JP2016525890A - 遺伝的不妊性動物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2013年5月31日に出願された米国仮特許出願第61/829,656号明細書および2013年8月27日に出願された米国仮特許出願第61/870,558号明細書の優先権を主張し、これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の研究の諸側面は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)からの助成金1R43RR033149−01A1号および農務省(USDA)−飲食農業研究所(National Institute of Food and Agriculture)のバイオテクノロジーリスク評価プログラム競争的助成金第2012−33522−19766号による支援を受けた。米国政府は本発明において一定の権利を有し得る。
ある家畜種中の遺伝子は、他の家畜種中、ならびにヒトおよびマウス中のオルソログを常に有する。ヒトおよびマウス遺伝子は、家畜、特にウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、およびウサギ中のオルソログを常に有する。これらの種および魚類間の遺伝子オルソログは、遺伝子機能に応じて一致することが多い。生物学者らは、遺伝子オルソログを見出す方法に精通しているため、オルソログを列記せずに種の1つに関して遺伝子を本明細書に記載することができる。したがって、遺伝子の破壊を記載する実施形態は、他の種中の同一または異なる名称を有するオルソログの破壊を含む。一般的な遺伝子データベースならびに遺伝子オルソログの同定に特殊化されたデータベースが存在する。破壊のための遺伝子としては、配偶子形成、特に精子形成に選択的な遺伝子が挙げられる。精子の配偶子を破壊せずに精子形成を不能とするためのモチーフは、精子の運動性、先体融合、または配偶子合体に干渉することである。標的遺伝子としては、TENR、ADAM1a、ADAM2、ADAM、アルファ4、ATP2B4遺伝子、CatSper1、CatSper2、CatSper3、Catsper4、CatSperベータ、CatSperガンマ、CatSperデルタ、KCNU1、DNAH8、クラメジン(Clamegin)、コンプレキシン−I、セルトリ細胞アンドロゲン受容体、Gasz、Ra175、Cib1、Cnot7、Zmynd15、CKs2、PIWIL4、PIWIL2、およびSmcpからなる群から選択されるものを挙げることができる。
マーカーを定位置に残し、動物外でのその交配を可能とする方法を使用し、または動物中にマーカーを配置しない方法により、染色体改変について単アレルまたは両アレル性の動物を作製することができる。例えば、本発明者らは、相同依存性組換え(HDR)の方法を使用して動物の染色体の変化、または動物の染色体中への外因性遺伝子の挿入を作製した。ツール、例えば、TALENおよびリコンビナーゼ融合タンパク質、ならびに慣用の方法は、本明細書の他箇所で考察する。本明細書に開示の遺伝子改変を支持する実験データの一部を以下のとおりまとめる。本発明者らは、改変細胞の多遺伝子集団からクローン化する場合の例外的なクローン化効率を既に実証し、単離コロニーについての体細胞核移植(SCNT)によるクローン化効率の変動を回避するためにこのアプローチを推奨している(Carlson et al.,2011)。しかしながら、さらに、TALEN媒介ゲノム改変、およびリコンビナーゼ融合分子による改変は、単一世代における両アレル変更の達成を提供する。例えば、ノックアウト遺伝子についてホモ接合性の動物は、SCNTにより、ホモ接合性を生産するための同系交配なしで作製することができる。家畜、例えば、ブタおよびウシについての妊娠期間および生殖齢への成熟は、研究および生産に対する顕著な障壁である。例えば、クローン化および交配によるヘテロ接合性突然変異細胞(両方の性)からのホモ接合性ノックアウトの生成は、ブタおよびウシについてそれぞれ16および30ヵ月を要求する。一部は、遺伝子改変およびSCNT(Kuroiwa et al.,2004)の連続サイクルによりこの負荷を低減させているが、これは、技術的に困難であり、かなり費用を要する。SCNT前に両アレルKO細胞を定型的に生成する能力は、大型動物の遺伝子操作において顕著な発展である。両アレルノックアウトは、他の方法、例えば、ZFNおよび希釈クローン化を使用して不死細胞系において達成されている(Liu et al.,2010)。別のグループは、市販のZFN試薬を使用してブタGGTA1の両アレルKOを近年実証し(Hauschild et al.,2011)、両アレルヌル細胞をGGTA1依存性表面エピトープの不存在についてFACSにより濃縮することができる。これらの研究は、ある有用な概念を実証する一方、研究者らは動物または家畜を改変することができることを示していない。これは、単一クローン希釈は一般に初代線維芽細胞単離株に適しておらず(線維芽細胞は、低密度における成長が不十分である)、ヌル細胞についての生物学的濃縮が大多数の遺伝子に利用可能でないためである。
動物の生存を達成するためにブタゲノム中の2つの遺伝子編集遺伝子座APCおよびDAZLを選択した。大腸腺腫様ポリポーシス(APC)遺伝子中の突然変異は、家族性腺腫性ポリポーシス(FAP)を担うだけでなく、大多数の散発性結腸直腸癌において律速的な役割も担う。DAZL(無精子症欠失様(deleted in azoospermia−like))は、脊椎動物における生殖細胞分化に重要なRNA結合タンパク質である。DAZL遺伝子は受精能に関連しており、受精不能モデルおよび精子形成停止に有用である。DAZLまたはAPCのHDR編集アレルを有するコロニーをクロマチン移植によるクローン化のためにプールした。それぞれのプールは、3つの移植から2つの妊娠を生じさせ、そのうちの1つの妊娠をそれぞれ支援して命名した。合計8頭の仔ブタがDAZL改変細胞から生まれ、そのそれぞれは、HDRアレル(ファウンダー1650、1651および1657)またはNHEJから生じる欠失のいずれかと一致する選択コロニーの遺伝子型を反映した(図5パネルa)。DAZL仔ブタ203のうち3頭が死産であった。APC改変細胞からの6頭の仔ブタのうち、1頭が死産であり、3頭は1週間以内に死亡し、他は3週間後に死亡し、全てクローン化に関する不明の理由による可能性が高い。6頭全てのAPC仔ブタは目的HDR編集アレルについてヘテロ接合性であり、1頭を除き全てが第2のアレル上の3bpのインフレーム挿入または欠失を有した(図5パネルaおよびb)。残りの動物は、精子形成停止(DAZL−/−ファウンダー)または結腸癌の発生(APC+/−ファウンダー)の表現型分析のために育成した。
配偶子形成は、生殖系列前駆細胞が細胞分裂および分化を受けて成熟半数体配偶子を形成する生物学的プロセスを指す。動物は、性腺中の減数分裂を介して配偶子を生産する。始原生殖細胞(PGC)は、発生の間に生殖原細胞を形成する。雌生殖原細胞は、卵母細胞形成、卵子細胞形成(ootidogenesis)および卵子を形成するための成熟(卵子形成と称されることもある)の下位プロセスを有する卵子形成を受ける。雄生殖原細胞は、精子形成を受ける。生殖原細胞は、一次精母細胞(二倍体)を生じさせる精原細胞(二倍体)を生産するための減数分裂を受ける雄一次精細胞(二倍体)の前駆体である。一次精母細胞は、減数分裂を受け、精細胞としても公知の成熟精子(半数体)に発達する精子細胞(半数体)を形成する二次精母細胞(半数体)を形成する。精巣の精細管は、このプロセスのための出発点であり、内管壁に隣接する幹細胞は壁から開始して求心方向で分裂し、最も内側の部分に進行して精子細胞を生産する。精子細胞の成熟は、精巣上体中で生じる。マウスまたはラットにおける研究は、第1の動物の精細管がドナー動物からの組織および/または精原細胞を受容し得、その結果、供与された細胞が機能的な精子に成熟することを示している。レシピエントの精細管は、ドナー細胞についての精子形成プロセスを効率的に受け入れ得る。
相同性指向修復(HDR)は、ssDNAおよび二本鎖DNA(dsDNA)損傷を修復するための細胞中の機序である。この修復機序は、損傷部位と顕著な相同性を有する配列を有するHDRテンプレートが存在する場合に細胞により使用され得る。特異的結合は、生物学分野において一般に使用される用語であり、非標的組織と比較して相対的に高い親和性で標的に結合し、一般に複数の非共有相互作用、例えば、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などを含む分子を指す。特異的ハイブリダイゼーションは、相補的配列を有する核酸間の特異的結合の形態である。タンパク質も、例えば、TALENもしくはCRISPR/Cas9系において、またはGal4モチーフによりDNAに特異的に結合し得る。アレルの遺伝子移入は、テンプレートガイド型プロセスにより内因性アレルを上回って外因性アレルをコピーするプロセスを指す。内因性アレルは実際に切り出され、一部の状況において外因性核酸アレルにより置き換えられ得るが、現在の理論は、このプロセスはコピー機序であるということである。アレルは遺伝子ペアであるため、それらの間には顕著な相同性が存在する。アレルは、タンパク質をコードする遺伝子であり得、またはそれは他の機能、例えば、生物活性RNA鎖をコードすることまたは調節タンパク質もしくはRNAを受容するための部位を提供することを有し得る。
ゲノム編集ツール、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)および亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)は、バイオテクノロジー、遺伝子療法および多くの生物における機能的ゲノム研究の分野に影響を与えた。ごく最近、RNAガイド型エンドヌクレアーゼ(RGEN)が、相補的RNA分子によりその標的部位に指向される。Cas9/CRISPR系は、REGENである。tracrRNAは、別のそのようなツールである。これらは、標的化されるヌクレアーゼ系の例であり:これらの系は、ヌクレアーゼを標的部位に局在化させるDNA結合メンバーを有する。次いで、部位はヌクレアーゼにより切断される。TALENおよびZFNは、DNA結合メンバーに融合しているヌクレアーゼを有する。Cas9/CRISPRは、標的DNA上で互いに遭遇するコグネートである。DNA結合メンバーは、染色体DNA中のコグネート配列を有する。DNA結合メンバーは、典型的には、目的部位においても、その近くにおいても核酸分解作用が生じないように目的コグネート配列に照らして設計される。ある実施形態は、全てのそのような系、限定されるものではないが、例として、ヌクレアーゼ再開裂を最小化する実施形態、目的残基において正確にSNPを作製するための実施形態、およびDNA結合部位において遺伝子移入されているアレルの配置に適用可能である。
ゲノム編集ツール、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)および亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)は、バイオテクノロジー、遺伝子療法および多くの生物における機能的ゲノム研究の分野に影響を与えた。ごく最近、RNAガイド型エンドヌクレアーゼ(RGEN)が、相補的RNA分子によりその標的部位に指向される。Cas9/CRISPR系は、REGENである。tracrRNAは、別のそのようなツールである。これらは、標的化されるヌクレアーゼ系の例であり:これらの系は、ヌクレアーゼを標的部位に局在化させるDNA結合メンバーを有する。次いで、部位はヌクレアーゼにより切断される。TALENおよびZFNは、DNA結合メンバーに融合しているヌクレアーゼを有する。Cas9/CRISPRは、標的DNA上で互いに遭遇するコグネートである。DNA結合メンバーは、染色体DNA中のコグネート配列を有する。DNA結合メンバーは、典型的には、目的部位における、またはその近くの核酸分解作用を得るように目的コグネート配列に照らして設計される。ある実施形態は、全てのそのような系、限定されるものではないが、例として、ヌクレアーゼ再開裂を最小化する実施形態、目的残基において正確にSNPを作製するための実施形態、およびDNA結合部位において遺伝子移入されているアレルの配置に適用可能である。
本明細書において使用されるTALENという用語は広義であり、別のTALENからの支援なしで二本鎖DNAを開裂し得るモノマーTALENを含む。TALENという用語は、同一部位においてDNAを開裂するために一緒に機能するように遺伝子操作されたTALENのペアの一方または両方のメンバーを指すためにも使用される。一緒に機能するTALENは、DNAまたはTALENペアの掌性を参照する左側TALENおよび右側TALENと称することができる。
亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)は、亜鉛フィンガーDNA結合ドメインをDNA開裂ドメインに融合させることにより生成される人工的制限酵素である。亜鉛フィンガードメインは、所望のDNA配列を標的化するように遺伝子操作することができ、これにより、亜鉛フィンガーヌクレアーゼが複合体ゲノム内のユニーク配列を標的化することが可能となる。内因性DNA修復機構を利用することにより、これらの試薬を使用して高等生物のゲノムを変更することができる。ZFNは、遺伝子を不活性化させる方法において使用することができる。
ノックアウト目的のため、遺伝子の不活性化のため、遺伝子の発現を得るため、または他の目的のために、種々の核酸を細胞中に導入することができる。本明細書において使用される核酸という用語は、DNA、RNA、および核酸アナログ、および二本鎖または一本鎖(すなわち、センスまたはアンチセンス一本鎖)である核酸を含む。核酸アナログは、例えば、核酸の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解度を改善するように塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格において改変することができる。デオキシリボースリン酸骨格は、それぞれの塩基部分が6員モルホリノ環に連結しているモルホリノ核酸、またはデオキシリン酸骨格がシュードペプチド骨格により置き換えられており、4つの塩基が保持されるペプチド核酸を生産するように改変することができる。
動物は、TALENまたは他の遺伝子操作ツール、例として、リコンビナーゼ融合タンパク質、または公知の種々のベクターを使用して改変することができる。このようなツールにより作製される遺伝子改変は、遺伝子の破壊を含み得る。遺伝子の破壊という用語は、機能的遺伝子産物の形成の妨害を指す。遺伝子産物は、それがその通常の(野生型)機能を実行する場合にのみ機能的である。遺伝子の破壊は、遺伝子によりコードされる機能的因子の発現を妨害し、遺伝子によりコードされる配列中ならびに/または動物中の遺伝子の発現に必要なプロモーターおよび/もしくはオペレーターの1つ以上の塩基の挿入、欠失、または置換を含む。破壊される遺伝子は、例えば、動物のゲノムからの遺伝子の少なくとも一部の除去、遺伝子によりコードされる機能的因子の発現を妨害するための遺伝子の変更、干渉RNA、または外因性遺伝子によるドミナントネガティブ因子の発現により破壊することができる。遺伝子改変動物の材料および方法は、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる2012年2月24日に出願された米国特許出願第13/404,662号明細書、2012年5月9日に出願された米国特許出願第13/467,588号明細書、および2009年11月10日に出願された米国特許出願第12/622,886号明細書にさらに詳述されており、矛盾する場合、本明細書が優先する。トランス作用という用語は、異なる分子からの標的遺伝子に対して(すなわち、分子間)作用するプロセスを指す。トランス作用エレメントは、通常、遺伝子を含有するDNA配列である。この遺伝子は、標的遺伝子の調節において使用されるタンパク質(またはマイクロRNAもしくは他の拡散性分子)をコードする。トランス作用遺伝子は、標的遺伝子と同一の染色体上に存在し得るが、活性は、中間タンパク質またはそれがコードするRNAを介するものである。トランス作用遺伝子の実施形態は、例えば、標的化エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子である。ドミナントネガティブを使用する遺伝子の不活性化は、一般に、トランス作用エレメントを含む。シス調節またはシス作用という用語は、タンパク質もRNAもコードしない作用を意味し;遺伝子不活性化に関して、これは、一般に、遺伝子のコード部分、または機能的遺伝子の発現に必要なプロモーターおよび/もしくはオペレーターの不活性化を意味する。
種々の干渉RNA(RNAi)が公知である。二本鎖RNA(dsRNA)は、相同遺伝子転写物の配列特異的分解を誘導する。RNA誘導型サイレンシング複合体(RISC)は、dsRNAを小さい21〜23ヌクレオチドの小分子干渉RNA(siRNA)に代謝する。RISCは、二本鎖RNアーゼ(dsRNアーゼ、例えば、ダイサー)およびssRNアーゼ(例えば、Argonaut2またはAgo2)を含有する。RISCは、開裂可能な標的を見出すためのガイドとしてアンチセンス鎖を利用する。siRNAおよびマイクロRNA(miRNA)の両方が公知である。遺伝子改変動物中の遺伝子を破壊する方法は、標的遺伝子および/または核酸の発現が低減するように標的遺伝子および/または核酸に対するRNA干渉を誘導することを含む。
誘導性系を使用して遺伝子の発現を制御することができる。遺伝子の発現の時空間的制御を可能とする種々の誘導性系が公知である。いくつかは、トランスジェニック動物中でインビボで機能的であることが証明されている。誘導性系という用語は、慣習的なプロモーターおよび誘導性遺伝子発現エレメントを含む。
したがって、遺伝子は、除去またはRNAi抑制だけでなく、その遺伝子産物の通常の機能に対して阻害効果を有するタンパク質のドミナントネガティブバリアントの作出/発現によっても破壊することができる。ドミナントネガティブ(DN)遺伝子の発現は、表現型の変更をもたらし得、a)タイトレーション効果;(DNは、同一の活性を構成せずに内因性遺伝子の協調的因子または通常標的のいずれかについて内因性遺伝子産物と受動的に競合する)、b)ドミナントネガティブ遺伝子産物が通常の遺伝子機能に要求されるプロセスと能動的に干渉するポイズンピル(またはモンキーレンチ)効果、c)DNが遺伝子機能の負の調節因子を能動的に刺激するフィードバック効果により発揮される。
ファウンダー動物は、クローン化および本明細書に記載の他の方法により生産することができる。ファウンダーは、接合子または初代細胞がホモ接合性の改変を受ける場合のように、遺伝子改変についてホモ接合性であり得る。同様に、ヘテロ接合性のファウンダーを作製することもできる。ファウンダーはゲノム的に改変されていてもよく、このことは、そのゲノムにおける細胞の全てが改変を受けていることを意味する。ファウンダーは、ベクターを胚における複数の細胞の1つに、典型的には胚盤胞段階において導入する場合に起こり得るように、改変についてモザイクであり得る。モザイク動物の子孫を試験してゲノム的に改変されている子孫を同定することができる。有性生殖させることができ、または生殖補助技術により生殖させることができ、異種またはホモ接合性の子孫が常に改変を発現する動物のプールが作出された場合、動物系統が樹立される。
本発明の実施形態は、標的化されるヌクレアーゼ系をリコンビナーゼ(例えば、RecAタンパク質、Rad51)またはDNA組換えに関連する他のDNA結合タンパク質と投与することを含む。リコンビナーゼは、核酸断片とフィラメントを形成し、事実上、細胞DNAを探索してその配列と実質的に相同なDNA配列を見出す。例えば、リコンビナーゼは、HDRについてのテンプレートとして機能する核酸配列と組み合わせることができる。次いで、リコンビナーゼをHDRテンプレートと組み合わせてフィラメントを形成し、細胞中に配置することができる。リコンビナーゼおよび/またはリコンビナーゼと組み合わさるHDRテンプレートは、細胞または胚中に、タンパク質、mRNAとして配置し、またはリコンビナーゼをコードするベクターにより配置することができる。米国特許出願公開第2011/0059160号明細書(米国特許出願第12/869,232号明細書)の開示が、本明細書により全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれ、矛盾する場合、本明細書が優先する。リコンビナーゼという用語は、細胞中で2つの比較的長いDNA鎖間の比較的短いDNA片の結合を酵素的に触媒する遺伝子組換え酵素を指す。リコンビナーゼとしては、Creリコンビナーゼ、Hinリコンビナーゼ、RecA、RAD51、Cre、およびFLPが挙げられる。Creリコンビナーゼは、loxP部位間のDNAの部位特異的組換えを触媒するP1バクテリオファージからのI型トポイソメラーゼである。Hinリコンビナーゼは、細菌のサルモネラ属(Salmonella)中に見出される198アミノ酸から構成される21kDのタンパク質である。Hinは、DNA開裂および組換えの開始を活性部位セリンに頼るDNAインベルターゼのセリンリコンビナーゼファミリーに属する。RAD51はヒト遺伝子である。この遺伝子によりコードされるタンパク質は、DNA二本鎖分解の修復を支援するRAD51タンパク質ファミリーのメンバーである。RAD51ファミリーメンバーは、細菌RecAおよび酵母Rad51と相同である。Creリコンビナーゼは、loxP部位によりフランキングされる規定の配列を欠失させるための実験において使用される酵素である。FLPは、パン酵母の出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)の2μプラスミドに由来するフリッパーゼ組換え酵素(FLPまたはFlp)を指す。
本発明はまた、例えば、部位特異的エンドヌクレアーゼ、CRISPR、Cas9、ZNF、TALEN、RecA−gal4融合物をコードする核酸分子、そのポリペプチドを含有する組成物およびキット、そのような核酸分子もしくはポリペプチド、または遺伝子操作細胞系を含有する組成物を提供する。示されるアレルの遺伝子移入について効率的なHDRを提供することもできる。このようなアイテムは、例えば、研究ツールとして、または治療的に使用することができる。
形質移入 − 線維芽細胞を培養し、既に記載されているヌクレオフェクションにより形質移入する(Carlson et al.,2011)。トランスポゾンは、実験中の合計1μgを構成する。相同性依存性修復(HDR)分析のため、二本鎖分解(DSB)誘導のための最良の実施条件を選択し、修復テンプレートをTALENプラスミドに等量、3および10倍過剰において添加する。細胞培養 − 個々のコロニーの単離は、所定密度における96ウェルプレート中の選択により実施してウェルの30〜50%中のコロニーをもたらす。インデル検出集団 − 約500bpのアンプリコンをもたらすように標的部位をフランキングするプライマーを設計する。PCRアンプリコンをSURVEYOR(登録商標)ヌクレアーゼ(Transgenomic,Omaha NE)により提案のとおりにより処理し、8〜10%のポリアクリルアミドゲル上で分解する。インデル陽性胚盤胞からのアンプリコンの一部をクローン化し、配列決定して突然変異を特徴決定した。インデル検出コロニー − 上記で使用される標的部位をフランキングするプライマーを、高解像度融解分析qPCRマスターミックス(Invitrogen)を使用する増幅に使用し、融解曲線分析を実施する。リアルタイムPCR産物の融解プロファイルの変動は、TALEN誘導突然変異を担持するクローンを野生型配列から区別する。アンプリコン由来非形質移入対照細胞の融解温度の通常の変動を参照として使用する。通常の変動外の融解プロファイルを有するアンプリコンをクローン化し、配列決定して突然変異を特徴決定する。Y標的化検出 − PCRアッセイを相同性アームの外側のプライマーおよびアーム内の1つのプライマーにより開発して相同組換えが生じた場合にのみ考えられる産物をもたらす。PCR陽性コロニーをホールゲノム増幅サザンブロッティングにより検証する。Y標的化を確認するためのWGAサザンブロッティング − REPLI−g Mini Kit(Qiagen,Valencia,CA)の半反応を「Amplification of Blood or Cells」プロトコルに従って使用してWGAを個々のクローンに対して実施する。サザンブロッティングのためのプローブをハイブリダイズさせて標的化される細胞の5’および3’ジャンクションを検証する。FACS−XおよびY担持精細胞のソーティングのために、Hoechst33342が6.25uMの濃度に添加された1mlのBTS中に1500万個の精子を装入することにより新たな精液を調製する。この調製物を35℃において45分間インキュベートする。精子ソーティングのための標準的な改変を有する改変フローサイトメーターを使用してXおよびY担持精子をDNA含有率によりソーティングする(Johnson et al.,1987;Johnson and Pinkel,1986)。ソーティングされた集団の精度は、XおよびY標的についての定量的PCRにより決定する。血清ホルモン計測 − Endocrine Technologies(Newark,CA)からの市販のELISAキットを使用してテストステロンおよびFSHの血清レベルを評価する。
Carlson et al.2012は、トランスジェニック初代線維芽細胞を効率的に拡張させ、非トランスジェニック線維芽細胞(フィーダー細胞)と標準的密度(>150個の細胞/cm2)においてプレーティングし、上記に適用されるトランスポゾン同時選択技術を使用する薬物選択に供した場合にコロニーとして単離する家畜における標的遺伝子の改変を記載している(Carlson et al.,(2011)Transgenic Res.20:1125および2012年5月9日に出願された米国特許出願公開第2012/0220037号明細書)。これらの技術は、動物をクローン化するために使用することができる体細胞の遺伝子変化の作製に有用である。
ブタ低密度リポタンパク質受容体(LDLR)遺伝子の第4エキソンに標的化されるTALENペア(LDLR4.2)を、ブタLDLR遺伝子に対応する相同性アームおよびHDR時にネオマイシンホスホトランスフェラーゼの発現を可能とする遺伝子トラップを含有するスーパーコイルドプラスミドLdlr−E4N−stopと同時形質移入した。培養3日後、PCR分析により、抗生物質選択なしでも、HDRイベントに対応するバンドを30℃において標的化される遺伝子座において検出することができることが明らかになった。geneticin(G418)による14日間の培養細胞の集団の選択は、HDR細胞の顕著な濃縮をもたらした。
Tan et al.2013は、遺伝子のテンプレートドライブ型改変の一本鎖DNAの使用を記載している。一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(ssODN)は、TALEN刺激HRのための効率的なテンプレートである。11塩基対のBelgian Blueウシ突然変異をWagyu細胞中に遺伝子移入させるように遺伝子座を標的化した。11塩基対を欠失するBB GDF8遺伝子のセンスまたはアンチセンス鎖のいずれかを模倣するように2つの76塩基対ssODNを設計した。4マイクログラムのTALENコードプラスミドをWagyu細胞中に形質移入し、0.3nMolのssODNをTALEN(N)と同時形質移入し、またはMirusLT1(M)試薬もしくはLipofectamine LTX試薬(L)のいずれかによりTALENヌクレオフェクションの24時間後に送達した。3日目における半定量PCRは、ssODNをTALEN形質移入の24時間後にLIPOFECTAMINE LTX試薬により送達した条件において最大5%のアレル変換頻度が送達されたことを示した。標的に対して設計されたセンスおよびアンチセンスssODN間でPCRシグナルの差は観察されなかった。
Tan et al.(2013)は、ある種中で天然に生じるアレルを別の種に配置する(種間移動)ためのmRNAコードTALENおよび一本鎖オリゴヌクレオチドの組合せによる細胞の改変を記載している。PiedmonteseGFD8SNP C313Yが、一例として選択され、Ossabowブタ細胞中に導入された。これらの細胞中では、いずれの段階においてもマーカーは使用されなかった。0.4nmolのssODNにおいてHDRの類似ピークがブタおよびウシ細胞間で観察されたが(示さず)、HDRは、Ossabaw線維芽細胞中のより高濃度のssODNによっては消失しなかった。
遺伝子特異的gRNA配列をChurch実験室gRNAベクター(Addgene番号:41824)中にその研究者らの方法に従ってクローン化した。Cas9ヌクレアーゼは、hCas9プラスミド(Addgene番号:41815)またはRCIScript−hCas9から合成されたmRNAのいずれかの同時形質移入により提供された。このRCIScript−hCas9は、hCas9プラスミド(hCas9cDNAを包含)からのXbaI−AgeI断片の、RCIScriptプラスミド中へのサブクローン化により構築した。mRNAの合成は、上記のとおり実施したが、但し直鎖化はKpnIを使用して実施した。
CRISPR/Cas9媒介HDRを使用してイボイノシシからのp65S531P突然変異を慣用のブタ中に遺伝子移入した。図5を参照すると、パネルa)において、S531Pミスセンス突然変異をブタp65(RELA)のヌクレオチド1591におけるT−Cトランシジョンにより引き起こした。S−P HDRテンプレートは、新規XmaI部位を導入し、RFLPスクリーニングを可能とする原因TCトランシジョン突然変異(大文字)を含む。2つのgRNA配列(P65_G1SおよびP65_G2A)を、予備実験において使用されるp65.8TALENとともに示す。パネルb)において、Landrace線維芽細胞を、S−P−HDRオリゴ(2μM)、hCas9をコードする2つの量のプラスミド(0.5μgと2.0μg);5つの量のG2A転写プラスミド(0.05〜1.0μg)により形質移入した。それぞれの形質移入からの細胞を60:40に分け、それぞれ30および37℃において3日間培養してから10日目まで37℃において培養を延長した。Surveyorアッセイにより、16〜30%に及ぶ活性が明らかになった。パネルcおよびd)3および10日目において試料採取された細胞のRFLP分析。191および118bpの予測開裂産物を黒色矢印により示す。DSBと標的SNPとの近接性にかかわらず、CRISPR/Cas9媒介HDRはS531Pの遺伝子移入についてTALENより効率的でなかった。それぞれのgRNA配列を使用して個々のコロニーも分析した。
ブタAPCにおけるTALENおよびCRISPR/Cas9媒介HDRの比較。図6を参照すると、パネルa)において、APC14.2TALENおよびgRNA配列APC14.2G1aを、野生型APC配列に対して示す。最下段に、新規HindIII部位をもたらす4bp挿入(文字参照)を送達するHDRオリゴを示す。次いで、2μMのオリゴHDRテンプレート、および1μgのTALENmRNA、hCas9をコードする1μgのそれぞれのプラスミドDNAおよびgRNA発現プラスミドのいずれか;またはhCas9をコードする1μgのmRNAおよび0.5μgのgRNA発現プラスミドにより形質移入されたブタ線維芽細胞を分け、30または37℃のいずれかにおいて3日間培養してから10日目まで37℃において拡張させた。パネルb)RFLPおよびSurveyorアッセイ結果を示すチャート。既に決定されたとおり、TALEN刺激HDRは30℃において最も効率的であった一方、CRISPR/Cas9媒介HDRが37℃において最も効率的であった。この遺伝子座について、TALENは、SURVEYORアッセイにより計測された類似DNA切断頻度にかかわらずHDRの刺激についてCRISPR/Cas9系より効率的であった。TALENとは対照的に、hCas9をプラスミドに対してmRNAとして送達した場合にHDRにほとんど差が存在しなかった。
TALENおよびプラスミド相同性カセットの組合せを使用してmCaggs−EGFPカセットをY染色体に標的化した。この実験目的のため、陽性配向は、トランス遺伝子カセットの両方および内因性遺伝子(SRYまたはAMELY)が同一配向である場合であり、陰性配向は、それらを逆の配向である場合である。1マイクログラムのTALENmRNAと500ngの相同性カセットを、単一の100ulのエレクトロポレーションで600,000個の細胞と混合した。NEONエレクトロポレーション系(Life Technologies)を使用して細胞を形質移入し、30℃において3日間培養し、単一細胞由来コロニーの誘導のために低密度においてプレーティングした。相同性アームの外側の1つプライマーおよびトランス遺伝子カセット内の第2のプライマーを使用するジャンクションPCRによりY染色体の正確な標的化についてコロニーを分析した。いくつかのコロニーを予測アンプリコンについて陽性であった。図8は、図7に示される結果のまとめである。Y標的化について陽性のクローンは、6〜24パーセントに及んだ。トランス遺伝子カセットの配向は、Y標的化の効率に対するいくらかの効果を有すると考えられた。
プラスミド相同性カセットの代替法として、AMELYおよびSRY部位を標的化するように短鎖(50〜100bp)相同性アームを有する直鎖テンプレートを開発した。相同性テンプレートは、カセットの5’および3’末端に結合したプライマーを使用するユビキチンEGFPカセットのPCR増幅により作出し、Orlando et al.,2010(NAR;2010 Aug;38(15))に記載のとおり、想定TALEN誘導二本鎖分解の配列5’および3’に対応するテールを含んだ。プライマーは、内因性ヌクレアーゼによる分解を阻害するための第1の2つのヌクレオチド間のホスホルチオエート(phosphorthioate)結合を含んだ。2マイクログラムのTALENmRNA(または対照としての不使用)およびそれぞれの部位に特異的な1ugの短鎖相同性テンプレートを、典型的な100ulのエレクトロポレーションに含めた。エレクトロポレーション後、細胞を30または33℃のいずれかにおける3日間の培養のために分割し、次いでジャンクションPCRによりY標的化について試験した。30または33℃において培養された細胞は、Y標的化が30℃においてより効率的であることを産物強度が示唆するにもかかわらず、5’および3’ジャンクションの両方におけるY標的化について陽性であった。それぞれの部位について、正確なY標的化に対応するアンプリコンは、TALENに依存的であり、SRY3’ジャンクション上段バンドが非特異的バックグラウンドシグナルであることに留意されたい。形質移入後14日間培養された細胞集団は、非統合テンプレートをもはや発現しないはずである。EGFPについてのFACsを14日目の集団に実施しTALENと短鎖相同性テンプレートの組合せがテンプレート単独に対してEGFP陽性細胞の比率を増加させるか否かを決定した。実際、EGFP陽性細胞は、TALENを含めた場合に約3倍濃縮されており、温度の効果はほとんど観察されなかった(図10)。個々のEGFP陽性コロニーを、Y標的化についてゲノタイピングした。AMELYについては、EGFP陽性コロニーの0/5(0%)および2/5(20%)が30または33℃においてそれぞれ最初に培養された細胞からのY標的化についても陽性であった(図11)。SRYについては、EGFP陽性コロニーの5/24(21%)および0/9(0%)が30または33℃においてそれぞれ最初に培養された細胞からのY標的化についても陽性であった(図11)。
カスタム設計されたノックアウトアレルを有するブタを生成するため、本発明者らは、TALENおよびTan et al.,2013に記載のオリゴにより細胞を処理した。この実験のセットのため、それぞれブタDAZLまたはAPCを標的化するようにTALENおよびオリゴテンプレートを設計し、次いで単一コロニーを単離し、オリゴHDRにより導入された新規制限部位についてスクリーニングした。図12は、DAZLおよびAPCのHDRアレルを有するクローン化ブタを示す実験結果のモンタージュである。パネルa)は、DAZLおよびAPC改変landraceおよびOssabaw線維芽細胞にそれぞれ由来するクローン化仔ブタの制限断片長多型(RFLP)分析である。DAZLファウンダーの予測RFLP産物は、312、242、および70bp(白色三角)であり、APCについてのそれは310、221、および89bp(黒色三角)である。WTおよびDAZLファウンダー間の312bpバンドのサイズの差は、予測欠失アレルを反映する。パネルb)8頭のDAZLファウンダーの3頭、および6頭のAPCファウンダーの6頭中のHDRアレルの存在を裏付ける配列分析。ドナーテンプレート(HDR)における遮断突然変異を枠内に示し、挿入塩基を下線により示す。最上段のWT配列中の太文字は、TALEN結合部位を示す。パネルc)DAZL(左側)およびAPC(右側)ファウンダー動物の写真。
図13は、DAZL KOブタが精子形成の欠落および生殖細胞の完全な不存在を示すことを示す顕微鏡写真モンタージュである。a.精巣の内側部分からのDAZL KO精細管のH&E染色は、精原細胞の完全な不存在を示す。b.精巣の外側部分からのDAZL KO精細管のH&E染色も、精原細胞の完全な不存在を示す。c.精原細胞のマーカーのユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼL1(UCH−LI)は、野生型ブタ精巣中に存在する。d.UCH−LIはDAZL KO精巣中に不存在であり、このことは、精原細胞の不存在を示す。e.アセチル化a−チューブリンが野生型ブタ精巣の精細管中に存在し、このことは、精原細胞の存在を示す。f.DAZL KOブタ精細管はアセチル化a−チューブリンについて陰性であり、このことは、それらの動物中の生殖細胞の欠落を実証する。
実施形態は、例えば、参照のために番号付与された以下の全てを含む。1.配偶子形成に選択的に関与する標的遺伝子を破壊するための遺伝子改変を含む遺伝子改変動物であって、標的遺伝子の破壊が、動物の機能的配偶子の形成を妨害する遺伝子改変動物。2.遺伝子の破壊が、標的遺伝子をコードする配列および/またはそのシス調節エレメント中の1つ以上の塩基の挿入、欠失、または置換を含む、1の動物。3.破壊される遺伝子が、動物のゲノムからの遺伝子の少なくとも一部の除去、遺伝子によりコードされる機能的因子の発現を妨害するための遺伝子の変更、またはトランス作用因子により破壊される、1の動物。4.標的遺伝子が、トランス作用因子により破壊されており、前記トランス作用因子が、干渉RNAおよびドミナントネガティブ因子からなる群から選択され、前記トランス作用因子が、外因性遺伝子または内因性遺伝子により発現される、3の動物。トランス作用因子は、例えば、標的化されるヌクレアーゼであり得る。5.標的遺伝子の破壊が、誘導性系の制御下にある、1の動物。6.誘導性系が、Tet−On、Tet−Off、Cre−lox、Hif1アルファ、RHEOSWITCH、エクジソン遺伝子スイッチ、およびクメート(cumate)遺伝子スイッチからなる群のメンバーを含む、5の動物。7.標的遺伝子が、DAZL、vasa、CatSper、KCNU1、DNAH8、および精巣発現遺伝子11(Tex11)からなる群から選択される、1の動物。8.標的遺伝子が、X染色体または常染色体上に存在する、1の動物。9.標的遺伝子が、Y染色体上に存在する、1の動物。10.標的遺伝子の破壊が、雄配偶子または雌配偶子の形成を選択的に阻害する、1の動物。11.標的遺伝子が、TENR、ADAM1a、ADAM2、ADAM、アルファ4、ATP2B4遺伝子、CatSper遺伝子サブユニット、CatSper1、CatSper2、CatSper3、Catsper4、CatSperベータ、CatSperガンマ、CatSperデルタ、クラメジン、コンプレキシン−I、セルトリ細胞アンドロゲン受容体、Gasz、Ra175、Cib1、Cnot7、Zmynd15、CKs2、およびSmcpからなる群から選択される、1の動物。12.標的遺伝子が、精子形成に必要であり、遺伝子の破壊が、精子形成を選択的に阻害する、1の動物。13.標的遺伝子が、精巣発現遺伝子11(Tex11)を含む、12の動物。14.標的遺伝子が、精子運動性、精子先体融合、または精子配偶子合体に必要であり、標的遺伝子の破壊が、精子運動性、精子先体融合、または精子配偶子合体の1つ以上を選択的に阻害する、1の動物。15.標的遺伝子の破壊が、精子運動性を選択的に阻害し、かつ遺伝子が、TENR、ADAM1a、ADAM3、Atp1a4、およびATP2B4からなる群から選択される、14の動物。16.標的遺伝子の破壊が、精子先体融合を選択的に阻害し、かつ遺伝子が、ADAM2、ADAM3、CatSper、クラメジン、およびコンプレキシン−Iからなる群から選択される、14の動物。17.非ヒト脊椎動物、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、鳥類、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物、および魚類からなる群から選択される、1の動物。18.不妊性の雄であり、および機能的精子を生産し得ない、1の動物。19.標的遺伝子が、DAZLを含む、18の動物。20.ドナーの単相ドナー染色体対を有する機能的ドナー精子を生じさせるドナー細胞のレシピエントである、1の動物。21.ドナー細胞が、トランスジェニック組換えタンパク質の発現のための遺伝子をさらに含む、20の動物。22.生産形質、体型形質、作業性形質、受精能形質、母性形質、および疾患耐性形質からなる群から選択されるトランスジェニック形質を含む、1の動物。23.細胞および胚からなる群から選択される生物中に、細胞の染色体標的部位に特異的に結合し、二本鎖DNA分解を引き起こして遺伝子を破壊して配偶子形成を選択的に破壊する薬剤を導入することを含み、薬剤が、標的化されるエンドヌクレアーゼ、RNA、およびリコンビナーゼ融合タンパク質からなる群から選択される、動物の細胞を調製する方法。24.薬剤が、標的化されるエンドヌクレアーゼであり、かつTALENまたはTALENペアであり、TALENまたはTALENペアが、染色体標的部位に特異的に結合するための配列を含み、かつ遺伝子中の二本鎖分解を作出し、または第2の二本鎖分解を作出するさらなるTALENとの組合せで染色体中の二本鎖分解を作出し、遺伝子の少なくとも一部が、第1の分解および第2の分解の間で破棄される、23の方法。25.薬剤が、標的化ヌクレアーゼを含み、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、RNAガイド型ヌクレアーゼ、またはCRISPR/Cas9からなる群から選択される、23の方法。26.リコンビナーゼを生物中に標的化されるエンドヌクレアーゼと同時導入することをさらに含む、24の方法。27.薬剤の生物中への導入が、ペプチドとしての薬剤の直接注入、薬剤をコードするmRNAの注入、薬剤をコードするベクターへの生物の曝露、および薬剤をコードするプラスミドの生物中への導入からなる群から選択される方法を含む、23の方法。28.薬剤が、リコンビナーゼ融合タンパク質であり、標的化核酸配列を、融合タンパク質と導入することを含み、標的化核酸配列が、染色体部位への特異的結合のためにリコンビナーゼとフィラメントを形成する23の方法。29.リコンビナーゼ融合タンパク質が、リコンビナーゼおよびGal4を含む、23の方法。30.核酸を生物中に導入することをさらに含み、核酸を、生物のゲノム中に二本鎖分解の部位において、または第1の分解および第2の分解の間に導入する、23の方法。例えば、相同性依存性修復(HDR)は、例えば、オリゴベースHDRによる導入のための機序であり得る。31.細胞が、インビトロ細胞、インビトロ初代細胞、接合子、卵母細胞、配偶子形成細胞、精細胞、卵母細胞、幹細胞、および接合子からなる群から選択される、23の方法。32.細胞が、接合子または胚であり、接合子を代理母中に移植することを含む、31の方法。33.細胞をクローン化することを含む、31の方法。34.細胞のクローン化を、体細胞核移植およびクロマチン移植からなる群から選択される方法により実施する、33の方法。35.核酸テンプレートを細胞中に導入することをさらに含み、テンプレートが、分解により生産される末端と実質的に相同な末端を有する、23の方法。さらに、テンプレートはガイドHDRであり得る。36.薬剤を、細胞により転写される核酸として導入して薬剤を作製する、23の方法。37.動物が、非ヒト脊椎動物、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、鳥類、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物、および魚類からなる群から選択される、23の方法。38.遺伝子の破壊が、誘導性系の制御下にある、23の方法。39.破壊される遺伝子が、DAZL、vasa、CatSper、KCNU1、DNAH8、PIWIL4(MIWI2)、PIWIL2(MIWI)および精巣発現遺伝子11(Tex11)からなる群から選択される、23の方法。40.細胞の染色体標的部位に特異的に結合し、二本鎖DNA分解を引き起こして遺伝子を破壊して配偶子形成を選択的に破壊する薬剤を含み、薬剤が、標的化エンドヌクレアーゼ、およびリコンビナーゼ融合タンパク質からなる群から選択されるインビトロ細胞。41.薬剤が、TALENまたはTALENペアであり、TALENまたはTALENペアが、染色体標的部位に特異的に結合するための配列を含み、かつ遺伝子中の二本鎖分解を作出し、または第2の二本鎖分解を作出するさらなるTALENとの組合せで染色体中の二本鎖分解を作出し、遺伝子の少なくとも一部が、第1の分解および第2の分解の間で破棄される、40の細胞。さらに、薬剤が、標的化されるヌクレアーゼを含み、かつ亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、Tal−エフェクターヌクレアーゼ、RNAガイド型ヌクレアーゼ(例えば、CRISPR/Cas9)、メガヌクレアーゼからなる群から選択される、40の細胞。42.染色体が、Y染色体である、41の細胞。43.Y染色体のゲノム改変を含み、改変が、染色体の1つ以上の塩基の挿入、欠失、置換を含む遺伝子改変動物。例えば、動物は、非ヒト脊椎動物、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、鳥類、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物、および魚類からなる群から選択される。44.改変が、Y染色体の遺伝子においてなされている、43の動物。45.改変が、Y染色体を含む配偶子を不能とする因子をコードする外因性核酸の挿入を含む、43の動物。46.外因性核酸が、干渉RNA、標的化されるヌクレアーゼ、およびドミナントネガティブからなる群から選択される因子を発現する、43の動物。47.外因性核酸が、アポトーシス因子およびエンドヌクレアーゼからなる群から選択される因子を発現する、43の動物。48.外因性核酸の発現が、誘導性系の制御下にある、43の家畜動物。49.染色体上の外因性遺伝子を含み、遺伝子が、配偶子形成において選択的に活性化される遺伝子発現エレメントの制御下にある遺伝子改変動物。例えば、動物は、非ヒト脊椎動物、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、鳥類、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物、および魚類からなる群から選択される。50.染色体が、Y染色体である、49の動物。51.外因性遺伝子が、ヌクレアーゼをコードすることを含む、49の動物。さらに、ヌクレアーゼが、標的化されるエンドヌクレアーゼである、50の動物。52.さらに、標的化されるヌクレアーゼが、TALEN、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはCRISPR/Cas9からなる群から選択される、動物。さらに、標的化されるエンドヌクレアーゼは、標的遺伝子に特異的に結合し、それを開裂する。53.標的遺伝子が、DAZL、vasa、CatSper、KCNU1、DNAH8、PIWIL4、PIWIL2、および精巣発現遺伝子11(Tex11)からなる群のメンバーである、51の動物。54.遺伝子発現エレメントが、プロモーター、例えば、サイクリンA1プロモーター、または遺伝子発現エレメントを含む、49の動物。マイクロRNA部位を使用することができる。55.遺伝子発現エレメントが、精子形成に選択的であり、SP−10プロモーター、Stra8プロモーター、C−Kit、ACE、およびプロタミンからなる群から選択される、49の動物。56.遺伝子発現エレメントが、卵子形成に選択的であり、Nobox、Oct4、Bmp15、Gdf9、オージェネシン1およびオージェネシン2からなる群から選択される、49の動物。57.外因性遺伝子が、雄子孫の生産に選択的に要求される遺伝子を不活性化させ、かつ動物の有性生殖が、雌子孫のみを生産する、49の動物。58.外因性遺伝子が、雌子孫の生産に選択的に要求される遺伝子を不活性化させ、かつ動物の有性生殖が、雄子孫のみを生産する、49の動物。59.外因性遺伝子が、細胞に致死的であり、それにより雄または雌配偶子のみを破壊する因子を発現する、49の動物。60.因子が、アポトーシス因子または毒性遺伝子産物を含む、59の動物。61.因子が、アポトーシス性であり、かつ外因性遺伝子が、FAS、BAX、CASP3、およびSPATA17からなる群から選択される、59の動物。62.因子が、毒性であり、かつ遺伝子が、毒素遺伝子、バルナーゼ、ジフテリア毒素A、チミジンキナーゼ、およびリシン毒素からなる群から選択される、59の動物。63.因子が、エンドヌクレアーゼを含む、59の動物。64.(エンド)ヌクレアーゼが、RNAおよび/もしくはDNAの一般的な分解についての広域スペクトルのヌクレアーゼであり、またはそうでなければ一般的な細胞活性を破壊するために有用であり、例えば、ダイサーである、63の動物。65.遺伝的不妊性である雄または雌であり、外因性
遺伝子が、精子形成または卵子形成にそれぞれ選択的である第2の遺伝子に干渉し、それにより動物による良好な有性生殖を妨害する因子を発現する、49の動物。66.因子が、標的化エンドヌクレアーゼ、例えば、TALEN、干渉RNA、およびドミナントネガティブからなる群から選択される、65の動物。67.第2の遺伝子への干渉が、精子運動性、精子先体融合、または精子配偶子形成を選択的に阻害する、65の動物および/または外因性遺伝子が、精子ダイニン干渉タンパク質(SDIP)を含む、65の動物。68.機能的天然精子の生産なしで機能的ドナー精子を生成する遺伝的に受精不能な雄家畜動物を含む遺伝子改変動物。例えば、動物は、非ヒト脊椎動物、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、鳥類、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物、および魚類からなる群から選択される。69.ドナーの子孫を有性生殖する、68の動物。70.ドナーのゲノムが、生産形質、体型形質、作業性形質、受精能形質、母性形質、疾患耐性形質からなる群から選択される形質をさらに含む、68の動物。71.複数の68の動物を含む動物集団。72.動物のドナー精子細胞が、遺伝子型的に同一の染色体を担持する(あるいは、同一の生殖質を担持する)、71の動物集団。73.染色体上の外因性遺伝子を含み、遺伝子が、動物の子孫の性を制御する因子を発現し、一方の性のみの子孫を生産する遺伝子改変動物。例えば、動物は、非ヒト脊椎動物、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、鳥類、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物、および魚類からなる群から選択される。74.染色体が、Y染色体である、73の動物。75.外因性遺伝子が、細胞に致死的であり、それにより雄または雌配偶子または胚のみを破壊する因子を発現する、74の動物。76.外因性遺伝子が、ヌクレアーゼをコードすることを含む、75の動物。77.ヌクレアーゼが、RNAおよび/もしくはDNAの一般的な分解についての広域スペクトルのヌクレアーゼであり、またはそうでなければ一般的な細胞活性を破壊するために有用であり、例えば、ダイサーである、76の動物。78.ヌクレアーゼが、標的化エンドヌクレアーゼである、76の動物。79.因子が、アポトーシス因子または毒性遺伝子産物を含む、75の動物。80.因子が、アポトーシス性であり、かつ外因性遺伝子が、FAS、BAX、CASP3、およびSPATA17からなる群から選択される、77の動物。81.因子が、毒性であり、かつ遺伝子が、毒素遺伝子、バルナーゼ、ジフテリア毒素A、チミジンキナーゼ、およびリシン毒素からなる群から選択される、79の動物。82.外因性遺伝子が、因子およびマイクロRNAの融合物をコードする、75の動物。83.因子が、染色体の標的配列に特異的に結合し、それを開裂する標的化されるヌクレアーゼを含む、73の動物。84.標的化されるエンドヌクレアーゼが、TALEN、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、ガイド型RNA標的化ヌクレアーゼ、RecA融合タンパク質、およびメガヌクレアーゼからなる群から選択される、83の動物。85.因子が、標的化エンドヌクレアーゼ、例えば、TALEN、干渉RNA、およびドミナントネガティブからなる群から選択される、73の動物。86.外因性遺伝子が、雄子孫の生産に選択的に要求される遺伝子を不活性化させ、かつ動物の有性生殖が、雌子孫のみを生産する、83の動物。例えば、SRYまたはMIS(ミュラー管阻害物質)についての遺伝子を破壊することができる。
Claims (37)
- 配偶子形成に選択的に関与する標的遺伝子を破壊するための遺伝子改変を含む遺伝子改変家畜動物であって、前記標的遺伝子の前記破壊が、前記動物の機能的配偶子の形成を妨害する遺伝子改変家畜動物。
- 前記標的遺伝子の前記破壊が、誘導性系の制御下にある、請求項1に記載の家畜動物。
- 前記標的遺伝子が、DAZL、vasa、CatSper、KCNU1、DNAH8、および精巣発現遺伝子11(Tex11)からなる群から選択される、請求項1に記載の動物。
- 前記標的遺伝子が、X染色体、Y染色体、または常染色体上に存在する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の動物。
- 前記標的遺伝子の前記破壊が、雄配偶子または雌配偶子の形成を選択的に阻害する、請求項1に記載の動物。
- 前記標的遺伝子が、TENR、ADAM1a、ADAM2、ADAM、アルファ4、ATP2B4遺伝子、CatSper遺伝子サブユニット、CatSper1、CatSper2、CatSper3、Catsper4、CatSperベータ、CatSperガンマ、CatSperデルタ、クラメジン、コンプレキシン−I、セルトリ細胞アンドロゲン受容体、Gasz、Ra175、Cib1、Cnot7、Zmynd15、CKs2、およびSmcpからなる群から選択される、請求項1に記載の動物。
- 前記標的遺伝子が、精子形成に必要であり、前記遺伝子の破壊が、精子形成を選択的に阻害する、請求項1に記載の動物。
- 前記標的遺伝子が、精巣発現遺伝子11(Tex11)を含む、請求項7に記載の動物。
- 前記標的遺伝子が、精子運動性、精子先体融合、または精子配偶子合体に必要であり、前記標的遺伝子の破壊が、精子運動性、精子先体融合、または精子配偶子合体の1つ以上を選択的に阻害する、請求項1に記載の動物。
- 前記標的遺伝子の破壊が、精子運動性を選択的に阻害し、かつ前記遺伝子が、TENR、ADAM1a、ADAM3、Atp1a4、およびATP2B4からなる群から選択される、請求項9に記載の動物。
- 前記標的遺伝子の破壊が、精子先体融合を選択的に阻害し、かつ前記遺伝子が、ADAM2、ADAM3、CatSper、クラメジン、およびコンプレキシン−Iからなる群から選択される、請求項9に記載の動物。
- 非ヒト脊椎動物、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、鳥類、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、および魚類からなる群から選択される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の動物。
- 機能的精子を生産し得ない、請求項1に記載の動物。
- 前記標的遺伝子が、DAZLを含む、請求項13に記載の動物。
- ドナーの単相ドナー染色体対を有する機能的ドナー精子を生じさせるドナー細胞のレシピエントである、請求項1に記載の動物。
- 非ヒト細胞および非ヒト胚からなる群から選択される生物中に、前記細胞の染色体標的部位に特異的に結合し、遺伝子を破壊して配偶子形成を選択的に破壊する薬剤を導入することを含み、前記薬剤が、標的化エンドヌクレアーゼ、RNAガイド型ヌクレアーゼ、およびリコンビナーゼ融合タンパク質からなる群から選択される、動物の細胞を調製する方法。
- 前記薬剤が、前記標的化されるエンドヌクレアーゼであり、かつ前記染色体標的部位に特異的に結合するための配列を含むTALENまたはTALENペアを含む、請求項16に記載の方法。
- 核酸を前記生物中に導入することをさらに含み、前記核酸配列を、前記生物のゲノム中に前記染色体標的部位において導入する、請求項16または17に記載の方法。
- 前記細胞が、インビトロ細胞、インビトロ初代細胞、接合子、卵母細胞、配偶子形成細胞、精細胞、卵母細胞、幹細胞、および接合子からなる群から選択される、請求項16または17に記載の方法。
- 核酸テンプレートを前記細胞中に導入することをさらに含み、前記テンプレートは、分解により生産される末端と実質的に相同である末端を有し、核酸テンプレート配列を、前記生物のゲノム中に前記染色体標的部位において導入する、請求項16または17に記載の方法。
- 前記動物が、非ヒト脊椎動物、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、鳥類、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物、および魚類からなる群から選択される、請求項16〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記破壊される遺伝子が、DAZL、vasa、CatSper、KCNU1、DNAH8、および精巣発現遺伝子11、TENR、ADAM1a、ADAM2、ADAM、アルファ4、ATP2B4遺伝子、CatSper遺伝子サブユニット、CatSper1、CatSper2、CatSper3、Catsper4、CatSperベータ、CatSperガンマ、CatSperデルタ、クラメジン、コンプレキシン−I、セルトリ細胞アンドロゲン受容体、Gasz、Ra175、Cib1、Cnot7、Zmynd15、CKs2、およびSmcpからなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
- 細胞の染色体標的部位に特異的に結合し、二本鎖DNA分解を引き起こして遺伝子を破壊して配偶子形成を選択的に破壊する薬剤を含み、前記薬剤が、標的化エンドヌクレアーゼ、RNAガイド型ヌクレアーゼ、およびリコンビナーゼ融合タンパク質からなる群から選択されるインビトロ細胞。
- 前記薬剤が、前記染色体標的部位に特異的に結合するための配列を含み、かつ前記遺伝子の前記二本鎖分解を作出するTALENまたはTALENペアである、請求項23に記載の細胞。
- 前記薬剤が、前記標的化ヌクレアーゼを含み、かつ亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、Talエフェクターヌクレアーゼ、RNAガイド型ヌクレアーゼ、およびメガヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項23に記載の細胞。
- 前記染色体が、Y染色体である、請求項23〜25のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記動物が、非ヒト脊椎動物、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、鳥類、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物、および魚類からなる群から選択される、請求項23〜26のいずれか一項に記載の細胞。
- Y染色体のゲノム改変を含み、前記改変が、前記染色体の1つ以上の塩基の挿入、欠失、または置換を含む遺伝子改変家畜動物。
- 染色体上の外因性遺伝子を含み、前記遺伝子が、配偶子形成において選択的に活性化される遺伝子発現エレメントの制御下にある遺伝子改変家畜動物。
- 前記外因性遺伝子が、雄子孫の生産に選択的に要求される遺伝子を不活性化させ、かつ前記動物の有性生殖が、雌子孫のみを生産する、請求項29に記載の動物。
- 前記外因性遺伝子が、雌子孫の生産に選択的に要求される遺伝子を不活性化させ、かつ前記動物の有性生殖が、雄子孫のみを生産する、請求項29に記載の動物。
- 前記外因性遺伝子が、細胞に致死的であり、それにより雄配偶子のみまたは雌配偶子のみを破壊する因子を発現する、請求項30または31に記載の動物。
- 遺伝的不妊性である雄または雌であり、前記外因性遺伝子が、精子形成または卵子形成にそれぞれ選択的である第2の遺伝子に干渉し、それにより前記動物による良好な有性生殖を妨害する因子を発現する、請求項30または31に記載の動物。
- 前記第2の遺伝子への干渉が、精子運動性、精子先体融合、または精子配偶子合体を選択的に阻害する、請求項33に記載の動物。
- 機能的天然精子の生産なしで機能的ドナー精子を生成する遺伝的に受精不能な雄家畜動物を含む遺伝子改変動物。
- 前記ドナーの子孫を有性生殖する、請求項35に記載の動物。
- 非ヒト脊椎動物、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、鳥類、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物、および魚類からなる群から選択される、請求項35または36に記載の動物。
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