JP2005514016A - ノックアウトブタ及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
この発明は、α(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウトブタを含む生存力のあるノックアウトブタ及びかかるブタの製造方法を提供する。この発明は又、例えば、異種移植において有用であるかかるブタから得られる臓器、組織及び細胞をも提供する。
図1.pGalGTターゲティングベクター及びターゲティングのためのゲノムのPCRアッセイ。α(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼ(GGTA1)遺伝子座の領域(エキソン7から始まる)の構造を描写している(目盛りは、キロ塩基対)。pGalGTベクター中のGGTA1相同配列は、エキソン7の約0.8kb下流から始まって、エキソン9の最後から約6.8kb下流まで続いている。Bip内部リボソームエントリー部位、APRTコード配列(G418耐性をコード)及び隣接する停止コドンよりなる選択用カセットが、エキソン9内のGGTA1触媒性ドメインの上流のEcoRV部位に挿入されている。ターゲティングは、2つのPCRアッセイ(各々は、ベクターの相同領域の外側の一つのプライマーを含む)を利用して評価される。上流のゲノム構造は、プライマーF238(エキソン7、pGalGTベクターの5’末端の上流)及びR823(エキソン9、選択用カセット挿入部位の下流)を利用することにより評価される。EcoRIでの消化に際して、2.0kb(WT遺伝子座)、3.1kb(標的の遺伝子座)及び10.4kb(何れかの遺伝子座)の断片が生成される。下流のゲノム構造は、プライマーF527(選択用カセット挿入部位の上流のエキソン9)及びGR2520(pGalGTベクターの3’末端の下流)を利用することにより評価される。SacIでの消化に際して、1.2kb(WT遺伝子座)、2.3kb(標的の遺伝子座)及び8.1kb(何れかの遺伝子座)の断片が生成される。ブタのGGTA1ポリペプチドは、SEQ ID NO:1にて表され、SEQ ID NO:1をコードするポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:2として与えられる(米国特許第6,413,769号参照)。
図2.NTにより得られる小さいブタ、親のミニブタの胎児細胞株F3及びF7、並びに代理母雌ブタ(SUR)のターゲティング分析。これらのアッセイの図式表示については、図1を参照されたい。パネルA、プライマーF238及びR823を利用した上流のゲノムのPCR分析。パネルB,プライマーF527及びGR2520を利用した下流のゲノムのPCR分析。トランスファー後に、消化された反応物を、選択用カセットのIRES部分からのオリゴヌクレオチド(Bip419)を利用してプローブ検出した。すべての子孫の分析は、O230−2を除いて、一つのGGTA1アレルでの置換型ターゲティング事象と一致している。
図3.小さいブタO230−1の写真(10日齢で撮影)。
ここで引用した特許及び刊行物は、参考として、そっくりそのまま本明細書中に援用する。これらの特許及び刊行物並びにこの明細書の間での不一致は、後者に賛成することで解決する。
ノックアウト一次胎児ブタ細胞の製造
高度に同系交配の、MHCの規定されたミニブタ系統、異種移植研究に長期間利用されてきた子孫を利用した(参照、D.H.Sachs等、Transplantation 22, 559 (1976))。この系統は、臨床的異種移植における最終用途にマッチした理想的な大きさであり、ブタの内因性レトロウイルス(PERV)のヒト細胞への伝達に関する試験で一貫して陰性の動物を有している。
除核した卵母細胞への核トランスファー
屠殺された未経産雌ブタから得られた卵母細胞を、規定されたタンパク質培地(0.1%PVA 0.1mg/ml システイン、10ng/mlEGF、0.91mM Na−ピルベート、3.05mM D−グルコース、0.5μg/ml FSH、0.5μg/ml LH、75μg/ml ペニシリン、50μg/mlストレプトマイシンを補ったTCM 199)で成熟させた。経産雌ブタの卵巣に由来する卵母細胞をBioMed, Inc.(ウィスコンシン、Madison在)から購入して、成熟用培地(5μg/mlインシュリン、10ng/ml EGF、0.6mM システイン、0.2mM Na−ピルベート、3μg/ml FSH 25ng/ml ゲンタマイシン及び10% ブタ卵胞液を補ったTCM 199−Hepes)に一晩入れた。ブタの卵胞液は、直径3〜6mmの卵胞から集めて、4℃で1500×gで30分間遠心分離し、1.2μmシリンジを通して濾過して、使用するまで−20℃に貯蔵した。核トランスファーを、イン・ビトロで成熟した卵母細胞を利用して行なった(但し、表2に示した4つのトランスファーは、低温保存したドナー細胞であって更なる培養はしなかった)。42〜44時間の成熟後に、卵母細胞をヒアルロニダーゼの存在下での激しいピペッティングによって集積から自由にした。完全な原形質膜を有する卵母細胞を選択して、使用するまで4mg/ml BSAを補ったTCM 199中に維持した。中期IIの卵母細胞の除核を、7.5μg/mlサイトカラシンBを補った培地中で行なったが、クロマチンの染色は、その後の発生に有害でありうるので行なわなかった。低温保存したドナー細胞を37℃で解凍し、10容のFCSを加えた。この懸濁液を室温に30分間維持した。その後、4容のTCM/BSAを加えて、それらの細胞を、500gで5分間ペレット化した。繊維芽細胞を15〜20μlの培地に再懸濁して、直ちにNTのために使用した。4匹の代理母(O230、O203、O291及びO221)にトランスファーされたNTにより得られる胎児については、それらの細胞を1週間上記のように培養した後に、核トランスファーに使用する前に、一晩、0.5% 血清を含む培地中で培養した。標的細胞の限られた数が如何なる選択をも許さなかったので、完全な膜を有するすべての細胞を使用した。単一細胞を卵黄周囲腔に、除核に使用したのと同じピペットを用いてトランスファーした。融合及び活性化のために、細胞質体−繊維芽細胞複合体を2つの電極(1mm間隔)の間に置き、融合用培地(0.3M マンニトール、1mM CaCl2、0.1mM MgCl2、0.5mM Hepes)を上に重ねて、手作業で整列させた。融合及び活性化を、BTXオプティマイザー(Biotechnology and Experimental Research, カリフォルニア、San Diego在)により測定して30μ秒間1.2kV/cmのパルスを2回加えることによって同時に達成した。胎児を更に30〜60分間TCM/BSA中に維持してから、融合率を評価した。融合した胎児を、4mg/mlBSAを補って、鉱油を上に重ねた500μlのNCSU23(Petters及びWells, J.Reprod.Fert.補遺48:61-73 1993参照)中で培養した。生存胎児(完全な原形質膜)を、18〜22時間の培養の後に、代理母へのトランスファーのために選択した。
NTにより得られる胎児の交配した代理母へのトランスファー
潜在的な代理母を、1日に2回、発情を調べた。発情の正確な時間によって、NTにより得られる胎児のトランスファーを、0日目及び1日目の代理母について、それぞれ、発情の実際の開始から5〜17時間又は20〜36時間後に行なった。受精後22時間培養してから1日目の代理母にトランスファーされたイン・ビトロで生成された胎児を利用した前の制御実験において、6日目に回収された100匹の胎児の内の19匹は、胚盤胞ステージであって、平均核数65を有した。外科手術のために、未経産雌ブタをペントサル(登録商標)(Abbott Laboratories, イリノイ、North Chicago在)で予備麻酔し、麻酔を、2%ハロタン(Halocarbon Laboratories, ニュージャージー、River Edge在)で維持した。腹中線開腹術を行ない、胎児をトムキャットカテーテル内に入れて、卵管内に挿入した。ベナミン(フルニキシンメグルミン、1.5ml IM)を、この外科手術中に、代理母に投与した。胎児トランスファー中の卵層の検査は、何れの代理母も排卵を完了しなかったことを確認した。
NTにより得られる胎児の交配してない代理母へのトランスファー
NTにより得られる胎児のみの未交配代理母への20の更なるトランスファーを行なった。これらの代理母の内の6匹において、妊娠を超音波により確認した。2匹の生きた仔ブタが代理母O230から産まれ、その内の一匹(O230−2)は、呼吸障害症候群のため、産後間もなく死亡した。4匹の生きた仔ブタが代理母O226から産まれ、一匹(O226−4)は、産後間もなく呼吸障害症候群により死亡した。
仔ブタのマイクロサテライト分析及びゲノムターゲティング分析
全部で28匹の胎児のトランスファーを行なった。マイクロサテライト反応を、USDAにより親切に提供された蛍光プライマー(U.S. Pig Genome Coordination Projectが支持)を利用して増幅して、Lark Technologies, Inc(テキサス、Houston在)により分析した。マイクロサテライト分析は、一匹の雌の仔ブタ(O212−2)につき、6つのハプロタイプの内の6つが、ノックアウトドナー株F7−H6が得られたF7胎児細胞株のそれと同じであることを明らかにした(表3)。その上、O212−2の6つのハプロタイプの内の3つは、代理母の交配と適合しなかった。他のすべての仔ブタは、F7株と少なくとも4つのハプロタイプマッチを有し、代理母の交配と適合した。
ノックアウト仔ブタの健康評価
NTにより得られる仔ブタの健康状態の概要を表4に与える。分娩直後の期間を超えて生き残った5匹の仔ブタの内の4匹は、ミニブタの正常な成長速度で健康を維持した。5匹目のO226−3は、17日齢で、日常的採血中に突然死亡した。検死は、右心室の拡張と心臓壁の肥厚を示した。この所見及びO230−1における軽度の腹部膨満の発生に基づいて、残りの4匹のブタは、ドップラー心臓エコー検査法による心臓検査を受けた。仔ブタO212−2及びO226−1については、特別の所見はなかった。O226−2は、三尖弁の中央で低速の逆流を示した(これは、取るに足らないものでありうる)。しかしながら、中位の肺高血圧を伴う拡大した肺動脈がO230−1で注目された。X線撮影法は又、心臓の右側の拡大をも示した。この動物は活動的であり且つ何の苦痛の徴候も示していないが、長期の見通しは、疑わしい。
生きたGGTA1ノックアウトブタの製造
5匹の異なるノックアウト雄細胞株を核トランスファーに利用し(イン・ビトロ成熟させた経産雌ブタ卵母細胞をレシピエント細胞として)、その結果生成した胎児を14匹の異なる代理母にトランスファーした。9匹の代理母が、超音波で測定して、妊娠を確立した。一匹の妊娠は、31日目に終了し、7匹の胎児が、回収された(3匹は正常であり、4匹は、縮退していた)。6匹の妊娠は、41日目までに消失した。一匹の代理母(#O098)から、生存力のある雄の仔ブタが回収された。死産の雄の仔ブタが、同じ代理母から回収された。更なる仔ブタが、7/12/02に#O100からの回収後短時間で死亡した。生きた雄の仔ブタは、予想されたように変化したGGTA1遺伝子を有することが確認され、これは、健康な動物である。
Claims (40)
- 野生型α(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子と比較して破壊されたα(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むノックアウトブタであって、該ノックアウトブタにおける機能的α(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼの発現が野生型ブタと比較して低下している当該ノックアウトブタ。
- 野生型α(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、SEQ ID NO:1に対する少なくとも90%のアミノ酸同一性を有するα(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする、請求項1に記載のブタ。
- 野生型α(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、SEQ ID NO:1に対する少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するα(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする、請求項1〜2の何れか一つに記載のブタ。
- 野生型α(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、SEQ ID NO:1をコードする、請求項1〜3の何れか一つに記載のブタ。
- 野生型α(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、SEQ ID NO:2を含む、請求項1〜4の何れか一つに記載のブタ。
- 少なくとも幾つかの細胞の表面で、野生型ブタと比較して、減少した量のα(1,3)−ガラクトシルエピトープを有する、請求項1〜5の何れか一つに記載のブタ。
- 野生型α(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子と比較して破壊されたα(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むブタの臓器であって、該臓器における機能的α(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼの発現が野生型臓器と比較して低下している当該臓器。
- 野生型α(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、SEQ ID NO:1に対する少なくとも90%のアミノ酸同一性を有するα(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする、請求項7に記載の臓器。
- 野生型α(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、SEQ ID NO:1に対する少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するα(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする、請求項7〜8の何れか一つに記載の臓器。
- 野生型α(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、SEQ ID NO:1をコードする、請求項7〜9の何れか一つに記載の臓器。
- 野生型α(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、SEQ ID NO:2を含む、請求項7〜10の何れか一つに記載の臓器。
- 臓器を、心臓、肝臓、腎臓、膵臓、肺、甲状腺及び皮膚よりなる群から選択する、請求項7〜11の何れか一つに記載の臓器。
- 少なくとも幾つかの細胞の表面で、野生型臓器由来の細胞と比較して、減少した量のα(1,3)−ガラクトシルエピトープを有する、請求項7〜12の何れか一つに記載の臓器。
- 野生型α(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子と比較して破壊されたα(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むブタの組織であって、該組織における機能的α(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼの発現が野生型組織と比較して低下している当該組織。
- 野生型α(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、SEQ ID NO:1に対する少なくとも90%のアミノ酸同一性を有するα(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする、請求項14に記載の組織。
- 野生型α(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、SEQ ID NO:1に対する少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するα(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする、請求項14〜15の何れか一つに記載の組織。
- 野生型α(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、SEQ ID NO:1をコードする、請求項14〜16の何れか一つに記載の組織。
- 野生型α(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、SEQ ID NO:2を含む、請求項14〜17の何れか一つに記載の組織。
- 少なくとも幾つかの細胞の表面で、野生型臓器由来の細胞と比較して、減少した量のα(1,3)−ガラクトシルエピトープを有する、請求項14〜18の何れか一つに記載の組織。
- トランスジェニックブタ胎児を製造する方法であって、下記を含む当該方法:
(a)卵母細胞を除核し;そして
(b)該卵母細胞を、野生型α(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子と比較して破壊されたα(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むドナーブタ細胞と融合させる。 - ノックアウトブタを製造する方法であって、該方法は、下記:
(a)卵母細胞を除核し;
(b)該卵母細胞を、野生型α(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子と比較して破壊されたα(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むドナーブタ細胞と融合させて胎児を生成し;そして
(c)該胎児を代理母ブタに移植することを含み、該代理母ブタが、発情を開始しているが未だ排卵を完了していない当該方法。 - 野生型α(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、SEQ ID NO:1に対する少なくとも90%のアミノ酸同一性を有するα(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする、請求項20〜21の何れか一つに記載の方法。
- 野生型α(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、SEQ ID NO:1に対する少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するα(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする、請求項20〜22の何れか一つに記載の方法。
- 野生型α(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼが、SEQ ID NO:1を含む、請求項20〜23の何れか一つに記載の方法。
- 野生型α(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、SEQ ID NO:2を含む、請求項20〜24の何れか一つに記載の方法。
- 請求項20又は22〜25の何れか一つに従って製造された胎児。
- 請求項20又は22〜26の何れか一つに記載の胎児から得られた臓器。
- 請求項20又は22〜26の何れか一つに記載の胎児から得られた組織。
- 請求項20又は22〜26の何れか一つに記載の胎児から得られた細胞。
- 請求項21〜25の何れか一つに従って製造されたブタ。
- 請求項21〜25又は30の何れか一つに記載のブタから得られた臓器。
- 請求項21〜25又は30の何れか一つに記載のブタから得られた組織。
- 請求項21〜25又は30の何れか一つに記載のブタから得られた細胞。
- 請求項21〜25又は30の何れか一つに記載のブタの子孫のブタ。
- 請求項21〜25、30又は34の何れか一つに記載のブタから得られた配偶子。
- 精子である、請求項35に記載の配偶子。
- 卵である、請求項35に記載の配偶子。
- 治療において利用するための、請求項7〜13、27又は31の何れか一つに記載の臓器。
- 治療において利用するための、請求項14〜19、28又は32の何れか一つに記載の組織。
- 治療において利用するための、請求項29又は33の何れか一つに記載の細胞。
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