CN113558012A - 一种哺乳动物繁育雌性多胎的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种哺乳动物繁育雌性多胎的方法，涉及哺乳动物培育技术领域。该方法包括如下步骤，包括如下步骤，选择缺失SRY基因的染色体为XY的哺乳动物雌性的卵子母本以及含多胎基因的哺乳动物雄性的精子作为父本，将所述父本的精子与所述母本的卵子体外授精，得到含多胎基因且缺失SRY基因的子代，将所述子代横交，得到能表达多胎性状和SRY基因缺失性状的染色体为XY的雌性个体，该方法不仅能够使哺乳动物进行多胎繁育，还能使繁育的后代几乎都为雌性，从而提高了哺乳动物的利用价值，也使哺乳动物的繁育更加容易，并且将人工授精的方式用于哺乳动物，不仅使操作更加简便，并且大大缩短了培育时间。
Description
技术领域
本发明涉及哺乳动物培育技术领域，具体而言，涉及一种哺乳动物繁育雌性多胎的方法。
背景技术
哺乳动物的多胎繁育一直是目前急需解决的一种业界问题，现目前只有羊的多胎繁育比较稳定，而牛等其他哺乳动物的多胎繁育仍然是目前需要解决的问题。根据现目前相关的各种研究结果显示，羊之所以能够进行多胎繁育，主要是因为羊体内的多胎基因的表达，而其他哺乳动物如牛等，其多胎基因表达的个体相对稀少，且不容易遗传。
另外，在哺乳动物中，如牛、羊等，其中主要为母羊和母牛的产奶量更高，且母牛和母羊的皮毛更加光滑，利用价值也较高，因此在哺乳动物中，雌性的直接利用价值明显高于雄性，因此目前如何稳定的繁育出更多的雌性哺乳动物也是目前主要需要解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种哺乳动物繁育雌性多胎的方法，该方法不仅能够使哺乳动物进行多胎繁育，还能使繁育的后代几乎都为雌性，从而提高了哺乳动物的利用价值，也使哺乳动物的繁育更加容易，并且将人工授精的方式用于哺乳动物，不仅使操作更加简便，并且大大缩短了培育时间。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
一种哺乳动物繁育雌性多胎的方法，包括如下步骤，选择缺失SRY基因的染色体为XY的哺乳动物雌性的卵子母本以及含多胎基因的哺乳动物雄性的精子作为父本，将父本的精子与母本的卵子体外授精，得到含多胎基因且缺失SRY基因的子代，将子代横交，得到能表达多胎性状和SRY基因缺失性状的染色体为XY的雌性个体。SRY基因，又被称为睾丸决定因子，为雄性的性别决定基因，指Y染色体上具体决定生物雄性性别的基因片段。人的SRY基因位于Yp11.3，只含有一个外显子，没有内含子，转录单位长约1.1kb，编码一个204氨基酸的蛋白质。由于SRY蛋白含有一个典型的DNA结合结构域：高泳动类非组蛋白盒基序，类似于已知的转录因子，所以推测SRY编码一个转录因子。SRY的HMG域以一种序列特异的方式与DNA相结合，在双螺旋结构中引入一个尖锐的转折。有证据显示，性反转病人HMG域中的突变可分为两类：影响DNA结合和影响DNA弯曲的，提示这两种性质对于SRY蛋白行使转录调节功能来说都很重要。已发现HMG域在体外能以高亲和力与钙调素相结合。这一现象的功能意义不明，但提示SRY的活性可能受另一个层次的调控。人类的SRY基因定位在雄性Y染色体的短臂上，长约850bp，其仅含有一个单外显子，SRY基因含有一个多聚腺苷酸尾巴、两个转录起始位点，中间为开放阅读框；SRY基因编码一个含有204个氨基酸的蛋白质，称为SRY蛋白，SRY蛋白包含一端79个氨基酸的高保守区——高泳动组盒基序，其在不同的哺乳动物体内具有高度的同源性。例如人和牛的SRY基因的HMG盒同源性高达84％，大量研究证实哺乳动物雄性生殖器官的正常发育前提是SRY基因功能的正常发挥。且SRY基因功能发挥具有时序特异性，其在雄性胚胎和胎儿的发育过程中即雄性生殖器官产生的不同阶段其甲基化程度明显不同。
相对于现有技术，本发明的实施例至少具有如下优点或有益效果：
本发明的实施例提供一种哺乳动物繁育雌性多胎的方法，其通过将多胎基因和缺失SRY基因的哺乳动物群体进行杂交，不仅能够使哺乳动物进行多胎繁育，还能使繁育的后代几乎都为雌性，从而提高了哺乳动物的利用价值，也使哺乳动物的繁育更加容易。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。
本发明实施例提供一种哺乳动物繁育雌性多胎的方法，包括如下步骤，选择不含多胎基因的哺乳动物雌性作为第一母本以及含多胎基因的哺乳动物雄性作为第一父本，将所述第一父本与所述第一母本杂交，得到含多胎基因的F1子代，将所述F1子代横交，得到含多胎基因的F2子代，将所述F2子代作为第二父本，选取所述染色体为XY型且缺失SRY基因的哺乳动物雌性作为母本，将所述母本与所述第二父本杂交，得到含多胎基因和缺失SRY基因的F3子代，将所述F3子代横交多代，筛选出后代中含多胎基因且缺失SRY基因的个体，即得到繁育雌性多胎的哺乳动物。
在本发明的一些实施例中，上述母本还包括激活的SOX9基因。SOX9基因通常只在男性体内活动，当男性的SOX9一旦被开启，FOXL2的活动就遭抑制，并进而终身停顿。这种情况在女性体内刚好相反，FOXL2会最先被启动。学界普遍了解FOXL2对女性维持女性特征与卵巢的成长十分重要，然而科学家并不预期卵巢中的排卵细胞会被SOX9基因吸收，进而发挥男性生育功能。Sox9基因是继Sry基因后发现的又一性别决定的Sox家族成员为一转录激活因子，位于常染色体上。人类Sox9含两个内含子，在哺乳动物﹑禽类和爬行动物中的Sox9高度保守8。人类Sox9基因突变可引起骨畸形综合征；含额外的Sox9的XX个体发育为男性，而大部分仅含一个有功能的Sox9的XY个体发育为女性或两性人说明Sox9不管在骨骼发育还是在性别决定中均起着重要作用。小鼠的Sox9基因仅在雄性生殖啃中表达，表达时间较Sry晚。抗牟勒氏管激素基因是Sox9下游的一个重要基因编码脊椎动物早期雄性发育中抗牟勒氏激素，Sox9基因在激活Amh中起关键性作用：soX9蛋白与Amh启动子结合，促进Amh基因的表达。SOX9蛋白和SRY蛋白功能相似在Sry基因缺失的前提下Sox9亦能诱发雄性性别分化以保证雄性性腺的正常发育。
在本发明的一些实施例中，上述母本还包括激活的SOX3基因。Sox3位于X染色体上小鼠定位于X染色体最保守区段是与Sry相关的基因。Sox3是已发现的Sox基因家族中与Sry相似性最高的基因，Sry是Sox3的抑制因子，由Sox3侧翼序列平截形成的8。Sox3也因此被认为是Sry进化的鼻祖，多数学者认为二者也可能是一对等位基因。
在本发明的一些实施例中，上述母本还包括激活的DAX1基因。Daxc1蛋白是Dax1基因(DSS-AHC criticalregion on the X chromoe gene 1)编码的核激素受体超家族的1个蛋白，1980年发现于XY女性患者中并于1994年克隆出基因[6。Daxl蛋白是受视黄酸受体调节转录的负调节因子。研究表明，当人类X染色体某个部位突变加倍后，可引起XY个体向女性方向发育这一突变部位的片段被称为性逆转基因该基因与先天性肾上腺发育不全促性腺激素分泌不足性生殖腺机能减退共同连锁在X染色体上。人类Dax1基因编码一种核蛋白可与DNA结合并调节其转录，一般情况下，SRY抑制Daxl基因但当Daxl出现多余的活性拷贝时，可致SRY正常的XY个体发生性反转为女性。在雄性小鼠中出现额外的Daxl拷贝将导致性反转：将携带Dax-1基因的DNA片段导入XY小鼠胚胎中，出现睾丸发育迟缓甚至性反转，说明Dax1基因对Sry基因有抑制作用。DAxl是一抗睾丸因子，通过抑制类固醇生成因子1和威尔姆氏肿瘤抑制基因1于性别分化中起协同作用阻止生殖峭向雄性分化。研究表明Dax1可以破坏Wtl的功能从而抑制Sry的表达同时通过核受体共抑制物抑制的转录激活。Daxl与Sry二者产物可相互拮抗，Dax1表达量的增加导致个体朝雌性方向发育反之Sry表达量的增加会诱导个体发育为雄性。
在本发明的一些实施例中，上述母本还包括激活的SF1基因。sf1也称Ad4BP或NRSA1，属于孤核激素受体的家族成员，它的cDNA与小鼠中来源于癌细胞eDNA文库的eDNA极为相似。Sf1具有明显的DNA结合区和配体结合区其作用主要表现在以下两方面：(1)是肾上腺皮质激素表达调节的决定因子之一通过对成年小鼠的各组织检测发现，只要产生甾族化合物的组织中都检测到Sf1的表达活性也在足细胞中表达，可见Sf1对肾上腺发育、甾族化合物的产生以及早期胚胎发育均起着重要作用。(2)sf1直接调节牟勒氏体抑制基因的表达。胚胎早期足细胞转染发现Sf1与Mis的调控区Mis-RE-1可相互作用两者互相激活同时也发现对其他细胞系的Sf1和Mis并没有活性表达早期，足细胞内或许含有Mis转录所依赖的Sf1配体，配体和配体结合区相结合导致配体结合区脱离Sf1，sf1激活表达促进Mis的转录。Sf1也结合Daxl基因的启动子诱导其转录。
在本发明的一些实施例中，上述母本还包括AMH基因的缺失。Amh也被称为Mis，是雄性性别分化中的一个重要因子，该基因的突变将导致永久性牟勒管综合征。Amh基因的表达在Sry表达后迅速开始是支持细胞中第一个可鉴别的产物。研究表明，Sry蛋白并不直接结合到Amh的调节元件上，而是通过间接方式诱导Ahm的表达推测Sry和Amh之间应该有其他中间因子的参与。随后发现在Amh启动子上游有Sox9蛋白和S1的结合序列1上与Amh基因结合位点的突变将导致Amh基因的表达量减少，而.Sox9上的结合位点突变则会使Amh基因的表达量完全消失，说明Sox9或许是Amh基因的激活开关，一旦Amh基因被激活则由Sf1蛋白和1蛋白共同作用促进Amh基因的表达提高转录水平。
在本发明的一些实施例中，上述母本还包括WT1基因的缺失。wt1基因抑制细胞分裂和分化与精巢的形成有关。W1基因主要在尿殖管道的发育中起重要作用。剔除Wt1基因的小鼠会缺少雄性性腺而出现发育反常，说明Wtl基因在雄性性腺发育过程中有一定调节作用。人Wt1基因位于第17号染色体，wt1蛋白的DNA结合结构域为4个Cys-Cys锌指。该基因突变将导致Denys-Drash综合症其特征是患Wilms瘤、肾和性腺发育异常。
在本发明的一些实施例中，上述母本还包括DMRT1、DMRT2和DMRT3基因的缺失。dmrt基因所编码的蛋白质中包含一个具有DNA结合能力的保守基序:DM结构域。目前所报道的Dmrt家族成员共8个，即Dmrtl，2，3，4，5 6，7，8其中Dmr2有2个亚型Dmrt2a和Dmrt2b，除Dmrt8外，其他成员所编码产物仅DM域具有高度保守性。Dmrt在多个物种中存在同源物，是迄今为止在所发现的性别决定基因中唯一一个在种属间具有保守性的基因，人类胚胎中Dmrt1，2和3对精巢正常发育有重要作用，其中Dmrtl与Sry相似，该基因的缺失会导致性反转现象的发生。现有研究表明尽管Dmrt1参与了哺乳动物雄性性腺的分化，但并非雄性性别决定的主要基因。
在本发明的一些实施例中，上述母本还包括激活的WNT4基因。Wnt4基因抑制睾丸间质细胞的分化，诱导雌性卵巢的形成，过表达Wnt4基因进而上调DAX1的表达水平，导致雌性表型形成。雌性大鼠的Wnt4基因如果发生突变，则导致其卵巢发生雄性化，间质细胞分泌雄激素.进而中肾管分化以及苗勒氏管缺失等。WNT/RSPO信号与FOXL2协同决定哺乳动物的雄性性腺向雌性性器官发育。β-catenin信号的抑制对于雄性Scrtoli细胞的发育具有重要作用。在Scrto-li细胞超表达CTNNB1，Sertoli细胞会向颗粒样细胞分化，CTNNBI通过与FOXL2启动子区的Tcl/Lef特定位点结合引起Fox12表达；而在Sertoli细胞超表达Foxl2，引起Sertoli细胞相关基因特异性下调。
在本发明的一些实施例中，上述表达多胎性状和SRY基因缺失性状的染色体为XY的雌性个体的多胎性状和SRY基因缺失性状能够稳定遗传。通过稳定遗传的个体才能保证多胎性状和雌性性状的稳定遗传。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例
这里选用牛作为其中的例子。取142只无患病，体重不低于60公斤、体长不低于60cm且体高不低于60cm的成年贵州荷斯坦牛，58只无患病，体重不低于40公斤、体长不低于40cm且体高不低于40cm的周岁贵州荷斯坦牛作为第一母本。再取127只无患病、含FecB和SRY基因缺失、SOX9、SOX3、DAX1、SF1、AMH基因缺失、WIT1基因缺失、DMRT1、DMRT2和DMRT3基因缺失和WNT4基因，体重不低于70公斤、体长不低于80cm且体高不低于80cm的成年山东欧洲野牛，73只无患病、含FecB和HGTP基因，体重不低于50公斤、体长不低于70cm且体高不低于70cm的周岁欧洲野牛作为第一父本；通过人工授精将山东欧洲野牛的精子授于贵州荷斯坦牛的卵子内，再将发育成胚胎后的受精卵送入贵州荷斯坦牛的子宫中进行培养，三年后筛选出后代中无患病、含FecB和HGTP基因且体重不低于90公斤、体长不低于80cm以及体高不低于80cm的成年公牛，无患病、含FecB和HGTP基因且体重不低于70公斤、体长不低于70cm以及体高不低于60cm的成年母牛，无患病、含FecB和HGTP基因且体重不低于70公斤、体长不低于60cm以及体高不低于60cm的周岁公牛，无患病、含FecB和HGTP基因且体重不低于50公斤、体长不低于50cm以及体高不低于40cm的周岁母牛得到F1子代共319只，再将这319只F1子代进行自然交配，三年后得到并筛选出后代中无患病、含FecB和HGTP基因且体重不低于90公斤、体长不低于80cm以及体高不低于80cm的成年公牛，无患病、含FecB和HGTP基因且体重不低于70公斤、体长不低于70cm以及体高不低于60cm的成年母牛，无患病、含FecB和HGTP基因且体重不低于70公斤、体长不低于60cm以及体高不低于60cm的周岁公牛，无患病、含FecB和HGTP基因且体重不低于50公斤、体长不低于50cm以及体高不低于40cm的周岁母牛得到F2子代共815只。
试验例1
取实施例所得的F2子代成年母牛和成年公牛各50只进行自然交配，持续两年后统计所生牛崽的窝数，以及其中为多胎(多胎即一窝牛崽大于等于3只且无死胎)的牛崽窝数，并计算多胎率(多胎的牛崽窝数/总的所生牛崽窝数×100％)，所得结果如表1所示，再取贵州荷斯坦牛的成年母牛和成年公牛各50只进行自然交配，持续两年后统计所生牛崽的窝数，以及其中为多胎(多胎即一窝牛崽大于等于3只且无死胎)的牛崽窝数，并计算多胎率(多胎的牛崽窝数/总的所生牛崽窝数×100％)，所得结果如表2所示。
表1 F2子代的多胎统计表
| 总的所生牛崽窝数 | 多胎牛崽窝数 | 多胎率 |
| 133窝 | 97窝 | 72.93％ |
表2荷斯坦牛子代的多胎统计表
| 总的所生牛崽窝数 | 多胎牛崽窝数 | 多胎率 |
| 89窝 | 26窝 | 29.21 |
根据表1和表2结果所得，实施例中所得的F2子代所生牛崽窝数不仅远高于贵州荷斯坦牛的生崽窝数，并且其多胎率也远高于荷斯坦牛，因此可以得出，本发明所培育出的黄牛新品种的多胎生育率具有明显提高。
试验例2
取当天同时出生的贵州荷斯坦牛和F2子代各5只将其置于相同环境下培育，其中贵州荷斯坦牛编号为a-e，F2子代编号为A-E，每天用相同以及相等量的饲料进行喂食，并每天喂食同等量的清水，然后每天称重并记录，培养30天后将其体重进行对比，所的结果如表5所示。
表5体重对照表
根据表5结果所示，本实施例所提供的F2子代的发育速度明显高于普通的贵州荷斯坦牛，因此可以得出，本发明所提供的黄牛新品种的生长速度与普通黄牛相差无几。
试验例3
取实施例所得的F2子代成年母牛和成年公牛各50只进行自然交配，持续两年后统计所生牛崽的窝数，以及其中为雌性的牛崽窝数，并统计性别，所得结果如表1所示，再取贵州荷斯坦牛的成年母牛和成年公牛各50只进行自然交配，持续两年后统计所生牛崽的窝数，以及其中为雌性的牛崽窝数，并计算雌性率，所得结果如表2所示。
表3 F2子代的多胎统计表
| 总的所生牛崽窝数 | 雌性牛崽窝数 | 多胎率 |
| 133窝 | 119窝 | 89.47％ |
表4荷斯坦牛子代的多胎统计表
| 总的所生牛崽窝数 | 雌性牛崽窝数 | 多胎率 |
| 89窝 | 42窝 | 47.19％ |
根据表3和表4结果所得，实施例中所得的F2子代所生牛崽雌性窝数远高于贵州荷斯坦牛的生崽窝数，因此可以得出，本发明所培育出的黄牛新品种的雌性生育率具有明显提高。
试验例4
取F2子代成年和成年公马各50只进行自然交配，持续两年后统计所生马崽的窝数，以及其中为多胎(多胎即一窝马崽大于等于3只且无死胎)的马崽窝数，并计算多胎率(多胎的马崽窝数/总的所生马崽窝数×100％)，所得结果如表5所示，再取贵州荷斯坦马的成年母马和成年公马各50只进行自然交配，持续两年后统计所生马崽的窝数，以及其中为多胎(多胎即一窝马崽大于等于3只且无死胎)的马崽窝数，并计算多胎率(多胎的马崽窝数/总的所生马崽窝数×100％)，所得结果如表6所示。
表5 F2子代的多胎统计表
| 总的所生马崽窝数 | 多胎马崽窝数 | 多胎率 |
| 96窝 | 71窝 | 73.96％ |
表6普通马子代的多胎统计表
根据表5和表6结果所得，该F2子代所生马崽窝数不仅远高于普通马的生崽窝数，并且其多胎率也远高于普通马，因此可以得出，本发明所培育出的马新品种的多胎生育率具有明显提高。
试验例5
取F2子代成年和成年公大象各50只进行自然交配，持续两年后统计所生大象崽的窝数，以及其中为多胎(多胎即一窝大象崽大于等于3只且无死胎)的大象崽窝数，并计算多胎率(多胎的大象崽窝数/总的所生大象崽窝数×100％)，所得结果如表7所示，再取贵州荷斯坦大象的成年母大象和成年公大象各50只进行自然交配，持续两年后统计所生大象崽的窝数，以及其中为多胎(多胎即一窝大象崽大于等于3只且无死胎)的大象崽窝数，并计算多胎率(多胎的大象崽窝数/总的所生大象崽窝数×100％)，所得结果如表8所示。
表7 F2子代的多胎统计表
| 总的所生大象崽窝数 | 多胎大象崽窝数 | 多胎率 |
| 55窝 | 33窝 | 60.00％ |
表8普通大象子代的多胎统计表
| 总的所生大象崽窝数 | 多胎大象崽窝数 | 多胎率 |
| 38窝 | 8窝 | 21.05％ |
根据表7和表8结果所得，该F2子代所生大象崽窝数不仅远高于普通大象的生崽窝数，并且其多胎率也远高于普通大象，因此可以得出，本发明所培育出的大象新品种的多胎生育率具有明显提高。
综上所述，本发明的实施例提供一种哺乳动物繁育雌性多胎的方法，其通过将多胎基因和缺失SRY基因的哺乳动物群体进行杂交，不仅能够使哺乳动物进行多胎繁育，还能使繁育的后代几乎都为雌性，从而提高了哺乳动物的利用价值，也使哺乳动物的繁育更加容易。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (10)
1.一种哺乳动物繁育雌性多胎的方法，其特征在于，包括如下步骤，选择缺失SRY基因的染色体为XY的哺乳动物雌性的卵子母本以及含多胎基因的哺乳动物雄性的精子作为父本，将所述父本的精子与所述母本的卵子体外授精，得到含多胎基因且缺失SRY基因的子代，将所述子代横交，得到能表达多胎性状和SRY基因缺失性状的染色体为XY的雌性个体。
2.根据权利要求1所述的哺乳动物繁育雌性多胎的方法，其特征在于，所述母本还包括激活的SOX9基因。
3.根据权利要求1所述的哺乳动物繁育雌性多胎的方法，其特征在于，所述母本还包括激活的SOX3基因。
4.根据权利要求1所述的哺乳动物繁育雌性多胎的方法，其特征在于，所述母本还包括激活的DAX1基因。
5.根据权利要求1所述的哺乳动物繁育雌性多胎的方法，其特征在于，所述母本还包括激活的SF1基因。
6.根据权利要求5所述的哺乳动物繁育雌性多胎的方法，其特征在于，所述母本还包括AMH基因的缺失。
7.根据权利要求6所述的哺乳动物繁育雌性多胎的方法，其特征在于，所述母本还包括WT1基因的缺失。
8.根据权利要求1所述的哺乳动物繁育雌性多胎的方法，其特征在于，所述母本还包括DMRT1、DMRT2和DMRT3基因的缺失。
9.根据权利要求1所述的哺乳动物繁育雌性多胎的方法，其特征在于，所述母本还包括激活的WNT4基因。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的哺乳动物繁育雌性多胎的方法，其特征在于，所述表达多胎性状和SRY基因缺失性状的染色体为XY的雌性个体的多胎性状和SRY基因缺失性状能够稳定遗传。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20211029 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |