JPH10504442A - α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ陰性ブタ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼの正常な発現が少なくとも組織型の一つの器官で妨げられる遺伝子導入ブタ。この酵素の不在あるいは不活性は、ブタ移植片の異種、とりわけヒト移植拒絶に重要な要因である異なった末端Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃを持つ炭水化物部分の生産を妨げる。

Description

【発明の詳細な説明】 α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ陰性ブタ 供与体の器官不足は、異種移植が器官利用能の代替的手段として役立つ可能性 があるという希望に導くことになった。ブタ、とりわけミニブタは、潜在的に大 きな利用能、人畜共通性感染症の危険性の少ないこと、器官の適切な大きさおよ び社会的かつ倫理的懸念が少ないなどの理由で非ヒト霊長類に対する魅力的な選 択肢である（サックス，Ｄ．Ｈ．他、１９７６年、移植、２２巻、５５９−５６ ７ページ：オーチンクロス，Ｈ．ジュニア、１９８８年、移植、４６巻、１−２ ０ページ）。しかし異種移植に対する主要な障害は、超急性拒絶（激症拒絶）と して説明される現象である（ブッシュ他、１９７２年、アメリカン・ジャーナル ・オブ・パソロジー、７９巻、３１−５７ページ：オーチンクロス，Ｈ．ジュニ ア、１９８８年、移植、４６巻、１−２０ページ）。この現象は非常に早く厳し い体液拒絶であり、これは供与体器官の移植の数分あるいは数時間以内に移植片 の破壊に導く。激症拒絶は、補体システムの活性化、血液凝固タンパク質の活性 化、内皮細胞の活性化および炎症タンパク質の放出を含む複合シリーズの事象で 明らかに影響される（ブッシュ他、１９７２年、アメリカン・ジャーナル・オブ ・パソロジー、７９巻、３１−５７ページ；プラット，Ｊ．Ｌ．１９９２年、Ａ ＳＡＩＴＯジャーナル、３８巻、８−１６ページ）。種の間に見られる激症拒絶 で根本的な重要 性を持つ一連の前もって形成された抗体、所謂自然抗体を意味する情報の累積体 が存在する。移植片の受容体が供与体種に激症応答を開始できる循環抗体を持つ 種の組み合せは不調和であると説明される。ブタとヒトはそのような不調和種の 組み合わせである。 激症拒絶過程は受容体の自然抗体が供与体の器官の細胞に結合する時に開始さ れる（プラット他、１９９０年、移植、５０巻、８７０−８２２ページ；プラッ ト他、今日の免疫学、１１巻、４５０−４６０ページ）。末端Ｇａｌα１−３Ｇ ａｌβ−４ＧｌｃＮＡｃ構造を運ぶブタＮ結合炭水化物は、抗ブタ異種反応ヒト 自然抗体の主要標的であることが提案されてきた（グッド他、移植紀要、２４巻 、５５９−５６２ページ；サンドリン他、１９９３年、全米科学アカデミー紀要 、アメリカ合衆国、９０巻、１１３９１−１１３９５ページ）。ブタ組織および ヒト組織のグリコシル化パターンの間の主要な差異は、ブタ細胞および組織に高 水準で末端Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ−４ＧｌｃＮＡｃ構造が存在することである 。この構造は調査された下級哺乳類すべてで高水準で発現されるが、旧世界（ア ジア、ヨーロッパ、アフリカ）サル、類人猿、およびヒト（狭鼻型人類）の細胞 および組織では殆ど発現されない（ガリリ，Ｕ．およびスワンソン，Ｋ．１９９ ２年、全米科学アカデミー紀要、８８巻、７４０１−７４０４ページ；ガリリ他 、全米科学アカデミー紀要、８４巻、１３６９−１３７３ページ）。特異トラン スフェラーゼ、ＵＤＰ：Ｇａｌβ１…＞４ＧｌｃＮＡｃ α１…＞３−ガラク トシルトランスフェ ラーゼ（ＥＣ２．４．１．１５１；α（１、３）ガラクトシルトランスフェラー ゼ）はＮ−アセチルラクトースアミン型炭水化物鎖およびラクトースアミノ多糖 類の末端ガラクトースを末端ガラクトース残渣に転移する原因であり、それは以 下の反応により行われる： ここでＲは糖タンパク質あるいは糖脂質である（ブランケン，Ｗ．Ｍ．およびバ ン・デン・アイヒンデン，Ｄ．Ｈ．、１９８５年、ジャーナル・オブ・バイオロ ジカル・ケミストリー、２６０巻、１２９２７−１２９３４ページ）。かくして Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ−４ＧｌｃＮＡｃエピトープ（決定基）ができる。マウ ス（ラーセン他、１９８８年、全米科学アカデミー紀要、８６巻、８２２７−８ ２３１ページ）およびウシ（ジョジアス他、１９８９年、ジャーナル・オブ・バ イオロジカル・ケミストリー、２６４巻、１４２９０−１４２９７ページ）酵素 をコード化する全長ｃＤＮＡ配列が決定された。加えて、マウスα（１、３）ガ ラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノム体制が確立された（ジョジアス他 、１９９２年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２６７巻、 ５５３４−５５４１ページ）。ブタα（１、３）ガラクトシルトランスフェラー ゼｃＤＮＡ遺伝子の３′領域をコード化する部分配列が決定された（ダブコウス キー他、１９９３年、移植紀要、２５巻、２９２１ページ）が、全長配 列は報告されなかった。５′領域の不在がここで説明される出願にとっては重要 である。下級哺乳類とは対照的に、ヒトはα（１、３）ガラクトシルトランスフ ェラーゼを発現しない。更に、マウス配列に相同であるヒト配列は染色体１２の 処理偽遺伝子および染色体９の不活性化残遺物に対応する（シェーパー他、１９ ９２年、ゲノミックス、１２巻、６１３−６１５ページ）。 この発明に従って、ブタ器官あるいは組織もしくは細胞は、ブタ移植の異種、 とりわけヒト激症拒絶の重要な要素である弁別的末端Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１ −４ＧｌｃＮＡｃエピトープを含む炭水化物成分を生産しないであろう。更にこ の発明に従って、完全なα（１、３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子抑 圧なしで意図された受容体に対し、α（１、３）ガラクトシルトランスフェラー ゼの生産量を減少し、その減少の範囲は炭水化物にＧａｌα１−３Ｇａｌβ１− ４ＧｌｃＮＡｃエピトープの提供から生じる量を細胞表面に提供されることから 阻害し、それにより遺伝子導入動物、器官、組織、細胞あるいは細胞培養を免疫 的に寛容にするのに十分な範囲にするという見地である。 この発明の主要な見地の一つは、発明者が完全なブタα（１、３）ガラクトシ ルトランスフェラーゼｃＤＮＡ遺伝子（配列識別番号１）を分離したことである 。今や５′末端の配列を特異的に提供する完全ｃＤＮＡ遺伝子の識別、分離およ び配列化は重要な前進である。何故なら、実施例２に説明するように、この領域 はアンチセンス標的化にもっとも効果的である と確認されたためである。その上、マウスおよびウシ相同配列（図２）で比較さ れるように、α（１、３）ガラクトシルトランスフェラーゼｍＲＮＡの領域はこ れらの種の間で広範にそれ、それを「交差種」アンチセンス構築物の利用が成功 するということから極端に似て非なるものにする。 この発明のも一つの主要な見地は、遺伝子変更動物、より特異的には遺伝子導 入、キメラあるいはモザイクブタに関するものであり、ここでは、生物活性α（ １，３）ガラクトシルトランスフェラーゼの発現は、少なくとも１個の器官、組 織あるい細胞型に妨げられる。遺伝子導入動物は、初期の成長段階に動物が生殖 細胞系、あるいは動物の祖先に導入された遺伝子を運ぶ。遺伝子導入動物での遺 伝子変更は、意図的な実験的介入の結果としてゲノムに安定して組み込まれる。 典型的には、これは外因性外来ＤＮＡもしくは新規構築物の追加より生じる（パ ルマイター他、１９８６年、アニュアル・レヴィュー・オブ・ジェネティクス、 ２０巻、４６５ページ）。胚幹（ＥＳ）細胞および特異的遺伝子標的化の到来と ともに、遺伝子導入生成(taonsgenesis)の定義は、今や直接の実験操作により、 また内因性遺伝子の発現も調節するエフェクター分子をコードするＤＮＡの安定 した組込みにより内因性遺伝子配列の特異的修飾（変更）を含む（ゴスラー他、 １９８６年、全米科学アカデミー紀要、８３巻、９０６５ページ：シュバーツバ ーク他、１９８９年、サイエンス、２４６巻、７９７ページ；ジョイナー他、ネ イチャー、３３８巻、１５３ページ）。 遺伝子導入動物を生成する一つの望ましいアプローチは、細 胞への望ましくは初期胚段階（通常は、接合体／１細胞段階）で動物の前核への 裸のＤＮＡの顕微注射を含む。説明された通り注射されたＤＮＡは、胚の天然遺 伝子物質に組み込まれ、宿主生体の染色体ＤＮＡとともに確実に複製を行う。こ れは生殖細胞系を含む成長生体のすべての細胞に遺伝子導入が行きわたることを 可能とする。生殖細胞系に伝達された遺伝子導入ＤＮＡは遺伝子導入子の上昇を 与える。もしメンデル方式で伝達される場合には、子の半分が遺伝子導入される 。創始動物から誘導される遺伝子導入動物すべては遺伝子導入系として引用され る。顕微注射された遺伝子導入ＤＮＡが１細胞胚以降の段階で染色体ＤＮＡに組 み込まれるものとすると、すべての細胞が遺伝子導入とはならず、また動物は遺 伝子的にモザイクであるとして引用される。遺伝子的にモザイクな動物は、生殖 細胞系伝達物質あるいは非伝達物質のいずれかとなる。異種ＤＮＡ構築物の初期 胚細胞への顕微注射の一般的アプローチは、通常優勢効果の生成を制限する。す なわち、導入遺伝子の対立遺伝子（半接合体）の一つが表現型の発現を起こす（ パルマイター他、１９８６年）マニュアル・レヴィユー・オブ・ジェネティクス 、２０巻、４６５ページ）。 も一つの望ましいアプローチにおいて、動物は胚幹（ＥＳ）細胞媒介遺伝子導 入生成により遺伝子的に変更される（ゴスラー他、１９８６年、全米科学アカデ ミー紀要、８３巻、９０６５ページ）。ＥＳ細胞系は、胚盤胞（相対的に成長の 初期段階の胚）の内細胞塊（ＩＣＭ）から、もしくは胚体内生殖腺にある始原生 殖細胞の移動よりのいずれかにより、初期胚か ら誘導される。それは多くの継代にわたり試験管内で培養されるポテンシャルを 有し（すなわち、それは条件的に不死となり）、またそれは多能性、あるいは全 能性（すなわちすべての細胞型に分化しおよびそれらを生じることが可能）であ る。ＥＳ細胞は受容体の胚盤胞に導入され、それは成長のため出産予定日まで養 母の子宮に移される。ＥＳ細胞を注射された受容体胚盤胞は宿主胚および胚幹細 胞からの助力によりキメラ動物に成長することができる。ＥＳ細胞は、優勢効果 を生じ、全遺伝子を不活性化し、あるいは点突然変異を含む微妙な変化を導入す る異種遺伝子構築のいずれかにより形質移入することができる。定義された遺伝 子変更のためのクローン選別に続き、少数のＥＳ細胞は受容体の胚（胚盤胞ある いは桑実胚）に再導入することができ、ここではそれは生殖細胞系を含む動物の すべての組織に分化し、かくして設計された遺伝子修飾で動物の安定した系を発 生させる。全能性ブタ胚幹細胞は遺伝子変更により、異型接合（＋／−）突然変 異体、望ましくは無効対立遺伝子、特にこのような胚幹細胞内で相同性組替えに より生産されたものを持つことができる。選択肢としては、相同性組換えによる 遺伝子標的事象は、同じ遺伝子座で細胞のクローンを産出する２回のラウンドで 実行され、同型接合（−／−）突然変異体、望ましくは無効突然変異体に帰着す る（ラミレス−ソリス他、メソッズ・イン・エンザイモロジー，２２５巻、８５ ５ページ）。 この発明の望ましい実施例において、一つのＤＮＡ配列はブタの天然遺伝子物 質に組み込まれてアンチセンスＲＮＡを生産 し、このＲＮＡが遺伝子導入ブタにおけるα（１，３）ガラクトシルトランスフ ェラーゼをコード化する天然ｍＲＮＡに結合しその翻訳を妨げる。 特に望ましい実施例において、遺伝子導入ブタのゲノムは修飾されて、生物活 性酵素の全体あるいは一部の発現を妨げるα（１，３）ガラクトシルトランスフ ェラーゼコード化領域に相補的なＤＮＡよりなる一つの構築物を含む。「組込み アンチセンス配列」という語が使用される場合、それは非天然核酸配列の一つで あり、それが細胞の遺伝子物質に組込まれ、これが細胞の遺伝子物質により生産 されるｍＲＮＡに相補的でありかつそれと結合する一つのｍＲＮＡを生産するた めに（構造的にあるいは誘発的に）転写されそのためその発現を調節あるいは阻 害するような抗酸配列を意味する。 この発明のも一つの実施例において、非突然変異体から得る細胞あるいは細胞 系は１個あるいは両方の対立遺伝子で不活性化されたα（１，３）ガラクトシル トランスフェラーゼで組込みアンチセンス配列の利用を通じて作られ、この配列 は前記細胞あるいは細胞系でα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼをコ ード化する天然ｍＲＮＡに結合してその翻訳を妨げる。実施例３で転写されるＲ ＮＡ配列のような組込みアンチセンス配列は電気穿孔法、レトロウィルス形質導 入あるいはリポフェクション(lipofection)などの各種の手段により細胞に運ば れる。 も一つの望ましい実施例において、遺伝子導入ブタはα（１，３）ガラクトシ ルトランスフェラーゼｍＲＮＡを特異 性で切断するリボザイム（触媒ＲＮＡ）を生産するために作られる。リボザイム は他のＲＮＡ分子に関し酵素として作用するか、もしくは自己スプライシングも しくは自己切断のような反応で分子間で作用することで酵素活性を持ちＲＮＡの 特異領域である。（ロング，Ｄ．Ｍ、およびアーレンベック，Ｏ．Ｃ，１９９３ 年ＦＡＳＥＢジャーナル，７巻、２５−３０ページ）。ある種のリボザイムは「 ハンマーヘッド」と呼ばれる一般に約３０個だけのヌクレオチドの小さい構造領 域を含む。ハンマーヘッドは切断される基質領域に特異的な補体である２個の線 状領域により隣接されているＲＮＡのループである。基質の切断を実施するハン マーヘッドリボザイムの部位はステムループあるいはハンマーヘッドの基礎であ る。図３で示されるように、この発明のリボザイムは、α（１，３）ガラクトシ ルランスフェラーゼｃＤＮＡ遺伝子の５′末端に近い領域に相補的であるフラン キング（隣接）配列を持つ。 リボザイムのＤＮＡは動物、組織あるいは細胞の遺伝子物質に組込まれ、（構 造的あるいは誘発的に）転写されて、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラ ーゼと選択的に結合してそれを切断できるリボザイムを産出する。それが触媒分 子であるために、このような各リボザイムは多重基質分子を切断することができ る。 リボザイムの触媒的「ステムループ」はα（１，３）ガラクトシルトランスフ ェラーゼｍＲＮＡの領域に相補的な配列により隣接される。特に望ましい実施例 において、遺伝子導入ブタは修飾され、そのプロモーターと操作的に結合する α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼのｍＲＮＡを不活性化するのに必 要な触媒的ＲＮＡの一部をコード化するＤＮＡよりなる構築物を組込む。 この発明のも一つの実施例において、非突然変異体から得る細胞あるいは細胞 系は、前記細胞あるいは細胞系にあるα（１，３）ガラクトシルトランスフェラ ーゼをコード化する天然ｍＲＮＡに結合し、それを切断する組込みリボザイム配 列の使用を通じて１個もしくは両方の対立遺伝子で不活性化されたα（１，３） ガラクトシルトランスフェラーゼで作られる。実施例４で転写されるＲＮＡ配列 のような組込みリボザイム配列は、電気穿孔法、レトロウイルス形質導入あるい はリポフェクションなどの各種の手段により細胞に伝達される。 培養ブタ胚幹細胞を用いるも一つの実施例において、突然変異、望ましくは無 効（ヌル）突然変異がα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼをコード化 する天然ゲノム遺伝子座で遺伝子を標的化することにより導入される。ＥＳ細胞 の相同性組換えによる遺伝子標的化は、天然遺伝子に対する広範な配列相同性を 含むが、生物活性タンパク質を生成するのにとりわけ重要な遺伝子のある位置で 突然変異に特異的な構築物を用いて行われる。従って突然変異は翻訳、転写、あ るいはタンパク質の機能領域をコード化するもののいずれかにとって重要な領域 に位置することができる。遺伝子標的構築物を相同的に組換え、遺伝子「ノック アウト」構築物と名づけられるＥＳクローンの選別は特異的マーカー遺伝子を用 いて行うことができ る。その標準手順は２種の薬品選択マーカーの組み合わせを使用することであり 、その一つは正の選択のもの（マーカーが発現される場合には薬品の存在下で生 存）およびも一つは負の選択のもの（マーカーが発現される場合には薬品の存在 下で殺害）である。標的化ベクターの望ましい、一つのタイプは、薬品Ｇ４１８ 内で正の選択を行うネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ネオ）遺伝子であ り、また同様にガンシクロビル内で選択的殺害を行う単純ヘルペスウイルスチミ ジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）を含む。正負選択（ＰＮＳ）と名付けられたＧ４ １８およびガンシクロビルの薬品選択（マンサウアー他、１９８８年、ネイチャ ー、３３６巻、３４８ページ；タビュレヴィッチ他、１９９１年、細胞、６５巻 、１１５３ページ）は、ランダム組込み事象よりも遺伝子標的化を受けるＥＳ細 胞クローンの富化を可能にする。相同性組換え遺伝子事象の確認はサザン分析で 行なわれる。 α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ標準化構築物の設計は実施例６ で説明される。ここで適用される手順はネオ（ネオマイシン耐性）の組込みにも とづく正の選択を用いて、望ましくはカセット内でホスホグリセレートキナーゼ （ＰＧＫ−１）プロモーターを用いてα（１，３）ガラクトシルトランスフェラ ーゼ遺伝子配列の２個の異なった領域に相補的な隣接オリゴヌクレオチドととも に内因性α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座に逆方向で行わ れる。ネオに代わって他の正の選択マーカーを使用できることは理解される。ネ オ遺伝子はその制御下でネオ遺伝子プロモーターに連 結される。第２隣接配列の下流にはＨＳＶ−ｔｋ遺伝子があり、もしそれがゲノ ムに組込まれるとチミジンキナーゼの生産をコード化し、細胞がガンシクロビル により殺害され易くなる（負の選択）。ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子でなくネオ遺伝子を 組込むとα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼへの組込みが起こり、そ のような形質転換される細胞の正と負の選択が提供される。 同質遺伝子型ＤＮＡを用いるも一つの望ましい実施例において、接合体などの 生物システムにおいてすら高頻度相同的組換えを実行することが可能となり、こ の接合体は綿密な選択実験記録の使用には向かず、従って、これまでは相同的組 換えを指示する正のマーカー属性を示した細胞分離の適切な候補者ではなかった 。標的受容体細胞の染色体部分のそれと事実上同一である同質遺伝子型ＤＮＡを 含む標的化ベクターの使用は、その後遺伝子導入動物に成長する標的接合体に使 用できる。これらの接合体細胞の使用は、α（１，３）ガラクトシルトランスフ ェラーゼをコード化する染色体遺伝子座で望ましくは突然変異、望ましくは無効 突然変異を生産することである。かくしてこれらのベクターは、天然遺伝子に対 する広範な配列相同性を含み、しかもまた生物活性タンパク質を生産するのに極 めて重要な遺伝子内部分で特異的な突然変異を含む。従って、突然変異は翻訳、 転写あるいはタンパク質の機能領域を被覆するもののいずれかにとって重要な領 域に位置を占めることができる。同質遺伝子型ＤＮＡを用いて達成される高い割 合の相同的組換えが、「ノックアウト」実施例と関連して前に述べたられ たように遺伝子標的構築物を相同的に組換えたクローンの選択の必要性を避けさ せるため、前に述べた標準選択手順の必要性を避けることが可能となる。 より詳細には、この実施例において、ＰＣ％が１−２キロベースのＤＮＡ断片 を識別し抽出するのに使用され、これを次いで接合体注射のために選択されたミ ニブタ系にもっとも多く存在する領域あるいは対立遺伝子を識別するために制限 断片長多形消化を受ける。既知の挿入ベクターが使用されるが、しかし従来の技 術に記された置換ベクターも利用できる。僅か２，３キロベースの連続同質遺伝 子型ＤＮＡを必要とする同質遺伝子型置換ベクターとともにＤＮＡ配列を使用す ることも可能である。このようにして、高度に効果的な組換えを行うことが可能 となるため、標的化ベクター組換え接合体を選別する必要はない。むしろＰＣＲ を用いるゲノムＤＮＡ選別は、子ブタが生まれた後に行うことができる。天然α （１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座を標的とする遺伝子導入を 受けたと見做されるこれらの遺伝子導入創始動物（すなわちこの遺伝子に関して 異型接合体無効突然変異体）は異種交配され、この遺伝子座にとっては同型接合 体無効突然変異体を生産し、その結果抗体あるいはレクチン結合検定より確認で きるα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のノックアウトを来す 。 このブタは望ましくは核移転実験記録を用いてその前核物段が除去され全能性 ブタ胚幹細胞を導入されたブタ卵母細胞から成長するα（１，３）ガラクトシル トランスフェラーゼ陰性ブ タである（プラザー他、１９８９年、バイオロジカル・リプロダクション、４１ 巻、４１４ページ）。核移転のため使用されるＥＳ細胞はα（１，３）ガラクト シルトランスフェラーゼの発現は陰性であり、あるいは選択肢としては、核移転 のため使用される全能性ＥＳ細胞は標的様式においてα（１，３）ガラクトシル トランスフェラーゼ遺伝子の少なくとも１個の対立遺伝子に突然変異する。 このブタは望ましくはα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の 発現を欠いており、胚盤胞注射あるい桑実胚凝集によりＥＳ細胞から生成される キメラ動物から繁殖される。望ましい無効突然変異キメラ動物を生成するＥＳ細 胞は、相同的組換えにより遺伝子標的を用いるα（１，３）ガラクトシルトラン スフェラーゼ遺伝子座の少なくとも１個の対立遺伝子で突然変異された。 キメラブタは望ましくは、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼの１ 個の対立遺伝子を突然変異されたＥＳ細胞で構成される。突然変異ＥＳ細胞から 誘導されるのはまた雄性もしくは雌性配偶子の生殖細胞系であり、それはこの突 然変異の子孫への継代が可能となり、また異型接合体突然変異体姉妹細胞ブタを 繁殖させてα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座で同型接合体 突然変異体動物の産出を可能にする。更に説明されるのは、α（１，３）ガラク トシルトランスフェラーゼタンパク質を欠く（つまりα（１，３）ガラクトシル トランスフェラーゼタンパク質の発現の欠除で特徴づけられる）ブタであり、細 胞表面に、もしあっても機能的 Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃエピトープ含有炭水化物抗原を殆ど 持っていないブタである。更に説明されているものは、遺伝子導入ブタを生産す る方法およびこの発明の異型接合ブタあるいは同型接合ブタから組織を生産する 方法である。この発明は更にブタ細胞系のような細胞系に関し、ここではα（１ ，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が移植のための組織および細胞の 源泉として１個もしくは両方の対立遺伝子を不活性化しこのような細胞に使用さ れる。 この発明の遺伝子導入ブタ、より詳細には半接合体、異型接合体あるいは同型 接合体突然変異動物から得られた組織、器官および精製あるいは事実上精製され た細胞は、組織、器官あるいは細胞を必要とするヒトを含む他の哺乳類に異種移 植のため使用することができる。α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ 不活性細胞はそれ自身治療あるいは療法／臨床製品になり得る。例えば、不活性 のα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼを与えられたケラチノサイトは 黄斑変性に使用できるし、また欠損α（１，３）ガラクトシルトランスフェラー ゼを与えられた膵臓細胞は受容体に膵臓産物（および機能）を元に戻すことがで きる。も一つの実施例においては、この方法で生産された不活性α（１，３）ガ ラクトシルトランスフェラーゼは既知の方法を用いて受容体に提供される治療薬 などの製品をコード化する対象を得る。この実施例では、α（１，３）ガラクト シルトランスフェラーゼ欠損組織、器官あるいは細胞は、コード化製品のための 伝達ビヒクルとして役立つ。例えば、繊維芽細胞あるいは内皮細胞などの α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ欠損細胞は、治療薬、例えば供与 体組織移植を増すサイトカイン、因子VIII、因子IX、エリスロポイエチン、イン シュリン、ヒト主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子あるいは成長ホルモン などをコード化する遺伝子で形質移入され、このコード化製品の必要個人に導入 することができる。 選択肢としては、受容体の胚盤胞は注射され、あるいは桑実胚が全能性胚幹細 胞で凝集塊状化され、相同性組換えにより生産される突然変異、望ましくはα（ １，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の少なくとも１個の対立遺伝子 を持つキメラブタを産出する。キメラブタは、望ましくはα（１，３）ガラクト シルトランスフェラーゼ遺伝子の１個の対立遺伝子を突然変異されたＥＳ細胞に より構成されている。突然変異ＥＳ細胞から誘導されるのはまた生殖細胞であり 、これは子孫にまで継代して突然変異が残り、異型接合体突然変異姉妹細胞ブタ の繁殖はα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座で、同型接合体 突然変異体動物を産出する。更に説明されているのは、α（１，３）ガラクトシ ルトランスフェラーゼタンパク質を欠損するブタ（すなわち、α（１，３）ガラ クトシルトランスフェラーゼタンパク質を基本的には発現しないことにより特徴 付けられるもの）であり、もしあったとしても、細胞表面に官能Ｇａｌの１−３ Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃエピトープ含有炭水化物抗原を殆ど持たないブタが 産出される。更に説明されているのは、遺伝子導入ブタの生産方法およびこの発 明の異型接合体ブタあるいは同型接合体ブタから得る組織の 生産方法である。更にこの発明は細胞系、たとえばブタ細胞系に関し、ここでは α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子は１個もしくは両方の対立 遺伝子上で不活性化し、また移植用の組織、器官および細胞の源泉としてこのよ うな細胞系を利用することに関する。 図１は、３７１個のアミノ酸タンパク質をコード化する１１１３塩基対の読み 取り枠を持つα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼの完全ｃＤＮＡ配列 を図示する。 図２は、ブタ、ウシ、およびマウスα（１，３）ガラクトシルトランスフェラ ーゼｃＤＮＡ遺伝子によりコード化されたタンパク質配列を比較する。 図３は、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼを標的化する交流ハン マーヘッドリボザイムの二次構造を図示する。 図４は、マウスα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼのゲノム体制を 図示する。エキソンは１−９として標識され、固形ボックス型で示される。イン トロン配列は細い線で表示される。 キメラブタおよびα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子不活性 化に同型接合体のブタおよび組織培養、ここでα（１，３）ガラクトシルトラン スフェラーゼタンパク質合成および細胞表面Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌ ＮＡｃエピトープ含有炭化水素細胞表面マーカー発現が欠失しているものが開示 される。特に関心の深いものは、精製細胞型であり、これはα（１，３）ガラク トシルトランス フェラーゼ発現が欠損しているものである。このような細胞型は、繊維芽細胞、 ケラチノサイト、筋芽細胞および内皮細胞を含む。 この発明の一つの実施例において、前記の変更されたブタ細胞は受容体で必要 とされる細胞を提供するか、遺伝子治療を提供するために使用される。Ｇａｌα （１−３）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡエピトープ含有炭水化物細胞表面抗原を欠 失する細胞は培養され卵母細胞に移植される。 無効突然変異体α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座を持つ 胚幹細胞はブタ胚盤胞に導入され、それは次いで偽妊娠ブタに導入される。胚は キメラブタ子孫にて成長する。野生型メスと交配されると、キメラオスは胚幹細 胞内にあるα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ不活性化をその子孫に 伝達し、これは不活性化に対し異型接合体である。α（１，３）ガラクトシルト ランスフェラーゼ遺伝子不活性化に異型接合であるブタは交配されて、突然変異 に対し同型接合体（−／−）であるブタを生産する。 精製され、あるいは事実上精製されたα（１，３）ガラクトシルトランスフェ ラーゼ欠損細胞はここで説明されたように生産された組織あるいは遺伝子導入も しはキメラブタから得ることができる。選択肢としては、それはここで説明され たように、正常な（変更されていない）供与体ブタおよび変更されたものから得 ることができる。これらの細胞は次いで移植に有用な大量の細胞を生産する既知 の方法で培養することができる。更に、細胞系、例えばブタ細胞系、そこでα（ １，３）ガ ラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が分裂したもの望ましくは対立遺伝子は、 移植のための組織や細胞の源泉として有用である。 実施例１． ブタα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼｃＤＮＡの分離および特性化 これまでに説明されているλＺＡＰ ＩＩブタ脾臓ｃＤＮＡライブラリー（グ スタフソン他、１９９０年、全米科学アカデミー紀要、８７巻、９７９８−９８ ０２ページ）がクローン化α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼｃＤＮ Ａプローブでのハイブリッド形成により選別された（ジョジアス他、１９８９年 、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー，２６４巻、１４２９０− １４２９７ページ）。ウシα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼｃＤＮ Ａ配列のジェンバンク、アクセス番号はＪ０４９８９である。ウシα（１，３） ガラクトシルトランスフェラーゼｃＤＮＡプローブは、オランダ、ライデン大学 、デービッド・ジョジアス博士の好意で提供された。このプローブはメガプライ ムＤＮＡ標識システム（英国、エイマシャム・インターナショナル）を用いて³² Ｐ−ｄＡＴＰで放射線標識された。正（陽性）のクローンはポリメラーが連鎖反 応（ＰＣＲ）で確認され、ウシα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼｃ ＤＮＡ配列から誘導されるプライマー（配列識別番号２および配列識別番号３） が使用された。配列識別番号２はウシα（１，３）ガラクトシルトランスフェラ ーゼヌクレオチド７１２−７２９に一致 し、また配列識別番号３はウシα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼヌ クレオチド１５０１−１５０８に一致する。正のクローンから得られる組換えｐ ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドはヘルパーファージＲ４０８（英国、ケンブリ ッジ、ストラータジェン社）の助けを得て自動的に切除された大腸菌菌株ＴＧ１ （ＡＴＣＣ３９０７８）で増幅された。プラスミドＤＮＡは、業者の指示に従っ てマジック・ミニプレップ・キット（英国、サザンプトン、プロメガ社）を用い て準備され、ＤＮＡはＥｃｏＲＩ切断で特性付けられた。ＤＮＡ配列化は、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ配列化キット（英国、ミルトンケイズ，ファーマシア・バ イオシステムズ社）を使って業者の指示に従ってジデオキシ鎖終結法により行わ れた。合成オリゴヌクレオチドプライマー、配列識別番号４−１２が使用された 。配列識別番号４はストラータンジュＳＫ、カタログ番号３００３０５（カリホ ルニア、ラホーラ、ストラータジェン社）である。配列識別番号５はブタα（１ ，３）ガラクトシルトランスフェラーゼヌクレオチド９４−１１１の逆補体に一 致する。配列識別番号６ブタα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼヌク レオチド１６３−１８０に一致する。配列識別番号７はブタα（１，３）ガラク トシルトランスフェラーゼヌクレオトド４４２−９５９の逆補体に一致する。配 列識別番号８はブタ補体およびウシα（１，３）ガラクトシルトランスフェラー ゼヌクレオチド５３８−５５５および９８２−９９９にそれぞれ一致する。配列 識別番号９はブタα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼヌクレオチド５ ９６−６１５の逆 補体に一致する。配列識別番号１０ブタ（１，３）ガラクトシルトランスフェラ ーゼヌクレオチド６８２−６９９に一致する。配列識別番号１１はブタα（１， ３）ガラクトシルトランスフェラーゼヌクレオチド８４７−８６４に一致する。 配列識別番号１２はブタα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼヌクレオ チド９７０−９８７の逆補体に一致する。 ４個の正のクローンがウシα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼｃＤ ＮＡプローブを用いてハイブリッド形成による選別で約２×１０⁴個のプラーク から得られた（ジョジアス他、１９８９年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル ・ケミストリー、２６４巻；１４２９０−１４２９７ページ）。これらクローン の３個はＰＣＲにより正（陽性）であることが確認された。ヘルパーファージと ともにλＺａｐ ＩＩからの自動切除により生成される３個のｐＢｌｕｅｓｃｒ ｉｐｔプラスミドのそれぞれはＥｃｏＲＩ切断で決定されるように約２．５キロ ベースの挿入断片を含んでいた。ｐＳα１３ＧＴ１と名付けられた１個のクロー ンは次の研究のために選択された。 ｐＳの１３ＧＴ１のＤＮＡ配列分析は１１１３塩基の読み取り枠を明らかにし （配列識別番号１および図１参照）、公開されたウシｃＤＮＡ配列と８６％の同 一性を示し（ジョジアス他、１９８９年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ ケミストリー２６４巻、１４２９０−１４２９７ページ）、またウシおよびマウ スα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼアミノ酸配列をそれぞれ８５％ および７６％の同一性で３７１個のアミノ酸タンパク質をコード化した（図２） 。 実施例２． α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ発現のアンチセンスオリゴヌクレ オチドの阻害 ３個のアンチセンス５′および３′ホスホチオエート保護オリゴヌクレオチド （Ｓ−オリゴヌクレオチド，配列識別番号１３−１５）が、ブタ一次内皮細胞培 養（ブタ大動脈より得たもの）およびブタＢ−細胞系を使って試験管内で検査さ れる（Ｌ２３１、動物細胞培養ヨーロッパコレクション、英国、ソールスベリ、 ポートダウン、センター・フォア・アプライド・マイクロバイオロジー・アンド ・リサーチ）。配列識別番号１３はブタα（１，３）ガラクトシルトランスフェ ラーゼｃＮＤＡヌクレオチド１６−３５の逆補体に一致する。配列識別番号１４ はブタα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼｃＤＮＡヌクレオチド３１ −５３の逆補体に一致する。配列識別番号１５はブタα（１，３）ガラクトシル トランスフェラーゼｃＤＮＡヌクレオド６−２３の逆補体に一致する。３個のア ンチセンスオリゴヌクレオチドすべては、翻訳開始を取り囲むｍＲＮＡの５′領 域に指向する。アンチセンス配列からランダム化されたナンセンスＳ−オリゴヌ クレオチドは同じモル濃度で対照として使用される。 ブタ内皮細胞は説明されているように、血管の管腔面を削ってミニチャーブタ 大動脈から取り出される（ライアン他、組織と細胞、１２巻、６１９−６３５ペ ージ）。この細胞は２０％のウシ胎児血清（メリーランド、ゲイザーズバーグ、 ジブコＢＲＬ）およびゲンタマイシンで補充されたＭ１９９培地に懸 濁され、２５cm²の組織培養フラスコにプレートされ、フィブロネクチン（５μ ｇ／cm²）およびラミニン（１μｇ／cm²）で前コートされる。１５０μｇ／ｍｌ の内皮細胞成長補足剤（マサチューセッツ、ベッドフォード、コラボレイティブ ・リサーチ）が培養の開始に当り加えられる。培養は２−３日毎に培地を半分と りかえて維持される。ブタリンパ芽球細胞系Ｌ２３１はＤＭＥＭ、１０％のウシ 胎児血清、１０％のＮＣＴＣ−１０９、１％のグルタミン、１％のペン−ストレ ップ（すべてメリーランド、ゲイザーズバーグ、ジブコＢＲＬ）および５×１０² Ｍの２−メルカプトエタノール（ミズーリ、セントルイス、シグマ）で維持さ れる。Ｌ−２３１細胞は３日毎に細胞を１：３に分配して継代培養される。 細胞処理に関しては、Ｓ−オリゴヌクレオチドが加えられて最終濃度が５−１ ０μＭになるように成長細胞に２４時間毎、典型的には４８時間になるように加 えられ、次いで処理細胞が（ノーザンブロット分析により）α（１，３）ガラク トシルトランスフェラーゼｍＲＮＡの水準、およびヒトＡＢ血清による細胞のエ ピトープの発現ならびにＦＩＴＣ−標識マウス抗ヒト二次試薬（抗ヒトＩｇＭお よびＩｇＧ）を検査される。 実施例３． 組込みアンチセンス構築物の調製と用途 我々はブタα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼの生産を特異的に阻 害する組込みアンチセンス構築物の能力を研究している。形質移入細胞における α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼの特異的阻害は激症現象におけ る酵素の寄与を評価することを可能にする。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プ ロモーターの制御の下で、ベクターはα（１，３）ガラクトシルトランスフェラ ーゼアンチセンスｍＲＮＡを発現するように構築される。特にｐＳα１３ＧＴ１ はＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＶで切断され、それはα（１，３）ガラクトシルトラ ンスフェラーゼｃＤＮＡ配列のヌクレオチド５３１に至るまでのｐＢｌｕｅｓｃ ｒｉｐｔポリリンカー配列の部分を含む長さ５３７塩基対の制限断片を生成する 。このＤＮＡ断片は発現ベクターｐｃＤＮＡ３（カリホルニア、サンジエゴ、イ ンバイトロゲン）にクローンされ、同じ酵素で切断される。生成ベクターは従っ て、ｐｃＤＮＡ３に位置するＣＭＶプロモーターに関連してアンチセンス方向に ブタα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼを含む。この構築物は電気穿 孔法あるいはＤＮＡを哺乳類細胞に導入する他の効果的な方法を用いてブタ内皮 細胞およびＬ２３１ブタリンパ芽球細胞系（実施例２で説明したように成長する もの）に形質移入される。アンチセンスＲＮＡの効果はα（１，３）ガラクトシ ルトランスフェラーゼ遺伝子のノーザンブロット分析およびヒト血清成分（すな わち天然抗体）の結合度合の両方によってモニターされる。 実施例４． ブタα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼｍＲＮＡを不活性化するリボ ザイム配列 この実施例はブタα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼｍＲＮＡ配列 を切断するように特に設計されたリボザイ ム配列をコード化するベクターの構築方法を説明する。 リボザイム配列の設計はコンセンサス作用ハンマーヘッドリボザイム配列にも とづくものである（ラフナー他、１９９０年、バイオケミストリー、２９巻、１ ０６９５−１０７０２ページ）。我々はシス作用ハンマーヘッドリボザイム配列 （デンマン，Ｒ．Ｂ．，１９９３年、バイオテクニクス、１５巻、１０９０−１ ０９５ページ）をモデルとしてジェネティック・コンピュータ・グループ（ウィ スコンシン、マジソン）から利用できるプログラムに合わせてズーカー十進法を 使用した。リボザイム標的配列は、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラー ゼｍＲＮＡ配列内で識別された。各潜在的リボザイム配列のための一つのリボザ イム配列ファイルは、標的配列にもとづき、またｍＲＮＡ標的配列をリボザイム の触媒鎖と結合する５個のヌクレオチドを利用して生成される。標的ファイルは ＲＮＡＦＯＬＤを用いて最低エネルギー構造に折り込まれる。非リボザイム構造 を持つ配列は取り除かれる。図３は、配列識別番号１６と一致するリボザイムを 使用するリボザイム標的ＲＮＡ二次構造の一つを図示する。小さい矢印はステム ＩおよびステムＩＩＩの間でｍＲＮＡの切断部分を示す。 リボザイム（配列識別番号１６−２１）をコード化する合成オリゴヌクレオチ ドは、制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩおよびＸｂａＩのオーバーハングに一致 する末端を使ってアプライド・バイオシステムのオリゴヌクレオチド合成機（カ リホルニア、フォスター・シティ）で作られた。二重螺旋ＤＮＡは哺乳類発現ク ローニングベクターｐｃＤＮＡ３（カリホルニア，イ ンバイトロゲン）にクローンされる。リボザイムの発現はｐｃＤＮＡ３に存在す るＣＭＶプロモーターの制御下にある。転写物はリボザイム配列に対して５′お よび３′の両方で約１４０個のヌクレオチドよりなる。転写配列の発現水準はノ ーザンブロット分析により確認される。もしもＲＮＡ水準が低ければより長期で もっと安定した転写物を生成するために追加の配列が転写物に含まれる。 この構築物は電気穿孔法を用いてブタ一次内皮細胞、ブタＢ細胞（Ｌ−２３１ ）に形質移入される。またこのベクターは、ブタα（１，３）ガラクトシルトラ ンスフェラーゼを発現するプラスミドでＣＯＳ７細胞に同時形質移入される。Ｃ ＯＳ７細胞は内在性α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼを発現しない ので、導入されたブタα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の発 現に関してリボザイムの存在の効果はたやすく確認される。 実施例５． α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ合成を阻害するアンチセンスある いはリボザイムＲＮＡを生産する遺伝子導入ブタ このアプローチは接合体段階（１細胞胚）でブタ胚の前核の一つに遺伝子導入 ＤＮＡを直接顕微注射する必要がある。注射された１細胞胚は出産まで成長させ るために受容体養母若雌ブタに転移される（ハマー他、１９８５年、ネイチャー 、３１５巻、６８０ページ；パーセル他、１９８９年、サイエンス、２４４巻、 １２８１ページ）。 このアプローチを成功裡に達成するために重要なことは、供与体ブタ、望まし くはハプロタイプ（染色体減数）特異的ミニブタの年齢と重量である。最適のも のとしては、動物は８乃至１０ヶ月で７０乃至８５ポンドのものである。これは 遺伝子導入のための顕微注射にとっては最適な１細胞胚の供給を得る確率を増加 させる。数多くの胚供与体からこの段階での胚コレクションの正確なタイミング を得られるように、若雌ブタは合成黄体ホルモン（レギュメート、Ｒｅｇｕｍａ ｔｅ）の調製を用いて同調される。ホルモン移植組織は胚コレクションの日の３ ０日前に指定された若雌ブタに適用される。それから２０日後、コレクションの １０日前に、移植組織は除去され、過剰排卵、つまり顕微注射用の胚数増加を誘 発するために追加ホルモンで処置される。移植組織除去の３日後に動物は４００ 乃至１０００ＩＵの妊馬血清ゴナドロピン（ＰＭＳＧ）で処置され、また７５０ ＩＵのヒト柔毛ゴナドトロピン（ｈＣＧ）で３，４日後に処置される。これらの 動物はｈＣＧの注射の後連続２日間人工受精（ＡＩ）により繁殖される。 胚コレクションは以下のように行われる。ｈＣＧの最初の注射３日後に、動物 はテラゾール（３ｍｇ／１ｂ．）、ロンパン（２ｍｇ／１ｂ．）およびアトロビ ン（１ｍｇ／１ｂ．）の筋肉注射で麻酔される。正中線開腹が行われ生殖道が一 次体外へ露出される。接合体のコレクションは卵管の膨大部にカニューレ挿入し 卵管を前もって３９℃にあたためた１０乃至１５ｍｌの食塩加リン酸緩衝液で洗 浄することで行われる。コレクションに続いて供与体動物はＵＳＤＡ（米国農務 省）ガイドライン に従って手術からの回復を用意される。胚コレクションを２回行われた動物は、 ＵＳＤＡガイドラインに従って安楽死させられる。 接合体前核への遺伝子導入ＤＮＡの注射は、以下のように行われる。接合体は １０％のウシ胎児血清を補足したハムＦ１２培地で３８℃、５％の炭酸ガス雰囲 気で維持される。注射に際しては接合体はＨＥＰＥＳ塩を含む修飾ＢＭＯＣ−２ 培地に入れられ（エバート他、１９８４年、ジャーナル・オブ・エンブリオロジ カル・エクペリメント・アンド・モルフォロジー、８４巻、９１−１０３ページ ）、胚脂質を分離して前核を視覚化するため１３，０００×ｇで遠心分離される 。胚は軽パラフィン油でおおわれた同じ培地を含む注射チャンバ（陥凹スライド ）に置かれる。顕微注射はノマルスキー光学器械とナリシゲ顕微操作装置を備え たニコン・ダイヤホット逆転顕微鏡で行われる。４０倍率のレンズパワーを用い て胚は支持ピペットを持つ場所に置かれ、導入遺伝子（２ｇ／ｍｌ）を含むＤＮ Ａ溶液を裏込めされるガラス針で注射される。導入遺伝子約５００コピーに等し い約２ピコリットルの溶液（ＤＮＡ４フェムトグラム）の注射が約５０％の前核 膨張によってモニターされる。注射される胚は受容体動物に移転される前に恒温 器に置かれる。 受容体動物は供与体動物と同じように準備されるが過剰排卵はされない。注射 胚の移転の前に、受容体若雌ブタは麻酔され、腹部は外科的に縦方向切開で開か れ卵巣は一時露出される。数多くの黄体をともなう卵巣の同側にある卵管は洗い 流さ れ、動物が生殖的に健康であるかどうかを評価するため胚が検査される。遺伝子 導入で注射された約４乃至６個の接合体は洗われた卵管に移され、腹部切開は縫 合され、動物は回復のためあたたかい場所に置かれる。妊娠の状態が超音波によ り２５日から開始してモニターされ、あるいは移植の予想される約１週か後から モニターされる。妊娠受容体は子を生むまで別の所に入れられる。 新生子ブタは遺伝子導入の染色体への組込みを分析される。ゲノムＤＮＡは耳 穿孔あるいは血液サンプルから抽出され、最初の選別はＰＣＲを用いて行われる 。潜在的に遺伝子導入陽性の動物はサザン分析で確認される。遺伝子導入創始動 物は更に発現の水準、表現型および生殖細胞系伝達を含む分析を受ける。内皮細 胞を含む選択的組織のＲＮＡからのノーザン分析は遺伝子導入発現の水準を決定 するために行われる。またヒト血清からの抗体結合に関する流動細胞光度測定分 析およびヒト天然抗体により認識されるブタ細胞の補体仲介細胞溶解を含む免疫 検定は遺伝子導入効果を評価するために行われた。前記の基準を満足する動物は 遺伝子導入系の繁殖にとっての創始者として使用される。もし創始遺伝子導入動 物が必要条件の一部を満足するのに過ぎないならば、遺伝子導入子孫の繁殖およ び特異的交配は同型接合体動物における遺伝子導入効果を検定するために行われ る。 実施例６ ブタ胚幹細胞を使用する同種組換えによるα（１，３）ガラク トシルトランスフェラーゼ無効突然変異体とされたブタ ブタの同種組換えによる遺伝子標的化は、以下のものを含むいくつかの成分を 必要とする。（Ａ）陽性／陰性薬物選択マーカー遺伝子を含む突然変異遺伝子標 的化構築物（タビュレビッチ他、１９９１年、細胞、６５巻、１１５３ページ） ；（Ｂ）胚幹細胞培養、および、（Ｃ）培養細胞から動物を再構築する実験的発 生学、がそれである。 標的構築物は大抵のα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子にま たがるゲノムクローンから誘導され、ミニチャーブタの主要組織適合遺伝子複合 体（ＭＨＣ）ハプロタイプｄ／ｄから得られる同質遺伝子型ＤＮＡより作られる ライブラリーから分離される。このゲノムクローンの断片は、胚幹（ＥＳ）細胞 を標的化する遺伝子として特異的に成長した陽性／陰性選択マーカーカセットに 導入され、ｐＰＮＴと名付けられる（タビュレビッツ他、１９９１年、細胞、６ ５巻、１１５３ページ）。この遺伝子標的カセットは陽性の選択マーカーとして 細菌性ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ネオ）を含み、これはＧ ４１８で細胞の選択を可能にする。ネオ遺伝子は、ホスホグリセレートキナーゼ プロモーター−１（ＰＧＫ−１）のようなＥＳ細胞での高水準での発現を保証す る一つのプロモーターにより調節される。陰性選択は単純性ヘルペスウイルスチ ミジンキナーゼ（ＨＳｖ−ｔｋ）遺伝子の発現により達成することができ、これ はガンシクロビル内で細胞の選択的殺害を可能にする。ネオ遺伝子と同じように 、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子はＰＧＫ−１プロモーターにより調節 される。標的カセットｐＰＮＴにおいて、ネオおよびＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の間に ユニークで便利なクローニング部位があり、これは翻訳開始シグナルＡＵＧの上 流にあるα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノム断片を導 入するのに適切な部位（例えばイントロン２および４にあるＳａｌＩ部位）であ る。この約２キロベースのＤＮＡ断片は、α（１，３）ガラクトシルトランスフ ェラーゼ遺伝子座で切形あるいは残査ペプチドが生成されないように確実にする ためにＰＧＫ−ネオカセットの転写方向に逆の配向でクローンされる。エキソン ４の下流にあるα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座のゲノム 配列、約５キロベースがネオ遺伝子の５′末端でｐＰＮＴに導入される。ｐＰＮ Ｔ−アルファＧＴ１と名付けられたこの標的構築は線状化され、電気穿孔法によ りブタＥＳ細胞に形質移入される。Ｇ４１８（１５０乃至３００μｇ／ｍｌ）お よびガンシクロビルの二重選択は、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラー ゼ遺伝子座でＥＳ細胞のクローンを標的突然変異でまずクローンを分離すること で行われる。相同性組換えクローンの確認はサザン分析で行われる。 α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座の１個の対立遺伝子に ついて標的突然変異誘発を受けるＥＳ細胞クローンは試験管内で突然変異誘発の 第２ラウンドを受けるか、もしくは突然変異を含む動物の再形成に使用される。 試験管内での突然変異誘発の第２ラウンドはヒグロマイシンホスホトランスフェ ラーゼｈｙｇを陽性選択マーカー遺伝子として使用し 相似性標的構築を使って行うことができる。 動物の再形成に関する限りは、この方法は核移転、胚盤胞注射あるいは桑実胚 凝集を含む。望ましいルートは、供与体細胞と受容体胚の間にキメラを産み出す 胚盤胞注射あるいは桑実胚凝集のいずれかを含む。これら両方の方法に関して、 胚は以下のように用意される。胚供与体／受容体若雌ブタは実施例５に記述され るように同調されつがわされる。人工受精あるいは天然のつがいの６日後に、若 雌ブタは前記の通り外科手術の準備をされ、麻酔され、（３８℃で）前もってあ たためられた食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて子宮を逆流洗浄される。透 明帯で被包された胚盤胞はＨＥＰＥＳ緩衝培地（ホウィッテンもしくはＴＬ−Ｈ ＥＰＥＳ）を含む陥凹スライドに置かれ、約１５乃至２０個のＥＳ細胞がガラス 注射針と２０μｍの開口部とナリシゲ顕微操作装置を使って胞胚腔に注射される 。注射された胚は次いで出産までの成長のために受容体養母若雌ブタに注射され 、妊娠は超音波を用いてモニターされる。子孫は、血液、皮膚および組織生検材 料ならびにネオおよびｈｙｇ遺伝子に対する相補性プライマーから抽出されるＤ ＮＡサンプルのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてキメラ現象を分析され る。キメラの生殖細胞系伝達はＰＣＲを用いて検定され、組織サンプルの原位置 ハイブリット形成は雄性および雌性生殖腺から得る。ＥＳ細胞遺伝子型を生殖細 胞系に伝達する雄性および雌性キメラは同型接合体突然変異体動物を産出するた めに交配される。α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼの発現およびヒ ト天然抗体のこれら動物の内皮細胞への結合に関する 突然変異体動物の分析は、ブタにおける遺伝子ノックアウトアプローチの有効性 を評価するために最終検査として使用される。 実施例７ 接合体を標的とする同質遺伝子型ＤＮＡを用いるα（１，３）ガラクトシルトラ ンスフェラーゼの無効突然変異体に作られたブタ 同質遺伝子型ＤＮＡあるいは標的ベクターおよび染色体内の標的ＤＮＡとの間 にある配列と事実上同一のＤＮＡは、相同性組換え事象の頻度および従って遺伝 子標的化効率を大きく増加させる。同質遺伝子型ＤＮＡ標的ベクターを使って８ ０％もしくはそれ以上の標的化頻度がマウス胚幹細胞で達成される。対照的に、 非同質遺伝子型ＤＮＡベクターは通常約０．５％乃至５％の標的化頻度で産出し 、その大きさの度合は同質遺伝子型ＤＮＡベクターより約２桁小さい。驚くべき ことに、同質遺伝子型ＤＮＡ構築物はランダム組込みより相同性組換えにより染 色体に優勢に組込まれる。その結果遺伝子の標的突然変異誘発は、従って精密な 選択実験記録にもとづかない動物および接合体をも含む生物体システム内で行う ことができる。 遺伝子標的化アプローチにおける同質遺伝子型ＤＮＡの重要性は、テリール他 、全米科学アカデミー紀要、８９巻、５１２８−５１３２ページ（１９９２年） およびまたＰＣＴ／ＵＳ９２／０７１８４ではじめて説明された。 同質遺伝子型アプローチを実行可能にするためには、標的化ベクターは標的と される生体のＤＮＡと同一であるＤＮＡ源か ら構築されなければならない。理想的には、同質遺伝子型ＤＮＡはすべての遺伝 子座が同型接合体である動物の近交系で行われる。この近交系のすべての動物は 従って同質遺伝子型標的化ベクターの源泉として役立つことができる。近交系の 動物が欠除する場合には、遺伝子座は数多くの異なった対立遺伝子で構成され得 る。かくして同質遺伝子型ベクターは標的化遺伝子置換が試みられる個別のもの から誘導され得る。更に標的化ベクターは１個の対立遺伝子のみに対し同質遺伝 子型である。 ハプロタイプ特異的ミニチャーブタの場合、同質遺伝子型遺伝子標的化ベク ターは容易にＭＨＣ遺伝子座から誘導される。その理由はゲノム領域がいくつか の世代にわたり同型接合子で維持されるからである。α（１，３）ガラクトシル トランスフェラーゼ遺伝子座に対するｃＤＮＡ配列が決定されており（実施例１ ）、またゲノムクローンも最近生成されたので、今や遺伝子を染色体上に位置づ ける（遺伝地図化ｍａｐする）ことが可能になり、それによりα（１，３）ガラ クトシルトランスフェラーゼ遺伝子座遺伝子内で多形現象を避けることができる 。 多形現象の遺伝地図化は以下の通り行われる。密接に関連するミニブタのグル ープで姉妹細胞、および／もしくは親／子孫のいずれであるかが識別される。高 分子量のＤＮＡが抽出され、ＰＣＲ反応がエキソン６からエキソン７更にイント ロン６にわたる配列を増幅するために設計される。ブタ遺伝子のエキソン５から ９までの体制はマウス遺伝子のそれと相同であ ることが知られている（図４、ジョジアス、Ｄ．Ｈ．，シェイパー，Ｎ．Ｌ．， キム，Ｄ．，バン・デン・アイヒンデン，Ｄ．およびジョエル・Ｈ・シェイパー ，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、１６７巻、５５３４−５ ５４１ページ（１９９２年））。図４でマウスα（１，３）ガラクトシルトラン スフェラーゼ遺伝子エキソンのゲノム体制は１−９で標識され、立体ボックス型 で示される。イントロン配列は細い線で表される。エキソン６の５′オリゴは下 記の配列：5′-TCC GAG CTG GTT TAA CAA TGG GTA-3′（配列識別番号２５）を 含み、またエキソン７にある３′オリゴは下記の配列：5′-TCT TCG TGG TAA CT G TGA GTC CTA-3′（配列識別番号２６）を含む。ＰＣＲ断片は約１および２キ ロベース長である。ＰＣＲ−ＲＦＬＰを検定するために４個カッターを使用する 制限消化がしばしば切断されることを予期して行われる。このような４個カッタ ーは、BstU I(ＣＧＣＧ)、Hae III(ＧＧＣＣ)、Hha I(ＧＣＧＣ)、Sau3A(ＧＡＴ Ｃ)、Rsa Ｉ(ＧＴＡＣ)およびTaq I(ＴＣＧＡ)を含み、これらは工業的にニュー イングランド・バイオラブ（マサチューセッツ、ビバリー）から利用可能である 。親動物および子孫、同じく姉妹細胞の間からも得られる制限断片のパターンに もとづき、動物のグループに存在する異なった対立遺伝子数を決定することは可 能である。ＰＣＲ−ＲＦＬＰが異なった動物にある異なった対立遺伝子の間で明 らかな配列多形現象を産み出さない場合には、Ｔ７あるいはＴ４リゾルベースを 用いるＤＮＡ配列化あるいは酵素誤対合切断（ＥＭＣ）を含む代替的方法を採用 する ことができる。追加の動物が次いでα（１，３）ガラクトシルトランスフェラー ゼ遺伝子座で特異的対立遺伝子を識別するために同じような方法で分析される。 一度いくつかの対立遺伝子が識別されると、標的化構築は接合体注射のために選 択されたミニブタ系にもっとも豊富に存在するこれら対立遺伝子に対して準備さ れる。 遺伝子標的化構築は以下のように生成される。一つのゲノムライブラリーは、 ラムダＦＩＸ ＩＩ、ラムダＥＭＢＬ４あるいはラムダダッシュＩＩ（ストラー タジェン・クローニング・システム）を含むラムダ置換ベクター内で作られる。 このライブラリーは次いで約５０，０００プラーク／１５ｃｍプレートの濃度に プレートされ、ブタα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のエキ ソン９に特異的なプローブで選別される。プローブはＰＣＲを使って生成され、 これは標準実験記録：３５サイクル、６０℃で２０秒のアニール、７２℃で４０ 秒の拡張、および９４℃で２０秒の変性を使用して行われる。挿入断片の大きさ が約１５キロベースの陽性クローンは次いでｐＳＰ７２を含むプラスミドベクタ ーにサブクローンされ、挿入ベクターあるいは置換ベクターのいずれかとして標 的化のため操作される。 挿入ベクターはヘイスティおよびブラッドレーが説明したように設計される（ 哺乳類細胞に対する遺伝子標的化、遺伝子標的化：現実的アプローチ、アレクサ ンドラ・Ｌ・ジョイナー編、ＩＲＬプレス、１９９３年）。挿入ベクターは相同 性組換えにより天然遺伝子座への組込みを生じるためには１回だけの 交差（乗換え）を必要とする。ベクターの２個の末端が組換え遺伝子的であるこ とで知られる二本鎖切断は染色体の隣接配列に位置している。望ましくは挿入ベ クターの組込み部位はα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のイ ントロン８の開始部分にある。従ってイントロン８の全長は最小数の誤対合を選 ぶ相同性および同一の配列として含まれる。酵素の触媒領域をコード化するエキ ソン９はネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、あるいはＩＲＥＳ β ゼオと名付けられたその誘導体などの選択マーカーにより置換される。イントロ ン７からの下流、つまり選択マーカーの３′配列にはエキソン８およびイントロ ン８が含まれ、ベクターの開始に隣接する部位で終結する。この構築物の標的化 頻度は３０乃至５０％の範囲にある。これらすべての構築物は標準のクローニン グ手順で作られる。 置換ベクターについては更にヘイスティおよびブラッドレーの前掲同書に広範 に説明されている。挿入ベクターよりも概念的により直接的に、ここで発せられ る置換ベクターはα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座でのゲ ノム配列のある伸長を持つ基本的には共直線性断片である。望ましくは、同質遺 伝子型置換ベクターが構築されるＤＮＡ配列は約６乃至１０キロベースの連続性 ＤＮＡを含む。このＤＮＡはミニブタから得たα（１，３）ガラクトシルトラン スフェラーゼ遺伝子座のある対立遺伝子のエキソン４の開始およびイントロン８ の末端の間の領域に一致する。触媒領域をコード化するエキソン９は選択マーカ ー遺伝子、例えばネオ遺伝子、あ るいはその機能的類似体で置換される。置換ベクターの３′末端は、約１キロベ ースの同質遺伝子型ＤＮＡを含むエキソン９にある３′未翻訳領域を含む。選択 マーカーのどちらかの側の一つにある２個の交差は突然変異体標的化ベクターを 組込ませ野生型遺伝子を置換する。 特にミニブタの接合体段階（１細胞胚）においてブタ胚の前核の一つに同質遺 伝子型遺伝子導入ＤＮＡを顕微注射することについては、前に説明された実験記 録の修飾によってこれを達成することができる（ハマー他、１９８５年、ネイチ ャー、３１５巻、６８０ページ；パーセル他、１９８９年、サイエンス、２４４ 巻、１２８１ページ）。最適には、ミニブタは８乃至１０ケ月のもので重さ７０ 乃至８５ポンドである。これは１細胞胚供与体の適切な供給を得る確率を拡大さ せる。若雌ブタは合成黄体ホルモン（レギュメート）の調製を用いて同調される 。ホルモンの移植は胚コレクションの日の３０日前に指定若雌ブタに適用される 。その２０日後、つまりコレクションの１０日前に移植片は除去され、動物は過 剰排卵を誘発するために、つまり顕微注射のための胚の数を増やすために追加の ホルモンで処理される。移植片除去の３日後に動物は４００乃至１０００ＩＵの 妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）で、またその３，４日後に７５０ＩＵのヒ ト繊手性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）で処理される。これらの動物はｈＣＧ注射の 後２日連続して人工受精で繁殖される。 胚のコレクションは次のように行われる。ｈＣＧ注射の３日後、動物はテラゾ ール（３ｍｇ／１ｂ）、ロンパン（２ｍｇ／ １ｂ）およびアトロピン（１ｍｇ／１ｂ）の筋肉内注射で麻酔される。正中線開 腹が行われ、生殖道は一時対外へ露出される。接合体のコレクションは卵管の膨 大部にカニューレ挿入し卵管を前もって３９℃にあたためた１０乃至１５ｍｌの 食塩加リン酸緩衝液で洗浄することで行われる。コレクションに続いて供与体動 物はＵＳＤＡガイドラインに従って手術からの回復を用意される。胚コレクショ ンを２回行われた動物は、ＵＳＤＡガイドラインに従って安楽死させられる。 接合体前核への遺伝子導入ＤＮＡの注射は以下のように行われる。接合体は１ ０％のウシ胎児血清を補足したハムＦ１２培地で３８℃、５％の炭酸ガス雰囲気 で維持される。注射に際して接合体はＢＭＯＣ培地に入れられ、胚脂質を分離し て前核を視覚化するため１３，０００ｇで遠心チャンバ（陥凹スライド）に置か れる。顕微注射はノマルスキー光学器械とナリシゲ顕微操作装置を備えたニコン ダイヤホット逆転顕微鏡で行われる。４０倍率のレンズパワーを用いて胚は支持 ピペットを持つ場所に置かれ、導入遺伝子（２ｍｇ／ｍｌ）を含むＤＮＡ溶液を 裏込めされるガラス針で注射される。導入遺伝子約５００コピーに等しい約２ピ コリットルの溶液（ＤＮＡ４フェムトグラム）の注射が約５０％の前核膨張によ ってモニターされる。注射される胚は受容体動物に移転される前に恒温器に置か れる。 受容体動物は供与体動物と同じように準備されるが過剰排卵はされない。注射 胚の移転の前に、受容体若雌ブタは麻酔され、腹部は外科的に縦方向切開で開か れ卵巣は一時露出され る。数多くの黄体をともなう卵巣の同側にある卵管は洗い流され、動物が生殖的 に健康であるかどうかを評価するため検査される。遺伝子導入で注射された約４ 乃至６個の接合体は洗われた卵管に移され、腹部切開は縫合され、動物は回復の ためあたたかい場所に置かれる。妊娠の状態が超音波により２５日から開始して モニターされ、あるいは移植の予想される約１週間後からモニターされる。妊娠 受容体は子を生むまで別の所に入れられる。 新生子ブタは遺伝子導入の染色体への組込みを分析される。ゲノムＤＮＡは耳 穿孔あるいは血液サンプルから抽出され、最初の選別はＰＣＲを用いて行われる 。潜在的に遺伝子導入陽性の動物はサザン分析で確認される。遺伝子導入創始動 物はサザン分析を用いて遺伝子導入組込みの遺伝子座に関し、更に分析を受ける 。天然α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座に対して遺伝子導 入標的化する、すなわちその遺伝子に対して異型接合体突然変異体であるこれら の動物は成長し繁殖して追加の異型接合体突然変異体創始動物となる。メンデル 遺伝学を応用することで、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼに対し 同型接合体突然変異体である動物を繁殖させることが可能になる。レクチン１４ およびヒト前形成天然抗体を使った機能的検定は、次いでブタ細胞に関するＧａ ｌα（１，３）Ｇａｌエピトープの発現を考察し、α（１，３）ガラクトシルト ランスフェラーゼ遺伝子を確認するために使用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 インスティチュート オブ チャイルド ヘルス 英国，ダブリュシー１エヌ １イーエイチ ロンドン，ギルフォード ストリート 30，ザ ユニバーシティ オブ ロンドン (72)発明者 ベッチャー，マンフレッド，ダブリュ. アメリカ合衆国，01890 マサチューセッ ツ，ウインチェスター，ポンド ストリー ト 195 (72)発明者 サックス，ディビッド，エイチ. アメリカ合衆国，02216 マサチューセッ ツ，ニュートン，ステューディオ ロード 77 (72)発明者 グスタフソン，ケント，ティー 英国，エイチピー７ ９エイチアール バ ッキンガムシャー，エイマシャム，スタン レー ヒル ４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼの正常な発現が少なくとも組 織の型の一つの器官において妨げられる一つの遺伝子導入ブタ。 ２．請求の範囲第１項記載の遺伝子導入ブタであり、前記ブタα（１，３）ガ ラクトシルトランスフェラーゼをコード化するｍＲＮＡと結合しその翻訳を妨げ る一つの核酸配列を生産することを特徴とする遺伝子導入ブタ。 ３．請求の範囲第２項記載の遺伝子導入ブタであり、そのためにプロモーター に操作可能に結合される機能的酵素を妨げあるいは発現するの必要なα（１，３ ）ガラクトシルトランスフェラーゼコード化領域のその部分にアンチセンスＲＮ Ａをコード化するＤＮＡよりなる一つの構築物を含むようにブタのゲノムが修飾 されたことを特徴とする遺伝子導入ブタ。 ４．請求の範囲第３項記載の遺伝子導入ブタであって、ここでプロモーターが 強力で非組織特異的構築あるいは調節可能プロモーターであることを特徴とする 遺伝子導入ブタ。 ５．請求の範囲第３項記載の遺伝子導入ブタであって、ここでプロモーターが 強力で組織特異的構築あるいは調節可能プロモーターであることを特徴とする遺 伝導入ブタ。 ６．リボザイムを生産するように作られたことを特徴とする請求の範囲第１項 記載の遺伝子導入ブタ。 ７．請求の範囲第６項記載の遺伝子導入ブタであり、それがプロモーターに操 作可能に結合されるα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼを不活性化す るのに必要な少なくともリ ボザイムのその部分をコード化するＤＮＡよりなる構築物を含むように修飾され たことを特徴とする遺伝子導入ブタ。 ８．請求の範囲第７項記載の遺伝子導入ブタであって、ここでプロモーターが 強力で被組織特異的構成あるいは調節可能プロモーターであることを特徴とする 遺伝子導入ブタ。 ９．請求の範囲第７項記載の遺伝子導入ブタであって、ここでプロモーターが 強力で組織特異的構成あるいは調節可能プロモーターであることを特徴とする遺 伝導入ブタ。 １０．ブタ卵母細胞から成長するα（１，３）ガラクトシルトランスフェラー ゼフェらーゼ陰性ブタであり、その前核物質が除去されα（１，３）ガラクトシ ルトランスフェラーゼの発現に陰性である多能性ブタ胚幹細胞を導入されたα（ １，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ陰性ブタ。 １１．配列識別番号１および１３から２４よりなるグループから選択される配 列を持つ一つの核酸。 １２．配列識別番号１で説明された配列を持つことを特徴とする請求項第１１ 項記載の核酸。 １３．請求の範囲第１１項記載の核酸であって、ここで配列識別番号が配列識 別番号１３から１５よりなるグループから選択されることを特徴とする核酸。 １４．請求の範囲第１１項記載の核酸であって、ここで配列識別番号が配列識 別番号１６から２１よりなるグループから選択されることを特徴とする核酸。 １５．請求の範囲第１１項記載の核酸であって、ここで配列識別番号が配列識 別番号２２から２４よりなるグループから選 択されることを特徴とする核酸。 １６．請求の範囲第１項記載の遺伝子導入ブタであって、ここでβ（１，３） ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の正常な発現が同一遺伝子型ＤＮＡ含有 標的化ベクターの前記ブタへの導入により妨げられることを特徴とする遺伝子導 入ブタ。 １７．ブタ接合体から成長する請求の範囲第１６項記載のα（１，３）ガラク トシルトランスフェラーゼ陰性ブタであり、それはα（１，３）ガラクトシルト ランスフェラーゼ染色体遺伝子座において同質遺伝子型ＤＮＡ標的化ベクターを 用いて相同性組換えにより修飾されたことを特徴とするα（１，３）ガラクトシ ルトランスフェラーゼ陰性ブタ。 １８．請求の範囲第１７項記載のα（１，３）ガラクトシルトランスフェラー ゼ陰性ブタであって、ここで同一遺伝子型ＤＮＡ標的化ベクターが少なくとも約 ６キロベースの同質遺伝子型ＤＮＡおよび無プロモーター選択マーカー遺伝子よ りなることを特徴とするα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ陰性ブタ 。