MX2015001299A

MX2015001299A - Produccion de ganado resistente a fmdv mediante sustitucion de alelo.

Info

Publication number: MX2015001299A
Application number: MX2015001299A
Authority: MX
Inventors: Scott C Fahrenkrug; Daniel F Carlson
Original assignee: Recombinetics Inc
Priority date: 2012-07-31
Filing date: 2013-07-19
Publication date: 2015-06-05
Also published as: US20180310536A1; MX366723B; AU2013296901B2; PH12015500213A1; WO2014022120A1; NZ629582A; EP2880153A1; KR20150036792A; AU2013296901A1; RU2015106818A; US10058078B2; JP2015523098A; CN104837989A; EP3540050A1; AR091948A1; EP2880153A4; BR112015002280A2; CL2015000248A1; US20140041066A1; JP6446360B2

Abstract

Células, genes y proteínas que abarcan una proteína o gen elF-4G resistente a proteasa. Un animal vacuno modificado genéticamente que comprende una modificación genómica en un gen elF-4G.

Description

PRODUCCIÓN DE GANADO RESISTENTE A FMDV MEDIANTE SUSTITUCIÓN DE ALELO CAMPO DE LA INVENCIÓN El campo téenico se relaciona con animales modificados genéticamente y con técnicas asociadas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los animales bi-ungulados infectados por el virus de la Fiebre Aftosa (Foot and Mouth Disease Virus, (FMDV)) son incapacitados rápidamente por la enfermedad vesicular aguda. La infección de FMD de vacas y cerdos causa fiebre, ampollas dolorosas, cojera y pérdida del apetito. Como lo sugiere el nombre del agente infeccioso, a menudo ocurren infecciones secundarias de los pies, causando cojera crónica y cicatrización retardada y de manera similar la mastitis puede ser una secuela común en vacas lecheras. La fase aguda de la enfermedad dura por aproximadamente una semana cediendo en la cara o en una respuesta inmunitaria en aumento cuya respuesta de anticuerpo parece ser de particular importancia ya que es muy eficiente en la eliminación del virus del torrente sanguíneo. Puede presentarse mortalidad en animales jóvenes debido a infección del músculo cardiaco que causa falla respiratoria. La enfermedad es tan altamente contagiosa que la infección en un animal individual indica la destrucción y entierro de la piara entera. Por consiguiente, FMDV es considerada por algunos como el patógeno más importante del mundo de animales de granja domesticados. En 2001 un brote de FMD en Gran Bretaña dio como resultado la pérdida total de $12-4 billones (1) y hace más de una década, la University of California Davis estimó que un brote de FMD justamente en California pudiera costar desde $6-14 billones en costos de control y pérdidas de mercadeo debido a restricciones en el movimiento y ventas de animales. Las ventas de leche y otros productos, asi como también carne, deberán ser detenidas y se perderá trabajo de los productores y trabajadores en industrias relacionadas o se reducirán severamente. Los efectos económicos en otros países son proporcionales .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se describen en la presente animales que son resistentes a FMDV. Los animales se pueden elaborar solamente con un cambio mínimo de nucleótido y haciendo el cambio en una localización exacta, sin hacer otros cambios en el genoma de los animales.

Una modalidad de la invención es un animal modificado genéticamente que comprende una modificación genómica en un gen elF-4G. La modificación puede comprender, por ejemplo, una inserción, una eliminación, o una sustitución de una o más bases de un gen elF-4G. El gen elF-4G puede ser alterado de modo que exprese a una proteina de elF-4G alterada en relación con una proteina de elF-G4 de tipo salvaje del animal para ser resistente a la fragmentación mediante una proteinasa de una enzima del virus de fiebre aftosa, por ejemplo, una o ambas de una proteinasa líder de la enzima del virus de fiebre aftosa (Lpro) y un virus codificado por la proteasa 3C de la enzima del virus de la fiebre aftosa (3Cpro). El animal puede ser un mamífero. El animal puede ser un animal de investigación de laboratorio (por ejemplo, ratón, rata, perro o especies de cerdo usadas en laboratorios, por ejemplo, lechonas miniatura). El animal puede ser un animal de ganadería, por ejemplo, seleccionado de un grupo que consiste de cerdos, peces, conejos, vacas, pollos, cabras, y ovejas. En algunos casos, el animal es de una primera reproducción y la modificación genómica es un alelo natural del gen elF-4G encontrado en otras reproducciones del animal. En otros casos el animal es de una primera especie y la modificación del genoma es un alelo del gen elF4G en otra reproducción de una segunda especie (humana o animal no humano). El alelo, en general, no es un gen entero, sino que es una porción de un gen que codifica para una porción de proteina que media el enlace y proteólisis mediante una proteasa de FMDV. El animal puede ser homocigótico o heterocigótico hacia el gen elF4G modificado. El animal puede ser un animal fundador o una descendencia de un animal fundador, es decir, puede crearse una nueva raza o línea de animales. El animal puede comprender la proteína de elF-G4 expresada por el gen elF-G4 modificado. El animal puede ser resistente a la fiebre aftosa. La proteína de elF-G4 modificado puede ser modificada para prevenir el enlace de uno de, o ambos de Lpro y Cpro.

Una modalidad de la invención es un método de crear un organismo modificado genéticamente que comprende alterar un gen elF-G4 nativo de una célula primaria o un embrión in vitro (o en el útero en el caso de un embrión) y clonar la célula primaria o implantar el embrión en un animal madre (sustituta), con el gen elF4G que está alterado para expresar a una isoforma de elF4G que resista la proteólisis mediante una proteasa de fiebre aftosa. El método puede involucrar transfectar la célula primaria o el embrión con una nucleasa en sitio específico que fragmenta específicamente un sitio en el gen elFG4 nativo, y un molde de ácido nucleico que comprenda al menos una porción del gen elf4G, con el molde que proporcione un alelo alternativo para el gen elF4G nativo, dicho alelo alternativo que codifica a una isoforma de elF4G que sea resistente a fragmentación por una proteinasa de una enzima del virus de fiebre aftosa. Un ejemplo de una nucleasa en sitio especifico es un sistema basado en nucleasa seleccionado del grupo que consiste de unas nucleasa digitales de zinc (ZFN, Zinc Finger Nucleases), nucleasas efectoras similares a activador transcripcional ((TALEN, Trancriptional Activator-Like Effector Nucleases) y un Clustered Regulatory InterSpaced Short Palindromic (CRISPR o algunas veces mencionado como CRISPR/Cas9).

Una modalidad es una célula in vitro que comprende una modificación genómica en un gen elF4G. El gen elF4G puede ser que exprese a una proteina de elF4G alterada en relación a una proteina de elF4G de tipo salvaje del animal para ser resistente a fragmentación mediante una proteinasa de una enzima del virus de fiebre aftosa. La célula puede ser seleccionada de un grupo que consiste de ratón, rata, caballo, mini cerdo, cerdo, pez, conejo, vaca, pollo, cabra, artiodáctilo, ungulado, y oveja. La célula puede comprender adicionalmente a la proteina de elF4G expresada por el gen elF4G. Modalidades de la invención incluyen un ácido nucleico aislado que codifica a una isoforma de cualquiera de las proteínas de elF4G que sea resistente a fragmentación por una proteinasa de una enzima del virus de fiebre aftosa.

Modalidades de la invención incluyen células, organismos, o animales que incluyen un gen exógeno que expresa a una proteina de elF4G o a una porción de dicha proteina que es enlazada por una proteasa de FMDV. La expresión del gen exógeno compite por el virus de FMDV que enlaza de modo que se reduce la fragmentación de la proteina nativa. Alternativamente, la expresión del gen exógeno de un E1F4G resistente a proteasa proporciona función celular continua con la célula infectada. Una modalidad es un método de crear un organismo modificado genéticamente que comprende añadir la expresión de un gen elF4G exógeno a una célula primaria o a un embrión in vitro y clonar la célula primaria o implantar el embrión en un animal madre, con el gen elF4G exógeno que expresa a una isoforma de elF4G que resiste la proteólisis mediante una proteasa de fiebre aftosa. Una modalidad es una célula in vitro que comprende una modificación genómica en un gen elF4G o un ácido nucleico que expresa a un gen elF4G exógeno.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una radioautografia de perfiles de electroforesis de proteina celular total in vivo; las proteínas totales marcadas 35S-marcadas a partir de células son sometidas a imagenología como una función del tiempo post-infección picornaviral en horas en el fondo; lisis celular completa (después de 6.5 horas) mostró el transcurso de tiempo para desactivación de las proteínas huéspedes y la casi intervención de la síntesis de polipéptido por proteínas picornavirales . Las bandas prominentes a 5 horas son proteínas virales fragmentadas por Lpro desde la poliproteína precursora (banda pesada en la parte suprior del gel). Las bandas fuertes cerca de la parte inferior del gel son histonas que se derivan de ARN no poliadenilado y por consiguiente no dependiente de elF4G y sensible a la actividad proteinasa viral.

La Figura 2 muestra resultados experimentales para alterar una porción de un gen E1F4G1. Una secuencia para una porción de un E1F4G1 porcino se muestra en el pánel A. La secuencia de tipo salvaje tiene residuos asparagina y leucina en las posiciones menos 3 y 2 en el sitio de fragmentación Lpro (cabeza de flecha). En este ejemplo, se proporciona el molde para dirigir el remplazo de los residuos menos 3 y 2 con ácido aspártico y fenilalanina así como convertir el E1F4G1 resistente modificado para fragmentación de Lpro. Dos pares de TALENs (parte superior) fueron diseñados para cortar el E1F4G1 de tipo salvaje para estimular la recombinación homólogo. El pánel B) presenta resultados de un Ensayo por Surveyor (Cel-I) de fibroblastos de cerdo transíectados con cada par de TALEN. El pánel C) presenta el ensayo RFLP para determinar la eficiencia e recombinación homologa. La Figura incluye TALEN izquierdo CCGTCCTTTGCCAACCTT (SEC ID NO: 12), TALEN derecho AGCAACCGTGGGCCCCA (SEC ID NO: 13): TALEN izquierdo TGGCCGACCAGCCCTT (SEC ID NO: 14); TALEN derecho CCCAAGGGGTGGGCC (SEC ID NO: 15); la porción del gen E1F4G1 CAGACTTCACTCCGTCCTTTGCCAACCTTGGCCGACCAGCCCTTAGCAACCGTGGGCCCCC AAGGGGTGGGCC (SEC JD NO: 16); y HDR CAGACTTCACTCCGTCCTTTGCCGACTTCGGCCGACCAGCCCTTAGCCCTTAGCAACCGTG GGCCCCCAAGGGGTGGCCC (SEC ID NO: 17) DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta descripción explica como hacer animales que sean resistentes a FMDV. Los animales son modificados genéticamente de modo que su factor de inicio de translación eucariótica proteínas 4G (elF4G) son resistentes a fragmentación por uno o ambos de las proteasas de FMDV Lpro y 3Cpro (colectivamente mencionado en la presente como las proteasas de FMDV). Hay proteasas elaboradas por FMDV que fijan a proteínas de elF4G. Los ejemplos operativos incluyen la generación de una célula de ganado primario modificada para resistir el ataque por una de las proteasas de FMDV. Los animales pueden ser clonados desde estas células usando téenicas probadas por los inventores para ser efectivas para hacer animales fundadores. La modificación puede ser hecha e una manera de sitio especifico de modo que el alelo del gen nativo es modificado para hacer un alelo modificado que expresa a proteínas de elF4G resistentes a la proteasa de FMDV.

Resistencia FMDV FMDV pertenece a género Aphthovirus de la familia picornavirídiae , el más pequeño de los virus animales que incluyen poliovirus, rinovirus (común en frío) y hepatitis A. Existen siete serotipos con múltiples subtipos [2]. Como otros picornavirus, el genoma de FMDV es un ARN de una sola hebra de aproximadamente 8,500 nucleótidos que pueden ser transladados directamente (genomas de hebra positiva) que codifica a una poliproteína individual en exceso de 100 kDa. Codificado en la región N-terminal del ARN de FMDV es una proteasa similar a la papaína, llamada Lpro que tiene dos isoformas, Lab y Lb de los cuales Lb es el producto importante [3]. Lpro es tanto excepcionalmente pequeño como excepcionalmente específico. La secuencia de Lpro primero fragmenta la poliproteína de FMDV, mientras que está siendo sintetizada, para liberarse de la poliproteína. Entonces, el Lpro libre corta adicionalmente la poliproteína remanente en polipéptidos funcionales individuales que producen números masivos de virus de descendencia. Lpr0 tiene otros varios sitios objetivo de los cuales el más importante parece ser el factor de inicio de translación eucariótica 4G (elF4G) [4,5] que cuando es fragmentado por Lpro es incapaz de promover la iniciación del ARNms cubierto por 4mG de células de mamíferos. E1F4G, que viene en dos isoformas elF4Gl y elF4GH, es una proteína estructural que lleva juntos varias proteínas de enlace de ARN de elF4G que fijan a estructuras en los extremos 5' y 3' de todos los ARNms cubiertos y poliadenilados. En algunos picornavirus, por ejemplo, poliovirus, la proteasa 2Apro tiene las actividades equivalentes como Lpr0.

El efecto neto de elF4G es para puentear no covalentemente el ARNms eucariótico termini que tiene elF4E de enlace de 7mGcobertura enlazado en sus extremos 5? Y la proteína de enlace de poli(A) (PABP) en sus extremos 3' [ b, 1 ] . Estas adiciones en el termini de ARNms permiten a la maquinaria translacional diferenciar completamente ARNms procesados a partir de la miríada de otras moléculas de ARN en una célula para coordinar su translación en proteínas. La actividad crítica de proteínas de elF4G los hace objetivos atractivos para fragmentación en invasores virales que han evolucionado para subyugar a la maquinaria translacional de la célula para producir exclusivamente proteínas virales [8-12]. Una vez que se corta en dos o más péptidos, elF4G es incapaz de puentear los extremos 5' y 3' de ARNms y la síntesis de proteínas huéspedes vienen a detener durante unas cuantas horas (Figura 1). Las proteasas tienen actividades colaterales que proteínas objetivo como interferones y sus reguladores [13-16] así como también el factor nuclear kapa B [17] que están involucrados con respuestas in unitarias a virus, especialmente virus que tienen un producto intermediario (o final) de ARN de doble hebra durante el transcurso de la replicación. La interacción de péptidos de elF4G fragmentado con el sitio de iniciación ribosómico interno de FMDV parece ser importante para la expresión de genes de FMDV [18-2].

Genomas picornavirales no están cubiertos y por consiguiente no requieren la asistencia de elG4G para iniciar la translación de sus poliproteínas codificadas. Preferiblemente, la iniciación de translación de la poliproteína precursora ocurre en el sitio de entrada de ribosoma interno (IRES, Internal Ribosome Entry Site). Como un resultado, casi toda la síntesis de proteínas de células huéspedes es desactivada dejando la maquinaria sintética de la proteína casi exclusivamente disponible para la producción de proteínas virales. Esta característica es la clave de la diseminación rápida y principio de síntomas en animales infectados viralmente. Existe una segunda proteasa, 3Cpro que también ataca a elF4G, PABP y la helicasa de ARN elF4A [22].

No obstante, la actividad de 3Cpro es retardada y generalmente tiene un papel menor que Lpro en subversión de la síntesis de la proteína huésped [1123,24]. Estas dos características de Lpro y 3Cpro son esenciales para la debilitación y propagación del virus. Aunque un estudio que usó células BHK-21 cultivadas mostró que FMDV que caree de Lpro replicaron a una velocidad ligeramente más baja [25]. FMDV que carece de Lpro fue notablemente no virulenta cuando se inyectó en vacas y cerdos y fue incapaz de propagarse a animales cohabitantes [26, 27]. El virus deficiente en Lpro fue susceptible a defensa celular mediada por interferon en el animal completo pero no en células cultivadas [27,28].

La estrategia efectiva de picornavirus es por consiguiente, inactivar la síntesis de la proteína huésped atacando su punto débil, la función del puente de elF4G, usando las mismas proteasas virales que son necesarias para fragmentación de la poliproteína en proteínas maduras. Cuando se hizo esto, el genoma viral replicó vía un intermediario de doble hebra que no inducirá significativamente respuestas inmunitarias intracelulares porque 1) la síntesis de las proteínas huéspedes necesarias necesaria es comprometida y 2) varias proteínas de defensa huéspedes tienen secuencias de aminoácidos que son objetivos mediante las proteasas virales.

El virus es citocidal debido a la subversión de actividades celulares normales; virus infecciosos aparecen 4-6 horas post-infección .

Una modalidad de la invención es un animal con un gen elF4G que codifica a la proteina de elF4G que resiste a proteasas elaboradas por FMDV. Una modalidad resistente a FMDV es para elaborar una o solamente unos cuantos específicos de nucleótidos en los genes elF4G que conferirá a una proteina de elF4G con resistencia a Cpr0 y/o Lpro. Dichos cambios genéticos de precisión en un genoma animal pueden ser hechos con nucleasas en sitio específico tales como nucleasas digitales de zinc (ZFNs), nucleasas efectoras similares a activadoras transcripcionales (TALENs). Repeticiones Palindrómicas Cortas Interespaciadas Regularmente Aglomeradas (CRISPRs). TALENs son una plataforma mas versátil que SFNs [34,35]. CRISPR es una herramienta efectiva y reciente (Cong y colaboradores, Science Express, 3 de Enero de 2013, p.1-7; Malí y colaboradores, Science 15 de Febrero de 2013: Vol. 339, pag. 823-826). El Ejemplo 2 describe generalmente células que han sido modificadas genómicamente para hacer su E1F4G en un gen resistente a la proteasa de FMDV. Estas células pueden ser usadas para hacer animales clonados usando téenicas convencionales.

Una modalidad del animal tiene el gen resistente en el genoma del animal. Una modalidad alternativa añade un gen exógeno al animal, el cual expresa al gen exógeno en algunas o en todas las células. El gen exógeno resiste la actividad de FMDV. Modalidades de la invención incluyen células, organismos, o animales gue incluyen un gen exógeno gue expresa a una proteina de EIF4G o a una porción de dicha proteina gue es enlazada por una proteasa de FMDV. Otra modalidad alternativa ubica al gen elF4G bajo el control de un promotor inducible. En uso, por ejemplo, un grupo de animales puede recibir un aditivo en su alimentación o de otra manera activar al gen para crear resistencia. Animales fundadores y crias pueden establecerse con una o más de estas características.

Sustituyendo aminoácidos específicos en las secuencias de elF4Gl y elF4GH gue retienen la función translacional pero son resistentes a la digestión de proteasa, la síntesis de proteína huésped puede continuar para desplazar la síntesis de proteínas virales debida al exceso masivo de ARNms huésped, el cual noes degradado en células infectadas con picornavirus [36]. Además, la translación de ARN de FMDV mediada por IRES puede ser atenuada debido a la falta de productos de fragmentación de elF4G [20,21]. Este procedimiento proporciona resistencia a la replicación de FMDV y es mejor gue meramente añadir genes elF4G resistentes a proteasa en genomas con genes elF4G susceptibles a proteasa [19,36]. Esta estrategia no implica transgénesis: en vez de su equivalente para conversión genética, una actividad genética estándar en células animales.

Tabla 1: La secuencia de elF4G e isoformas resistentes a FMDV porcina, bovina y ovina.

A manera de ejemplo, la Tabla 1 muestra la forma de la secuencia de aminoácidos 668-679 para la porción de un gen elF4G porcino (100% de identidad con bovino y ovino) que es enlazado por Lpro y es fragmentado por Lpro. La Tabla 1 muestra adicionalmente alteraciones de uno ofdos aminoácidos que son esperadas para causar resistencia a degradación y crear resistencia a FMDV, con las alteraciones que son enfatizadas por subrayado. Las secuencias de aminoácidos alternativas son isoformas de la proteina elFG4; los genes que codifican las varias isoformas son alelos entre si. Los aminoácidos 668-679 son porción E1F4G1 de tipo salvaje (Wt) que se transladaron desde NM_001246253 . Isoformas alternativas para conferir resistencia a la proteasa de Lpro de FMDV son predichos desde (ver Santos y colaboradores 2009 que describe sitios de polipéptidos virales; Biochemistry 48, 7948). La Isoforma 1 se basa en la alineación con EIF4GH humano en este sitio. El EIF4GH no es fragmentado aquí y es funcional. Las isoformas 2 y 8 se basan similarmente en la alineación con E1F4GH humano. Las isoformas restantes, por consiguiente, son seleccionadas con base en su probabilidad de inhibirlas proteasas y mantener la función normal. Los expertos pueden crear fácilmente secuencias de ácidos nucleicos para elaborar las isoformas indicadas y la secuencia del gen de tipo salvaje están fácil y públicamente disponibles. Se pueden generar moldes de recombinación homologa (HR, Homologous Recombination) para codificar a las varias isoformas junto con mutaciones de RFLP silenciosas para ayudar en el cribado de la colonia. Estos moldes tendrán oligonucleótidos de 90-mer que separan los sitios de enlace de E1F4G14.1 TALEN (Figura 2). Cada molde de HR (típicamente desde aproximadamente 0.025 a aproximadamente 0.8 nMoles) junto con E1F4G14.1 TALENs (típicamente desde aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10 microgramos) será introducido en fibroblastos de paso precoz, y colonias individuales serán cribadas introgresión de los alelos mutantes. Se tomarán células de las colonias que incorporan el alelo deseado y se usaran para clonar animales fundadores.

La Tabla 2 muestra fuentes para secuencias de varios genes elF4G en varias especies de ganado. Los expertos pueden fácilmente obtener información para éstas y otros genes elF4G de ganado.

Tabla 2. Ortólogos y homólogos de elF4G en ganado.

^Observe que el ge E1F4G3 codifica a la proteína de E1F4G Por consiguiente, modalidades de la invención incluyen un E1F4G que es resistente a una proteinasa de FMDV, por ejemplo, Lpro y/o Cpro. Modalidades incluyen isoformas que tienen cambios en uno o más residuos (aminoácido o ácido nucleico) del tipo salvaje, y también secuencias de ácido nucleico que los codifican. El uno o más residuos alterados pueden estar en posición en donde una proteinasa de FMDV enlazan a una secuencia de ácido nucleico correspondiente al mismo. Alternativamente, la mutación puede estar en el punto donde la proteinasa hace su corte en la proteina. El número de cambios en relación con un tipo salvaje típicamente abarcaría desde 1 a aproximadamente 50 cambios; expertos entenderán inmediatamente que se contemplan todos los intervalos y valores entre 1 y 50, por ejemplo desde 1 a 5, desde 1 a 10, y así sucesivamente. Los cambios son tales que E1F4G son operables para llevar a cabo funciones normales (RMDV no significativas). Animales con el E1F4G mejorado será resistente a la fiebre aftosa. Una forma de resistencia es inmunidad, significa que el animal no es afectado esencialmente por la enfermedad. Otra forma de resistencia es que el animal se recupera más fácilmente una vez que es infectado. Otra forma de resistencia es que el animal es más difícil de infectar en el primer lugar como un resultado del virus que tiene dificultad para propagarse. Una consecuencia de resistencia puede incluir una probabilidad decreciente de propagar la enfermedad porque los títulos virales en el huésped son grandemente decrecientes.

Las modalidades también incluyen los genes, las proteínas, los ácidos nucleicos que codifican a las proteínas, y las células o animales con dichos genes y proteínas. Los animales son útiles como ganado y como animales de investigación para estudiar FMDV. Las células son útiles para elaborar animales como ganado o como animales de investigación y también son de uso para investigación de FMDV. Células que resisten la proteólisis de FMDV son útiles para probar fármacos y para tratamientos que interfieren con otros aspectos del ciclo de vida de FMDV. Una razón es que los animales y células persistirán más tiempo de modo que pueden ser ensayados los efectos de éstas y otras intervenciones. Otra razón es que los resultados de estudios con otras terapias pueden determinar rápidamente si su modo de acción es proteólisis de FMDV, o no. Los genes y las proteínas por sí mismas son de uso adicional para ensayar pruebas y efectos de FMDV.

Animales Modificados Genéticamente Se puede elaborar a los animales que sean mono-alélicos o bi-alélicos para una modificación cromosómica, usando métodos que ya sea que dejen un marcador en el lugar, permite su reproducción afuera de un animal, o por métodos que no colocan un marcador en el animal. Por ejemplo, los inventores han usado métodos de recombinación dependiente homologa (HDR, Homologous Dependent Recombination) para hacer cambios en, o inserciones de genes exógenos en el interior, cromosomas de animales. Están disponibles instrumentos tales como nucleasas especificas del sitio, por ejemplo, TALENs, nucleasas digitales de zinc (ZFN), o CRISPR, y proteínas de fusión de recombinasas, así como también métodos convencionales.

El término alelo natural en el contexto de modificación genética significa un alelo encontrado en la naturaleza en la misma especie de organismo que está siendo modificado, El término nuevo alelo significa un alelo no natural. Un alelo humano colocado en una cabra es un alelo nuevo. Por consiguiente, un alelo natural es una variación que ya existe en una especie que puede ser inter-reproducida. Y un nuevo alelo es uno que no existe en una especie que puede ser inter-reproducida. El movimiento de una interespecies de alelo significa de una especie de animal a otra y movimiento intraespecies significa movimiento entre animales de la misma especie.

Mover un alelo de una reproducción a otra por procesos de reproducción convencionales involucra intercambiar muchos alelos entre las reproducciones. La recombinación durante la meiosis inevitablemente intercambia loci genético entre las reproducciones. En contraste, la nucleasa especifica del sitio modificó el ganado y otros animales están libres de cambios genéticos que resultan de eventos de recombinación meiótica desde que las células o embriones son modificados en un momento en que las células son exclusivamente meióticas. Como un resultado, un animal modificado por TALEN puede distinguirse fácilmente de un animal creado por reproducción sexual.

Los procesos en la presente se proporcionan para editar los genomas de animales existentes. El animal tiene un fenotipo fijado y la clonación del animal, por ejemplo, clonando efectivamente células somáticas preserva ese fenotipo. Hacer un cambio o cambios en un genoma celular durante la clonación permite que un fenotipo conocido sea alterado. Los procesos en la presente se proporcionan para alterar un genoma de un embrión que todavía tiene que desarrollar en un animal con rasgos fijados. Embriones con sonidos genéticos no obstante, no pueden expresar todos los rasgos que están en el potencial genético de su genética, es decir, los animales no siempre expresan los rasgos de su línea por reproducir.

Los inventores han demostrado previamente la eficiencia de clonar efectivamente cuando la clonación de poblaciones poligenéticas de células modificadas (Carlson y colaboradores, 2011). Adicionalmente, sin embargo, la modificación del genoma mediada por TALEN, asi como también la modificación por moléculas de fusión de recombinasa, se proporcionan para una alteración bi-alélica para ser lograda en una sola generación. Por ejemplo, un animal homocigótico para un gen agotado puede elaborarse mediante SCNT y sin inseminación para producir homocigotidad. La duración de la gestación y la maduración hasta la edad de reproducción para ganado tal como cerdos y vacas es una barrera significativa para la investigación y para la producción. Por ejemplo, la generación de un homocigótico agotado a partir de células mutantes heterocigóticas (ambos sexos) clonando y reproduciendo requerirla 16 y 30 meses, para cerdos y vacas respectivamente.

Los inventos han mostrado previamente que fibroblastos primarios transgénicos pueden se expandidos efectivamente y aislados como colonias cuando se plaquearon con fibroblastos no transgénicos y se sometieron a selección de fármacos usando una téenica de co-selección de transposon (Caebon y colaboradores, 2011, Pub. U.S. No, 2011/0197290).

Adicionalmente se mostró (ver US 2012/0222143) que colonias resistentes a puromicina fueron aisladas por células tratadas con seis pares de TALEN y evaluaron sus genotipos mediante el ensayo SURVEYOR o secuenciación dirigida de productos de PCR que espaciaron el sitio objetivo. En general, la proporción de clones indel positivas fue similar a predicciones hechas con base en niveles de modificación del día 3. Clones bi-alélicos agotados fueron identificados por 5 de 6 pares de TALEN, ocurriendo en hasta 35% se células indel positivas. Notablemente, la frecuencia de clones agotados bi-alélicos por la mayoría de pares de TALEN en exceso que seria predicho si la fragmentación de cada cromosoma es tratada como evento independiente.

La recombinación homologa inducida por TALEN elimina la necesidad de marcadores de selección unidos. Se puede usar TALENs para transferir precisamente alelos específicos en un genoma de ganado por reparación dependiente de la homología (HDR). En un estudio piloto, una eliminación de 11 pb específicos (el alelo de Belgian Blue) (Grober y colaboradores, 1997; Kambadur y colaboradores, 1997) fue introducido en el locus GDF8 bovino (ver US 2012/0222143). Cuando se transíectó solo el par de TALEN btGDF8.1 fragmentó hasta 16% de cromosomas en el locus objetivo. La co-transfección molde de reparación de ADN homólogo super en espiral que alberga las 11 eliminaciones de pb en una frecuencia de conversión de gen (HDR) de hasta 5% en el día 3 sin selección para el evento deseado. Se identificó la conversión del gen en 1.4% de colonias aisladas gue fueron cribados .

TALENs Los TALENs son instrumentos de diseño genético. La inactivación de un gen es uno de muchos usos de TALENs. El término TALEN, como se usa en la presente, es amplio e incluye un TALEN monomérico que puede fragmentar ADN de doble hebra sin ayuda de otro TALEN. El término TALEN se usa también para referirse a uno o a ambos miembros de un par de TALENs que son diseñados para trabajar juntos para fragmentar ADN en el mismo sitio. TALENs que trabajan juntos pueden mencionarse como un TALEN izquierdo y un TALEN derecho, lo cual se refiere al manejo de ADN.

Miller y colaboradores (Miller y colaboradores (2011) Nature Bíotechnol . 29:143) reportaron la elaboración de TALENs por arquitectura de nucleasa en sitio especifico uniendo variantes de truncado de TAL al dominio catalítico de nucleasa FokI. Se mostró que los TALENs resultantes indujeron la modificación del gen en células humanas inmortalizadas por medio de dos rutas de reparación de ADN eucarióticas principales, uniendo extremos no homólogos (NHEJ, Non Homologous End Joining) y reparación dirigida de homología.

Los TALENs pueden ser diseñados para enlace específico. Los mejoramientos de Miller y colaboradores los TALENs son descritos en U.S. serie No.13/594,694 presentado el 24 de Agosto de 2012 Enlace específico como se usa comúnmente el término en las artes biológicas, se refiere a una molécula que enlaza a un objetivo con una afinidad relativamente alta en comparación con tejidos no objetivos, y generalmente, involucra una pluralidad de interacciones no covalentes tal como interacciones electrostáticas, interacciones de van der Walls, enlace de hidrógeno y los similares. Las interacciones de enlace específico caracterizan al enlace de sustrato-enzima que enlaza al anticuerpo-antígeno e interacciones de proteína receptor que enlazan específicamente.

Se ha reportado el código para TALs (Solicitud de PCT WO 2011/072246) en donde cada repetición que enlaza a ADN es responsable de reconocer un par de bases en la secuencia de ADN objetivo. Los residuos pueden ser conjuntados para dirigirse hacia una secuencia de ADN, con: (a) HD para reconocimiento de C/G; (b) NI para reconocimiento de A/T; (c) NG para reconocimiento de T/A; (d) NS para reconocimiento de C/G o A/T o G/C; (e) NN para 30 reconocimientos de G/C o A/T; (f) IG para reconocimiento de T/A; (g) N para reconocimiento de C/G; (h) HG para reconocimiento de C/G o T/A; (i) H para reconocimiento de T/A; y (j) NK para reconocimiento de G/C.

Abreviando, se determinó un sitio objetivo para enlace de un TALEN y se creó una molécula de fusión que comprende una nucleasa y una serie de RVDs que reconoce el sitio objetivo. Después de enlace, la nucleasa fragmenta al ADN de modo que pueda operar la maquinaria de reparación celular para elaborar una modificación genética en el extremo de corte. El término TALENS significa una proteina que comprende un dominio de enlace efector similar a Activador de Transcripción (TAL, Transcription Activator Li e) y un dominio nucleasa e incluye TALENs onoméricos que son funcionales per se asi como también otros que requieren dimerización con otros TALEN monoméricos. La dimerización puede dar como resultado un TALEN heterodimérico cuando el TALEN monomérico es diferente.

En algunas modalidades, se puede usar un TALEN monomérico. TALEN, típicamente funciona como dímero a través de un sitio de reconocimiento bipartita con un espaciador, de modo que, dos dominios efectores TAL están cada uno fusionado a un dominio catalítico de la enzima de restricción Fokl, los sitios de reconocimiento de ADN para cada TALEN resultante son separados por una secuencia espad adora, y el enlace de cada monómero TALEN al sitio de reconocimiento permite a Fokl dimerizar y crear una doble hebra rota en el espaciador. TALENs monoméricos también se pueden construir, no obstante, de modo que efectores TAL individuales son fusionados a una nucleasa que no requiere dimerización para funcionar. Una nucleasa tal, por ejemplo, es una variante de cadena individual de Fokl en la cual son expresados los dos monómeros como un polipéptido individual. Otras nucleasas monoméricas diseñadas o que se encuentran de manera natural también pueden servir para este papel. El dominio de reconocimiento de ADN usado para un TALEN monomérico puede derivarse de un efector TAL que se encuentra de manera natural. Alternativamente, el dominio de reconocimiento de ADN puede ser diseñado para reconocer a un ADN especifico objetivo. Los TALENs de cadena individual diseñados pueden más fáciles de construir y desplegar cuando requieran solamente un dominio de reconocimiento de ADN diseñado. Una nucleasa especifica de secuencia de ADN dimérico se puede generar usando dos dominios de enlace de ADN diferentes (por ejemplo, un dominio de enlace de TAL efector y un dominio de enlace de otro tipo de molécula) Los TALENs pueden funcionar como dimeros a través de un sitio de reconocimiento bipartita con un espaciador. Esta arquitectura de nucleasa también puede ser usada para nucleasas especificas del objetivo generadas a partir de, por ejemplo, un monómero de TALEN y un monómero de nucleasa digital de zinc. En dichos casos, los sitios de reconocimiento de ADN para los monómeros de TALEN y de nucleasa digital de zinc pueden ser separados mediante un espaciador de longitud apropiada. El enlace de los dos monómeros puede permitir a Fokl dimerizar y crear una desintegración de doble cadena en la secuencia espaciadora. Dominios de enlace de ADN diferentes a digitales de zinc, tal como homodominios, repeticiones myb o cierres de leucina, también pueden se usados para Fokl y servir como un compañero con un monómero de TALEN para crear una nucleasa funcional.

En algunas modalidades, un efector TAL puede ser usado para dirigir otros dominios de proteínas (por ejemplo, dominios de proteína no nucleasa) para especificar secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, un efector TAL puede ser ligado a un dominio de proteína desde, sin limitación, una enzima que interactúa con 20 ADN (por ejemplo, una metilasa, una topoisomerasa, una integrasa, una transposasa, o una ligasa), un represor o activadores de transcripción, o una proteína que interactúa con o modifica a otras proteínas tales como histonas. Las aplicaciones de dichas fusiones del efector TAL incluyen, por ejemplo, crear o modificar elementos reguladores epigenéticos, haciendo inserciones en sitio específico, eliminaciones, o reparaciones de ADN, que controlan la expresión genética, y que modifican la estructura de cromatina.

El espaciador de la secuencia objetivo puede ser seleccionado o variado para modular la actividad y especificidad de TALEN. La flexibilidad en la longitud del espaciador indica que la longitud del espaciador puede ser seleccionada para dirigirse hacia secuencias particulares con alta especificidad. Además, la variación en la actividad ha sido observada para diferentes longitudes de espaciadores que indican que la longitud del espaciador puede ser seleccionada para lograr un nivel deseado de actividad de TALEN.

El término nucleasa incluye exonucleasas y endonucleasas. El término endonucleasa se refiere a cualquier enzima variante o de tipo salvaje capaz de catalizar la hidrólisis (fragmentación) de enlaces entre ácidos nucleicos sin una molécula de ADN o ARN, preferiblemente por una molécula de ADN. Ejemplos no limitantes de endonucleasas incluyen endonucleasas de restricción de tipo II tal como Fokl, Hhal, HindIII, Notl, BhvCl, EcoRI, BglII, y Alwl. Las endonucleasas comprenden también endonucleasas de corte raro cuando tienen típicamente un sitio de reconocimiento de polinucleótido de aproximadamente 12-45 pares de bases (pb) de longitud, más preferiblemente de 14-45 pb. Endonucleasas de corte raro inducen la ruptura de la doble hebra (DSBs, Double Strand Breaks) de ADN en un locus definido. Las endonucleasas de corte raro pueden ser, por ejemplo, una endonucleasa mensajera, una nucleasa digital de zinc (ZFN) resultante de la fusión de dominios digitales de zinc diseñados con el dominio catalítico de una enzima de restricción tal como Fokl o una endonucleasa química. En endonucleasas químicas, un fragmentador peptídico o químico es conjugado ya sea con un polímero de ácidos nucleicos o bien con otro ADN que reconoce una secuencia objetivo específica, dirigiendo así la actividad de fragmentación hacia una secuencia específica. Las endonucleasas químicas también abracan nucleasas sintéticas como conjugadas deortofenantrolina, una molécula fragmentadora de ADN, y oligonucleótidos formadores de tripletos (TFOs, Triplex-Forming Oligonucleotides), conocidos por enlazar específicamente a secuencias de ADN. Dichas endonucleasas químicas están comprendidas en el término "endonucleasa" de conformidad con la presente invención. Ejemplos de dichas endonucleasas incluyen I-See I, I-Chu L I-Cre I, I-Csm I, Pi-See L PI-Tti L PI-Mtu I, I-Ceu I I-See IL 1- See III, HO, Pi-Civ I PI-Ctr L PI-Aae I, PI-Bsu I, PI-Dha I, PI-Dra L PI-Mav L PI-Meh I, PI-Mfu L PI-Mfl I, PI-Mga L PI-Mgo I, PI-Min L PI-Mka L PI-Mle I, PI-Mma I, PI-30 Msh L Pl-Msm I, PI-Mth I, PI-Mtu I PI-Mxe I PI-Npu I, PI-Pfu L PI-Rma I, Pl-Spb I PI-Ssp L PI-Fae L PI-Mja I, PI-Pho L Pi-Tag L PI-Thy PI-Tko I, PI-Tsp I, I- Msol.

Una modificación genética hecha mediante TALENs u otros instrumentos pueden ser, por ejemplo, seleccionadas de la lista que consiste de una inserción, una eliminación, inserción de un fragmento de ácido nucleico exógeno, y una sustitución. El término "inserción" es usado ampliamente para decir ya sea inserción literal en el cromosoma o uso de la secuencia exógena como un molde para reparación. En general, un sitio de ADN objetivo es identificado y se crea un par de TALEN que enlazará específicamente en el sitio. El TALEN es liberado a la célula o embrión, por ejemplo, como una proteína, ARNm o por un vector que codifica al TALEN. El TALEN fragmenta al ADN para romper una doble hebra, que es luego reparada, a menudo da como resultado la creación de un indel, o incorporación de secuencias o polimorfismos contenidos en un ácido nucleico exógeno acompañante que es ya sea insertado en el cromosoma o bien que sirve como un molde para reparación de la ruptura con una secuencia modificada. Esta reparación activada de molde es un proceso útil para cambiar un cromosoma, y se proporciona para cambios efectivos a cromosomas celulares.

El término ácido nucleico exógeno significa un ácido nucleico que es añadido a la célula o embrión, independientemente de si el ácido nucleico es el mismo o distinto de secuencias de ácidos nucleicos naturalmente en la célula. El término ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico o secuencia de ácidos nucleicos es amplio e incluye un cromosoma, "cassette" de expresión, gen, ADN, ARN, ARNm, o porciones de éstos. La célula o embrión puede ser por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste de ganado, un artiodáctilo, una vaca, una cerda, una oveja, una cabra, un pollo, un conejo, y un pez. El término ganado significa animales domesticados que son criados como artículos para alimento o material biológico. El término artiodáctilo significa un mamífero de cuernos del orden ñrtiodactyla, el cual incluye vacas, venados, camellos, hipopótamo, oveja, y cabras, que tienen un número igual de patas, usualmente dos o algunas veces cuatro, en cada pata.

Algunas modalidades implica una composición o un método de elaborar un ganado modificado genéticamente y/o artiodáctilo que comprende introducir un par de TALEN en la célula o embrión del ganado y/o artiodáctilo que genera una modificación genética al ADN de la célula o embrión en un sitio que es enlazado específicamente por el par de TALEN, y que produce el animal/artiodáctilo del ganado a partir de la célula. Se puede usar la inyección directa para la célula o el embrión, por ejemplo, en un cigoto, blastocisto, o embrión. Alternativamente, el TALEN y/u otros factores pueden ser introducidos en una célula usando cualquiera de muchas téenicas conocidas para introducción de proteínas, ARN, ARNm, ADN, efectores. Se pueden elaborar animales modificados genéticamente a partir de las células o embriones de conformidad con un proceso conocido, por ejemplo, implante del embrión en un huésped gestacional, o varios métodos de clonación. La frase "una modificación genética al ADN de la célula en un sitio que es enlazado específicamente por el TALEN", o las similares, significa que la modificación genética es hecha en el sitio cortado por la nucleasa sobre el TALEN cuando el TALEN es enlazado específicamente al sitio objetivo. La nucleasa no corta exactamente donde el par de TALEN enlaza, sino preferiblemente en un sitio definido entre los dos sitios de enlace.

Algunas modalidades implican una composición o un tratamiento de una célula que es usada para clonar al animal. La célula puede ser una célula de ganado y/o de artiodáctilo, una célula cultivada, una célula primaria, una célula somática primaria, un cigoto, una célula germinal, una célula germinal primordial, o una célula germinal. Por ejemplo, una modalidad es una composición o un método de crear una modificación genética que comprende exponer una pluralidad de células primarias en un cultivo para proteínas de TALEN o un ácido nucleico que codifica a un TALEN o TALENs. Los TALENs pueden ser introducidos como proteínas o como fragmentos de ácidos nucleicos, por ejemplo, codificado por ARN o una secuencia de ADN en un vector.

La modificación genética de células puede incluir también la inserción de un informador. El informador puede ser, por ejemplo, un marcador fluorescente, por ejemplo una proteina verde fluorescente y proteina amarillo fluorescente. El informador puede ser un marcador de selección, por ejemplo, puromicina, ganciclovir, adenosina, desaminasa (ADA, Adenosine DeAminase), aminoglicosida fosfotransferasa (neo, G418, APH), dihidrofoliato reductasa (DHFR, DiHydroFolate Reductase), higromicin-B-fosfotransferasa, timidina quinasa (TK, Thymidine Kinase), o xantinguanina fosforibosiltransferasa (CGPRT, XanthinGuanine PhosphoRibosylTransferase). Vectores para el informador, selección del marcador, y/o uno o más TALEN pueden ser uno o más plásmidos, transposones, transposasa, viral u otros vectores, por ejemplo, como se detalla en la presente.

Los TALENs pueden ser dirigidos hacia una pluralidad de sitios de ADN. Los sitios pueden ser separados mediante varios miles o muchos miles de pares de bases. El ADN puede ser reunido por la maquinaria celular para causar asi la eliminación de la región entera entre los sitios. Las modalidades incluyen, por ejemplo, sitios separados por una distancia entre 1-5 mega-bases o entre 50% y 80% de un cromosoma; o entre aproximadamente 100 y aproximadamente 1,000,000 de pares de bases; los expertos apreciaran inmediatamente que todos los intervalos y valores en los intervalos declarados explícitamente, están contemplados, por ejemplo, desde aproximadamente 1,000 a aproximadamente 10,000 pares de bases o desde aproximadamente 500 a aproximadamente 500,000 pares de bases. Alternativamente, el ADN exógeno puede ser añadido a la célula o embrión por inserción del ADN exógeno, o reparación del molde activado del ADN entre los sitios. La modificación en una pluralidad de sitios se puede usar para elaborar células, embriones, artiodáctilos, y ganado modificados genéticamente.

Nucleasas Digi tales de Zinc Las nucleasas digitales de zinc (ZFNs) son enzimas de restricción artificiales generadas por fusión de un dominio de enlace del ADN digital de zinc a un dominio de fragmentación de ADN. Los dominios digitales de zinc pueden ser diseñados para dirigirse hacia las secuencias de ADN deseadas y ésto facilita a las nucleasas digitales de zinc dirigirse hacia secuencias únicas en genomas complejos. Tomando ventaja de la maquinaria de reparación de ADN endógeno, estos reactivos se pueden usar para alterar los genomas de organismos superiores. ZFNs pueden ser usados en el método de inactivar genes.

Un dominio de enlace de ADN digital de zinc tiene aproximadamente 30 aminoácidos y se doblan en una estructura estable. Cada dedo enlaza primeramente a un tripleto en el sustrato de ADN. Los residuos de aminoácidos en posiciones clave contribuyen a la mayoría de las secuencias de las interacciones especificas de secuencia con el sitio de ADN. Estos aminoácidos pueden ser cambiados siempre que mantengan los aminoácidos remanentes para preservar la estructura necesaria. El enlace a secuencias de ADN más largas es logrado mediante la ligadura de varios dominios en tándem. El dominio de fragmentación de Fokl (N), dominios activadores de transcripción (A), dominios represores de transcripción ® y metilasas (M) pueden ser fusionadas a unos ZFPs para formar ZFNs respectivamente, activadores de transcripción digital de zinc (ZFA), represores de transcripción digital de zinc (ZFR), y metilasas digitales de zinc (ZFM). Materiales y Métodos para usar dedos de zinc y nucleasas digitales de zinc para elaborar animales modificados genéticamente, se describen, por ejemplo, en US8,106,255, US20120192298 , US20110023159, y US20110281306.

Repeticiones Palindrómicas Cortas Interespaciadas Regularmente Aglomeradas Las repeticiones palindrómicas cortas interespaciadas regularmente aglomeradas (CRISPR) se derivan de defensas inmunitarias adaptativas de bacterias/arqueobacterias. La actividad de CRISPR involucra la integración de "espaciadores" desde invadir el ADN virus o plásmidos en el locus de CRISPR, expresión y procesamiento de ARNs de CRISPR de quia corta (crARNs) que consiste de unidades de repetición espaciadoras,-fragmentación de ácidos nucleicos complementaros al espaciador. La nucleasa Cas9 busca secuencias que igualen al crARNs para fragmentar. Cas9 corta en ADN solamente si un motivo adyacente al protoespaciador correcto (PAM, Protoespaciador Adyacent Motif) está también presente en el extremo 3'. Como un instrumento de diseño de genoma, la especificidad de fragmentación de Cas9 dirigida hacia ARNg es muy útil.

Por ejemplo, Di Cario y colaboradores (Nucí. Acids. Res. 41(5) (2013)) reportaron que el (ARNg), mostró actividad endonucleasa dirigida por el ARN especifica y robusta hacia el loci genómico endógeno dirigido en levaduras. Usando la expresión de Cas9 constitutivo y un "cassette" de ARNg transitorio, mostraron la ruptura de doble hebra dirigida incrementó las velocidades de recombinación homologa de donadores de oligonucleótidos de una sola y de doble hebra en 5 veces y 130 veces, respectivamente. Además, la co-transformación de un ARNg plásmido y un ADN donador en células que expresan constitutivamente a Cas9 dio como resultado casi 100% de frecuencia de recombinación de ADN donador. El término CRISPR en la presente es usado para referirse a instrumentos de diseño genético que usa estas téenicas .

Y Cong y colaboradores reportaron que sistemas de CRISPR y nucleasas Cas9 asociadas pudieron ser dirigidas por ARN cortos para inducir la fragmentación precisa en loci genómico endógeno en células humanas y de ratón. Casp9 fue también convertida en una enzima formadora de cortes para facilitar la reparación dirigida por homología con actividad mutagénica mínima. Finalmente, secuencias de guía múltiple fueron capaces de estar involucradas en una distribución de CRISPR individual para facilitar la edición simultánea de varios sitios en el genoma de mamífero, demostrando fácil programabilidad y amplia posibilidad de aplicación de la tecnología de CRISPR.

Vectores y Ácidos Nucleicos Se puede introducir una variedad de ácidos nucleicos en las células de artiodáctilo y otras, para propósitos de agotamiento, para inactivación de un gen, para obtener expresión de un gen, o para otros propósitos. Como se usa en la presente, el término ácido nucleico incluye ADN, ARN y análogos de ácidos nucleicos que son de una sola hebra o de doble hebra (es decir una sola hebra en el sentido o antisentido). Los análogos de ácido nucleico pueden ser modificados en la porción base, porción azúcar, o estructura principal fosfato para mejorar la estabilidad, hibridización, o solubilidad del ácido nucleico. Las modificaciones en la porción base incluyen desoxiuridina por desoxitimidina y 5-metil- 2'- desoxicitidina y 5- bromo- 2' - desoxicitidina por desoxicitidina. Las modificaciones de la porción azúcar incluyen la modificación del 2' - hidroxilo del azúcar ribosa para formar los azúcares 2 ' - O-metilo o 2 ' - O-alilo. La estructura principal fosfato desoxiribosa puede ser modificada para producir ácidos morfolino nucleicos, en los cuales cada porción base está ligada a un anillo morfolino de seis miembros, o ácidos nucleicos peptidicos, en los cuales la estructura principal desoxifosfato es remplazada por una estructura principal pseudopeptidica y las cuatro bases son retenidas. Ver, Summerton y Weller (1997) Antisense Nucleic Acids Drug Dev. 7(3):187; y Hyrup y colaboradores (1996) Bioorgan . Med. Chem. 4:5. Además, la estructura principal desoxifosfato puede ser remplazada con, por ejemplo, una estructura principal fosforotioato o fosforoditioato, una estructura principal fósforodiamidita, o una alquil fósforotriéster.

La secuencia de ácido nucleico objetivo puede ser operablemente ligada a una región reguladora tal como un promotor. Regiones reguladoras pueden ser regiones reguladoras porcinas o pueden ser de otras especies. Como se usa en la presente, operablemente ligada, se refiere al posicionamiento de una región reguladora en relación con una secuencia de ácido nucleico de una manera tal para permitir o facilitar la transcripción del ácido nucleico objetivo.

Cualquier tipo de promotor puede ser operablemente ligado a una secuencia de ácido nucleico objetivo. Ejemplos de promotores incluyen, sin limitación, promotores específicos de tejido, promotores constitutivos, promotores inducibles y promotores responsables o irresponsables a un estímulo particular. Los promotores específicos de tejido adecuados pueden dar como resultado expresión preferencial de un transcrito de ácido nucleico en células beta e incluyen, por ejemplo, el promotor de insulina humana. Otros promotores específicos de tejido pueden dar como resultado la expresión preferencial, por ejemplo, hepatocitos o tejido cardíaco y pueden incluir la promotores de cadena pesada de alfa miosina o albúmina, respectivamente. En otras modalidades, se puede usar un promotor que facilita la expresión de una molécula de ácido nucleico sin tejidos significativos o especificidad temporal (es decir, un promotor constitutivo). Por ejemplo, se puede usar un promotor beta-actina tal como el promotor del gen de beta-actina de pollo, promotor ubiquitino, promotor de miniGAGs, promotor de gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH, GlycerAldehyde- 3- Phosphate DeHydrogenase), o promotor de 3- fosfoglicerato quinasa (PGK, 3-PhosphoGlycerate Kinase) , asi como también promotores virales tales como el promotor del virus timidina quinasa del herpes simplex (HSV-TK, Herpes Simplex Virus-Thymidine Kinase), el promotor de SC40, o un promotor de citomegalovirus (CMV).En algunas modalidades, una fusión del promotor del gen de beta actina de pollo y el mejorador de CMV es usado como un promotor. Ver, por ejemplo, Xu y colaboradores (2001) Hum Gene Ther 12:563; y Kiwaki y colaboradores (1996) Hum Gene Ther: 7:821.

Un ejemplo de un promotor inducible es el sistema promotor de tetracielina (tet)-on, el cual puede ser usado para regular la transcripción del ácido nucleico. En este sistema, un represor de Tet mutado (TetR) es fusionado al dominio de activación de la proteina trans-activadora VP16 del virus del herpes simplex para crear un activador transcripcional controlado por tetraciclina (tTA), el cual es regulado por tet o desoxiciclina (dox). En la ausencia de antibiótico, la transcripción es mínima, mientras que en la presencia de tet o dox, la transcripción es inducida. Sistemas inducibles alternativos incluyen sistemas de ecdisona o rapamicina. La ecdisona es una hormona mutada de insecto cuya producción es controlada por un receptor heterodímero de la ecdisona y el producto del gen ultraspiracle (USP). La expresión es inducida mediante el tratamiento con ecdisona o un análogo de ecdisona tal como muristerona A. El agente que es administrado al animal para activar el sistema inducible es mencionado como un agente de inducción .

Regiones reguladoras adicionales que pueden ser útiles en constructos de ácidos nucleicos, incluyen, pero n se limitan a, secuencias de poliadenilación, secuencias de control de translación, (por ejemplo, un segmento de entrada de ribosoma interno, IRES), mejoradores, elementos inducibles, o intrones. Dichas regiones reguladoras pueden no ser necesarias, aunque pueden incrementar la expresión afectando la transcripción, estabilidad del ARNm, eficiencia de translación, o los similares. Dichas regiones reguladoras pueden ser incluidas en un constructo de ácido nucleico según se desee para obtener expresión óptima de los ácidos nucleicos en la(s) célula(s). No obstante, algunas veces, puede obtenerse suficiente expresión sin dichos elementos adicionales.

Se puede usar un constructo de ácido nucleico que codifica a péptidos de señal o marcadores seleccionables. Los péptidos de señal pueden ser usados de modo que un polipéptido codificado es dirigido hacia una localización celular particular (por ejemplo, la superficie celular). Ejemplos no limitantes de marcadores incluyen puromicina, ganciclovir, adenosina desaminasa (ADA), aminoglicosida fosfotransferasa (neo, G418, APH), dihidrofolato reductasa (DHFR), higromicina-B-fosfotransferasa, timidina quinasa (TK), y xantin-guanina fosforibosiltransferas (XGPRT). Dichos marcadores son útiles para seleccionar transformantes estables en cultivo. Otros marcadores seleccionables incluyen polipéptidos fluorescentes, tal como proteina verde fluorescente , o proteina amarillo fluorescente.

En algunas modalidades, una secuencia que codifica a un marcador seleccionadle puede ser flanqueada por secuencias de reconocimiento para una recombinasa tal como, por ejemplo, Cre o Flp. Por ejemplo, el marcador seleccionadle puede ser flanqueado por sitios de reconocimiento laxP (sitios de reconocimiento de 34 pb reconocidos por la Cre recombinasa) o sitios de reconocimiento de FRT de modo que el marcador seleccionable puede ser excusado desde el constructo. Ver, Orban, y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. (1992) 89:6861, para una revisión de teenologia de Cre/lox, y Brand y Dymecki, Dev. Cll (2004) 6:7. Un transposon que contiene un transgen activable-Flp interrumpido por un gen marcador seleccionadle también se puede usar para obtener animales transgénicos con expresión condicional de un transgen. Por ejemplo, un promotor activador de expresión del marcador/transgen puede ser ya sea ubicuo o especifico de tejido, lo cual daría como resultado la expresión ubicua o específica de tejido del marcador en animales FO (por ejemplo, cerdos). La activación específica de tejido del transgen puede ser lograda, por ejemplo, cruzando un cerdo que expresa ubicuamente a un transgen interrumpido por marcador en un cerdo que expresa a Cre o Flp de manera específica de tejido, o cruzando un cerdo que expresa a un transgen interrumpido por marcador de manera específica de tejido en un cerdo que expresa ubicuamente a Cre o Flp recombinasa. La expresión controlada del transgen o excisión controlada del marcador permite la expresión del transgen.

En algunas modalidades, el ácido nucleico exógeno codifica a un polipéptido. Una secuencia de ácido nucleico que codifica a un polipéptido puede incluir una secuencia marcadora que codifica a una "marca" diseñada para facilitar la manipulación subsecuente del polipéptido codificado (por ejemplo, para facilitar la localización o detección) . Secuencias marcadoras pueden ser insertadas en la secuencia de ácido nucleico que codifica al polipéptido de modo que la marca codificada es localizada en ya sea el término carboxilo o amino del polipéptido. Ejemplos no limitantes de marcas codificadas incluye glutatión-N-transferasa (GS) y marca FLAG™ (Kodak, New Haven, CT).

Constructos de ácidos nucleicos pueden ser metilados usando una Sssl CpG metilasa (New England Biolabs, Ipswich, MA). En general, el constructo de ácido nucleico puede ser incubado con S-adenosilmetionina y Sssl CpG-metilasa en amortiguador a 37°C. La hipermetilación puede ser confirmada incubando el constructo con una unidad de HmPII endonucleasa durante 1 hora a 37°C y ensayar por electroforesis sobre gel de agarosa.

Constructos de ácidos nucleicos pueden ser introducidos en células embrionarias, fetales o de artiodáctilo adulto de cualquier tipo, incluyendo, por ejemplo, células germinales como oocitos o un huevo, una célula precursora, una célula madre embrionaria o de adulto, una célula madre primordial, una célula de riñón tal como una célula PK-15, una célula de isleta, una célula hepática, o un fibroblasto tal como un fibroblasto dérmico, usando una variedad de téenicas. Ejemplos no limitantes de técnicas incluyen el uso de sistemas de transposón, virus recombinantes que pueden infectar células, o liposomas u otros métodos no virales como electroporación, microinyección, o precipitación con fosfato de calcio, que son capaces de liberar ácidos nucleicos a las células.

En sistemas de transposones, la unidad transcripcional de un constructo de ácido nucleico, es decir, la región reguladora ligada operablemente a una secuencia de ácido nucleico exógena, es flanqueado por una repetición invertida de un transposón. Varios sistemas de transposón, incluyendo, por ejemplo, Sleeping Beauty (ver, Patente U.S. No. 6,613,752 y Publicación U.S. No. 2005/0003542); Frog Prince (Miskey y colaboradores (2003) Nucleic Acids Res . 31: 6873); Tol2 (Kawakami (2007) Genome Biology 8(Suppl.1):S7; Minos (Pavlopoulus y colaboradores (2007) Genome Biology 8 (Suppl. 1): S2); Hsmarl (Miskey y colaboradores (2007) Mol. Cell Biol. 27:4589); y se ha desarrollado Passport para introducir ácidos nucleicos en células, incluyendo células de ratones, humanas, y de cerdo. El transposón de Sleeping Beauty es particularmente útil. Puede liberarse una transposasa como una proteina, codificada sobre en mismo constructo de ácido nucleico que el ácido nucleico exógeno puede ser introducido sobre un constructo de ácido nucleico separado, o proporcionado como un ARNm (por ejemplo, un ARNm cubierto y transcrito in vitro ) .

También se pueden incluir elementos aislantes en un constructo de ácido nucleico para mantenerla expresión del ácido nucleico exógeno e inhibir la transcripción indeseable de genes huéspedes. Ver, por ejemplo, la Publicación U.S. No. 2004/0203158. Típicamente, un elemento aislante flanquea cada lado de la unidad transcripcional y es interna a la repetición invertida del transposón. Ejemplos no limitantes de elementos aislantes incluyen elementos aislantes de tipo (MAR) de región de fijación matriz y elementos aislantes de tipo limitante. Ver, por ejemplo, las Patentes U.S. Nos. 6,395,549, 5,731,178, 6,100,448, y 5,610,053, y La publicación U.S. No.2004/0203158.

Se pueden incorporar ácidos nucleicos en vectores. Un vector es un término amplio que incluye cualquier segmento de ADN especifico que es diseñado para moverse desde un portado en un ADN objetivo. Un vector puede ser mencionado como un vector de expresión, o un sistema vecLor, el cual es un grupo de componentes necesarios para provocar la inserción de ADN en un genoma u otra secuencia de ADN de destino tal como episoma, plásmido, o aún segmento de ADN de virus/fago. Sistemas vectores como vectores virales (por ejemplo, retrovirus, virus adeno-asociados y virus de fago integrante, y vectores no virales (por ejemplo, transposones) usados para liberar el gen en animales tienen dos componentes básicos: 1) un vector que comprende ADN (o ARN que es transcrito de manera contraria en un ADNc) y 2) una transposasa, recombinasa, u otra enzima integrase que reconoce tanto el vector como una secuencia objetivo de ADN e inserta el vector en la secuencia de ADN objetivo. Los vectores, más a menudo contienen uno o más "cassettes" de expresión que comprende una o más secuencias de control de expresión, en donde una secuencia de control de expresión es una secuencia de ADN que controla y regula la transcripción y/o translación de otra secuencia de ADN o ARNm, respectivamente.

Se conocen muchos tipos de vectores. Por ejemplo, vectores virales y plás idos, por ejemplo, se conocen vectores retrovirales. Plásmidos de expresión de mamíferos típicamente tienen un origen de replicación, un promotor adecuado y un mejorador opcional, y también sitios de enlace de ribosoma necesarios, un sitio de poliadenilación, un donador de empalme y sitios receptores, secuencias de terminación transcripcional, y secuencias no transcritas que flanquean 5'. Ejemplos de vectores incluyen: plásmidos (los cuales también pueden ser portadores de otro tipo de vector), adenovirus, virus adenoasociados (AAV), lentivirus (por ejemplo, HIV-1 modificado, SIV o FIV), retrovirus )(por ejemplo, ASV, ALV o MoMLV), y transposones (por ejemplo, Sleeping Beauty, elementos-P, Tol-2, Frog Prince, PiggyBac) .

Como se usa en la presente, el término ácido nucleico se refiere tanto a ARN como a ADN, incluyendo, por ejemplo, ADNc, ADN genómico, ADN sintético (por ejemplo, sintetizado químicamente), así como también ácidos nucleicos modificados químicamente y como se encuentran de manera natural, por ejemplo, bases sintéticas o estructuras principales alternativas. Una molécula de ácido nucleico puede ser de doble hebra o de una hebra (es decir, una sola hebra en un sentido o antisentido). El término transgenico es usado ampliamente en la presente y se refiere a un organismo codificado genéticamente u organismo diseñado genéticamente cuyo material genético ha sido alterado usando téenicas de diseño genético. Un artiodáctilo agotado es por consiguiente, transgénico, independientemente de si o no genes exógenos o ácidos nucleicos son expresados en el animal o su descendencia.

Animales Modificados Genéticamente Los animales pueden ser modificados usando TALENs, Dedos de zinc, CRISPR/Cas9, u otros instrumentos de diseño genético, que incluyen proteínas de fusión recombinasa, o varios vectores que son conocidos. Materiales y Métodos de animales que se modifican genéticamente se detallan adicionalmente en U.S. 2012/0222143, U.S. 2012/0220037 y 2010/0251395 presentada el 10 de Noviembre de 2000, las cuales se incorporan a la presente como referencia, para todos los propósitos; en caso de conflicto, la presente descripción es la que controla. El término trans-actuante, se refiere a procesos que actúan sobre un gen objetivo desde una molécula diferente (es decir, intermolecular). Un elemento trans-actuante es usualmente una secuencia de ADN que contiene un gen. Este gen codifica para una proteina (o microARN u otra molécula difusible) que es usada en la regulación del gen objetivo. El gen trans-actante puede estar sobre el mismo cromosoma que el gen objetivo, pero la actividad es vía la proteina intermediaria o ARN que la codifica. La inactivación de un gen usando un dominante negativo generalmente involucra un elemento trans-actuante. El término regulador-cis o actuante-cis significa una acción sin codificar para proteina o ARN; en el contexto de inactivación del en, esta, generalmente significa inactivación de la porción codificadora de un gen, o un promotor y/o operador que es necesaria para expresión del gen funcional.

Se pueden usar varias téenicas conocidas en el arte para introducir constructos de ácido nucleico en animales para producir animales fundadores y hacer lineas de animales, el constructo de ácido nucleico (o un agotado de un gen) es integrado en el genoma. Dichas técnicas incluyen, sin limitación, microinyección pronuclear (Patente U.S. No. 4,873,191), transfieren el gen mediado por retrovirus en lineas madres (Van der Putten y colaboradores (1985) Proc.

Acad. Sci USA 82, 6148-1652) el gen objetivo en células madres embrionarias (Thompson y colaboradores (1989) Cell 56, 313-321), electroporación de embriones (Lo (1983) Mol. Cell. Biol . 3, 1803-1814), transferencia del gen mediada por esperma (Lavitrano y colaboradores (2002) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99, 14230-14235; Lavitrano y colaboradores (2006) Reprod. Fert. Develop.18, 19-23), y transformación in vitro de células somáticas, como células mamarias o cúmulo, o células madres de adulto, fetales, o embrionarias, seguido por transplante nuclear (Wilmut y colaboradores (1997) Nature 385, 810-813; y Wakayama y colaboradores (1998) Nature 394, 369-374), Microinyección pronuclear, transferencia de en mediada por esperma, y transferencia nuclear de células somáticas son téenicas particularmente útiles. Un animal que es modificado genéticamente es un animal en el que todas sus células tienen la modificación genética, incluyendo sus células de linea madre. Cuando se usan métodos que producen un animal que es mosaico en su modificación genética, el animal puede ser reproducido y la descendencia que es genómicamente modificada puede ser seleccionada. La clonación, por ejemplo, puede ser usada para hacer un animal mosaico si sus células son modificadas en el estado de blastocisto, o la modificación genómica puede tener lugar cuando una célula individual es modificada. Animales que son modificados asi, no maduran sexualmente, pueden ser homocigóticos o heterocigóticos para la modificación, dependiendo del procedimiento especifico que es usado. Si un gen particular es inactivado por una modificación agotada, la homocigotidad sería normalmente requerida. Si un gen particular es inactivado por una interferencia de ARN o estrategia negativa dominante, entonces la heterocigotidad es a menudo adecuada.

Típicamente, en microinyección pronuclear, un constructo de ácido nucleico es introducido en un huevo fertilizado; 1 o 2 células de huevo fertilizados son usadas como el pronúcleo que contiene el material genético de la cabeza del esperma y el huevo son visibles en el protoplasma. Se pueden obtener huevos fertilizados gradualmente pronucleares in vitro o in vivo (es decir, recuperados quirúrgicamente del oviducto de animales donadores). Huevos fertilizados in vitro se pueden producir como sigue. Por ejemplo, se pueden colectar ovarios de lechona en un matadero, y mantenidos a 22-28°C durante el transporte. Los ovarios pueden ser lavados y aislados por aspiración folicular, y los folículos que varían desde 4 a 8 mm pueden ser aspirados en tubos de centrífuga cónicos de 50 mL usando agujas calibre 18 y bajo vacío. El fluido folicular y los oocitos aspirados pueden ser enjuagados a través de pre- filtros con TL-HEPES comercial (Minitubo, Verona, WI). Los oocitos circundados por un masa en cúmulo compacto pueden ser seleccionados y colocados en MEDIO DE MADURACIÓN DE OOCITO TCM-199 (Minitube, Verona, WI) suplementado con 0.1 mg/ml de cisteina; 10 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico, fluido folicular porcino al 10%, 50 mM de 2-mercaptoetanol, 0.5 mg/mL de cAMP, 10 UI/mL de cada uno de gonadotropina de suero de yegua gestante (PMSG) y gonadotropina coriónica humana (hCG) durante aproximadamente 22 horas en aire humidificado a 38.7°C y CO2 al 5%. Subsecuentemente, los oocitos pueden se movidos a medio de maduración TCM-199 recientemente preparado, el cual no contendrá cAMP, PMSG o hCG e incubado durante 22 horas ·adicionales. Oocitos madurados pueden ser atrapados de su células de cúmulo por vórtice en hialuronidasa al 0.1% durante 1 minuto.

Para lechonas, oocitos maduros pueden ser fertilizados en un minitubo de 500 ml PORCPRO IVF MEDIUM SYSTEM (Minitube, Verona, WI) en placas de fertilización de 5 pocilios Minitube. En preparación para fertilización in vitro (IVF), semen de jabalí congelado o recientemente recolectado puede ser lavado y resuspendido en Medio PORCPRO IVF a 4 x 105 de esperma. Las concentraciones de esperma pueden ser analizadas mediante el análisis de semen asistido por computadora (SPERMVISION, Minitube Verona, WI)La inseminación final in vitro puede ser efectuada en un volumen de 10 ml a una concentración final de aproximadamente 40 espermas móvil/oocito, dependiendo del jabalí. Todos los oocitos fertilizantes se incubaron a 38.7°C en atmósfera de CO2 al 5% durante 6 horas. Seis horas post-inseminación, presuntos cigotos se pueden lavar dos veces en NCSU-23 y movidos a 0.5 L del mismo medio. Este sistema puede producir 20-30% de blastocistos rutinariamente a través de la mayoría de los jabalíes con un 10-30% de índice de inseminación poliespermática.

Constructos de ácidos nucleicos alineados pueden ser inyectados en uno de los pronúcleos. Luego, los huevos inyectados pueden ser transferidos a una hembra receptora (por ejemplo, en los oviductos de una hembra receptora) dejados desarrollar en la hembra receptora para producir los animales transgénicos. En particular, embriones fertilizados in vitro pueden ser centrifugados a 15,000 X g durante 5 minutos para sedimentar lípidos permitiendo la visualización del pronúcleo. Los embriones pueden ser inyectados usando un inyector Eppendorf FEMTOJET y pueden ser cultivados hasta formación de blastocistos. Se pueden registrar las velocidades de fragmentación embrionaria y de formación de blastocistos y la calidad.

Los embriones pueden ser transferidos quirúrgicamente en el útero de recipientes asincronos. Típicamente, 100-200 (por ejemplo, 150-200) embriones pueden ser depositados en la unión de Ampulla-isthmus del oviducto usando un catéter TOMCAT™ de 5.5 pulgadas. Después de cirugía, se puede efectuar el examen de ultrasonido en tiempo real de embarazo.

En transferencia nuclear de células somáticas, una célula de artiodáctilo transgénico (por ejemplo, una célula de cerdo transgénico o célula bovina) tal como un blastómero embrionario, fibroblasto fetal, fibroblasto de oreja de adulto, o célula granulosa que incluye un constructo de ácido nucleico descrito anteriormente, puede ser introducido en un oocito enucleado para establecer una célula combinada. Los oocitos pueden ser enucleados disección de la zona parcial cerca del cuerpo polar y luego presionar el citoplasma hacia afuera en el área de disección. Típicamente, una pipeta de inyección con una punta biselada afilada es usada para inyectar la célula transgénica en un oocito enucleado detenido en meiosis 2. En algunas convenciones (por ejemplo, por fusión y activación del oocito), el embrión es transferido a los oviductos de un recipiente hembra, aproximadamente 20 a 24 horas después de activación. Ver, por ejemplo, Cibello y colaboradores (1998) Science 280, 1256-1258 y Patente U.S. No. 6,548,741. Para cerdos, hembras receptoras pueden ser verificadas para embarazo aproximadamente 20-21 dias después de transferencia de los embriones. Otros ganados tienen proceso comparables.

Téenicas de reproducción estándares se pueden usar para crear animales que son homocigóticos para el ácido nucleico exógeno a partir de los animales fundadores heterocigóticos iniciales. No obstante, la homocigotidad puede no ser requerida. Cerdos de animales modificados descritos en la presente pueden ser reproducidos con otros animales de interés.

En algunas modalidades, un ácido nucleico de interés y un marcador seleccionable puede ser proporcionado sobre transposones separados y proporcionado ya sea embriones o células en cantidades desiguales donde la canlidad de transposón que contiene el marcador seleccionable excede mucho (5-10 veces en exceso) al transposón que contiene el ácido nucleico de interés. Células o animales transgénicos que expresan al ácido nucleico de interés pueden ser aislados con base en la presencia y expresión del marcador seleccionable. Porque los transposones se integrarán en el genoma de una manera precisa y sin relación (eventos de transposición independientes), el ácido nucleico de interés y el marcador seleccionable no están genéticamente ligados y fácilmente pueden separarse por segregación genética a través de reproducción estándar. Por consiguiente, se pueden producir animales que están constreñidos para retener marcadores seleccionados en generaciones subsecuentes, una cuestión de alguna consideración desde una perspectiva de salud pública.

Una vez que se ha generado el animal transgénico, se puede evaluar la expresión de un ácido nucleico exógeno usando téenicas estándares. Se puede lograr el cribado inicial mediante análisis por tinción Southern para determinar si o no ha tenido lugar la integración del constructo. Para una descripción de análisis Southern, ver la sección 9.37-9.52 de Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Coid Spring Harbor Press, NY. Las técnicas de reacción en cadena polimerasa (PCR) también se pueden usar en el cribado inicial. PCR se refiere a un procedimiento o técnica en la cual ácidos nucleicos objetivo son amplificados. Generalmente, la información de secuencia a partir de los extremos de la región de interés o más allá es empleada para diseñar cebadores oligonucleótidos que son idénticos o similares en secuencia a hebras opuestas del molde a ser amplificado. Se puede usar PCR para amplificar secuencias específicas a partir de ADN así como también ARN, incluyendo secuencias de ADN genómico total o ARN celular total. Los cebadores típicamente, son de 14 a 40 nucleótidos de longitud, pero pueden variar desde 10 nucleótidos a cientos de nucleótidos de longitud. Se describe PCR en, por ejemplo, PCR Primer: A Laboratory Manual, ed. Deffenbachy Dveksler, Coid Spring Harbor Laboratory Press, 1995. Los ácidos nucleicos también pueden ser amplificados mediante la reacción en cadena de ligasa, replicación de secuencia auto-sostenida por amplificación de desplazamiento de hebra, o amplificada con base en la secuencia de ácidos nucleicos. Ver, por ejemplo, Lewis (1992) Genetic Engineering News 12,1; Guatelli y colaboradores (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:1874; y Weiss (1991) Science 254:1292. En la etapa de blastocisto, los embriones pueden ser procesados individualmente para análisis por PCR, hibridización Southern y PCR esplinquerete (ver por ejemplo, Dupuy y colaboradores Proc. Nati. Acad. Sci. USA (2002) 99:4495).

La expresión de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica a un polipéptido en los tejidos de animales transgénicos puede ser evaluada usando téenicas que incluyen, por ejemplo, análisis por tinción Northern de muestras de ejido obtenidas del animal, análisis por hibrización in situ, análisis Western, inmunoensayos tales como ensayos por inmunosorbente ligado a enzima, y PCR transcriptasa inversa (RT-PCR).

Animales fundadores líneas animales rasgos y reproducción Se pueden producir animales fundadores por clonación y otros métodos descritos en la presente. Los fundadores pueden ser homocigóticos para una modificación genética, como en el caso donde un cigoto o célula primaria sufre una modificación homocigótico. De manera similar, también se pueden elaborar fundadores que son heterocigóticos . Los fundadores pueden ser modificados genómicamente, significa que todas las células en su genoma han sufrido modificación. Los fundadores pueden ser mosaicos para una modificación, como puede pasar cuando se introducen vectores en una de una pluralidad de células en un embrión, típicamente en una etapa de blastocisto. La descendencia de animales mosaico puede ser examinada para identificar descendencia que es genómicamente modificada. Una línea animal es establecida cuando un conjunto de animales ha sido creado que pueden ser reproducidos sexualmente o por téenicas reproductivas asistidas, con descendencia homocigótica o heterocigótica que expresa consistentemente la modificación.

En ganado, se conocen muchos alelos por estar vinculados a varios rasgos tales como rasgos de producción, rasgos de tipo, rasgos de capacidad de trabajo, y otros rasgos funcionales. Los expertos están acostumbrados a monitorear y cuantificar estos rasgos, por ejemplo, Visscher y colaboradores, Livestock Production Science, 40 (1994) 123-137, US 7,709,206, US 2001/0016315, US 2011/0023140, y US 2005/0153317. Una linea animal puede incluir un rasgo seleccionado de un rasgo en el grupo que consiste de un rasgo de producción, un rasgo de tipo, un rasgo de capacidad de trabajo, un rasgo de fertilidad, un rasgo de maternidad, y un rasgo de resistencia enfermedades. Rasgos adicionales incluyen la expresión de un producto genético recombinante.

Recombinasas Modalidades de la invención incluyen la administración de un TALEN o TALENs o una nucleasa digital de zinc con una recombinasa u otra proteina de enlace asociada con la recombinación de ADN. Las modalidades también incluyen la administración de una proteina de fusión recombinasa para crear una ruptura de doble hebra en un cromosoma celular, por ejemplo, una fusión RecA-gal4, como en la Pub. U.S. No. 2011/0059160.

Una recombinasa forma un filamento con un fragmento de ácido nucleico y, en efecto, busca ADN celular para encontrar una secuencia de ADN sustancialmente homologa a la secuencia. Una modalidad de una modalidad de recombinasa. TALEN comprende combinar una recombinasa con una secuencia de ácido nucleico que sirve como un molde. La secuencia molde tiene sustancial homología con un sitio que es destinado para corte por el par de TALEN/TALEN. Como se describe en la presente, la secuencia molde proporciona un cambio en el ADN nativo, por colocación de un alelo, creación de un indel, inserción de ADN exógeno, o con otros cambios. El TALEN es colocado en la célula o embrión mediante métodos descritos en la presente como una proteína, ARN , o mediante el uso de un vector. La recombinasa es combinada con la secuencia molde para formar un filamento y se coloca en la célula. La recombinasa y/o la secuencia molde que se combina con la recombinasa puede ser colocada en la célula o embrión como una proteína, un ARNm, o con un vector que codifica a la recombinasa. La descripción de la Pub. US.2011/0059160 es por incorporada a la presente como referencia para todos los propósitos; en caso de conflicto, la especificación es la que controla. El término recombinasa se refiere a una enzima de recombinación genética que cataliza enzimáticamente, en una célula, la unión de piezas relativamente cortas de ADN entre dos hebras de ADN relativamente más larga. Las recombinasas incluyen Cre recombinasa, Hin recombinasa, RecA, RAD51, Cre, y FLP. La Cre recombinasa es una topoisomerasa de tipo I de bacteriófago PI que cataliza la recombinación en sitio específico de ADN entre los sitios loxl'. La recombinasa Hin es una proteína de 21 kD compuesta de 198 aminoácidos que se encuentra en la bacteria Salmonella. Hin pertenece a la familia serina recombinasa de ADN invertasa en la cual depende de la serina de sitio activo para iniciar la fragmentación y recombinación de ADN. RAD 51 es un gen humano. La proteina codificada por este gen es un miembro de la familia de la proteina RAD51 la cual asiste en la reparación de la ruptura de la doble hebra del ADN. Los miembros de la familia RAD 51 son homólogos al RccA bacteriano y a Rad51 de levadura. Cre recombinasa es una enzima experimental que en pruebas de laboratorio ha removido exitosamente el ADN insertado por HIV desde células infectadas. La enzima se derivó de Cre recombinasa a través de la mutación selectiva para los propósitos de identificara marcadores de HIV, los cuales estén enlazados por sitios loxl' y por consiguiente impide intentos de recombinación Cre-Lox. FLP se refiere a la enzima de recombinación Flippasa (FLP o Flp) derivada del plásmido de 2m de la levadura de hornear Saccharomyces cerevisiae.

Un homólogo eucariótico de RecA, que también procesa actividad recombinasa, es la proteina Rad51, primero identificada en la levadura Sacharomyces cervisiae . Ver Bishop y colaboradores (1992) Cell 69:439-56 y Shinohara y colaboradores, (1992) Cell: 457-70 Aboussekhra y colaboradores (1992) Mol. Cell Biol.72, 3224-3234. Basile y colaboradores (1992) Mol. Cell. Biol. 12, 3235-3246. Las secuencias de Rad 51 vegetal se describen en las Patentes US Nos. 6,541,684; 6,720,478; 6,905,857; 6,905,857 y 7,034,117. Se ha descrito otra proteina de levadura que es homologa a RecA es la proteina Dmel. Los homólogos de RecA/Rad51 en organismos diferentes de E. coli y S. cerevisiae. Morita y colaboradores (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6577-6580;Shinohara y colaboradores (1993) Nature Genet. 4239; Hcyer (1994) Experientia 50: 223-233; Maeshima y colaboradores (1995) Gene 160:195-200; Patentes U.S.Nos. 6,541,684 y 6,905,857.

En la presente "RecA" o "proteina RecA", se refiere a una familia de proteínas de recombinación similares a RecA que tiene esencialmente todas o la mayor parte de las mismas funciones, particularmente: (i) la habilidad para posicionar apropiadamente oligonucleótídos o polinucleótidos sobre sus objetivos homólogos para extensión subsecuente por ADN polimerasas; (ii)la habilidad para preparar topológicamente ácidos nucleicos dupletos por síntesis de ADN y, (iii) la habilidad de RecA/oligonucleótido o el complejo RecA/polinucleótido para encontrar y enlazar eficientemente a secuencias complementarias. La proteína de RecA mejor caracterizada es de E. coli, además de la forma alélica original de la proteína, se ha identificado a un número de proteínas similares a RcA mutante, por ejemplo, RecA803.

Adicionalmente, muchos organismos tienen proteínas de transferencia de hebra similares a RecA que incluyen, por ejemplo, levaduras, Drosophila, mamíferos incluyendo humanos y plantas. Las poternas incluyen, por ejemplo, Recl, Rec2, Rad 51, Rad51B, Rad51C, Rad51D, Rad51ECC2 y DM. Una modalidad de la proteina de recombinación es la proteína RecA de E. coli, una proteína RecA de otra fuente bacteriana o una proteína de recombinación homologa de otro organismo.

Se puede formar un filamento de nucleoproteína, o "filamento". El término filamento, en el contexto de formar una estructura con una recombinasa, es un término conocido por los expertos en este campo. El filamento de nucleoproteína así formado puede ser entonces, por ejemplo, puesto en contacto con otro ácido nucleico o introducido en una célula. Métodos para formar filamentos de nucleoproteínas, en donde los filamentos comprenden secuencias de polipéptidos que tienen actividad recombinasa y un ácido nucleico son bien conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, Cui y colaboradores (2003) Marine Biotechnol.5:174-184 y las Patentes U.S. Nos.4,888,274; 5,763,240; 5,948,653 y 7,199,281, cuyas descripciones se incorporan a la presente como referencia para los propósitos de describir téenicas ejemplares para enlazar recombinasa a ácidos nucleicos para formar filamentos de nucleoproteínas.

En general, una molécula que tiene actividad recombinasa es puesta en contacto con un ácido nucleico de una hebra, lineal. El ácido nucleico de una hebra, lineal puede ser una sonda. Son conocidos los métodos de preparación de dicho ácido nucleico de una hebra. La mezcla de reacción contiene típicamente un ión magnesio. Opcionalmente, la mezcla de reacción es amortiguada y opcionalmente también contiene ATP, dATP o un análogo de ATP no hidrolizable, tal como, por ejemplo, ?-tio-ATP (ATR-i-S) o ?-tio-GTP (GTP-Í-S). La mezcla de reacción también puede contener, opcionalmente, un sistema generador de ATP. Moléculas de ADN de doble hebra pueden ser desnaturalizadas (por ejemplo, por calentamiento o alcalinización) ya sea antes de, o durante, la formación del filamento. La optimización de la proporción molar de recombinasa a ácido nucleico está en el experto en el arte. Por ejemplo, se pueden añadir una serie de diferentes concentraciones o recombinasa en una cantidad constante de ácido nucleico, y se ensaya la formación de filamento por movilidad en un gel de agarosa o acrilamida. Porque la proteína enlazada retarda la movilidad electroforética de un polinucleótido, la formación de filamento es puesta en evidencia por movilidad retardada del ácido nucleico. Ya sea, grado máximo de retardo, o cantidad máxima de ácido nucleico que migra con movilidad retardada, se pueden usar para indicar óptimas proporciones de recombinasa a ácido nucleico. La asociación de proteina-ADN también puede ser cuantificada midiendo la habilidad de un polinucleótido para enlazar a nitrocelulosa.

Polipéptidos En algunos casos se puede requerir una determinación del por ciento de identidad de un péptido a un grupo de secuencias expuestas en la presente. En dichos casos, el por ciento de identidad es medido en términos del número de residuos del péptido. Un polipéptido, por ejemplo, 90% de identidad, también puede ser una porción de un péptido más grande. Las modalidades incluyen los polipéptidos que tienen la identidad indicada y/o sustitución conservadora de secuencia expuesta en la presente.

El término aislado como se usa en la presente con referencia a un polipéptido se refiere a un polipéptido ya sea que no tenga contraparte que se encuentre naturalmente (por ejemplo, péptidomimético), o ha sido sintetizado químicamente y por consiguiente no está sustancialmente contaminado por otros polipéptidos, o ha sido separado o purificado a partir de otros componentes celulares por lo cual está acompañado naturalmente (por ejemplo, otras proteínas naturales, polinucleótidos, o componentes celulares.

Investigación e Instrumentos de Búsqueda Los procesos para modificar células y embriones en la presente son aplicables a una amplia variedad de instrumentos de búsqueda. Las células o embriones mismos son también útiles para búsqueda. Por ejemplo, programas de reproducción tradicional a menudo son muy confiables sobre tener un entendimiento de los componentes genéticos de los animales que son reproducidos. Los animales con rasgos deseables son criados para propiciar la reproducción. Estos rasgos son difícilmente dependientes de los genes y combinación de genes d e los animales. La colocación de genes en células o embriones, o modificar sus genes proporciona información valiosa acerca de cómo los genes interactúan para producir rasgos que sean de interés. Las células o embriones pueden ser cultivadas durante un tiempo y luego examinados. El embrión puede ser destruido antes de lograr cualquier etapa de desarrollo significativa, siempre que, no obstante proporcione conocimientos útiles.

Se presentan pruebas de cribado para cribar células o animales para una modificación como se expone en la presente. Como es evidente, es útil entender la condición del organismo cribado para determinar etapas siguientes para el proceso de búsqueda. Adicionalmente, en el caso de una manada expuesta a fiebre aftosa, es útil conocer cuáles animales en la manada son genéticamente resistentes a la enfermedad, y cuáles no. El cribado puede comprender examinar el ADN, por ejemplo, o examinar para una presencia de una proteína de elF4G resistente a proteasa. Una modalidad es una prueba o un método de cribado para una presencia de resistencia a fiebre aftosa, que comprende probar una célula, embrión, o animal, para determinar si comprende un gen elF4G modificado y/o una proteína de elF4G modificada. Por ejemplo, la célula, o una o más células del organismo, pueden ser destruidos para determinar la expresión de dicho gen o dicha proteína o ambos.

Referencias Todas las referencias siguientes se incorporan a la presente como referencia. Patentes y Solicitudes d Patentes expuestas en este documento también se incorporan a la presnete como referencia. En caso de conflicto, la presente especificación controla. 1. Thompson, D. y colaboradores, Eonomic costs of the foot and mouth disease outbreak in the United Kingdom in 2001. Rev. Sci. Tech.2002, 21: p 657-686.2. Grubman, M.J. y B. Baxt, Foot and mouth disease Clin. Microbiol. Rev., 2004, 17: p.465-493. 3. Cao, X. y colaboradores, Funcional Analysis of the t o aiternative translation initiation sites of foot and mouth disease virus. J. Virol., 1395, 69: p. 560- 563. 4. Glaser, W. y T. Skern, Extremely Efficient cleavage of elF4G bypicornaviral proteinases L y 2A in vitro. FEBS Lett ., 2000, 480: p. 151-155.5.Gradi,A.,ycolaboradores,Cleavage of eukaryotic translation initiation factor 4GII within foot-and-mouth disease virus-infected cells: Identification of the L-protease cleavage site in vitro. J. Virol., 2004.78: p. 3271-3278. 6. Nton, T.M., y colaboradores, Functional analysis of individual binding activities of the scaffold protein elF4G. J. biol. Chem., 2007.282: p. 1695-1708. 7. Aitken, C.E. y J.R. Lorsch, A mechanistic overview of translation initiation in eukaryotes. Nature Rev. Struc. Mol. Biol., 2012. 19: p. 568-576. 8. Kerekatte, V., y colaboradores, Cleavage of Poly (A) -bin ding protein by coxsackievirus 2A protease in vitro and in vivo: another mechanism for host protein synthesis shutoff? J. Virol., 1999. 73: p. 709-717. 9. Foeger, N., y colaboradores, The binding of foot-and-mouth disease virus leader proteinase to eIF4GI involves conserved ionic interactions. FEBS J., 2005. 272: p. 2602-261 1. 10. Prevot, D., J.L. Darlix, y T. Ohlmann, Conducting the initiation of protein synthesis: the role of eIF4G. Biol. Cell., 2003.95: p.141-156. 11. Lloyd, R.E., Translational control by viral proteinases. Virus Res., 2006. 1 19: p. 76-88. 12. Truniger, V. and M.A. Aranda, Recessive resistance to plant viruses. Adv. Virus Res., 2009. 75: p. 120-159. 13. De los Santos, T., y colaboradores, The leader proteinase of foot-and-mouth disease virus inhibits the induction of beta inferieron mRNA and blocks the host innate immune response. J. Virol., 2006. 80: p. 1906-1914. 14. Perez-Martin, E., y colaboradores, Bovine type III interferon significantly delays and reduces the severity of foot-and-mouth disease in cattle. J. Virol., 2012. 86: p. 4477-4487. 15. Wang, D., y colaboradores, The leader proteinase of foot-and-mouth disease virus negatively regulates the interferon pathway by acting as a viral deubiquitinase . J. Virol., 2011. 85: p.3758-3766. 16. Wang, D., y colaboradores, Foot-and-mouth disease virus leader proteinase inhibits dsRNA-induced type I interferon transcription by decreasing interfero regulatory factor 3/7 in protein levels. Biochem. Biophys. Res. Comm., 2010. 399: p. 72-78. 17. De los Santos, T., F. Diaz-San Segundo, and M.J. Grubman, Degradatio of nuclear factor kappa B during foot-and-mouth disease virus infection. J. Virol., 2007.81 : p. 12803-12815. 18. Borman, A.M., y colaboradores, elF4G and its proteolytic cleavage products: effect on initiation of protein synthesis from capped, uncapped, and IRES-containing mRNAs. RNA, 1997. 3: p. 186-196. 19. Zhao, X., y colaboradores, Protection of cap-dependent protein synthesis in vivo and in vitro with an eIF4G-l variant highly resistant to cleavage by Coxsackievirus 2 A protease. J. Biol. Chem., 2003. 278: p. 4449-4457. 20. López de Quinto, S. and E.

Martinez-Salas , Interaction of the eIF4G initiation factor with the aphthovirus IRES is essential for internal translation initiation in vivo. RNA, 2000, 6: p. 1380-1392. 21. Sal eh, L., y colaboradores, Functional interaction of translation initiation factor eIF4G with the foot-and-mouth disease virus internal ribosome entry site. J. Gen. Virol., 2001. 82: p. 757-763. 22. Hinton, T.M., y colaboradores, Conservation of L and 3C proteinase activities across distantly related aphthoviruses. J. Gen. Virol., 2002. 83: p. 31 11-3121. 23. Belsham, G.J., G.M. Mclnerncy, and N. Ross- Smith, Foot-and-mouth disease virus 3C protease induces cleavage of translation initiation factors eIF4A and eIF4G within infected cells. J. Virol, 2000.74: p. 272-280. 24.

Strong, R. and G.J. Belsham, Sequential modification of translation initiation factor eIF4GI by two different foot-and-mouth disease virus proteases within infected baby hámster kidney cells: Identification of the 3Cpro cleavage site. J. Gen. Virol., 2004.85: p. 2953-2962. 25. Piccone, M.E., y colaboradores, The foot-and-mouth disease virus leader proteinase gene is not required for viral replication.

J. Virol., 1995. 69: p. 5372-5382. 26. Masón, P.W., y colaboradores, Evaluation of a live-attenuated foot-and-mouth disease virus as a vaccine candidate. Virology, 1997.227: p. 96-102. 27. Chinsangaram, J., P.W. Masón, and M.J. Grubman, Protection of swine by live and inactivated vaccines prepared from a leader proteinase-deficient serotype A12 foot-and-mouth disease virus. Vaccine, 1998. 16: p. 1516-1522. 28. Chinsangaram, J., M. Koster, y M.J. Grubman, Inhibition of L-deleted foot-and-mouth disease virus replication by alpha/beta interferon involves double-stranded RNA-dependent protein kinase. J. Virol., 2001. 75: p. 5498-5503. 29. Fabian, M.R. y N. Sonenberg, The mechanics of miRNA-mediated gene silencing: a look under the hood of miRISC. Nature Rev. Struc. Mol. Biol., 2012.19: p.586-593. 30. Drake, J.W. and J.J. Holland, Mutation rafes among RNA viruses. Proc Nati Acad Sci USA, 1999. 96: p. 13910-13913. 31. Pfeiffer, J.K. and K. Kirkegaard, Increased fidelity reduces poliovirus fitness and virulence under selective pressure in mice. PLoS Pathog., 2005. 1 : p. el 1 32. Freistadt, M.S., J.A. Vaccaro, and K.E. Eberle, Biochemical characterization of the fidelity of poliovirus RNA-dependent RNA polymerase. Virol. J., 2007. 4: p. 44. 33. Lee, S.W., y colaboradores, Attenuated vaccines can recombine to form virulent field viruses. Science, 2012. 337: p.188. 34. Carlson, D.F., S.C. Fahrenkrug, y P.B. Hackett, Targeting DNA with fingers and TALENs. Mol. Ther. Nuc. Acids, 2012.1 : p. e3.35. Tan, S., y colaboradores, Precisión editing of large animal genomes. Adv. Genet., 2012.80: p. (in press).36. Lamphear, B.J. and R.E. Rhoads, A single amino acid change in protein synthesis initiation factor 4G renders cap-dependent translation resistant to picornaviral 2A proteases. Biochemistry, 1996. 35: p. 15726-15733. 37. A.M. GEURTS, y colaboradores, Knockout rats via embryo microinjection of zinc-finger nucleases, 325 Science (2009). 38. ID. CARBERY, y colaboradores, Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases, 186 Genetics (2010).39. Carlson, D.

F., J. R. Garbe, y colaboradores (2011). "Strategies for selection marker-free swine transgenesis using the Sleeping Beauty transposon System." Transgenic research 20(5): 1125-1 137. 40. Carlson, D. F., W. Tan, y colaboradores (2012). "Efficient TALEN- ediated gene knockout in livestock." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109(43): 17382-17387. 41. Guschin, D. Y., A. J. Waite, y colaboradores (2010). "A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification." Methods in molecular biology 649: 247-256. Solicitudes de Patentes también incorporadas como referencia en la presente: US 2010/0146655, US 2010/0105140, US 201 1/0059160, US 2011/0197290, US 2010/0146655, US 201 1/0197290, US 2012/0222143 and U.S. Serial No.61/662,767.

EJEMPLOS Materiales y Métodos, que incluyen la elaboración de TALENs, se describen generalmente en la U.S. Serial No. 13/594,694 presentada el 24 de Agosto de 2012, a menos que se indique de otra manera. Estos procesos han demostrado ser efectivos para cambiar alelos en células primarias que son luego usadas para elaborar animales fundadores modificados genéticamente que tengan alelos y los pase a su descendencia.

Ejemplo 1 Con referencia a la Figura 2, se muestra en el pánel A, una porción de E1F4G1 porcino. La secuencia d e tipo salvaje tiene residuos asparagina y leucina en las posiciones menos 3 y 2 en relación con el sitio de fragmentación Lpro (cabeza de flecha). En este ejemplo, el molde de HDR remplaza los residuos menos 3 y 2 con ácido aspártico y fenilalanina para convertir un E1F4G1 resistente a la fragmentación de Lpro. Se diseñaron dos pares de TALENs (parte superior) para cortar el E1F4G1 de tipo salvaje para estimular la recombinación homologa. Pánel B: ensayos por Surveyor (Cel-I) de fibroblastos de cerdo transíectados con cada par de TALEN. Pánel C: ensayo por RFLP para determinar la eficiencia de la recombinación homologa.

Se efectuaron las transfecciones en fibroblastos de cerdo en pasajes previos (<2 pasajes). Fibroblastos a 70-90% de confluencia fueron cosechados para usar en las transíecciones. Dos microgramos de ssEIF4G14.1 o ssEIF4G14.2 de ARNm de TALEN junto con 0.2 nMoles de un oligonucleótido homólogo de 90-mer (5'-cccagacttcactccgtcctttgccgacttcggccgaccagccctttageaaccgtgggcc ccaaggggtgggccaggtgggagctgcc) SEC ID NO: 18) fueron transíectadas en 500,000 fibroblastos usando el sistema d e nucleofección NEON (Life Technology) con los siguientes grupos: 1 impulso, 1800 v; 20 ms de ancho y una punta de 100 ml. Las células transfectadas fueron cultivadas 3 días ya sea a 30° Celsius antes de análisis de indel mediante el ensayo Surveyor (Transgenomic) (Carlson, Tan y colaboradores, 2012) y análisis por RFPL cuantitativo usando EagI. Los productos se resolvieron en gel PAGE al 10% y productos de fragmentación se midieron por densitometria. Por ciento de NHEJ se calculó como se describe en Guischin y colaboradores (Guschin, Waite y colaboradores, 2010) y se presenta a continuación. Se calculó el por ciento de recombinación homologa dividiendo la suma de la densidad del producto de fragmentación entre la suma de todos los productos.

Mutaciones adicionales del sitio de fragmentación de Lpro en EIF4G1 pueden ser introducidas en el futuro por el mismo método.

Ejemplo 2 Para aislamiento de colonias, se enumeraron las células y se plaquearon en un intervalo de densidades de 1-20 células/cm2 en placas de 10 cm. Se cultivaron las placas durante 10-15 dias hasta que estén presentes colonias individuales de 3-4 mm de diámetro. Las colonias individuales son aspiradas con u pipeteador p-200 bajo aspiración delicada y se expulsaron en un pocilio de la placa de 500 ml demedio de crecimiento (Carlson, Garbe y colaboradores, 2011). Las placas con colonias claramente definidas (~10-30/placa) serán seleccionadas por aspiración de colonias para limitar la probabilidad de aspirar células de múltiples colonia. Una vez que una colonia alcance 70-90% de confluencia en la placa de 24 pocillas, una porción será cosechada para análisis por RFPL y las restantes se crioconservaron. Las células serán tomadas de las colonias que se han determinado para tener características previstas adquiridas exitosamente y usadas para clonar para hacer animales fundadores.

Las modalidades específicas anteriores están previstas para ser ilustrativas y no limitantes. Las modalidades adicionales están en los conceptos amplios descritos en la presente. Además, aunque la invención se ha descrito con referencia a modalidades particulares, los expertos en el arte reconocerán que se pueden hacer cambios en la forma y detalle sin alejarse del espíritu y del alcance de la invención. Cualquier incorporación por documentos de referencia en la presente está limitada, de modo que no se incorpora ningún tema que sea contrario a la descripción explícita en la presente.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1.-Una célula in vitro caracterizada porque comprende una modificación en un gen elF4G o en un ácido nucleico que expresa a un gen elF4G exógeno.

2.-La célula de conformidad con la reivindicación 1 caracterizada porque el gen elF4G expresa a una proteina de elF4G alterada en relación con una proteina de elF4G de tipo salvaje del animal, dicha proteina de elF4G es resistente a fragmentación mediante una proteinasa de una enzima del virus de fiebre aftosa.

3.-La célula de conformidad con las reivindicaciones 1 y 2 caracterizada porque es seleccionada de un grupo que consiste de cerdo, pez, conejo, vaca, pollo, cabra, y oveja.

4.-La célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 caracterizada adicionalmente porque comprende la proteina de elF4G expresada por el gen elF4G modificado .

5.-Un ácido nucleico aislado caracterizado porque codifica a una isoforma de una proteina de elF4G que es resistente a fragmentación por una proteinasa de una enzima del virus de fiebre aftosa.

6.-Un método de cribado para una presencia de resistencia a la fiebre aftosa caracterizado porque comprende examinar una célula, embrión, o animal para determinar si comprende un gen elF4G modificado y/o proteina de elF4G modificada.

7.-Un método de crear un organismo modificado genéticamente caracterizado porque comprende: (a.) alterar un gen elF4G nativo de una célula, una célula primaria, o un embrión in vi tro y clonar la célula primaria o implantar el embrión en un animal madre, con el gen elF4G que está alterado para expresar a una isoforma de elF4G que resista la proteólisis por una proteasa de fiebre aftosa, o (b). añadir la expresión de un gen elF4G exógeno en una célula primaria o un embrión in vitro y clonar la célula primaria o implantar el embrión en un animal madre, con el gen elF4G exógeno que expresa a una isoforma de elF4G que resiste la proteólisis por una proteasa de fiebre aftosa, o (c). ambos (a) y (b).

8.-El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque comprende introducir en la célula primaria o el embrión; (a).un ácido nucleico que codifica a una nucleasa en sitio especifico que fragmenta específicamente un sitio en el gen elF4G nativo, y (b)un ácido nucleico molde que comprende al menos una porción del gen elF4G, con el molde que proporciona un alelo alternativo para el gen elF4G nativo, dicho alelo alternativo que codifica a una isoforma de elF4G que es resistente a fragmentación por una proteinasa de una enzima del virus de fiebre aftosa.

9.-El método de conformidad con la reivindicación 7 u 8, caracterizado porque la nucleasa de sitio específico es seleccionada del grupo que consiste de unas nucleasas digitales de zinc (ZFN), nucleasas efectoras similares a activadores transcripcionales (TALEN) y una Repetición Palindrómica Corta Interespaciada Regularmente Aglomerada (CRISPR).

10.-Un animal caracterizado porque es elaborado mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-9.

11.-Un animal ganadero modificado genéticamente caracterizado porque comprende una modificación genómica en un gen elF4G.

12.-El animal de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque tiene la modificación comprende una inserción, una eliminación, o una sustitución de una o más bases del gen elF4G.

13.-El animal de conformidad con la reivindicación 11 o 12, caracterizado porque tiene un gen elF4G que expresa a una proteína de elF4G alterada en relación con la proteína de elF4G de tipo salvaje del animal para ser resistente a fragmentación por una proteínasa de una enzima del virus de fiebre aftosa.

14.-El animal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-13 caracterizada porque tiene el gen elF4G que expresa a una proteína de elF4G alterada en relación con una proteína de elF4G nativa del animal para ser resistente a fragmentación por una proteínasa líder de la enzima del virus de fiebre aftosa (Lpro).

15.-El animal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-14 caracterizado porque tiene el gen elF4G que expresa a una proteína de elF4G alterada en relación con una proteína de elF4G de tipo salvaje del animal para ser resistente a fragmentación por el virus codificado por la proteasa 3C de la enzima del virus de fiebre aftosa (3Cpro).

16.-El animal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-15 caracterizado porque es seleccionado de un grupo que consiste de cerdo, pez, conejo, vaca, pollo, cabra, y oveja.

17.-El animal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-16 caracterizado porque el animal es de una primera reproducción y la modificación genómica es un alelo natural del gen elF4G encontrado en otra reproducción del animal.

18.-El animal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-16 caracterizado porque el animal es de una primera especie y la modificación genómica es un alelo del gen elF4G en otra reproducción de una segunda especie.

19.-El animal de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el animal es homocigótico para el gen elFG4G modificado

20.-El animal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-19 caracterizado porque es un animal fundador.

21.-El animal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-20, caracterizado adicionalmente porque comprende la proteina de elF4G expresado por el gen elF4G modificado.

22.-El animal de conformidad con las reivindicaciones 11-21 caracterizado porque es resistente a la fiebre aftosa.

23.-El animal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-22 caracterizado porque la proteina de elF4G modificada es modificada para prevenir el enlace de Lpro y/o Cpro.

24.-Un compuesto de ácido nucleico aislado caracterizado porque codifica a una proteina de elF4G que es resistente a fragmentación por una proteinasa de una enzima del virus de fiebre aftosa, para usarse en el tratamiento o prevención de fiebre aftosa.

25.-El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 24 caracterizado porque es un ácido nucleico que expresa a un gen elF4G exógeno de un ácido nucleico que expresa a una proteina de elF4G alterada en relación con una proteina de elF4G de tipo salvaje del animal.

26.-Un vector caracterizado porque codifica a un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 24 o 25.

27.-Un uso del ácido nucleico o vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-26 para tratar la fiebre aftosa o para la prevención de la misma. RESUMEN DE LA INVENCIÓN Células, genes y proteínas que abarcan un gen o proteína de elF-4G, resistente a proteasa. Un animal ganadero modificado genéticamente que comprende una modificación genómica en un gen elF-4G.