "선별마커(selection marker)"란 세포로 유전자 타겟팅 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있고, 양성 선별마커와 음성 선별마커가 있다.
본 발명에서 용어 "양성 선별마커"란 선택제 (selective agent)가 처리된 환경에서 선택 마커를 발현하는 세포만 생존하도록 하여 양성 선택을 가능하게 하는 마커로, 네오마이신 (Neomycin: Neo), 하이그로마이신 (hygromycin: Hyg), 히스티디놀 디하이드로게나제(histidinol dehydrogenase gene: hisD) 및 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (guanine phosphosribosyltransferase: Gpt) 등이 있으며, 바람직하게는 네오마이신 마커이지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명의 양성 선별마커는 제1영역과 제2영역 사이에 위치하는 것이 바람직하며, 제1영역의 3' 말단에 연결되고, 제2영역 상부(5') 쪽에 위치할 수 있다. 이러한 위치에 삽입됨으로써, 본 발명의 벡터가 세포 내로 타겟팅되어 상동재조합을 일으켜, 숙주 세포 게놈 상의 타겟 유전자와 재조합되었을 때, 게놈 내로의 삽입이 용이해지며, 이들의 발현을 통해 유전자 타겟팅 여부의 식별이 가능해지게 된다.
또한, 본 발명에서 용어 "음성 선별마커"란 무작위적 삽입 (random insertion)이 일어난 세포를 선별하여 제거하는 네가티브 선택을 가능하게 하는 마커로, 헤르페스 심플렉스 바이러스-싸이미딘 키나제 (Herpes simplex virus-thymidine kinase: HSV-tk), 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스퍼라아제 (hypoxanthine phosphoribosyl transferase: Hprt), 싸이토신 디아미네즈 (cytosine deaminase), 디프테리아 톡신 (Diphtheria toxin) 등이 있으며, 바람직하게는 디프테리아 톡신(DT-A)이지만, 이로 제한되는 것은 아니다. 디프테리아 톡신 마커는 싸이미틴 키나제에 비해 몇 가지 장점을 가진다. 먼저, 싸이미틴 키나제는 gancyclovir (GANC) 처리를 요구하는 반면, 디프테리아 톡신은 어떤 처리도 요구하지 않는다는 점에서 편리하다. 또한, 싸이미틴 키나제/gancyclovir (GANC) 시스템은 싸이미틴 키나제 유전자가 없는 세포도 사멸될 가능성이 높다는 것이 이미 보고되어진 바 있다 (Yoshiyasu Kaneko et al., Cancer Letters, 96;105-110, 1995). 이러한 점에서, 음성 선별마커로서 디프테리아 톡신이 유리하다.
본 발명의 음성 선별마커는 제1영역의 5' 말단 쪽 또는 제2영역의 3' 말단 쪽에 위치할 수 있으나, 바람직하게는 제2영역의 3'말단 쪽이며, 본 발명의 벡터 상에서 제2영역의 3'말단에 연결되어 벡터의 3'말단 쪽에 위치하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명의 선별마커는 선별마커 유전자를 전사시키기 위한 별도의 프 로모터를 상기 벡터 내에 포함할 수 있다. 본 발명의 선별마커 전사를 위해 사용할 수 있는 프로모터로는 포스포글리세레이트 키나아제(phosphoglycerate kinase, PGK) 프로모터, 원숭이 바이러스 40(SV40), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 엡스타인 바 바이러스(EBV) 프로모터, 로우스 사코마 바이러스(RSV) 프로모터, RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 양성 선별마커를 전사시키기 위한 프로모터는 포스포글리세레이트 키나아제(phosphoglycerate kinase, PGK) 프로모터를 양성 선별마커의 상부(upstream)에 연결되도록 벡터에 삽입시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체적 실시예에서, 미니돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 상동 영역, 핵 국재화 신호(nuclear localization signal, nls), 양성 선별마커 및 음성 선별마커를 이용하여 벡터를 구축하였다. 본 발명에서는 Simian virus 40 genome에 포함되어 있는 72bp tandem repeat enhancer sequence인 핵 국재화 신호(nuclear localization signal, nls)를 맨 앞에 위치시키며 다음에 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 엑손9의 EcoRV 제한 효소 위치로부터 SmaI 위치까지 앞쪽 4.8kb(제1영역)를 5‘ 상동 영역으로 연결하고, 양성 선별마커로는 pohosphoglycerine kinase(PGK) 프로모터에 의하여 발현되는 neor 유전자를 연결하 였다. 그 다음은 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 상동 영역으로 엑손9의 EcoRV 제한 효소 위치부터 PstI 위치까지 뒤쪽 1.9kb(제2영역)를 연결한다. 이를 음성 선별마커가 포함되어 있는 pMCDT-A(A+T/pau)벡터 내에 삽입하여 최종 벡터를 구축하였다. 이렇게 구축된 본 발명의 벡터는 5' 말단부터 핵 국재화 신호 영역-미니돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자에 상동인 제1영역-양성 선별마커 영역-미니돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자에 상동인 제2영역-음성 선별마커 영역의 순서로 구성된다. 이러한 벡터는 세포에 도입시 SalI 제한효소로 선형화시켜 이용할 수 있다.
본 발명의 상기 벡터는 핵 국재화 신호 영역을 포함하지 않은 벡터나 핵 국재화 신호 영역을 3'말단 쪽에 포함한 벡터에 비해 유전자 타겟팅 효율이 높은 것을 확인할 수 있었다(도 5).
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터로 유전자 타겟팅된 세포에 관한 것이다.
본 발명의 벡터로 타겟팅 될 수 있는 세포는 동물, 바람직하게는 돼지 유래의 체세포이다. 세포를 분리하거나 활성화할 수 있는 유용한 조직에는 간, 신장, 비장, 뼈, 골수, 흉선, 심장, 근육, 허파, 뇌, 정소, 난소, 소도(islet), 내장, 골수, 귀, 피부, 뼈, 쓸개 조직, 전립선, 방광, 배아(embryo), 면역계 및 조혈계 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 세포 타입은 섬유아 세포, 상피 세포, 신경 세포, 배아 세포, 간 세포, 및 여포 세포 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 바람 직하게는 섬유 아세포 또는 귀 조직 세포이다.
상기 세포 내로 본 발명의 벡터를 도입하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하기 위한 공지의 방법을 이용할 수 있으며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술, 예들 들어, 전기천공법(electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전(calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), DEAE-덱스트란(DEAE-dextran) 및 양이온 리포좀(cationic liposome)법 등을 이용할 수 있으며, 이로 제한되지 않는다. 이 때 원형의 벡터를 적절한 제한효소로 절단하여 선형의 벡터 형태로 도입하는 것이 바람직하다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 벡터가 도입되어 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 넉 아웃된 형질전환 동물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "넉 아웃(knock-out)"이라 함은 염기서열 중 특정 유전자가 발현될 수 없도록 이를 변형시키거나 제거하는 것을 의미하는데, 본 발명의 타겟팅 벡터가 도입된 체세포를 이용하여 동물의 수정란에 핵이식시키고, 핵이식된 수정란을 착상시켜 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 넉 아웃된 형질전환 개체를 생산해낼 수 있다. 이러한 개체는 세포의 유전적 물질이 핵수여 세포질로 그대로 전달되었기 때문에 유전적으로 완전히 동일한 복제 개체라고 할 수 있다.
본 발명의 벡터를 도입시켜 넉 아웃시킬 수 있는 동물은 바람직하게는 돼지, 더욱 바람직하게는 미니돼지이며, 본 발명의 벡터를 통해 알파 1,3-갈락토실트랜스 퍼라아제 유전자가 넉 아웃된 형질전환 돼지는 급성 면역반응을 일으키지 않아 이종장기이식에 효과적으로 이용될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 (1)제1항의 돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터를 구축하는 단계; (2)돼지로부터 체세포를 분리 및 배양하는 단계; (3)구축된 단계(1)의 벡터를 상기 단계(2)에서 분리한 체세포에 도입하여 상동재조합을 유도하는 단계; 및 (4)상동재조합에 의해 돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 타겟팅된 돼지의 체세포를 선별하는 단계를 포함하는, 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 타겟팅된 돼지의 체세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 타겟팅된 돼지의 체세포를 제조하는 방법을 단계별로 설명한다.
먼저, 단계 (1)은 본 발명의 돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터를 구축하는 단계로서, 상기에서 설명한 바와 같이, 핵 국재화 신호(nuclear localization signal, nls) 영역 - 돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 핵산 서열에 상동인 4 내지 6 kb 길이의 핵산 서열로서 돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 인트론 8 일부 및 엑손 9의 일부를 포함하는 제1영역 - 양성 선별마커 영역 - 돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 핵산 서열에 상동인 0.5 내지 2 kb 길이의 핵산 서열로서 돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 엑손 9의 일부를 포함하는 제2영역 - 음성 선별마커 영역을 가지며, 상기 영역들이 5'말단에서부터 순서대로 구성되도록 구축할 수 있다. 이렇게 구축된 본 발명의 타겟팅 벡터는 세포 내의 내재적 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자에 타겟팅되어 이들 유전자를 파괴시킬 수 있다.
단계 (2)는 돼지로부터 체세포를 분리 및 배양하는 단계로서, 단계 (1)의 타겟팅 벡터를 도입시키기 위한 돼지의 체세포를 분리하고, 배양시켜 체세포를 생산하는 단계이다. 상기 돼지의 체세포는 돼지의 귀 조직에서 분리하는 것이 바람직한데, 귀 조직은 분만 10일령의 귀 조직을 사용하고 이들 조직을 1 내지 3mm 정도로 절단하여 배양할 수 있다.
이들의 조직 배양시에는 귀 조직이 배양액 안으로 완전히 잠기지 않도록 하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 체세포 분리 및 배양을 위한 배지는 고농도의 글루코오스 및 FBS가 포함된 배지를 이용하여 귀 조직으로부터 체세포를 분리하고, FBS, 비필수 아미노산 및 항생제를 포함한 배지에서 계대 배양하는 것을 통해 체세포를 생산할 수 있으며, 바람직하게는 돼지의 귀 조직을 고농도의 글루코오스 및 15% FBS(fetal bovine serum)가 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지에 배양하여 체세포를 분리하고, 20% FBS, 1X 비필수 아미노산, 1X 피루브산나트륨, 10-4M 베타-머르캅토에탄올, 100Unit/ml 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지에서 계대 배양할 수 있다.
단계 (3)은 구축된 단계(1)의 벡터를 상기 단계(2)에서 분리한 체세포에 도입하여 상동재조합을 유도하는 단계로서, 본 발명의 타겟팅 벡터를 단계(2)에서 생산한 돼지의 체세포에 도입시켜 상동재조합을 유도하여 돼지의 체세포 게놈 상의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자를 파괴시키는 단계이다.
본 발명의 벡터를 돼지의 체세포에 도입시키는 방법은 상기에서 설명한 바와 같이 핵산을 세포 내로 도입하는 공지의 방법, 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전(calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), DEAE-덱스트란(DEAE-dextran) 및 양이온 리포좀(cationic liposome) 등을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 전기천공법이지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 통상적인 유전자 타겟팅 벡터의 경우 유전자의 크기가 큰 편이라서 주로 전기천공법을 이용하여 체세포 내로 도입하지만, 본 발명의 벡터는 핵 국재화 신호 영역을 포함하고 있어, 핵 내로의 유입이 용이하므로 양이온 리포좀 법을 이용하더라도 효율적으로 세포 내 도입이 가능할 수 있다.
또한, 본 발명의 단계 (3)은 벡터를 도입하기 전에 돼지의 체세포에 싸이미딘(thymidine)을 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 싸이미딘은 세포의 주기를 S 기(phase)에서 블럭시켜 S 기로 동기화시킬 수 있는데, 이를 통해 S기로 동기화된 세포는 유전자 타겟팅 벡터의 타겟팅 효율을 훨씬 증가시켜줄 수 있다. 본 발명의 돼지 체세포에 처리하는 싸이미딘의 농도는 1 내지 5 mM 정도가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 2 mM이며, 싸이미딘 처리 시간은 15 내지 18시간 정도가 바 람직하며, 더욱 바람직하게는 16시간이다.
단계 (4)는 상동재조합에 의해 돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 타겟팅된 돼지의 체세포를 선별하는 단계로서, 단계 (3)의 상동재조합에 의해 돼지 체세포의 게놈 상에 존재하는 내재적 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 파괴된 돼지의 체세포를 선별해내는 단계이다.
상기 체세포 선별은 벡터 내에 삽입되어 있던 선별마커 유전자를 이용할 수 있는데, 특히, 벡터 상에 존재하던 양성 선별마커가 돼지 체세포 게놈 상으로 도입되어 발현되면, 이들 양성 선별마커 발현을 인식할 수 있는 처리제를 이용하여 타겟팅 여부를 식별할 수 있게 된다. 본 발명의 선별마커로는 바람직하게는 네오마이신 마커를 이용할 수 있으며, 선별을 위한 처리제로는 항생제, G418을 이용할 수 있다. 선별을 위해 사용하는 G418의 농도는 200 내지 400㎍/㎖ 가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 300 ㎍/㎖이다.
또한, 유전자 타겟팅 벡터가 도입된 클론 체세포의 선별에 이용할 수 있는 배양은 15% 내지 20% FBS을 포함하는 DMEM을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 20% FBS를 포함한다. 왜냐하면, 선별 시 세포의 증식을 촉진시키는 것이 보다 빠르게 세포를 선별할 수 있기 때문이다. 더욱 바람직하게는 20%의 FBS(fetal bovine serum, FBS), 비필수 아미노산, 피루브산나트륨, 베타-머르캅토에탄올이 포함된 DMEM 배지를 이용할 수 있다. 또한, 상기 단계(3)을 통해 상동재조합을 유도한 돼지 체세포를 G418 선별 배지에서 11 내지 12일간 배양한 후, 선별하는 것이 바람직 하다.
또한, 본 발명의 벡터가 제대로 체세포 내의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자에 타겟팅되었는지를 분석하기 위해 PCR 및 서던 블롯(Southern blot)을 이용할 수 있다.
상기 PCR 분석은 1차 및 2차 PCR을 통해 효율적으로 타겟팅된 세포를 분석해낼 수 있는데 먼저, 1차적인 PCR은 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 3' 상동영역(제2영역) 바깥 쪽에 있는 프라이머와 neor 유전자 상에 있는 프라이머를 이용함으로써, 벡터가 세포 내로 유입이 되었는지를 분석한다. 유전자 타겟팅은 상동염색체 중 한 곳에서 일어나므로 유전자 타겟팅이 일어난 상동염색체와 그렇지 않은 상동염색체가 세포에 존재하게 되므로 이들을 동시에 PCR 분석함으로써, 이들의 차이를 통해 타겟팅 여부를 좀더 정확하게 분석할 수 있게 된다. 이를 위해 1차 PCR에 의해 선별된 세포를 대상으로 2차 PCR을 수행할 수 있다. 2차 PCR을 위한 프라이머는 엑손 9번 EcoRV 위치의 앞쪽 프라이머와 3' 상동영역(제2영역) 바깥 쪽에 있는 프라이머를 이용할 수 있다.
상기 유전자 타겟팅된 체세포 제조방법에 의해 본 발명의 벡터로 유전자 타겟팅된 돼지 체세포주를 GTKO 21 이라고 명명하였고, KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전 유성구 과학로 111번지 한국생명공학연구원)에 2008 년 7월 24일자로 기탁번호 제KCTC 11369BP호로 기탁하였다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 (1)상기 체세포 제조방법에 의하여 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 타겟팅된 돼지의 체세포를 수득하는 단계; (2)돼지 난자의 핵을 제거하고 상기 유전자 타겟팅된 세포를 도입하여 체세포 핵이식된 수정란을 제조하는 단계; 및 (3)상기 수정란을 착상시키는 단계를 포함하는, 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 넉 아웃된 형질전환 돼지를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 벡터는 돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자로의 타겟팅이 최적화된 벡터이므로, 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 넉 아웃된 돼지 제조에 이용될 수 있으며, 상기 벡터로 타겟팅된 체세포를 돼지의 수정란에 핵 이식시키고, 이렇게 핵 이식된 수정란을 착상시켜 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 넉 아웃된 돼지를 생산해낼 수 있다.
난자의 핵, 즉 유전 물질을 제거하기 위해서는 물리적인 방법, 화학적인 방법 및 사이토칼라신(Cytochalasin) B를 사용한 원심분리법 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 유리 마이크로피펫 (glass micropipette)을 사용하는 물리적인 핵 제거 방법을 사용할 수 있다.
상기 유전자 타겟팅된 체세포를 핵이 제거된 난자 내로 도입시키는 방법은 세포막융합법, 세포질내 미세주입법 등을 이용할 수 있는데, 세포막융합법은 간단하며 대규모 수정란 생산에 적합하다는 장점이 있으며, 세포질내 미세주입법은 핵과 난자내 물질들과의 접촉을 극대화시킨다는 장점이 있다.
체세포와 핵이 제거된 난자와의 융합은 전기자극을 통하여 세포막의 점도를 변화시켜 융합시키는 방법을 통하여 재조합할 수 있으며, 이때, 미세전류ㆍ전압을 자유롭게 조정할 수 있는 전기융합기를 이용할 수 있다.
핵이식된 수정란은 활성화시켜 이식 가능한 단계까지 발생시킨 후 대리모로 착상시키는 것이 바람직하다. 여기서 복제 수정란의 활성화는 수정란이 분열할 수 있도록 성숙과정에서 일시적으로 정지되어진 세포주기를 다시 가동시키는 것을 의미한다. 복제수정란 활성화를 위하여서는 세포주기 정지요소인 MPF, MAP 키나제 등의 세포신호전달물질의 활성을 저하시키는 것이 바람직하며, 이를 위해 복제 수정란 내 칼슘이온을 증가시키기 위해 세포막 투과도를 변형시키거나, 세포 외로부터 칼슘유입을 급격히 증가시키거나, 이노마이신(ionomycin) 및 6-DMAP 등의 화학적 물질을 이용하여 세포주기 정지요소의 활성을 직접적으로 저해시키는 방법 등을 이용할 수 있다.
이러한 방법을 통해 생산된 돼지는 세포 내재적인 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 결손되어 있기 때문에, 이종간 장기이식시 급성 면역반응이 저해될 수 있다.
본 발명의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터는 핵 국재화 신호 영역을 포함하고 있어 타겟팅 세포의 핵 내로의 유입이 용이하여 타겟팅 효율이 높은 장점을 가진다. 이러한 타겟팅 벡터를 이용하여 생산된 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자기 넉 아웃된 형질전환 동물은 급속한 면역거부반응이 억제되어 이종 간의 장기이식에 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 미니돼지 알파 1,3- 갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터 구축
돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자는 9개의 엑손으로 이루어져 있으며, 엑손 1 내지 엑손 9와 인트론의 일부 염기서열이 알려져 있다(Kihiro Koike et al., Transplantation, 70;1275-1283, 2000). 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 효소활성의 대부분은 엑손 9에 존재하므로 (Yifan Dai, Nature, 20;251-255, 2002), 본 실시예에서는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 영역과 핵 국재화 신호(localization signal, nls), 양성 선별마커 및 음성 선별마커를 이용하여 엑손 9번 부위를 제거할 수 있는 유전자 타겟팅 벡터를 구축하였다.
구체적으로, 미니돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 엑손 8과 9번을 포함하는 유전자 단편은 미니돼지 게놈 DNA을 이용하여 다음과 같이 long PCR에 의하여 동정하였다. PCR은 200ng 게놈 DNA, 1XPCR buffer, 2.5mM dNTP, 2.5 U i-Max II DNA 폴리머라제, 10 pmole 센스 프라이머 (AGGTCGTGACCATAACCAGATGGAAGGCTC, 서열번호 1) 및 안티센스 프라이머 (CTTGCACCATGAAAGGTCTCTGCAACTCCAGAA, 서열번호 2)를 이용하여 94℃ 40초, 68℃ 40초, 72℃ 10분의 조건에서 실시하였다. 증폭된 DNA 단편은 pGEM T-easy vector에 서브클로닝하였으며 시퀀싱을 실시하여 최종적으로 미니돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자임을 확인하였다.
또한, 핵 국재화 신호(Nuclear localization signal, NLS)는 Clontech pEGFP-N3 벡터(Clontech)를 이용하여 클로닝하였다. DNA는 10pg로 희석하여 사용하였고 10 pmol의 센스 프라이머 (CGGAGTTAGGGGCGGGACTA, 서열번호 3) 및 안티센스 프라이머 (CCAGCTGTGGAATGTGTGTC, 서열번호 4)를 이용하여 1×PCR-버퍼, 0.5U 택 폴리머라제(Taq polymerase, Promega), 각 200uM dNTP 조성으로 변성(denaturation) 94℃ 30초, 어닐링(nealing) 60℃ 30초, 연장(extension) 72℃ 30 초, 40 cycle의 반응조건으로 PCR을 수행하였다. PCR산물은 2% 아가로오스 겔에서 전기영동하여 확인하였으며 염기서열 결정을 위하여 pGEM T-easy vector(Promega)에 서브클로닝하였다. 염기서열 결정은 ABI PRISM 377 sequencer(Applied Biosystems)를 사용하여 결정하였다. 결정된 염기서열의 분석은 Genetyx-win(version 4.0)을 이용하여 분석하였다.
상기 방법으로 얻은 미니돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 엑손 8과 9번을 포함하는 유전자 단편을 Not I 제한효소로 절단한 다음 pBluscriptII SK (-) vector에 서브클로닝하여 pBSK(-)GT DNA을 확보하였다.
타겟팅 벡터의 5' 상동영역(제1영역) 및 3' 상동영역(제2영역)을 제작하기 위하여 pBSK(-)GT DNA을 Not I과 EcoR V 제한효소로 절단하여 5.4kb와 2.5kb의 단편을 각각 pBluscriptII SK (-) 벡터에 서브클로닝하여 pBSK(-)GT5.4 DNA와 pBSK(-)GT2.5 DNA을 확보하였다. 5' 상동영역을 구축하기 위하여 pBSK(-)GT5.4 DNA을 제한효소 SmaI으로 절단한 후 blunting하였으며 이 위치에 Sal I linker을 연결하였다. 또한 EcoR V site는 blunting하여 Not I linker을 연결하였다. 이렇게 제작된 4.8kb Sal I-Not I 단편은 pBluscriptII SK (+)의 Sal I-Not I site에 서브클로닝하여 pBSK(+)GT4.8 DNA을 제작하였다.
또한, 3' 상동영역을 구축하기위해서는 pBSK(-)GT2.5 DNA을 Pst I 제한효소로 절단하여 blunting 한 후 Xho I linker을 연결한 다음 pBluscriptII SK (-)의 EcoR V-Xho I site에 서브클로닝하여 pBSK(-)GT1.9 DNA을 구축하였다.
양성선별마커인 neo 유전자는 pKJ2-neo plasmid을 EcoR I과 BamH I으로 절단한 후 Not I과 EcoR V linker을 연결하였다. 이렇게 확보된 neo 유전자의 Not I-EcoR V 단편과 pBSK(-)GT1.9 DNA의 EcoR V-Xho I 단편은 pBluscriptII SK (-)의 Not I-Xho I site에 3 fragment ligation을 실시하여 pBSK(-)GTneo1.9 DNA을 구축하였다.
5' 상동영역을 연결하기 위하여 pBSK(+)GT4.8 DNA을 Sal I-Not I 제한효소로 절단한 4.8kb의 단편을 pBSK(-)GTneo1.9 DNA의 Sal I-Not I 제한효소 위치에 서브클로닝하였다. 이렇게 제조된 DNA를 pBSK(-)GT4.8neo1.9 DNA라고 명명하였으며, 이를 Sal I과 Not I 제한 효소로 처리한 후 단편을 음성 선별마커 디프레리아 톡신 유전자를 포함하고 있는 pMCDT-A(A+T/pau) 벡터의 Sal I-Not I site에 연결하여 기본적인 미니돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터를 구축하였며, DT-A/pGT5'/neor/pGT3' vector로 명명하였다. 또한 nls의 연결은 nls을 Xho I과 Sal I 제한효소로 절단한 단편을 DT-A/pGT5'/neor/pGT3' vector의 Xho I-Sal I site에 연결하여 최종적인 본 발명의 벡터 DT-A/nls/pGT5'/neor/pGT3'를 구축하였다. 상기 벡터는 Sal I 제한효소으로 절단시켜 선형화한 후 세포로의 유전자 도입에 이용하였다(도 1, 도 2).
또한, 본 발명에서 제조된 벡터와 효율을 비교하기 위하여 일반적으로 사용되는 유전자 타겟팅 벡터를 제조하였다.
첫 번째 대조군 벡터로서 일반적으로 사용하는 핵 국재화 신호 영역이 포함되지 않고, 양성 선별마커와 음성 선별마커를 가지고 있는 벡터를 제작하였다. 이 벡터는 상기에서 기재한 방법과 같이 미니돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 5' 상동영역의 Sam I 제한 효소 위치를 Sal I으로, 엑손 9에 존재하는 EcoR V 위치를 Not I으로 치환하여 사용하였다. 그리고 양성 선별마커는 PGK-neor 유전자를, 3' 상동영역은 엑손 9의 위치에 있는 Pst I 제한효소 위치를 Xho I으로 치환시켜 제조한 EcoR V-Xho I 1.9kb 단편을 이용하였다. 이렇게 얻어진 단편 5' 상동영역(Sal I-Not I, 4.8kb), PGK-neor 유전자, 3' 상동영역(EcoR V-Xho I)을 연 결한 후에 전체 연결된 단편을 Sal I과 Xho I으로 절단하여 음성 선별마커(디프테리아 톡신)를 포함하고 있는 pMCDT-A(A+T/pau)벡터의 SalI과 XhoI 제한효소 위치에 삽입하여 최종적인 첫 번째 대조군 벡터 DT-A/pGT5'/neor/pGT3'를 구축하였다(도 2). 세포에 도입시에는 salI 제한효소로 절단하여 선형화하여 이용하였다.
두 번째 대조군 벡터로서, 음성 선별마커를 사용하지 않고 양성 선별마커와 핵 국재화 신호 영역만으로 구성된 벡터를 구축하였다. 이 벡터는 상기와 같은 방법으로 5' 상동영역(Sma I-Not I, 4.8kb), PGK-neor 유전자, 3' 상동영역(EcoR V-Xho I)을 연결하여 pBluescript SK 벡터에 삽입하고, nls 영역을 3' 벡터의 3'말단쪽 xhoI 제한효소 위치에 삽입하여 최종적인 두 번째 대조군 벡터, pGT5'/neor/pGT3'/NLS 를 구축하였다(도 2). 세포에 도입시에는 ApaI 제한효소로 절단하여 선형화하여 이용하였다.
실시예 2. 미니돼지 귀 조직으로부터 체세포의 분리와 배양
생후 10일된 수컷 시카고 미니돼지의 귀를 무균적으로 절제한 뒤 실체현미경하에서 피부와 연골 조직을 매스를 이용하여 제거한 후 조직을 2 x 2 mm 크기의 절편으로 절단하였다. 절단된 조직은 배양액에서 세척한 후 2 ml의 배양액이 있는 6 cm 디쉬에 약 8개 정도의 조직 절편을 넣고 5일간 37℃, 5%, CO2 배양기에서 배양하였다. 5일 후 배양된 세포는 1×106 cells/10cm 디쉬에 계대 배양하였으며 세포가 적당하게 자란 후 이들 세포는 1×106 cells/ml로 동결 보존하여 사용하였으며 제조된 세포는 전형적인 섬유아세포의 형태를 나타내었다.
이때 사용한 배양액은 고농도 글루코오스가 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)을 기본으로 15%의 FBS(fetal bovine serum)가 포함된 배지를 이용하였다. 그러나 제조된 귀세포의 계대 배양에는 DMEM을 기본으로 20% FBS, 1×비필수 아미노산, 1×피루브산나트륨, 10-4M 베타-머르캅토에탄올, 100Unit/ml 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 포함된 배지를 이용하였다(도 3).
실시예 3. 미니돼지 체세포에 유전자 타겟팅 벡터의 도입
미니돼지 체세포로의 유전자 타겟팅 벡터의 도입은 전기천공법을 이용하였다. 전기천공법에서는 배양한 세포를 트립신 처리에 의하여 회수한 후, 세포 수가 5×106 cell/0.4 ml F10 배양액이 되도록 현탁한 다음 0.1ml F10 배양액에 녹인 10㎍의 직선화 유전자 타겟팅 벡터를 혼합하여 4 mm 갭 큐벳에 세포 벡터 혼합액을 넣었다. 이 큐벳을 BTX Electro-cell manipulator(ECM 2001)에 장착한 다음 480V, 4 pulses, 2 ms 조건에서 전기 충격을 실시하였다. 전기 충격 후 큐벳을 얼음 위에 10분 간 방치 한 다음 10ml 배양액으로 옮겨 잘 현탁한 다음 10 cm 배양 디쉬로 옮겨 배양하였다. 넉 아웃(knock-out) 벡터는 주로 세포주기 S기에서 상동유전자 재조합에 의하여 삽입되므로 벡터 도입시 세포주기를 S기로 동기화하기 위하여 2 mM 싸이미딘(Thymidine)을 16시간 처리한 세포를 이용하여 벡터 도입을 실시하였다. 도입조건은 GFP 유전자를 이용하여 효율을 검증하였다(도 4).
실시예 4. 유전자 타겟팅 벡터가 도입된 클론 체세포의 선별과 배양
전기천공법을 이용하여 본 발명에서 제작된 3가지 벡터를 미니돼지 체세포에 도입하여 도입 효율을 검증하였다. 본 실시예에서는 유전자 타겟팅 벡터를 세포에 도입한 다음 48시간 후 300㎍/ml의 G418로 12일간 선별하였다.
특히 본 선별 과정 중에는 20% FBS, 1×피루브산나트륨, 1×비필수 아미노산, 10-4M 베타-머르캅토에탄올, 100Unit/ml 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지를 이용하였다. 선별 11일째에 정상적인 형태를 보이는 클론 체세포은 cloning cylinder를 사용하여 각 클론 체세포를 따로 각각 배양하였으며 하루 뒤인 12일째 클론 체세포를 트립신 처리하여 세포를 24-well plate로 계대 하였다. 이렇게 계대된 체세포는 3-4일 후에 90% 컨플루언트 하면 12-웰 플레이트로 계대하였다. 그리고 3-4일 간격으로 6-웰, 60mm 배양 디쉬, 100mm 배양 디쉬로 계대 배양하여 동결보존하거나 실험에 이용하였다.
본 발명에서 제작한 벡터를 미니돼지 체세포에 도입한 후 넉 아웃된 체세포를 선별한 결과는 본 발명의 유전자 벡터인 DT-A/NLS/ pGT 5'/neor /pGT 3' 벡터에서 8.56%의 유전자 타겟팅 효율을 얻었다. 이와 같은 결과는 핵 국재화 신호가 없는 DT-A/pGT5'/neor/pGT3' 벡터뿐만 아니라, 핵 국재화 신호를 3' 말단 쪽에 삽입시 킨 DT-A/pGT5'/neor/pGT3'와 pGT5'/neor/pGT3'/nls 벡터보다도 더 높은 타겟팅 효율임을 확인할 수 있었다(도 5).
실시예 5. 미니돼지 알파 1,3- 갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 타겟팅된 돼지 체세포의 분석
상기 실시예 4로부터 확보된 클론 체세포는 24-well plate에서 12-well plate로 계대할 때 1차 PCR로 유전자 타겟팅되었는지 확인하였으며 100mm 배양 디쉬로 계대 배양한 다음 게놈 DNA을 분리하여 2차 PCR 및 서던 블롯팅을 통해 분석하였다(도 6).
1차 PCR분석을 위하여 24-웰 플레이트에서 트립신 처리한 후 1 ml 배양액으로 현탁한 세포혼합액 중 200㎕을 0.5ml 튜브로 옮겼다. 이들 세포는 10000 rpm, 5분 원심하여 세포를 침전시킨 다음 상층액을 버리고 멸균 증류수 40㎕을 넣고 잘 혼합한다음 50㎍/ml proteinase K을 첨가하였다. 이렇게 처리된 세포는 55℃에서 130분간 처리하여 세포를 파괴한 다음 98℃에서 10분간 처리하여 proteinase K를 불활성화시켰다. 이렇게 준비된 세포 파괴액 20㎕, 10 p mole 센스 및 안티센스 프라이머, 1×PCR 버퍼, 2.5mM dNTP, 1.25U Ex 택 폴리머라제를 첨가하여 전체 50㎕의 PCR 반응액을 준비하였다. PCR 반응 조건은 94℃ 30초, 68℃ 30초, 72℃ 2분 30초의 조건에서 38 cycle을 수행하였다. 또한, 이때 사용된 센스 프라이머로는 neo 유전자에 존재하는 TCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATT(서열번호 5) 배열을 사용하였 고, 안티센스 프라이머로는 3‘ 상동영역의 바깥 쪽에 존재하는 GACACAAATGACCTAAACTGGAACACAAGC(서열번호 6) 배열을 이용하였다. 이렇게 하여 PCR이 완료되면 반응액 중 20㎕을 아가로오스 겔에서 전기영동하여 약 2kb의 밴드가 검출되는지 확인하였다(도 6A).
2차 PCR분석은 1차 PCR 분석에서 2kb의 밴드가 검출된 세포만을 계대 배양하여 100mm 배양 디쉬로 계대 배양한 다음 게놈 DNA을 분리하여 실시하였다. PCR 반응액은 20ng 게놈 DNA, 10 p mole 센스 및 안티센스 프라이머, 1×PCR 버퍼, 2.5mM dNTP, 2.5U i-MAXII DNA polymerase을 첨가하여 전체 20㎕가 되도록 준비하였다. PCR 반응 조건은 94℃ 30초, 68℃ 30초, 72℃ 3분 30초의 조건에서 33 cycle을 수행하였다. 또한 이때 사용된 센스 프라이머로는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 엑손 9번 EcoR V 위치의 앞쪽에 존재하는 CATACTTCATGGTTGGCCACAAAGTC(서열번호 7)을 이용하였으며 안티센스 프라이머는 1차 PCR 분석에 이용한 안티센스 프라이머와 동일한 프라이머를 사용하였다. 이렇게 하여 PCR이 완료되면 반응액 중 5㎕을 아가로오스 겔에서 전기영동하여 약 3.4kb의 유전자 타겟팅된 밴드와 약 2.1kb의 정상 밴드가 검출되는지 확인하였다(도 6B).
서던 블롯(Southern blotting)은 20㎍의 게놈 DNA를 EcoR V 또는 BstE II 제한효소로 절단하고 0.8% agarose gel에서 전기영동 zeta-probe membrane으로 DNA을 전사시켰다. 멤브레인은 5×SSPE, 5×Denhardt's, 1% SDS(w/v), 50% fromamide(w/v)을 포함하는 용액에서 42℃, 16시간 혼성화(hybridization)를 실시하였다. 프로브는 엑손 8 부분을 포함하는 약 0.5kb 및 neo 유전자 약 0.6kb DNA단편을 random labelling kit(Amersharm 사)와 [α-32P]dCTP(110TBq/mmol, Amersham 사)를 이용하여 제조하였다. 멤브레인은 혼성화 후, 0.2%SSC, 0.1%SDS(w/v)에서 68℃, 30분, 3회 세척한 다음 방사능 사진촬영(autoradiography)을 실시하였다(도 6C).
상기 분석 방법에 의해 확인된 본 발명의 DT-A/nls/pGT5'/neor/pGT3' 벡터가 타겟팅된 돼지의 체세포주를 GTKO 21 이라고 명명하였고, KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전 유성구 과학로 111번지 한국생명공학연구원)에 2008 년 7월 24일자로 기탁번호 제KCTC 11369BP호로 기탁하였다.
본 발명의 타겟팅 효율이 증진된 돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터는 이종이식시 급속한 면역거부반응을 일으키는 원인 유전자인 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제의 활성을 효과적으로 제거시킬 수 있어, 장기이식시 면역반응을 최소화할 수 있다.
또한, 본 발명의 돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터는 면역거부반응이 억제된 복제 미니어쳐 돼지의 생산뿐만 아니라, 이종 간의 장기 이식분야에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 미니돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터의 개락도이다.
도 2는 본 발명에 기재된 미니돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터 3종류의 모식도이다.
도 3은 본 발명에서 사용한 미니어처 돼지 체세포 준비 및 배양 사진이다.
도 4는 본 발명에서 미니돼지 체세포로의 유전자 도입 효율을 확인하기 위하여 GFP 유전자로 검증한 사진이다.
도 5는 본 발명의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터와 대조군 벡터를 미니돼지 체세포에 도입하고 넉 아웃된 미니돼지 체세포를 동정한 결과를 비교 정리한 표이다.
도 6은 본 발명의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터를 미니돼지 체세포에 도입한 후, 넉 아웃된 미니돼지 체세포를 확인한 PCR 사진과 서던블롯 분석 결과의 사진이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> alpha 1,3-galactosyltransferase gene targeting vector and uses thereof <130> PA080043/KR <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for amplifying alpha 1,3-galactosyltransferase gene <400> 1 aggtcgtgac cataaccaga tggaaggctc 30 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for amplifying alpha 1,3-galactosyltransferase gene <400> 2 cttgcaccat gaaaggtctc tgcaactcca gaa 33 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for amplifying nls gene <400> 3 cggagttagg ggcgggacta 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for amplifying nls gene <400> 4 ccagctgtgg aatgtgtgtc 20 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for identifying gene targeting <400> 5 tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for identifying gene targeting <400> 6 gacacaaatg acctaaactg gaacacaagc 30 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for identifying gene targeting <400> 7 catacttcat ggttggccac aaagtc 26

Claims (10)

  1. (1)핵 국재화 신호(nuclear localization signal, nls) 영역; (2) 돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 핵산 서열에 상동인 4 내지 6 kb 길이의 핵산 서열로서 돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 인트론 8 일부 및 엑손 9의 일부를 포함하는 제1영역; (3)양성 선별마커 영역; (4)돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 핵산 서열에 상동인 0.5 내지 2 kb 길이의 핵산 서열로서 돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 엑손 9의 일부를 포함하는 제2영역; 및 (5)음성 선별마커 영역을 가지며, 상기 (1) 내지 (5)영역들이 5'말단에서부터 순서대로 구성되는 것을 특징으로 하는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 제1영역이 4.8kb의 길이를 가지고, 제2영역이 1.9kb의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 양성 선별마커가 네오마이신 (Neomycin: Neo), 하이그로마이신 (hygromycin: Hyg), 히스티디놀 디하이드로게나제(histidinol dehydrogenase gene: hisD) 및 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (guanine phosphosribosyltransferase: Gpt)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 상기 돼지는 미니돼지인 것을 특징으로 하는 벡터.
  5. 제1항에 있어서, 상기 음성 선별마커가 디프테리아 톡신 (Diphtheria toxin), 헤르페스 심플렉스 바이러스-싸이미딘 키나제 (Herpes simplex virus-thymidine kinase: HSV-tk), 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스퍼라아제 (hypoxanthine phosphoribosyl transferase: Hprt) 및 사이토신 디아미네즈 (cytosine deaminase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  6. 제1항에 있어서, 상기 벡터는 도 2에 개시된 NLS/pGT'5/neor/pGT3'/DT-A인 벡터.
  7. 제1항의 벡터로 유전자 타겟팅된 세포.
  8. 제1항의 벡터가 도입되어 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 넉 아웃된 형질전환 동물.
  9. (1)제1항의 돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터를 구축하는 단계; (2)돼지로부터 체세포를 분리 및 배양하는 단계; (3)구축된 단계(1)의 벡터를 상기 단계(2)에서 분리한 체세포에 도입하여 상동재조합을 유도하는 단계; 및 (4)상동재조합에 의해 돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 타겟팅된 돼지의 체세포를 선별하는 단계를 포함하는, 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 타겟팅된 돼지의 체세포를 제조하는 방법.
  10. (1)제9항의 방법에 의하여 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 타겟팅된 돼지의 체세포를 수득하는 단계; (2)돼지 난자의 핵을 제거하고 상기 유전자 타겟팅된 세포를 도입하여 체세포 핵이식된 수정란을 제조하는 단계; 및 (3)상기 수정란을 착상시키는 단계를 포함하는, 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 넉 아웃된 형질전환 돼지를 제조하는 방법.
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