BR112021002556A2 - um método de geração de progênie estéril e monosexuada - Google Patents

Abstract

“um método de geração de progênie estéril e monosexuada”. a divulgação fornece um método para gerar um peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo. o método compreende a reprodução (i) de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea, fértil, homozigótico e mutado tendo pelo menos uma primeira mutação e uma segunda mutação com (ii) um peixe, crustáceo ou molusco macho, fértil, homozigótico e mutado tendo pelo menos a primeira e a segunda mutações para produzir peixes, crustáceos ou moluscos estéreis determinados pelo sexo. a primeira mutação interrompe um ou mais genes que especificam a diferenciação sexual, a segunda mutação interrompe um ou mais genes que especificam a função do gameta e a fertilidade do peixe, crustáceo ou molusco fêmea, homozigótico e fértil e o peixe, crustáceo, ou molusco macho, homozigótico e fértil foi recuperada. a divulgação também fornece métodos de produção de reprodutores para uso na produção de peixes, crustáceos ou moluscos estéreis determinados pelo sexo, bem como dos próprios reprodutores.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “UM MÉTODO DE GERAÇÃO DE PROGÊNIE ESTÉRIL E MONOSEXUADA”

DECLARAÇÃO DE DIREITOS DO GOVERNO

[0001] Aspectos do trabalho aqui descritos foram apoiados pela concessão nº 2018-33522-28745 do USDA-Instituto Nacional de Alimentação e Agricultura. O Governo dos Estados Unidos pode ter certos direitos sobre essas invenções.

CAMPO

[0002] A presente divulgação se refere geralmente a métodos de esterilização e determinação de sexo de organismos de água doce e água salgada.

FUNDAMENTOS

[0003] Os parágrafos a seguir não são uma admissão de que qualquer coisa discutida neles é técnica anterior ou parte do conhecimento de pessoas versadas na técnica.

[0004] As espécies de peixes foram geneticamente modificadas (GM) para produzir proteínas farmacêuticas valiosas ou para incorporar características vantajosas para a aquicultura. Uma variedade de peixes com taxas de crescimento e taxas de conversão alimentar melhoradas, resistência a doenças e benefícios nutricionais aprimorados foram desenvolvidos para atender à demanda futura de frutos do mar e a necessidade de melhorar a sustentabilidade na indústria de aquicultura. No entanto, a adoção mundial desses peixes GM é dificultada por preocupações com sua liberação acidental nos ecossistemas naturais. Foi demonstrado que peixes cultivados se reproduzem e sobrevivem em ambientes naturais, resultando em populações selvagens. Da mesma forma, os peixes GM podem ter parentes nativos, aumentando a possibilidade de que as modificações genéticas se espalhem pela população selvagem e alterem o mapa genético nativo. Peixes GM comerciais, portanto, representam uma ameaça potencial ao meio ambiente e um desafio para os formuladores de políticas e agências regulatórias encarregados de avaliações de risco- benefício.

[0005] Uma abordagem para resolver um ou mais dos problemas acima mencionados é esterilizando os peixes. A indução da triploidia é a abordagem mais utilizada e melhor estudada para a produção de peixes estéreis. Geralmente, peixes triploides são produzidos pela aplicação de choque de temperatura ou pressão a ovos fertilizados, forçando a incorporação do segundo corpo polar e produzindo células com três conjuntos de cromossomos (3N). Os peixes triploides não desenvolvem gônadas normais, pois o conjunto extra de cromossomos interrompe a meiose. Na escala industrial, a logística de aplicação confiável de choques de pressão ou temperatura em lotes de ovos é complicada e acarreta custos significativos. Uma alternativa ao triploide induzido por tratamentos físicos é o triploide induzido pela genética, que resulta do cruzamento de um peixe tetraploide com um diploide. Peixes tetraploides, no entanto, são difíceis de gerar devido à baixa sobrevivência embrionária e crescimento lento. Em alguns exemplos, os machos triploides produzem alguns espermatozoides haploides normais, permitindo que os machos fertilizem os óvulos, embora com eficiência reduzida.

Além disso, em algumas espécies, as características de desempenho negativo foram associadas ao fenótipo triploide, incluindo o crescimento reduzido e sensibilidade à doenças.

[0006] Outra abordagem para esterilizar peixes se dá pelo tratamento hormonal que se estende por várias semanas.

Porém, em muitos casos, a inclusão desses processos de tratamento intensivo de longo prazo não tem uma eficácia de esterilidade desejável e/ou têm sido associados a um desempenho reduzido no crescimento de peixes. Além disso, os tratamentos envolvendo um esteroide sintético podem resultar em taxas de mortalidade mais elevadas.

[0007] Outra abordagem para esterilizar peixes é usando tecnologias baseadas em transgênicos, que incluem uma etapa de integração de um transgene que induz a morte de células germinativas ou interrompe seus padrões de migração, resultando em sua ablação em embriões em desenvolvimento. No entanto, os transgenes estão sujeitos ao efeito de posição e também ao silenciamento. Consequentemente, tais abordagens estão sujeitas a processos de revisão regulatória antes de serem consideradas aceitáveis para uso comercial.

[0008] Uma abordagem alternativa para esterilizar peixes é por knockdown (redução da expressão) ou knockout (inativação) dos genes que governam o desenvolvimento das células germinativas primordiais (CGP). Foi relatado que tais abordagens causam perda de CGP e esterilidade. No entanto, o traço estéril nesses peixes não é hereditário.

Consequentemente, a utilização de uma abordagem de knockdown ou knockout de genes que regem o desenvolvimento de CGP pode ser logisticamente desafiadora e cara e, portanto, impraticável para produzir peixes estéreis em massa de maneira eficiente e em escala comercial.

[0009] Os mecanismos que regem a diferenciação sexual ou gonadal em peixes teleósteos são processos complexos influenciados por fatores internos (fatores genéticos e endócrinos) e externos, incluindo interação social e condições ambientais (temperatura, pH e teor de oxigênio da água), cujas contribuições relativas podem variar significativamente dependendo da espécie.

[0010] Melhorias na geração de peixes, crustáceos ou moluscos estéreis e determinados pelo sexo são desejáveis.

INTRODUÇÃO

[0011] A seguinte introdução tem como objetivo apresentar ao leitor este relatório descritivo, mas não definir qualquer invenção. Uma ou mais invenções podem residir em uma combinação ou subcombinação dos elementos do instrumento ou etapas do método descritas abaixo ou em outras partes deste documento. Os inventores não renunciam ou negam seus direitos a qualquer invenção ou invenções divulgadas neste relatório descritivo meramente por não descrever tal invenção ou invenções nas reivindicações.

[0012] Um ou mais dos métodos propostos anteriormente usados para esterilizar organismos de água doce e água salgada podem resultar em: (1) eficácia insuficiente; (2) dificuldade aumentada para propagar a característica de esterilidade, por exemplo, tendo que realizar seleção genética para identificar uma subpopulação de indivíduo estéril e/ou repetir o tratamento em cada geração; (3) um aumento nos custos operacionais, por exemplo, incorporando mudanças significativas nas práticas de manejo, sendo intransferível entre várias espécies, aumentando os tempos de produção, a porcentagem de organismos estéreis com crescimento reduzido e causando uma maior sensibilidade a doenças, aumentando as taxas de mortalidade de organismos estéreis, ou uma combinação destes; (4) fluxo gênico para populações selvagens e colonização de novos habitats por espécies não nativas cultivadas; ou (4) uma combinação destes.

[0013] A presente divulgação fornece métodos de produção de organismos esterilizados de água doce e de água salgada determinados pelo sexo, interrompendo sua diferenciação sexual e vias de gametogênese. Um ou mais exemplos da presente divulgação podem: (1) aumentar a eficácia da esterilização, por exemplo, permitindo a produção em massa de indivíduos estéreis e garantindo que todos os indivíduos sejam completamente estéreis; (2) reduzir os custos operacionais, por exemplo, diminuindo a quantidade de equipamentos ou tratamentos caros, sendo comercialmente escalável e transferível entre várias espécies, diminuindo a alimentação, reduzindo os tempos de produção, diminuindo a porcentagem de organismos que atingem a maturidade sexual, aumentando o tamanho físico de organismos sexualmente maduros, ou uma combinação destes; (3) diminuir o fluxo gênico para populações selvagens e colonização de novos habitats por espécies não nativas cultivadas; (4) aumentar o desempenho da cultura diminuindo a perda de energia para o desenvolvimento das gônadas; ou (5) uma combinação destes, se comparados com um ou mais métodos propostos anteriormente usados para esterilizar organismos de água doce e de água salgada.

[0014] Um ou mais exemplos da presente divulgação podem render pelo menos uma melhoria de 10% nas taxas de conversão alimentar (CA = quantidade de peso ganho por quantidade de alimento fornecido) e taxas de crescimento cerca de 20% mais rápidas, se comparados com outras linhas atualmente usadas em sistemas de produção (Tratamento com metiltestosterona). Esses benefícios de desempenho podem impactar apenas os custos de alimentação (redução direta nos custos de alimentação) e mão de obra (mão de obra reduzida devido aos tempos de cultura encurtados). Com base nos custos detalhados médios de uma operação de cultivo de tilápia nos EUA produzindo 1000 libras de produto, uma economia de cerca de US $ 0,23 por peixe com tamanho de mercado (1,5 libras)

usando apenas tilápia macho estéril pode ser alcançada, sugerindo que uma operação que opte por reter suas economias em custos de produção pode sofrer um aumento na margem de lucro de aproximadamente 130%.

[0015] A presente divulgação também discute métodos de produção de organismos reprodutores de água doce e de água salgada para uso na produção de organismos de água doce e salgada esterilizados e determinados pelo sexo, bem como os próprios reprodutores.

[0016] A presente divulgação fornece um método para gerar um peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo, compreendendo as etapas de: reprodução (i) de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea, fértil, hemizigótico e mutado, tendo pelo menos uma primeira mutação e uma segunda mutação com (ii) um peixe, crustáceo ou molusco macho, fértil, hemizigótico e mutado, tendo pelo menos a primeira e a segunda mutações; e selecionar um progenitor que seja homozigótico por seleção genotípica, de tal modo que o progenitor homozigótico mutado seja o peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo, caracterizado pelo fato de que a primeira mutação interrompe um ou mais genes que especificam a diferenciação sexual, e que a segunda mutação interrompe um ou mais genes que especificam a função do gameta.

[0017] A presente divulgação também fornece um método para gerar um peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo, compreendendo as etapas de: reprodução de (i) um peixe, crustáceo ou molusco fêmea, fértil, homozigótico e mutado, tendo pelo menos uma primeira mutação e uma segunda mutação com (ii) um peixe, crustáceo ou molusco macho, fértil, homozigótico e mutado, tendo pelo menos a primeira e a segunda mutações para produzir o peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo, caracterizado pelo fato de que a primeira mutação interrompe um ou mais genes que especificam a diferenciação sexual, que a segunda mutação interrompe um ou mais genes que especificam a função do gameta, e que a fertilidade do peixe, crustáceo ou molusco fêmea, fértil e homozigótico e o peixe, crustáceo ou molusco macho, fértil, homozigótico e mutado foi recuperada.

[0018] A recuperação da fertilidade pode compreender o transplante de células-tronco da linhagem germinativa. A recuperação da fertilidade pode ainda incluir alteração de esteroides sexuais. A alteração de esteroides sexuais pode ser uma alteração do estrogênio ou uma alteração de um inibidor da aromatase.

[0019] O transplante de células-tronco da linhagem germinativa pode compreender as etapas de: obtenção de uma célula-tronco da linhagem germinativa de um peixe, crustáceo ou molusco macho, estéril e homozigótico, tendo pelo menos a primeira mutação e a segunda mutação ou uma célula-tronco da linhagem germinativa de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea,

estéril e homozigótico, tendo pelo menos a primeira e a segunda mutações; e transplante da célula-tronco da linhagem germinativa em um peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas, ou em um peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas.

O peixe,

crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas podem ser homozigóticos para uma mutação nula do gene semelhante a dnd, Elavl2, vasa, nanos3, ou piwi.

O peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas podem ser criados usando manipulação de ploidia.

O peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas podem ser criados por hibridização.

O peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas podem ser criados usando exposição a altos níveis de hormônios sexuais.

[0020] O transplante de células-tronco da linhagem germinativa pode compreender as etapas de: obtenção de uma célula-tronco espermatogonial de um peixe, crustáceo ou molusco macho, estéril e homozigótico, tendo pelo menos a primeira mutação e a segunda mutação ou uma célula-tronco oogonial de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea, estéril e homozigótico, tendo pelo menos a primeira e a segunda mutações; e transplante da célula-tronco espermatogonial em um testículo de um peixe, crustáceo ou molusco macho fértil sem células germinativas, ou a célula-tronco oogonial em um ovário de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea fértil sem células germinativas. O peixe, crustáceo ou molusco macho fértil sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea fértil sem células germinativas podem ser homozigóticos para a mutação do gene semelhante a dnd, Elavl2, vasa, nanos3 ou piwi. O peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas podem ser criados usando manipulação de ploidia. O peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas podem ser criados por hibridização. O peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas podem ser criados usando exposição a altos níveis de hormônios sexuais.

[0021] O peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo pode ser um peixe, crustáceo ou molusco macho estéril. A primeira mutação pode compreender uma mutação em um ou mais genes que modula a síntese androgênica e/ou estrogênica. A primeira mutação pode compreender uma mutação em um ou mais genes que modulam a expressão da aromatase Cyp19a1a, Cyp17 ou uma combinação dos mesmos. Um ou mais genes que modulam a expressão da aromatase Cyp19a1a podem ser um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em cyp19a1a, FoxL2 e um ortólogo dos mesmos. Um ou mais genes que modulam a expressão de Cyp17 podem ser cyp17I ou um ortólogo do mesmo. A segunda mutação pode compreender uma mutação em um ou mais genes que modulam a espermiogênese. A segunda mutação pode compreender uma mutação em um ou mais genes que causam a globozoospermia. A segunda mutação em um ou mais genes que causam globozoospermia pode causar espermatozoides com cabeça redonda, núcleo redondo, peça intermediária desorganizada, caudas parcialmente enroladas ou uma combinação dos mesmos. A segunda mutação pode compreender uma mutação em um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em Gopc, Hiat1, Tjp1a, Smap2, Csnk2a2 e um ortólogo dos mesmos.

[0022] O peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo pode ser um peixe, crustáceo ou molusco fêmea estéril. A primeira mutação pode compreender uma mutação em um ou mais genes que modulam a expressão de um inibidor da aromatase Cyp19a1a. Um ou mais genes que modulam a expressão de um inibidor da aromatase Cyp19a1a podem ser um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em Gsdf, dmrt1, Amh, Amhr e um ortólogo dos mesmos. A segunda mutação pode compreender uma mutação em um ou mais genes que modulam a oogênese, foliculogênese ou uma combinação. Um ou mais genes que modulam a oogênese podem modular a síntese de estrogênio. Um ou mais genes que modulam a síntese de estrogênio podem ser FSHR ou um ortólogo do mesmo. Um ou mais genes que modulam a foliculogênese podem modular a expressão de vitelogeninas. Um ou mais genes que modulam a expressão de vitelogeninas podem ser vtgs ou um ortólogo do mesmo. Um ou mais genes que modulam a expressão de vitelogeninas podem ser uma mutação em um gene que codifica ou regula: Vitelogenina; Receptor1 de estrogênio; Citocromo p450, família 1,

subfamília a; glicoproteína da zona pelúcida; Coriogenina H; Receptor ativado por proliferador de peroxissoma; Proteína reguladora aguda da esteroidogênese, ou um ortólogo dos mesmos.

[0023] A presente divulgação também fornece um método para gerar um peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo, compreendendo as etapas de: reprodução de (i) um peixe, crustáceo ou molusco fêmea fértil tendo uma mutação homozigótica com (ii) um peixe, crustáceo ou molusco macho fértil tendo uma mutação homozigótica para produzir o peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo, caracterizado pelo fato de que a mutação interrompe direta ou indiretamente a espermiogênese e/ou interrompe diretamente a vitelogênese, e que a fertilidade do peixe, crustáceo ou molusco fêmea fértil e o peixe, crustáceo ou molusco macho fértil foi recuperada.

[0024] A mutação que interrompe direta ou indiretamente a espermiogênese pode ser uma mutação em Gopc, Hiat1, Tjp1a, Smap2, Csnk2a2 ou um ortólogo dos mesmos. A mutação que interrompe diretamente a vitelogênese pode ser uma mutação em um gene que codifica ou regula: Vitelogenina; Receptor1 de estrogênio; Citocromo p450, família 1, subfamília a; glicoproteína da zona pelúcida; Coriogenina H;

Receptor ativado por proliferador de peroxissoma; Proteína reguladora aguda da esteroidogênese, ou um ortólogo dos mesmos. O peixe, crustáceo ou molusco fêmea fértil e o peixe, crustáceo ou molusco macho fértil podem ter uma pluralidade de mutações homozigóticas que, em combinação: interrompem direta ou indiretamente a espermiogênese; interrompem diretamente a vitelogênese; ou ambos.

[0025] A recuperação da fertilidade pode compreender o transplante de células-tronco da linhagem germinativa. A recuperação da fertilidade pode ainda incluir alteração de esteroides sexuais. A alteração de esteroides sexuais pode ser uma alteração do estrogênio ou uma alteração de um inibidor da aromatase.

[0026] O transplante de células-tronco da linhagem germinativa pode compreender as etapas de: obtenção de uma célula-tronco da linhagem germinativa de um peixe, crustáceo ou molusco macho, estéril e homozigótico, tendo pelo menos a mutação homozigótica ou uma célula-tronco da linhagem germinativa de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea, estéril e homozigótico, tendo pelo menos a mutação homozigótica; e transplante da célula-tronco da linhagem germinativa em um peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas, ou em um peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas. O peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas podem ser homozigóticos para uma mutação nula do gene semelhante a dnd, Elavl2, vasa, nanos3 ou piwi. O peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas podem ser criados usando manipulação de ploidia.

O peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas podem ser criados por hibridização.

O peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas podem ser criados usando exposição a altos níveis de hormônios sexuais.

[0027] O peixe, crustáceo ou molusco fêmea fértil e o peixe, crustáceo ou molusco macho fértil podem ter uma mutação homozigótica adicional que especifica a diferenciação sexual. A mutação que especifica a diferenciação sexual pode modular a expressão da aromatase Cyp19a1a, Cyp17, um inibidor da aromatase Cyp19a1a ou uma combinação dos mesmos. A mutação que modula a expressão de Cyp17 pode ser uma mutação em cyp17I ou um ortólogo da mesma. A mutação que modula a expressão do inibidor da aromatase Cyp19a1a pode ser uma mutação em Gsdf, dmrt1, Amh, Amhr ou um ortólogo da mesma.

[0028] A etapa de reprodução dos métodos aqui divulgados pode compreender hibridização ou manipulação hormonal e estratégias de reprodução para especificar a diferenciação sexual.

[0029] O peixe, crustáceo ou molusco dos métodos aqui divulgados pode ser um peixe.

[0030] A presente divulgação também fornece um peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado para produzir um peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo, onde o peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado tem pelo menos uma primeira mutação e uma segunda mutação, caracterizado pelo fato de que a primeira mutação interrompe um ou mais genes que especificam a diferenciação sexual, que a segunda mutação interrompe um ou mais genes que especificam a função do gameta e que a fertilidade do peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado foi recuperada. A recuperação da fertilidade pode compreender o transplante de células-tronco da linhagem germinativa. A recuperação da fertilidade pode ainda incluir alteração de esteroides sexuais. A alteração de esteroides sexuais pode ser uma alteração do estrogênio ou uma alteração de um inibidor da aromatase.

[0031] O transplante de células-tronco da linhagem germinativa pode compreender as etapas de: obtenção de uma célula-tronco da linhagem germinativa de um peixe, crustáceo ou molusco macho, estéril e homozigótico, tendo pelo menos a primeira mutação e a segunda mutação ou uma célula-tronco da linhagem germinativa de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea, estéril e homozigótico, tendo pelo menos a primeira e a segunda mutações; e transplante da célula-tronco da linhagem germinativa em um peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas, ou em um peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas. O peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas podem ser homozigóticos para uma mutação nula do gene semelhante a dnd, Elavl2, vasa, nanos3 ou piwi. O peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas podem ser criados usando manipulação de ploidia.

O peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas podem ser criados por hibridização.

O peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas podem ser criados usando exposição a altos níveis de hormônios sexuais.

[0032] O transplante de células-tronco da linhagem germinativa pode compreender as etapas de: obtenção de uma célula-tronco espermatogonial de um peixe, crustáceo ou molusco macho, estéril e homozigótico, tendo pelo menos a primeira mutação e a segunda mutação ou uma célula-tronco oogonial de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea, estéril e homozigótico, tendo pelo menos a primeira e a segunda mutações; e transplante da célula-tronco espermatogonial em um testículo de um peixe, crustáceo ou molusco macho fértil sem células germinativas, ou a célula-tronco oogonial em um ovário de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea fértil sem células germinativas. O peixe, crustáceo ou molusco macho fértil sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea fértil sem células germinativas podem ser homozigóticos para a mutação do gene semelhante a dnd, Elavl2, vasa, nanos3 ou piwi. O peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas podem ser criados usando manipulação de ploidia. O peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas podem ser criados por hibridização. O peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas podem ser criados usando exposição a altos níveis de hormônios sexuais.

[0033] O peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo pode ser um peixe, crustáceo ou molusco macho estéril. A primeira mutação pode compreender uma mutação em um ou mais genes que modula a síntese androgênica e/ou estrogênica. A primeira mutação pode compreender uma mutação em um ou mais genes que modulam a expressão da aromatase Cyp19a1a, Cyp17 ou uma combinação dos mesmos. Um ou mais genes que modulam a expressão da aromatase Cyp19a1a podem ser um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em cyp19a1a, FoxL2 e um ortólogo dos mesmos. Um ou mais genes que modulam a expressão de Cyp17 podem ser cyp17I ou um ortólogo do mesmo. A segunda mutação pode compreender uma mutação em um ou mais genes que modulam a espermiogênese. A segunda mutação pode compreender uma mutação em um ou mais genes que causam a globozoospermia. A segunda mutação em um ou mais genes que causam globozoospermia pode causar espermatozoides com cabeça redonda, núcleo redondo, peça intermediária desorganizada, caudas parcialmente enroladas ou uma combinação dos mesmos. A segunda mutação pode compreender uma mutação em um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em Gopc, Hiat1, Tjp1a, Smap2, Csnk2a2 e um ortólogo dos mesmos.

[0034] O peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo pode ser um peixe, crustáceo ou molusco fêmea estéril. A primeira mutação pode compreender uma mutação em um ou mais genes que modulam a expressão de um inibidor da aromatase Cyp19a1a. Um ou mais genes que modulam a expressão de um inibidor da aromatase Cyp19a1a podem ser um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em Gsdf, dmrt1, Amh, Amhr e um ortólogo dos mesmos. A segunda mutação pode compreender uma mutação em um ou mais genes que modulam a oogênese, foliculogênese ou uma combinação. Um ou mais genes que modulam a oogênese podem modular a síntese de estrogênio. Um ou mais genes que modulam a síntese de estrogênio podem ser FSHR ou um ortólogo do mesmo. Um ou mais genes que modulam a foliculogênese podem modular a expressão de vitelogeninas. Um ou mais genes que modulam a expressão de vitelogeninas podem ser vtgs ou um ortólogo do mesmo. Um ou mais genes que modulam a expressão de vitelogeninas podem ser uma mutação em um gene que codifica ou regula: Vitelogenina; Receptor1 de estrogênio; Citocromo p450, família 1, subfamília a; glicoproteína da zona pelúcida; Coriogenina H; Receptor ativado por proliferador de peroxissoma; Proteína reguladora aguda da esteroidogênese, ou um ortólogo dos mesmos.

[0035] A presente divulgação também fornece um peixe, crustáceo ou molusco fértil com uma mutação homozigótica para produzir um peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo, caracterizado pelo fato de que a mutação interrompe direta ou indiretamente a espermiogênese e/ou interrompe diretamente a vitelogênese, e que a fertilidade do peixe, crustáceo ou molusco fértil foi recuperada.

[0036] A mutação que interrompe direta ou indiretamente a espermiogênese pode ser uma mutação em Gopc, Hiat1, Tjp1a, Smap2, Csnk2a2 ou um ortólogo dos mesmos. A mutação que interrompe diretamente a vitelogênese pode ser uma mutação em um gene que codifica ou regula: Vitelogenina; Receptor1 de estrogênio; Citocromo p450, família 1, subfamília a; glicoproteína da zona pelúcida; Coriogenina H; Receptor ativado por proliferador de peroxissoma; Proteína reguladora aguda da esteroidogênese, ou um ortólogo dos mesmos. O peixe, crustáceo ou molusco fértil pode ter uma pluralidade de mutações homozigóticas que, em combinação: interrompe direta ou indiretamente a espermiogênese; interrompe diretamente a vitelogênese; ou ambos. A recuperação da fertilidade pode compreender o transplante de células-tronco da linhagem germinativa. A recuperação da fertilidade pode ainda incluir alteração de esteroides sexuais. A alteração de esteroides sexuais pode ser uma alteração do estrogênio ou uma alteração de um inibidor da aromatase.

[0037] O transplante de células-tronco da linhagem germinativa pode compreender as etapas de: obtenção de uma célula-tronco da linhagem germinativa de um peixe, crustáceo ou molusco macho, estéril e homozigótico, tendo pelo menos a mutação homozigótica ou uma célula-tronco da linhagem germinativa de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea, estéril e homozigótico, tendo pelo menos a mutação homozigótica; e transplante da célula-tronco da linhagem germinativa em um peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas, ou em um peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas. O peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas podem ser homozigóticos para uma mutação nula do gene semelhante a dnd, Elavl2, vasa, nanos3 ou piwi. O peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas podem ser criados usando manipulação de ploidia.

O peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas podem ser criados por hibridização.

O peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas podem ser criados usando exposição a altos níveis de hormônios sexuais.

[0038] O peixe, crustáceo ou molusco fértil pode ter uma mutação homozigótica adicional que especifica a diferenciação sexual. A mutação que especifica a diferenciação sexual pode modular a expressão da aromatase Cyp19a1a, Cyp17, um inibidor da aromatase Cyp19a1a ou uma combinação dos mesmos. Um ou mais genes que modulam a expressão da aromatase Cyp19a1a podem ser um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em cyp19a1a, FoxL2 e um ortólogo dos mesmos. Um ou mais genes que modulam a expressão de um inibidor da aromatase Cyp19a1a podem ser um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em Gsdf, dmrt1, Amh, Amhr e um ortólogo dos mesmos.

[0039] A produção de um peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo pode compreender uma etapa de reprodução consistindo de hibridização ou manipulação hormonal e estratégias de reprodução para especificar a diferenciação sexual.

[0040] O peixe, crustáceo ou molusco fértil aqui divulgado pode ser um peixe.

[0041] A presente divulgação também fornece um método para criar um peixe, crustáceo ou molusco fértil, homozigótico e mutado que gera um peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo, compreendendo as etapas de: reprodução (i) de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea, fértil, hemizigótico e mutado, tendo pelo menos uma primeira mutação e uma segunda mutação com (ii) um peixe, crustáceo ou molusco macho, fértil, hemizigótico e mutado, tendo pelo menos a primeira e a segunda mutações; selecionar um progenitor que seja homozigótico por seleção genotípica; e recuperar a fertilidade do progenitor homozigótico, caracterizado pelo fato de que a primeira mutação interrompe um ou mais genes que especificam a diferenciação sexual, e que a segunda mutação interrompe um ou mais genes que especificam a função do gameta.

[0042] Outros aspectos e características da presente divulgação se tornarão evidentes para aqueles versados na técnica após a revisão da seguinte descrição de exemplos específicos em conjunto com as figuras anexas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0043] Exemplos dos métodos e organismos divulgados serão agora descritos, apenas a título de exemplo, com referência às Figuras anexas.

[0044] A Fig. 1 é um fluxograma que mostra um exemplo de um método para gerar um peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo e propagar uma linhagem mutada.

[0045] A Fig. 2 trata-se de ilustrações e gráficos que mostram um exemplo de estratégia de seleção e identificação de mutante fundador de mosaico F0. Os alelos mutantes foram identificados por PCR de fluorescência com primers específicos de genes projetados para amplificar as regiões em torno dos loci alvo (120–300 pb). Para PCR fluorescente, ambas as combinações de primers específicos de genes e dois oligos diretos com o fluoróforo 6-FAM ou NED anexado foram adicionados à reação. Uma reação de controle usando DNA de tipo selvagem é usada para confirmar a presença de amplificação de pico único em cada loci. O amplicon resultante foi resolvido por meio de eletroforese capilar (EC) com um padrão de tamanho rotulado LIZ adicionado para determinar os tamanhos do amplicon precisos para resolução de par de base (Retrogen). Os arquivos de rastreamento bruto foram analisados no software Peak Scanner (ThermoFisher). O tamanho do pico em relação ao controle de pico do tipo selvagem determina a natureza (inserção ou deleção) e comprimento da mutação. O número de picos indica o nível de mosaicismo. Selecionamos o fundador do mosaico F0 com o menor número de alelos mutantes (pico 2-4, de preferência).

[0046] A Fig. 3 ilustra um gráfico de curvas de desnaturação de exemplo visualizando os genótipos de amostras mutadas heterozigóticas, homozigóticas e de tipo selvagem. A mudança negativa na fluorescência é traçada em função da temperatura (-dF/dT). Cada traço representa uma amostra. A temperatura de desnaturação do alelo de tipo selvagem neste exemplo é de ~ 81 ⁰C (pico do tipo selvagem), a temperatura de desnaturação do produto homozigótico mutado (pico de deleção homozigótica) é de ~ 79 ⁰C. O traço restante representa um heterozigoto.

[0047] Os painéis A a D da Fig. 4 são fotografias de diferentes estágios de crescimento de uma geração de Tilápia

F0 compreendendo knockout alélico duplo de genes de pigmentação.

[0048] Os painéis A a B da Fig. 5 são fotografias de Tilápia após inserção de múltiplos genes compreendendo dead end1 (dnd) e tirosinase (Tyr). O painel A da Fig. 5 é um albino deficiente em F0 Tyr. O painel B da Fig. 5 mostra testículos dissecados de Tilápia de controle (WT) e estéril (F0 dnd KO).

[0049] Os painéis A a B da Fig. 6 são fotografias de testículos e ovários sem células germinativas (as pontas das setas apontam para as gônadas) de Tilápia Elavl2-Knockout (Elavl2D8/D8). Pequenas inserções nas fotos mostram as papilas urogenitais. Os mutantes Elavl2 foram produzidos por microinjeção de nucleases modificadas visando a sequência de codificação Elavl2 em embriões de Tilápia em um estágio unicelular. Um dos machos fundadores resultantes foi acasalado com uma fêmea do tipo selvagem e produziu mutantes heterozigóticos na geração F1. O acasalamento desses mutantes F1 Elavl2D8/+ produziu uma geração F2 com aproximadamente 25% da ninhada sendo mutada homozigótica estéril de ambos os sexos.

[0050] Os painéis A a C da Fig. 7 são ilustrações de alelos mutantes selecionados nos loci da Tilápia cyp17. O painel A da Fig. 7 é um esquema do gene cyp17. Os exões (E1- 8) são apresentados como caixas sombreadas; locais de iniciação e terminação da tradução como ATG e TAA, respectivamente. As setas apontam para locais alvo no primeiro exão. O painel B da Fig. 7 é a sequência de referência do tipo selvagem (SEQ ID Nº: 60) com o alelo mutante da linhagem germinativa selecionado (SEQ ID Nº: 61) de uma descendência de Tilápia F0 Cyp17 mutada. Prevê-se que esta deleção 11nt+5 nt crie uma proteína truncada que termina no aminoácido 44 em vez da posição 521. O painel C da Fig. 7 são as sequências de proteínas previstas de aleto do tipo selvagem (SEQ ID Nº: 62) e do alelo mutante de cyp17 (SEQ ID Nº: 63) em que os primeiros 16 aminoácidos são idênticos aos da proteína Cyp17 de tipo selvagem e 44 aminoácidos estão codificados incorretamente. Os aminoácidos alterados estão destacados.

[0051] Os painéis A a C da Fig. 8 são gráficos, ilustrações e fotografias que mostram que a perda de função cyp17 produz descendentes totalmente masculinos sem características sexuais secundárias. O painel A da Fig. 8 é um gráfico que mostra peixes mutados de Cyp17 exibindo uma tendência completa para machos. Um macho fundador com mutações na linhagem germinativa nos loci cyp17 foi criado com uma fêmea do tipo selvagem, e a progênie F1 macho e fêmea portadora o alelo Δ16-cyp17 nulo foram selecionados e cruzados para produzir mutantes da geração F2 do tipo selvagem (WT), homozigóticos (-/-) e hemizigóticos (+/-). O gráfico mostra a contagem de machos e fêmeas para um determinado genótipo. O painel B da Fig. 8 mostra um nível indetectável de testosterona em mutantes com perda de função cyp17. Sangue foi coletado da veia caudal e centrifugado a 3000 rpm por 10 min. O plasma foi separado e congelado a - 80 °C e o nível de testosterona plasmática livre foi medido por ensaio imunoenzimático (ELISA) (Cayman Chemical, Michigan, EUA). As amostras de plasma foram analisadas em triplicado. O painel C da Fig. 8mostra fotografias de dois machos cyp17 F0 KO (-/-) com UGP subdesenvolvido em comparação com um macho não tratado de mesma idade (imagem à direita).

[0052] Os painéis A a E da Fig. 9 são ilustrações que mostram que mutantes com perda de função Cyp17 são sexualmente atrasados com testículos e oligospermia menores.

A progênie F2 de mutantes hemizigóticos cyp17 foi aumentada para 5 meses de idade, ponderada (Fig. 9, painel C) e genotipada. O painel A da Fig. 9 mostra machos que foram sacrificados e seus testículos expostos (Fig. 9, painel A) e dissecados (Fig. 9, painel B), revelando um gradiente de cor e tamanho (Fig. 9, painel D), com o tipo selvagem tendo a gônada mais madura, e os homozigóticos com aparência sexualmente atrasada. O painel E da Fig. 9 mostra o volume de milt removível de 8 machos homozigóticos e do tipo selvagem e o painel F da Fig. 9 mostra a comparação espectrofotométrica da concentração de espermatozoides (absorbância a 600 nm).

[0053] Os painéis A a C da Fig. 10 são ilustrações de alelos mutantes selecionados nos loci da proteína Tight junction 1 (Tjp1a) de Tilápia. O painel A da Fig. 10 é um esquema do gene Tjp1a. Os exões (E1-32) são apresentados como caixas sombreadas; locais de iniciação e terminação da tradução como ATG e TAA, respectivamente. As setas apontam para os exões alvo 15 e 17. O painel B da Fig. 10 é a sequência de referência do tipo selvagem (SEQ ID Nº: 71) com o alelo mutante da linhagem germinativa selecionado (SEQ ID Nº: 72) de uma descendência de tilápia Tjp1a F0 mutada.

Prevê-se que esta deleção 7 nt crie uma proteína truncada que termina no aminoácido 439 em vez da posição 1652. O painel C da Fig. 10 trata-se das sequências de proteínas previstas do tipo selvagem (SEQ ID Nº: 73) e do alelo mutante de Tjp1a (SEQ ID Nº: 74) em que os primeiros 439 aminoácidos são idênticos aos da proteína Tjp1a de tipo selvagem.

[0054] Os painéis A a C da Fig. 11 são ilustrações de mutações selecionadas nos loci de transcrição abundante no hipocampo 1a (Hiat1) de Tilápia. O painel A da Fig. 11 é um esquema do gene Hiat1 da Tilápia. Os exões (E1-12) são apresentados como caixas sombreadas; As regiões 5' e 3' não traduzidas são mostradas como caixas abertas. As setas apontam para os exões alvo 4 e 6. O painel B da Fig. 11 é a sequência de referência do tipo selvagem (SEQ ID Nº: 75) com a sequência do alelo mutante da linhagem germinativa selecionado (SEQ ID Nº: 76) de uma prole de tilápia Hiat1 F0 mutada. A localização da deleção de 17 nucleotídeos é mostrada por traços. Prevê-se que esta mutação de frameshift crie uma proteína truncada que termine no aminoácido 234 em vez da posição 491. O painel C da Fig. 11 mostra as sequências de proteínas previstas do tipo selvagem (SEQ ID Nº: 77) e da proteína Hiat1 mutada truncada (SEQ ID Nº: 78) em que os primeiros 218 aminoácidos são idênticos aos do tipo selvagem e os 16 aminoácidos seguintes estão codificados incorretamente.

[0055] Os painéis A a C da Fig. 12 são ilustrações de mutações selecionadas nos loci de Tilápia Small ArfGAP2 (Smap2). O painel A da Fig. 12 é um esquema do gene Smap2 de Tilápia. Os exões (E1-12) são mostrados como caixas sombreadas e a região 3' não traduzida é mostrada como uma caixa aberta. As setas apontam para os exões alvo 2 e 9. O painel B da Fig. 12 é a sequência de referência do tipo selvagem (SEQ ID Nº: 79) com a sequência do alelo mutante da linhagem germinativa selecionado (SEQ ID Nº: 80) de uma prole de tilápia Smap2 F0 mutada. A localização da deleção de 17 nucleotídeos é mostrada por traços. Prevê-se que esta mutação de frameshift crie uma proteína truncada que termine no aminoácido 118 em vez da posição 429. O painel C da Fig. 12 mostra as sequências de proteínas previstas do tipo selvagem (SEQ ID Nº: 81) e da proteína Smap2 mutada truncada (SEQ ID Nº: 82) em que os primeiros 53 aminoácidos são idênticos aos do tipo selvagem e os 63 aminoácidos seguintes estão codificados incorretamente.

[0056] Os painéis A a C da Fig. 13 são ilustrações de alelos mutantes selecionados nos loci do polipeptídeo alfa prime a (Csnk2a2), Caseína quinase 2, de Tilápia. O painel A da Fig. 13 é um esquema do gene Csnk2a2. Os exões (E1-11) são apresentados como caixas sombreadas; locais de iniciação e terminação da tradução como ATG e TGA, respectivamente. As setas apontam para os exões alvo 1 e 2. O painel B da Fig. 13 é a sequência de referência do tipo selvagem (SEQ ID Nº: 83) com o alelo mutante da linhagem germinativa selecionado (SEQ

ID Nº: 84) de uma prole de tilápia Csnk2a2 F0 mutada. Prevê- se que esta deleção 22 nt crie uma proteína truncada que termina no aminoácido 31 em vez da posição 350. O painel C da Fig. 13 trata-se das sequências de proteínas previstas do tipo selvagem (SEQ ID Nº: 85) e do alelo mutante de Csnk2a2 (SEQ ID Nº: 86) em que os primeiros 31 aminoácidos estão codificados incorretamente.

[0057] Os painéis A a C da Fig. 14 são ilustrações de alelos mutantes selecionados nos loci de PDZ associada ao Golgi e proteína contendo motivo espiralado (Gopc) de Tilápia. O painel A da Fig. 14 é um esquema do gene Gopc. Os exões (E1-9) são apresentados como caixas sombreadas; locais de iniciação e terminação da tradução como ATG e TAA, respectivamente. As setas apontam para os exões alvo 1 e 2. O painel B da Fig. 14 é a sequência de referência do tipo selvagem (SEQ ID Nº: 87) com o alelo mutante da linhagem germinativa selecionado (SEQ ID Nº: 88) de uma descendência de tilápia Gopc F0 mutada. Prevê-se que esta deleção 8 nt crie uma proteína truncada que termina no aminoácido 30 em vez da posição 444. O painel C da Fig. 14 são as sequências de proteínas previstas do tipo selvagem (SEQ ID Nº: 89) e do alelo mutante de Gopc (SEQ ID Nº: 90) em que os primeiros 9 aminoácidos são idênticos aos da proteína Gopc de tipo selvagem e os 21 aminoácidos seguintes estão codificados incorretamente.

[0058] Os painéis A e B da Fig. 15 são fotografias e gráficos que mostram deficiências humanas e de camundongos da fenocopia do knockout de genes específico da espermiogênese da Tilápia. O painel A da Fig. 15 mostra a malformação de espermatozoides em tilápia com deficiência em F0 para os cinco genes candidatos. Imagens microscópicas de espermatozoides coletados de peixes mutados F0 de tipo selvagem (WT) e Tjp1a, Gopc, Smap2, Hiat1 and Csnk2a2, respectivamente. As pontas das setas pretas apontam para a cabeça do espermatozoide com tamanho do tipo selvagem e as pontas das setas amarelas indicam a cabeça redonda aumentada dos espermatozoides. Barras de escala: 100 µm. O painel B da Fig. 15 mostra a taxa de sucesso de fertilização de gametas removidos à mão, seguida por fertilização in vitro onde gametas secos (200 ovos e milt removido) foram misturados e imediatamente ativados com 2mL de água de incubação. Os dados são médias +/- SD, n=3 repetições.

[0059] Os painéis A a C da Fig. 16 são imagens e gráficos que mostram os níveis de expressão de genes SMS em testículos férteis e sem células germinativas. O painel A da Fig. 16 mostra os testículos dissecados de dnd1 Knockout de 4 meses de idade e controles semelhantes com idade de tipo selvagem. O painel B da Fig. 16 ilustra que o nível de expressão relativa de vasa, um gene específico de célula germinativa é reduzido a um nível indetectável em testículos de peixes dnd1 KO, mas fortemente expresso em testículos de tipo selvagem, enquanto o gene específico de Sertoli Dmrt1 é expresso no mesmo nível em testículos de tilápia selvagem e estéril. b-actina foi usada como o gene de referência para normalizar o nível de expressão de vasa e Dmrt1. O painel C da Fig. 16 ilustra o nível de expressão relativa dos genes SMS Tjp1a, Hiat1, Gopc e Csnk2a2 em testículos de tilápia de tipo selvagem e estéril. Dmrt1 foi usado como o gene de referência para normalizar o nível de expressão dos genes SMS. Em todos os casos, o valor representa a média de 3 repetições biológicas, +/- SD.

[0060] Os painéis A a C da Fig. 17 são ilustrações da mutação selecionada nos loci Cyp9a1a. O painel A da Fig. 17 é um esquema do gene Cyp9a1a de tilápia. Os exões (E1-9) são apresentados como caixas sombreadas. As setas apontam para os exões alvo 1 e 9. O painel B da Fig. 17 é a sequência de referência do tipo selvagem (SEQ ID Nº: 65) com as sequências dos alelos mutantes da linhagem germinativa selecionados de tilápia mutada Cyp19a1a F0 (SEQ ID Nº: 66 e 67). As deleções

7 nt (del 8 e ins1) e 10 nt são indicadas por traços. Prevê- se que essas mutações de frameshift criem proteínas truncadas que terminem nos aminoácidos 12 e 11 em vez da posição 511. O painel C da Fig. 17 são as sequências de proteínas previstas de WT (SEQ ID Nº: 68) e proteínas mutantes truncadas (SEQ ID Nº: 69 e 70) em que os primeiros 7 e 5 aminoácidos são idênticos aos da proteína Cyp19a1a de tipo selvagem e os 5 e 6 aminoácidos seguintes estão codificados incorretamente. Os aminoácidos alterados estão destacados.

[0061] A Fig. 18 é uma ilustração e tabela que mostra um exemplo do esquema de reprodução e genótipos antecipados da progênie mutante de genitores heterozigóticos duplos. Os símbolos m1, 2, 3 indicam diferentes mutações no locus Tjp1a na fêmea do mosaico F0. Cada coluna na tabela mostra a frequência de uma progênie F2 esperada para cada combinação dos alelos cyp17 e Tjp1a, bem como a proporção sexual projetada e o status de fertilidade. A progênie considerada totalmente masculina e estéril está circulada.

[0062] Os painéis A a C da Fig. 19 são ilustrações da mutação selecionada nos loci Dmrt1. O painel A da Fig. 19 é um esquema do gene Dmrt1 de tilápia. Os exões (E1-9) são apresentados como caixas sombreadas. As setas apontam para os exões alvo 1 e 3. O painel B da Fig. 19 é a sequência de referência do tipo selvagem (SEQ ID Nº: 91) com as sequências dos alelos mutantes da linhagem germinativa selecionados de tilápia Dmrt1 F0 mutada (SEQ ID Nº: 92 e 93). As deleções 7 nt e 13 nt são indicadas por traços. Prevê-se que essas mutações de frameshift criem proteínas truncadas que terminem nos aminoácidos 40 e 38 em vez da posição 293. O painel C da Fig. 19 são as sequências de proteínas previstas do tipo selvagem (SEQ ID Nº: 94) e proteínas mutadas truncadas (SEQ ID Nº: 95 e 96) em que os primeiros 16 aminoácidos são idênticos aos da proteína Dmrt1 de tipo selvagem e os 24 e 22 aminoácidos seguintes estão codificados incorretamente. Os aminoácidos alterados estão destacados.

[0063] Os painéis A a C da Fig. 20 são ilustrações da mutação selecionada nos loci do tipo 6-B do fator de crescimento/diferenciação (Gsdf). O painel A da Fig. 20 é um esquema do gene Gsdf de tilápia. Os exões (E1-5) são apresentados como caixas sombreadas. As setas apontam para os exões alvo 2 e 4. O painel B da Fig. 20 é a sequência de referência do tipo selvagem (SEQ ID Nº: 97) com as sequências dos alelos mutantes da linhagem germinativa selecionados de tilápia Gsdf F0 mutada (SEQ ID Nº: 98 e 939). As deleções 5 nt e 22 nt são indicadas por traços. Prevê-se que essas mutações de frameshift criem proteínas truncadas que terminem nos aminoácidos 56 e 46 em vez da posição 213. O painel C da Fig. 20 são as sequências de proteínas previstas do tipo selvagem (SEQ ID Nº: 100) e proteínas mutadas truncadas (SEQ ID Nº: 101 e 102) em que os primeiros 52 e 46 aminoácidos são idênticos aos da proteína Gsdf de tipo selvagem e os 4 e 0 aminoácidos seguintes estão codificados incorretamente. Os aminoácidos alterados estão destacados.

[0064] Os painéis A a C da Fig. 21 são ilustrações de mutações selecionadas nos loci do receptor de hormônio estimulador da foliculogênese (FSHR) de tilápia. O painel A da Fig. 21 é um esquema do gene FSHR de tilápia. Os exões (E1-15) são apresentados como caixas sombreadas; As regiões 5' e 3' não traduzidas são mostradas como caixas abertas. As setas apontam para os exões alvo 11 e 15. O painel B da Fig.

21 é a sequência de referência do tipo selvagem (SEQ ID Nº: 103) com a sequência do alelo mutante da linhagem germinativa selecionado (SEQ ID Nº: 104) de uma prole de tilápia FSHR F0 mutada. A localização da deleção de 5 nucleotídeos é mostrada por traços. Prevê-se que esta mutação de frameshift crie uma proteína truncada que termine no aminoácido 264 em vez da posição 689. O painel C da Fig. 21 mostra as sequências de proteínas previstas do tipo selvagem (SEQ ID Nº: 105) e da proteína FSHR mutante truncada (SEQ ID Nº: 106) em que os primeiros 258 aminoácidos são idênticos aos do tipo selvagem e os 6 aminoácidos seguintes estão codificados incorretamente.

[0065] Os painéis A a C da Fig. 22 são ilustrações das mutações selecionadas nos loci da Vitelogenina Aa (VtgAa). O painel A da Fig. 22 é um esquema do gene VtgAa de tilápia. Os exões (E1-35) são apresentados como caixas sombreadas. As setas apontam para os exões alvo 7 e 22. O painel B da Fig. 22 é a sequência de referência do tipo selvagem (SEQ ID Nº: 107) com as sequências dos alelos mutantes da linhagem germinativa selecionados de tilápia Gsdf F0 mutada (SEQ ID Nº: 108 e 109). As deleções 5 nt e 25 nt são indicadas por traços. Prevê-se que essas mutações de frameshift criem proteínas truncadas que terminem nos aminoácidos 279 e 301 em vez da posição 1657. O painel C da Fig. 22 são as sequências de proteínas previstas do tipo selvagem (SEQ ID Nº: 110) e proteínas mutadas truncadas (SEQ ID Nº: 111 e 112) em que os primeiros 278 e 269 aminoácidos são idênticos aos da proteína VtgAa de tipo selvagem e os 1 e 32 aminoácidos seguintes estão codificados incorretamente. Os aminoácidos alterados estão destacados.

[0066] Os painéis A a C da Fig. 23 são ilustrações de mutações selecionadas nos loci de Vitellogenin Ab (VtgAb) de tilápia. O painel A da Fig. 21 é um esquema do gene VtgAb de tilápia. Os exões (E1-35) são apresentados como caixas sombreadas; A região 5' não traduzida é mostrada como caixa aberta. As setas apontam para os exões alvo 5 e 22. O painel B da Fig. 23 é a sequência de referência do tipo selvagem (SEQ ID Nº: 113) com a sequência do alelo mutante da linhagem germinativa selecionado (SEQ ID Nº: 114) de uma prole de tilápia VtgAb F0 mutada. A localização da deleção de 8 nucleotídeos é mostrada por traços. Prevê-se que esta mutação de frameshift crie uma proteína truncada que termine no aminoácido 202 em vez da posição 1747. O painel C da Fig. 23 mostra as sequências de proteínas previstas do tipo selvagem (SEQ ID Nº: 115) e da proteína VtgAb mutante truncada (SEQ ID Nº: 116) em que os primeiros 270 aminoácidos são idênticos aos da proteína VtgAb do tipo selvagem e os 32 aminoácidos seguintes estão codificados incorretamente. Os aminoácidos alterados estão destacados.

[0067] Os painéis A e B da Fig. 24 é uma fotografia e um gráfico que mostra que as fêmeas deficientes em VtgAa não conseguem produzir progênie viável. O painel A da Fig. 24 é uma fotografia de 8 horas após a fertilização dos embriões em água de incubação contendo azul de metileno (Roth, 0,01% de solução estoque na água de incubação). A coloração azul indica ovos não fertilizados e embriões mortos. Os embriões foram inspecionados diariamente em um estereomicroscópio leve e os embriões mortos contados e removidos. O painel B da Fig.

24 mostra a porcentagem de sobrevivência na progênie de machos e fêmeas F0 VtgAa cruzados com peixes de tipo selvagem. Os dados são médias +/- SD, n=2x3 repetições.

[0068] A Fig. 25 é uma ilustração que mostra o esquema de reprodução e o genótipo da progênie mutada de genitores heterozigóticos duplos. Os símbolos m1-n e m1 indicam mutações em mosaico em F0 e uma mutação específica selecionada para cada loci alvo. Os genótipos F1 mostrados correspondem a uma das quatro combinações de alelos que planejamos estabelecer. Cada coluna da tabela indica a frequência relativa da progênie F2 esperada para cada combinação de alelos, bem como a proporção sexual projetada e o status de fertilidade. A progênie considerada totalmente feminina e estéril está circulada em vermelho.

[0069] A Fig. 26 consiste de fotografias que mostram o impacto da deficiência em FSHR no desenvolvimento ovariano.

Irmãos de 12 meses de idade de fêmea de controle fértil (tipo selvagem de corpo colorido - painel inferior) e fêmea albina mutada de F0 FSHR (FSHR -/-, tyr-/-; painel superior) de tamanho corporal semelhante foram dissecados para análise morfológica de suas gônadas. As imagens à esquerda mostram ovários dissecados na cavidade peritoneal de fêmeas de controle e mutadas. As setas brancas apontam para as gônadas e as setas pretas apontam para as papilas urogenitais. A mutação de FSHR resultou em parada completa da foliculogênese e cadeia atrófica como gônada. A fêmea do tipo selvagem apresenta uma papila urogenital grande e proeminente, enquanto a fêmea albina F0 FSHR -/- apresenta uma papila significativamente menor.

[0070] A Fig. 27 é uma ilustração que mostra uma estratégia de transplante de células germinativas para permitir a produção em massa de gametas derivados de doadores com mutações em genes FEM (cyp17, Cyp19a1a), SMS (Tjp1a, Csnk2a2, Gopc, Smap2, Hiat1), MA (Dmrt1, Gsdf) e FLS (Vtgs, FSHR). No doador mutado, o gene defeituoso causa o desenvolvimento de populações monosexuadas masculinas (genes FEM) ou femininas (genes MA) ou torna os espermatozoides (genes SMS) ou oócitos (genes FLS) não funcionais. Como tal, a produção em massa desses mutantes homozigóticos não é possível. Para contornar essa limitação, direcionamos apenas genes cujos fenótipos mutantes são causados por função defeituosa no soma e não em células germinativas, e produzimos embriões quiméricos usando as técnicas de

“transplante de células germinativas”. Para produzir quimera, suspensões de células ovarianas ou testiculares obtidas de peixes mutados homozigóticos juvenis foram transplantadas para a cavidade peritoneal de embriões receptores sem células germinativas que são do tipo selvagem para o(s) gene(s) alvo.

Com esta estratégia, o embrião hospedeiro quimérico selvagem tem células somáticas normais, mas uma linhagem germinativa mutada. Esses receptores quiméricos restauram a proporção sexual normal e/ou esterilidade, pois possuem gene(s) somático(s) funcional(is). Estes peixes receptores podem ser usados como reprodutores comerciais para a produção em massa de peixes monosexuados e/ou estéreis.

[0071] A Fig. 28 é uma ilustração que mostra um método de transplante de células germinativas para produção em massa de espermatozoides funcionais portadores de um gene deficiente em espermiogênese (SMS (-)). Nenhum defeito foi encontrado durante a geração de células germinativas primordiais (CGPs) e espermatogônias em progênies de peixes nulos de SMS obtidas de genitores heterozigóticos mutados SMS. Na maturidade, no entanto, os machos mutados de SMS produzem apenas espermatozoides imóveis de cabeça redonda e são inférteis. Mutantes SMS fêmeas são férteis. O gene SMS é expresso nas células somáticas que circundam as células germinativas (células de Sertoli e Leydig) onde exerce sua atividade. A falta de proteína SMS causa um microambiente defeituoso onde a maturação dos espermatozoides é prejudicada. Para restaurar a espermiogênese, uma célula- tronco da linhagem germinativa pode ser isolada de um mutante SMS juvenil e transplantada em embriões receptores depletados de sua próprias CGPs, mas portadores de um gene SMS funcional. A célula-tronco espermatogonial SMS -/- transplantada colonizará a gônada receptora e, como SMS é dispensável para seu desenvolvimento contínuo, as células somáticas receptoras irão nutrir células germinativas transplantadas, restaurar a espermiogênese e permitir a produção de espermatozoides funcionais, todos portadores do gene mutado de SMS.

[0072] A Fig. 29 é uma ilustração que mostra um método de transplante de células germinativas para a produção de óvulos funcionais portadores de um gene deficiente em Vitelogenina (Vtg (-)). Nenhum defeito foi encontrado durante a geração de células germinativas primordiais (CGPs) e oogônia em progênies de peixes nulos de Vtg obtidas de genitores heterozigóticos mutados de Vtg. No entanto, na maturidade, as fêmeas mutadas de Vtg produzem apenas oócitos sem a proteína Vtg, resultando em esterilidade feminina.

Machos com deficiência em Vtg se desenvolvem normalmente e são férteis. O(s) gene(s) Vtg são normalmente expressos nas células do fígado e a(s) proteína(s) Vtg transportadas para o oócito através da corrente sanguínea. A falta de proteína Vtg faz com que os ovos não tenham nutrientes críticos necessários para sustentar o desenvolvimento inicial do embrião ou larva, resultando em interrupção do desenvolvimento. Como tal, as fêmeas Vtg -/- não tem filhotes. Para restaurar a vitelogênese, uma célula-tronco da linhagem germinativa pode ser isolada de um mutante nulo de Vtg juvenil e transplantada em embriões receptores depletados de sua próprias CGPs, mas portadores de um gene Vtg funcional. As células-tronco Vtg -/- da linhagem germinativa transplantadas colonizarão a gônada receptora e as células do fígado da mãe de aluguel garantirão que os nutrientes que sustentam o desenvolvimento inicial sejam levados adequadamente aos ovos. Estas fêmeas receptoras cruzadas com machos Vtg -/- produzirão proles Vtg -/- viáveis.

[0073] A Fig. 30 é uma ilustração que mostra um método de transplante de células germinativas para a produção de ovos mutados de FSHR viáveis (FSHR (-)). Nenhum defeito foi encontrado durante a geração de células germinativas primordiais (CGPs) e oogônia em progênies de peixes nulos de

FSHR obtidas de genitores heterozigóticos mutados de FSHR. No entanto, na maturidade, as fêmeas mutadas de FSHR não respondem à sinalização mediada por FSH, resultando em parada da foliculogênese e fêmeas. Os machos com knockout de FSHR se desenvolvem normalmente e são férteis. Como o FSHR é expresso exclusivamente em células foliculares somáticas, o transplante de células-tronco da linhagem germinativa de mutantes juvenis nulos de FSHR em embriões receptores depletados de suas próprias CGPs, mas portadores de um gene FSHR funcional, restaurará o desenvolvimento normal do oócito e permitirá a produção de ovos viáveis. Estas fêmeas receptoras cruzadas com machos FSHR (-/-) produzirão apenas proles FSHR (-/-).

[0074] A Fig. 31 é uma ilustração que mostra um método de transplante de células germinativas para a produção de ovos mutados de FEM funcionais (FEM: Cyp19a1a e cyp17).

Não encontramos defeitos durante a geração de células germinativas primordiais (CGPs) e oogônia em progênies de peixes nulos de FEM obtidos de genitores heterozigóticos mutados de FEM. No entanto, na maturidade, as fêmeas mutadas de FEM não convertem androgênio em estrogênio, resultando na reprogramação das células somáticas de suporte do ovário (células da teca e da granulosa) em células somáticas de suporte do testículo (células de Leydig e Sertoli) e reversão de fêmeas genéticas em machos fenotípicos. Machos com deficiência em FEM se desenvolvem normalmente e são férteis.

O(s) gene(s) FEM são normalmente expressos em células somáticas ovarianas. Para permitir a produção em massa de oócitos portadores de gene deficiente em FEM, uma célula- tronco da linhagem germinativa pode ser isolada de mutante juvenis nulos de FEM e transplantada em embriões receptores depletados de suas próprias CGPs, mas portadores de um gene FEM funcional. As células FEM -/- da linhagem germinativa transplantadas colonizarão a gônada receptora. As células somáticas ao redor do oócito doador produzirão uma quantidade normal de estrogênio, permitindo a progressão da foliculogênese e a manutenção do destino como fêmeas. Essas fêmeas receptoras cruzadas com machos FEM (-/-) produzirão apenas proles FEM -/-.

[0075] A Fig. 32 é uma representação esquemática de uma estratégia para produzir em massa uma população totalmente masculina de peixes estéreis. Genitores com KO duplo (por exemplo, SMS e cyp17) podem ser propagados por técnica de transplante de células germinativas, conforme descrito nas Figs. 27-32. Esses genitores de reprodutores produzem apenas gametas derivados de doadores portadores de os genes mutados. O acasalamento natural ou artificial destes reprodutores produz apenas uma população totalmente masculina estéril.

[0076] Os painéis A e B da Fig. 33 apresentam um experimento de transplante de células germinativas demonstrando colonização e produção bem-sucedidas de gametas de tilápia derivados de doadores. O painel A da Fig. 33 apresenta uma ilustração gráfica do transplante de células germinativas em larvas de tilápia livres de células germinativas recém-eclodidas. Células-tronco espermatogoniais (SSCs) de doadores portadoras de mutações foram transplantadas para a cavidade peritoneal do filhote sem células germinativas endógenas. Dois grupos de SSCs foram transplantados simultaneamente, um portador de uma deleção D3nt in-frame no gene de referência e uma inserção 6 nt no gene do pigmento (tyri6/i6), e o outro portador de uma deleção 4 nt out-of frame no gene de referência e uma deleção 22 no gene do pigmento (tyrD22/D22). A deleção 3 nt não deve alterar a função do gene e, portanto, serviu como controle positivo.

As células transplantadas migram e colonizam as cristas genitais do receptor. Após atingir a maturação sexual, os gametas do peixe receptor foram coletados e seu DNA analisado por ensaio de dimensionamento de fragmentos de PCR utilizando primers de PCR que flanqueiam a região de mutação do gameta derivado do doador. Os produtos de amplificação foram dimensionados e detectados por eletroforese capilar. Foi adquirida a porcentagem de receptores fêmeas e machos que produzem óvulos e espermatozoides funcionais derivados de células de doadores após o transplante de células-tronco espermatogoniais. O painel B da Fig. 33 mostra a análise do comprimento do fragmento capilar de DNA de espermatozoides de um controle de tipo selvagem e de uma tilápia fértil transplantada. O traço inferior mostra apenas fragmentos de deleção D3nt e D4nt derivados do doador do gene de referência, junto com um fragmento da inserção 6nt e da deleção D22nt no gene do pigmento. Um controle negativo com fragmentos específicos do gene de tamanho selvagem (268pb) para o gene de teste e 467nt para o gene tyr é exibido para referência.

[0077] Os painéis A a D da Fig. 34 são ilustrações que mostram diferentes métodos para a propagação de populações estéreis monosexuadas. FEM -/- e MA -/- representam genes nulos de feminilidade e masculinidade. SMS -/- e FLS -/- representam genes nulos de espermiogênese e foliculogênese. Sementes de machos e fêmeas são produzidas através da manipulação de hormônios esteroides e transplantes de células germinativas (painéis A e B da Fig. 34) e apenas pelo transplante de células germinativas (painéis C e D da Fig. 34). Um número limitado de sementes pode ser cruzado para produzir em massa milhões de embriões totalmente masculinos estéreis (painéis A e C da Fig. 34) ou embriões totalmente femininos estéreis (painéis B e D da Fig. 34) para uso em sistemas de aquicultura.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0078] De modo geral, a presente divulgação fornece um método para gerar um peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo. O método compreende as etapas de: reprodução (i) de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea, fértil, hemozigótico e mutado tendo pelo menos uma primeira mutação e uma segunda mutação com (ii) um peixe, crustáceo ou molusco macho, fértil, homozigótico e mutado tendo pelo menos a primeira e a segunda mutações; e seleção de um progenitor que seja homozigótico por seleção genotípica, sendo o progenitor homozigótico mutado o peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo. A primeira mutação interrompe um ou mais genes que especificam a diferenciação sexual. A segunda mutação interrompe um ou mais genes que especificam a função do gameta.

[0079] A presente divulgação também fornece um método para gerar um peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo. O método compreende as etapas de: reprodução (i) de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea, fértil, homozigótico e mutado tendo pelo menos uma primeira mutação e uma segunda mutação com (ii) um peixe, crustáceo ou molusco macho, fértil, homozigótico e mutado tendo pelo menos a primeira e a segunda mutações para produzir peixes, crustáceos ou moluscos estéreis determinados pelo sexo. A primeira mutação interrompe um ou mais genes que especificam a diferenciação sexual. A segunda mutação interrompe um ou mais genes que especificam a função do gameta. A fertilidade do peixe, crustáceo ou molusco fêmea, homozigótico e fértil e o peixe, crustáceo ou molusco macho, homozigótico, fértil e mutado deve ser recuperada.

[0080] A presente divulgação também fornece um método para gerar um peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo. O método compreende as etapas de: reprodução (i) de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea fértil com uma mutação homozigótica com (ii) um peixe, crustáceo ou molusco macho fértil com uma mutação homozigótica para produzir peixes, crustáceos ou moluscos estéreis determinados pelo sexo. A mutação interrompe direta ou indiretamente a espermiogênese e/ou interrompe diretamente a vitelogênese. A fertilidade do peixe, crustáceo ou molusco fêmea fértil e o peixe, crustáceo ou molusco macho fértil deve ser recuperada.

[0081] A presente divulgação também fornece um método para fazer um peixe, crustáceo ou molusco fértil, homozigótico e mutado que gera um peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo. O método compreende as etapas de: reprodução (i) de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea, fértil, hemizigótico e mutado tendo pelo menos uma primeira mutação e uma segunda mutação com (ii) um peixe, crustáceo ou molusco macho, fértil, homozigótico e mutado tendo pelo menos a primeira e a segunda mutações; seleção de um progenitor que seja homozigótico por seleção genotípica; e recuperação da fertilidade do progenitor homozigótico. A primeira mutação interrompe um ou mais genes que especificam a diferenciação sexual. A segunda mutação interrompe um ou mais genes que especificam a função do gameta.

[0082] A presente divulgação fornece ainda um peixe, crustáceo ou molusco mutado , homozigótico e fértil para a produção de um peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo. O peixe, crustáceo ou molusco mutado, homozigótico e fértil deve ter pelo menos uma primeira mutação e uma segunda mutação, caracterizado pelo fato de que a primeira mutação interrompe um ou mais genes que especificam a diferenciação sexual e a segunda mutação interrompe um ou mais genes que especificam a função do gameta. A fertilidade do peixe, crustáceo ou molusco mutado, homozigótico e fértil deve ser recuperada.

[0083] A presente divulgação também fornece um peixe, crustáceo ou molusco fértil com uma mutação homozigótica para produzir um peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo, caracterizado pelo fato de que a mutação interrompe direta ou indiretamente a espermiogênese e/ou interrompe diretamente a vitelogênese, e que a fertilidade do peixe, crustáceo ou molusco fértil foi recuperada.

[0084] No contexto da presente divulgação, um peixe se refere a qualquer animal do ramo Craniata portador de guelras que não tem membros com garras. Exemplos de peixes são carpa, tilápia, salmão, truta e peixe-gato. No contexto da presente divulgação, um crustáceo se refere a qualquer táxon de artrópode. Exemplos de crustáceos são caranguejos, lagostas, lagostins e camarões. No contexto da presente divulgação, um molusco se refere a qualquer animal invertebrado com um corpo mole não segmentado geralmente envolto por uma concha calcária. Exemplos de moluscos são amêijoas, vieiras, ostras, polvos, lulas e quitões.

[0085] Um peixe, crustáceo ou molusco estéril se refere a qualquer peixe, crustáceo ou molusco com uma capacidade diminuída de gerar progênie por meio de reprodução ou cruzamento em comparação com sua contraparte selvagem; por exemplo, um peixe, crustáceo ou molusco estéril pode ter uma probabilidade reduzida de cerca de 50%, 75%, 90%, 95% ou 100% de produzir progênie viável. Em contrapartida, um peixe, crustáceo ou molusco fértil se refere a qualquer peixe, crustáceo ou molusco que possui a capacidade de produzir progênie por meio da reprodução ou cruzamento. Reprodução e cruzamento se referem a qualquer processo no qual uma espécie masculina e uma espécie feminina acasalam para produzir progênie ou prole.

[0086] Um peixe, crustáceo ou molusco determinado pelo sexo se refere a qualquer progenitor de peixe, crustáceo ou molusco no qual o sexo foi pré-determinado pela interrupção da via de diferenciação sexual do progenitor. Em alguns exemplos, os progenitores determinados pelo sexo da mesma geração são monosexuados.

[0087] A função do gameta se refere ao processo no qual um gameta se funde com outro gameta durante a fertilização em organismos que se reproduzem sexualmente.

[0088] Uma mutação que interrompe um ou mais genes que especificam a diferenciação sexual se refere a qualquer mutação genética que modula direta ou indiretamente a função gonadal. Afetar direta ou indiretamente a função gonadal se refere a: (1) mutação da sequência de codificação de um ou mais genes gonadais; (2) mutação de uma sequência não codificadora que tem pelo menos algum controle sobre a transcrição de um ou mais genes gonadais; (3) mutação da sequência de codificação de outro gene que está envolvido na regulação pós-transcricional de um ou mais genes gonadais; ou (4) uma combinação das mesmas, para modular a função gonadal.

Modular a função gonadal se refere à especificação de que a gônada produz gametas femininos ou masculinos. Exemplos de quando a masculinização é preferida incluem a modulação de um ou mais genes que modulam a síntese androgênica e/ou estrogênica, por exemplo, a modulação da expressão da aromatase Cyp19a1a, Cyp17 ou uma combinação dos mesmos. Os genes envolvidos na modulação da expressão da aromatase Cyp19a1a incluem cyp19a1a, FoxL2, sf1 (fator 1 esteroidogênico) e um ortólogo dos mesmos. Os genes envolvidos na modulação da expressão de Cyp17 incluem cyp17I ou um ortólogo deste. Exemplos de quando a feminização é preferida incluem a modulação de um ou mais genes que modulam a expressão de um inibidor da aromatase Cyp19a1a. Os genes envolvidos na modulação da expressão de um inibidor da aromatase Cyp19a1a incluem Gsdf, dmrt1, Amh, Amhr e um ortólogo dos mesmos.

[0089] Alternativamente, a diferenciação sexual pode ser especificada sem uma ou mais mutações genéticas. Exemplos de métodos mutacionais não genéticos para especificação de diferenciação sexual incluem a utilização de reversão de sexo (manipulação hormonal) e reprodução, teste de progênie, androgênese e ginogênese, que podem produzir populações masculinas ou femininas monosexuadas que sejam homozigotas XX, YY ou ZZ (ver por exemplo [21]; Dunham 2004, que é incorporado por referência). Em alguns exemplos de acordo com a presente divulgação, a etapa de reprodução de (i) um peixe, crustáceo ou molusco fêmea fértil com uma mutação homozigótica com (ii) um peixe, crustáceo ou molusco macho fértil com uma mutação homozigótica para produzir o peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo compreende um método mutacional não genético para especificar a diferenciação sexual. Em alguns exemplos de acordo com a presente divulgação usando salmão do Atlântico, a criação e o cruzamento de um neomacho (XX) com uma fêmea produz uma progênie monosexuada de fêmeas. Em outro exemplo de acordo com a presente divulgação, a especificação da diferenciação sexual pode ser alcançada por hibridização interespecífica (ver, por exemplo, Pruginin, Rothbard et al. 1975, Wolters e DeMay 1996, que é incorporado por referência).

[0090] Uma mutação que interrompe um ou mais genes que especificam a função do gameta se refere a qualquer mutação genética que modula direta ou indiretamente a espermiogênese, oogênese e/ou foliculogênese para produzir um peixe, crustáceo ou molusco estéril. A modulação direta ou indireta da espermiogênese, oogênese e/ou foliculogênese se refere a: (1) mutação da sequência de codificação de um ou mais genes de gametas; (2) mutação de uma sequência não codificadora que tem pelo menos algum controle sobre a transcrição de um ou mais genes de gameta; (3) mutação da sequência de codificação de outro gene que está envolvido na regulação pós-transcricional de um ou mais genes de gameta; ou (4) uma combinação dos mesmos para produzir um peixe, crustáceo ou molusco estéril.

[0091] Uma mutação que interrompe direta ou indiretamente a espermiogênese e/ou interrompe diretamente a vitelogênese se refere a qualquer mutação genética que modula direta ou indiretamente a espermiogênese e/ou interrompe diretamente a vitelogênese para produzir um peixe, crustáceo ou molusco estéril. A modulação direta ou indireta da espermiogênese se refere a: (1) mutação da sequência de codificação de um ou mais genes de gametas envolvidos na espermiogênese; (2) mutação de uma sequência não codificadora que tem pelo menos algum controle sobre a transcrição de um ou mais genes de gameta envolvidos na espermiogênese; (3) a mutação da sequência de codificação de outro gene que está envolvido na regulação pós-transcricional de um ou mais genes de gametas envolvidos na espermiogênese; ou (4) uma combinação dos mesmos, para produzir um peixe, crustáceo ou molusco estéril. A modulação direta da vitelogênese se refere a: (1) mutação da sequência de codificação de um ou mais genes de gametas envolvidos na vitelogênese; (2) mutação de uma sequência não codificadora que tem pelo menos algum controle sobre a transcrição de um ou mais genes de gametas envolvidos na vitelogênese; ou (3) uma combinação dos mesmos, para produzir um peixe, crustáceo ou molusco estéril.

[0092] Em exemplos para a produção de um peixe, crustáceo ou molusco macho estéril, é preferível incluir a modulação de um ou mais genes que modulam a espermiogênese.

Exemplos de um ou mais genes que modulam a espermiogênese podem causar globozoospermia, espermatozoides com cabeça redonda, núcleo redondo, peça intermediária desorganizada,

caudas parcialmente enroladas ou uma combinação dos mesmos.

Exemplos de genes que causam globozoospermia incluem Gopc, Hiat1, Tjp1a, Smap2, Csnk2a2 e um ortólogo dos mesmos. Em exemplos para a produção de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea estéril, é preferível incluir a modulação de um ou mais genes que modulam a oogênese, foliculogênese ou uma combinação. Exemplos de um ou mais genes que modulam a oogênese incluem um ou mais genes que modulam a síntese de estrogênio. Exemplos de um ou mais genes que modulam a síntese de estrogênio incluem FSHR ou um ortólogo do mesmo.

Exemplos de um ou mais genes que modulam a foliculogênese incluem um ou mais genes que modulam a expressão de vitelogeninas. Exemplos de um ou mais genes que modulam a expressão de vitelogeninas incluem vtgs ou um ortólogo do mesmo. Exemplos de mutações que interrompem direta ou indiretamente a espermiogênese são mutações em Gopc, Hiat1, Tjp1a, Smap2, Csnk2a2 ou um ortólogo dos mesmos. Exemplos de mutações que interrompem diretamente a vitelogênese são mutações em um gene que codifica ou regula: Vitelogenina; Receptor1 de estrogênio; citocromo p450, família 1, subfamília a; glicoproteína da zona pelúcida; Coriogenina H; Receptor ativado por proliferador de peroxissoma; Proteína reguladora aguda da esteroidogênese, ou um ortólogo dos mesmos.

[0093] Uma mutação pode ser qualquer tipo de alteração de uma sequência de nucleotídeos de interesse, por exemplo, inserções de nucleotídeos, deleções de nucleotídeos e substituições de nucleotídeos.

[0094] A recuperação da esterilidade ou da fertilidade se refere a qualquer processo no qual um peixe, crustáceo ou molusco estéril é convertido em um peixe, crustáceo ou molusco fértil. Em alguns exemplos, um inibidor da aromatase é fornecido ao peixe, crustáceo ou molusco estéril para recuperar a fertilidade. Em outros exemplos, o transplante de células-tronco da linhagem germinativa de peixes, crustáceos ou moluscos estéreis recupera a fertilidade. O transplante de células-tronco da linhagem germinativa se refere a qualquer processo no qual células- tronco reprodutivas de um peixe, crustáceo ou molusco estéril são transplantadas em um peixe, crustáceo ou molusco fértil e recupera a fertilidade. Em alguns exemplos de acordo com a presente divulgação, o transplante de células-tronco da linhagem germinativa é um processo que compreende: obtenção de uma célula-tronco da linhagem germinativa de um peixe, crustáceo ou molusco macho, estéril e homozigótico, tendo pelo menos a primeira mutação e a segunda mutação ou uma célula-tronco da linhagem germinativa de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea, estéril e homozigótico, tendo pelo menos a primeira e a segunda mutações; e transplante da célula-tronco da linhagem germinativa em um peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas, ou em um peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas.

Um peixe, crustáceo ou molusco macho ou fêmea receptor é qualquer embrião sem células germinativas, mas portador de cópias funcionais de genes que especificam a diferenciação sexual e a função dos gametas. Alternativamente, o receptor sem células germinativas pode ser um peixe juvenil ou adulto portador de cópias funcionais dos genes alvo. De preferência, a espécie receptora é a mesma que a espécie doadora (receptor alogênico), mas outras espécies podem ser usadas (receptor xenogênico). Após o transplante, o receptor é um peixe, crustáceo ou molusco quimérico com células somáticas normais, mas uma linhagem germinativa mutada. Esses receptores quiméricos restauram a proporção sexual normal e/ou esterilidade, pois possuem gene(s) somático(s) funcional(is).

Um receptor sem células germinativas pode ser criado usando manipulação de ploidia, estratégias de hibridização ou exposição a altos níveis de hormônios sexuais. A exposição de espécies aquáticas juvenis a altos níveis de hormônios sexuais pode resultar em esterilidade nos animais expostos.

Esta técnica foi demonstrada (Hunter et al, 1982; Solar et al, 1984; Piferrer et al, 1994), mas não foi usada em escala comercial. Embora a técnica possa ser eficaz na criação de peixes estéreis, ela nunca se demonstrou eficaz em induzir a esterilidade em 100% dos peixes tratados. Os peixes tratados podem ser adequados para pesquisa ou como receptores para transferência de células germinativas, mas a técnica pode não ser adequada para criar peixes estéreis para criação comercial (ver também Hunter, G.A., E.M. Donaldson, F.W.

Goetz e P.R. Edgell. 1982. Production of all-female and sterile Coho salmon, and experimental evidence for male heterogamety. Transactions of the American Fisheries Society 111: 367-372; Piferrer, F, M Carillo, S. Zanuy, I.I. Solar e E.M. Donaldson. 1994. Induction of sterility in Coho salmon (Oncorhynchus kisutch) by androgen immersion before first feeding. Aquaculture 119: 409-423; e Solar, I., E.M.

Donaldson e G.A. Hunter. 1984. Optimization of treatment regimes for controlled sex differentiation and sterilization in wild rainbow trout (Salmo gairdeneri Richardson) by oral administration of 17α-methyltestosterone. Aquaculture 42: 129-139).

[0095] Em alguns exemplos, o transplante de células- tronco da linhagem germinativa é um processo que compreende: a obtenção de uma célula-tronco espermatogonial de um peixe, crustáceo ou molusco macho, homozigótico e estéril ou uma oogônia-tronco de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea, homozigótico e estéril e transplante da célula-tronco espermatogonial na cavidade peritoneal de um embrião sem células germinativas ou em um testículo ou ovário diferenciado sem células germinativas de um peixe, crustáceo ou molusco. De maneira opcional, além do transplante de células-tronco da linhagem germinativa, um esteroide sexual exógeno, como por exemplo o estrogênio, é fornecido ao peixe, crustáceo ou molusco estéril para recuperar a fertilidade. Em outros exemplos, um inibidor da aromatase é fornecido ao peixe, crustáceo ou molusco estéril para recuperar a fertilidade.

[0096] A Fig. 1 ilustra um fluxograma de acordo com a presente divulgação de como fazer um reprodutor macho e fêmea, ou seja, um peixe, crustáceo ou molusco macho e fêmea, homozigótico e fértil para uso na produção de um peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo.

[0097] A Fig. 1 ilustra as vias genéticas que governam a diferenciação sexual e a gametogênese e as estratégias de KO de genes para produzir populações estéreis monosexuadas.

[0098] Uma ou mais mutações no gene cyp19a1a , FoxI2 ou uma combinação dos mesmos, resultam em expressão baixa ou diminuída de estrogênio, causando a formação de testículos e a produção de um peixe, crustáceo ou molusco macho. Da mesma forma, uma ou mais mutações no gene cyp17 resultam em expressão baixa ou diminuída de estrogênio e androgênio, produzindo um peixe, crustáceo ou molusco macho. Uma ou mais mutações adicionais em um gene que interrompe a espermiogênese (SMS) fazem com que o peixe, crustáceo ou molusco macho seja estéril. Consequentemente, um peixe, crustáceo ou molusco macho, homozigótico, mutado e estéril é produzido.

[0099] Em uma etapa adicional usada para propagar a linhagem, a fertilidade do peixe, crustáceo ou molusco macho, homozigótico, mutado e estéril pode ser recuperada com tratamento de estrogênio. Após o tratamento, um peixe, crustáceo ou molusco fêmea, homozigótico, mutado e fértil é gerado. Neste processo de reversão de sexo, a fêmea fenotípica é portadora de uma ou mais mutações que interrompem a espermiogênese, deve ser fértil, e oócitos portadores de uma das mutações que interrompem a espermiogênese devem ser produzidos e permitir a propagação da linhagem. Alternativamente, e conforme descrito no Exemplo 10, a fertilidade do peixe, crustáceo ou molusco macho, homozigótico, mutado e estéril pode ser recuperada através da implantação de uma célula germinativa do peixe, crustáceo ou molusco macho homozigótico, mutado e estéril na célula testicular de um macho selvagem fértil para gerar um peixe, crustáceo ou molusco macho homozigótico, mutado e fértil, o que permite a propagação da linhagem.

[00100] No outro lado da Fig. 1, uma ou mais mutações no gene Gsdf, Dmrt1 ou uma combinação dos mesmos, resulta na inativação dos inibidores Cyp19a1a e causa expressão elevada ou aumentada de estrogênio, resultando na formação ovariana e na produção de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea. Uma ou mais mutações adicionais em um gene que modula a oogênese, foliculogênese (FLS) ou uma combinação das mesmas tornam com que o peixe, crustáceo ou molusco fêmea seja estéril.

Consequentemente, um peixe, crustáceo ou molusco fêmea, homozigótico, mutado e estéril é produzido.

[00101] Em uma etapa adicional usada para propagar a linhagem, a fertilidade do peixe, crustáceo ou molusco fêmea, homozigótico, mutado e estéril pode ser recuperada com tratamento de um inibidor da aromatase. Após o tratamento, um peixe, crustáceo ou molusco macho, homozigótico, mutado e fértil é gerado. Neste processo de reversão de sexo, o macho fenotípico é portador de uma ou mais mutações que interrompem a oogênese, foliculogênese ou uma combinação, deve ser fértil, e espermatozoides portadores de mutações que interrompem a oogênese, foliculogênese ou uma combinação devem ser produzidos e permitir a propagação da linhagem.

Alternativamente, e conforme descrito no Exemplo 10, a fertilidade do peixe, crustáceo ou molusco fêmea, homozigótico, mutado e estéril pode ser recuperada através da implantação de uma célula germinativa do peixe, crustáceo ou molusco fêmea homozigótico, mutado e estéril na célula ovular de uma fêmea selvagem fértil para gerar um peixe, crustáceo ou molusco fêmea homozigótico, mutado e fértil, o que permite a propagação da linhagem.

EXEMPLOS

[00102] Exemplo 1 – Materiais e Métodos

[00103] Animal usado e declaração ética: todos os experimentos em conformidade com os regulamentos dos EUA que garantem o bem-estar animal e os procedimentos de criação de animais foram realizados de acordo com o protocolo para animais CAT-004 aprovado pelo IACUC. As linhagens de tilápia (Oreochromis niloticus) utilizadas neste estudo são derivadas de uma cepa brasileira obtida de um produtor comercial dos Estados Unidos.

[00104] Geração de nucleases e estratégias: geração de mutantes F0: ortólogos de tilápia dos genes cyp17, Cyp19a1a, Tjp1a, Csnk2a2, Hiat1, Smap2, Gopc, Gsdf, Dmrt1, FSHR e vitelogenina (VtgAa e VtgicoAb) foram identificados in silico em bancos de dados genômicos.

[00105] Para criar quebras de fita dupla de DNA (DSBs) em um local genômico específico, usamos nucleases modificadas. Na maioria das aplicações, uma única DSB foi produzida na ausência de um molde de reparo, levando à ativação da via de reparo de união de extremidade não- homóloga (NHEJ). A NHEJ pode ser um processa de reparo imperfeito, gerando inserções ou deleções (indels) no local alvo. A introdução de um indel pode criar um frameshift na região codificadora do gene, resultando em produtos proteicos anormais com uma sequência de aminoácidos incorreta. Para aumentar a frequência de geração de mutações nulas no gene de interesse, direcionamos 2 exões separados simultaneamente, além daqueles direcionados a cyp17. Junto com o gene de interesse, codirecionamos um gene de pigmentação para servir como um marcador de seleção da mutagênese. Normalmente, a frequência mutagênica entre o gene do pigmento e o gene de interesse está correlacionada. Assim, embriões com ausência total de pigmentação (fenótipo albino) foram preferencialmente selecionados em comparação com o fenótipo de pigmento mosaico (inativação parcial do gene). Para confirmar a funcionalidade da nuclease recém-projetada, cinco embriões albinos de cada lote tratado foram testados quantitativamente em termos de modificações do genoma nos loci de interesse por análise de fragmentos de PCR. Os embriões tratados do mesmo lote eram eliminados se todos os cinco embriões testados não apresentassem indels nos loci alvo. Além disso, criamos preferencialmente lotes de embriões nos quais as mutações são produzidas em estágios unicelular ou bicelular (ou seja, detecção de 2 ou 4 alelos mutantes por loci alvo por ensaio de análise de fragmentos).

[00106] A codificação do DNA modelo para a nuclease modificada foi linearizada e purificada usando uma coluna DNA Clean & concentrator-5 (Zymo Resarch). Um micrograma de modelo linearizado foi usado para sintetizar RNA capeado usando o kit mMESSAGE mMACHINE T3 (Invitrogen), purificado usando colunas Qiaquick (Qiagen) e armazenado a -80 ° em água livre de RNase em uma concentração final de 800 ng/µl.

[00107] Injeções de embriões: os embriões foram produzidos a partir da fertilização in vitro. Aproximadamente 10 nL de volume total de solução contendo as nucleases programadas foram co-injetados no citoplasma de embriões em estágio unicelular. A injeção de 200 embriões normalmente produz 10-60 embriões com defeito de pigmentação completo (fenótipo albino). A sobrevivência do embrião/larva foi monitorada durante os primeiros 10-12 dias após a injeção.

[00108] Seleção de fundadores: um mínimo de 10 embriões albinos foram criados até 3 meses de idade e quantitativamente testados em termos de modificações do genoma por análise de fragmentos com PCR de fluorescência (consulte as colunas 8 e 11 da Tabela 1 para ver os primers de genotipagem específicos do gene). Selecionamos preferencialmente fundadores nos quais as mutações foram produzidas no estágio unicelular ou bicelular (detecção de 2 ou 4 alelos mutantes por loci alvo por análise de fragmento (Fig. 2).

[00109] Genotipagem F1: os fundadores selecionados foram cruzados com linhagens do tipo selvagem. Sua progênie F1 foi criada até os 2 meses de idade, anestesiada por imersão em 200mg/L MS-222 (tricaína) e transferida para uma superfície limpa com uma colher de plástico. Sua barbatana foi cortada com uma lâmina de barbear e colocada em um poço (placa de 96 poços com tampas). Os peixes cortados nas barbatanas foram então colocados em potes individuais enquanto o DNA das barbatanas era analisado por PCR de fluorescência. Em resumo, 60 µl de uma solução contendo 9,4% de Chelex e 0,625mg/ml de proteinase K foram adicionados a cada poço para digestão do tecido durante a noite e extração de gDNA em uma incubadora a 55 °C. A placa foi então agitada com vórtex e centrifugada. A solução de extração de gDNA foi então diluída 10x com água ultra-limpa para remover quaisquer inibidores de PCR na mistura. Normalmente, analisamos 80 juvenis/fundadores para selecionar e criar lotes de aproximadamente 20 juvenis portadores de mutações de tamanho idêntico.

[00110] PCR de fluorescência (ver Fig. 2): as reações de PCR usaram 3,8 µL de água, 0,2 µL de fin-DNA e 5 µL de master mix de PCR (Quiagen Multiplex PCR) com 1 µL de mistura de primer consistindo dos três primers a seguir: o primer de cauda com etiqueta fluorescente (6-FAM, NED), primer direto específico de amplicon com cauda direta (SEQ ID Nº: 117: 5′ - TGTAAAACGACGGCCAGT-3′ e SEQ ID Nº: 118: 5′ - TAGGAGTGCAGCAAGCAT-3′) e primer reverso específico de amplicon (primers específicos do gene para PCR fluorescente estão listados na Tabela 1). As condições de PCR foram as seguintes: desnaturação a 95 °C por 15 min, seguida por 30 ciclos de amplificação (94 °C por 30 seg, 57 °C por 45 seg e 72 °C por 45 seg), seguida por 8 ciclos de amplificação (94 °C por 30 seg, 53 °C por 45 seg e 72 °C por 45 seg) e extensão final a 72 °C por 10 min, e uma manutenção indefinida a 4 °C.

[00111] Um ou dois microlitros de diluição 1:10 dos amplicons resultantes foram resolvidos por eletroforese capilar (EC) com um padrão de tamanho marcado por LIZ adicionado para determinar os tamanhos de amplicon precisos para resolução de par de base (Retrogen Inc., San Diego). Os arquivos de rastreamento bruto foram analisados no software Peak Scanner (ThermoFisher). O tamanho do pico em relação ao controle de pico do tipo selvagem determina a natureza (inserção ou deleção) e comprimento da mutação. O número de pico(s) indica o nível de mosaicismo. Selecionamos o fundador do mosaico F0 com o menor número de alelos mutantes (pico 2- 4, de preferência).

[00112] Os tamanhos dos alelos foram usados para calcular as mutações indel observadas. Mutações que não são em múltiplos de 3 bp e, portanto, previstas como mutações de frameshift foram selecionadas para confirmação adicional por sequenciamento. Mutações de tamanho maior que 8 pb, mas menor que 30 pb, foram preferencialmente selecionadas para facilitar a genotipagem por análise de desnaturação QPCR para as gerações subsequentes. Para confirmação da sequência, o produto de PCR do indel selecionado foi posteriormente submetido ao sequenciamento. A cromatografia de sequenciamento de PCR mostrando duas leituras simultâneas é indicativa da presença de indels. O início da deleção ou inserção normalmente começa quando a sequência lida torna-se divergente. As sequências duplas foram analisadas cuidadosamente para detectar leituras de nucleotídeos únicos.

O padrão de leitura de nucleotídeos únicos é então analisado contra uma série de padrões de leitura única artificiais gerados a partir do deslocamento da sequência de tipo selvagem de forma incremental.

[00113] Genotipagem QPCR das gerações F1 e F2: qPCR em tempo real foi realizada em um SISTEMA DE PCR EM TEMPO REAL ROTOR-GENE RG-3000 (Corbett Research). O molde de 1 µL de DNA genômico (gDNA) (diluído a 5-20 ng/µl) foi usado em um volume total de 10 µL contendo 0,15 µM de concentrações de cada um dos primers diretos e reversos e 5 µL de master mix QPCR 2x (produtos Apex Bio-research). Os primers qPCR usados são apresentados na Tabela 2 (colunas 11-14 dos primers de RT-PCR de genotipagem). O qPCR foi realizado usando 40 ciclos de 15 segundos a 95 °C, de 60 segundos a 60 °C, seguidos por análise da curva de desnaturação para confirmar a especificidade do ensaio (67 °C a 97 °C). Nesta abordagem,

amplicons de PCR curtos (aproximadamente 120–200 bp) que incluem a região de interesse são gerados a partir de uma amostra de gDNA, submetida à dissociação dependente da temperatura (curva de desnaturação). Quando indels induzidos estão presentes no gDNA hemizigótico, heteroduplex, bem como diferentes moléculas homoduplex são formados.

A presença de múltiplas formas de moléculas duplex é detectada pelo perfil de desnaturação, mostrando se a desnaturação duplex age como uma única espécie ou mais de uma espécie.

Geralmente, a simetria da curva de desnaturação e da temperatura de desnaturação infere na homogeneidade da sequência de dsDNA e seu comprimento.

Assim, organismos homozigóticos e do tipo selvagem (WT) exibem curvas de desnaturação simétricas que são distinguíveis por temperatura de desnaturação variada.

A análise de desnaturação foi realizada por comparação com a amostra de DNA de referência (do DNA de controle do tipo selvagem) amplificada em paralelo com a mesma reação com master mix.

Em suma, a variação no perfil de desnaturação distingue os amplicons gerados de gDNA homozigótico, hemizigótico e do tipo selvagem (ver Fig. 3).

[00114] Avaliação da esterilidade em machos: o volume de espermatozoides removíveis e a densidade de espermatozoides foram medidos em 10 machos (5 meses de idade) para cada genótipo. Os espermatozoides foram contados em lâmina de hemocitômetro Neubauer, bem como por espectrofotometria (densidade óptica (DO) a 600nm) de amostras diluídas em série. A motilidade dos espermatozoides foi medida em termos de porcentagem de espermatozoides móveis no campo de visão [4]. A morfologia das células espermáticas coradas com eosina-nigrosina foi analisada em microscópio óptico a 400x. A capacidade de fertilização dos espermatozoides foi avaliada por fertilização in vitro de óvulos de tipo selvagem de 3 fêmeas diferentes na proporção espermatozoide/óvulo ideal (100 óvulos para 5,106 espermatozoides). A qualidade dos óvulos do tipo selvagem foi testada em paralelo usando espermatozoides de machos do tipo selvagem. As taxas de fertilização foram expressas como uma porcentagem de embriões sobreviventes em relação ao total de óvulos coletados 24 horas após a fertilização. Os valores médios obtidos a partir desses estudos foram comparados entre genótipos mutados usando um teste-t não pareado.

[00115] Avaliação da esterilidade em fêmeas: registramos o peso corporal de todos os peixes amostrados. Um mínimo de seis fêmeas para cada genótipo foram dissecadas aos 4 e 6 meses de idade e suas gônadas fotografadas in situ antes da dissecação. O índice gonadossomático total médio foi comparado estatisticamente em todos os genótipos (teste-T não pareado). A sobrevivência de óvulos, embriões e larvas produzidos a partir de um mínimo de seis fêmeas mutadas cruzadas com machos de tipo selvagem foi analisada estatisticamente (teste-T não pareado) e comparada aos controles (fêmeas de tipo selvagem cruzadas com machos mutados).

[00116] Isolamento de células doadoras e transplante de células germinativas: células-tronco germinativas foram colhidas das gônadas de peixes de 3-4 meses de idade (~ 50- 70g) por digestão enzimática, conforme descrito por Lacerda

[5]. Em resumo, as gônadas recém isoladas foram picadas e incubadas em 1 ml de 0,5% de tripsina (Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NJ), em PBS (pH 8,2) contendo 5% de soro fetal bovino (Gibco Invitrogen Co., Grand Island, NY) e DNase I a 0,05% (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) durante 3-4 h a 25 °C. Durante a incubação, uma pipetagem suave foi aplicada para desfazer fisicamente qualquer porção intacta remanescente das gônadas. A suspensão de células resultante foi filtrada através de uma tela de náilon com um tamanho de poro de 42 µm (N-No.330T; Tokyo Screen Co. Ltd., Tóquio, Japão) para remover quaisquer aglomerados de células não dissociadas e, em seguida, ressuspensa em meio L-15 (Gibco Invitrogen Co.) antes do armazenamento em gelo até o transplante.

[00117] Larvas receptoras sem células germinativas (5- 7dpf) foram anestesiadas com sal metanossulfonato de 3- aminobenzoato de etila a 0,0075% (Sigma-Aldrich Inc.) e transferidas para uma placa de Petri revestida com ágar a 2%.

O transplante de células foi realizado através da injeção de aproximadamente 15.000 células testiculares na cavidade peritoneal de aproximadamente 80 larvas descendentes de genitores hemizigóticos mutados Elavl2. Alternativamente, embriões sem CGP foram obtidos a partir de um cruzamento entre fêmeas homozigóticas MSC e machos do tipo selvagem [6].

Após o transplante, as larvas receptoras foram transferidas de volta para a água aerada de incubação de embriões e criadas até a idade adulta.

Tilapia homolog NCBI& Ensembl Targeted full gene name Accession # gene (alias) exon Forward Reverse Amplicon Label SEQ ID NO Forward primer SEQ ID NO Reverse primer primer primer size (bp) cytochrome P450, family Acc:ZDB-GENE-040213-2 1 FAM 5'UTR SEQ1 ttgaagttgctacataaaag 1 SEQ2 TGGTTGATGACAATCACACTGT 357 17, subfamily A, Cyp17 polypeptide 1 ENSONIG00000009168 1 FAM 5'UTR SEQ1 ttgaagttgctacataaaag 1 SEQ2 TGGTTGATGACAATCACACTGT 357 cytochrome P450, family 1 NED 5'UTR SEQ3 tgttctacatcatcacccttctc 1 SEQ4 AGCAGACAGACGAGCAGTATCAG 169 Acc:NM_001279586 19, subfamily A, Cyp19a1a polypeptide 1a gene ENSONIG00000000155 9 FAM 9 SEQ5 TGATGGAGAGCTTCATCTACGAA 9 SEQ6 GTTCCAGGTTAAATTGATTG 186 Acc:ZDB-GENE-031001-2 15 NED Intron14-15 SEQ7 gcgtgatttgctgacctttttac 15 SEQ8 acacttacCCTGAGAATCTGG 216 Tight junction protein 1a Tjp1a ENSONIG00000006221 17 FAM 16 SEQ9 GAAAAAGGATGgtgagggatgac 17 SEQ10 GAGTGTGTCTACCACACGGAAAA 239 Casein Kinase II subunit Acc:100690588 1 FAM 5'UTR SEQ11 gtatttagaaggcggtgaaggtc 1 SEQ12 CAGTTTGGCACATGAGCATCGTA 153 Csnk2a2 alpha ENSONIG00000015598 2 NED 1 SEQ13 ATGCTCATGTGCCAAACTG 2 SEQ14 cCTTCAGGATTTTCACCACCACT 222 Hippocampus abundant Acc:100705862 4 FAM Intron3-4 SEQ15 tactgacacatccagcagcgtct Intron4-5 SEQ16 cagcactgagccgtcagtattct 211 Hiat1 transcript 1a ENSONIG00000018605 6 NED 6 SEQ17 TGGAGCCTACCTGTCTGAG 6 SEQ18 tactcacAGCGAAGGGGTCT 182 Acc:ZDB-GENE-060503-374 2 NED Intron1-2 SEQ19 gctcctctgcgaagactctc 2 SEQ20 aagacctccgacCTGGACTTGCT 211 small ArfGAP2 Smap2 ENSONIG00000004622 9 FAM 9 SEQ21 AGAGGAGGGCACAGTCAAGAAAC 10 SEQ22 TTGGATATCCCATTTGGTTCAT 226 78/248 Golgi-associated PDZ Acc:100692751 1 NED 5'UTR SEQ23 tttaacggtgttggcagagatt 1 SEQ24 AGATCCACATCCACGAAAGCCT 207 and coiled-coil motif Gopc containing gene ENSONIG00000001688 2 FAM Intron1-2 SEQ25 tgcccctttaaaccaccta 2 SEQ26 CTCAGCTTGGCCTTGCTTGACAT 207 doublesex and mab-3 1 NED 5'UTR-1 SEQ27 ttgccaggacccATGAGCCAG 1 SEQ28 AGACACGTATCCGTGATTTCTAC 135 Acc:ZDB-GENE-050511-1 related transcription Dmrt1 factor 1 ENSONIG00000014201 3 FAM Intron2-3 SEQ29 ctcttcatcctctgtgtctcatc 3 SEQ30 GGGTTTCCAGCAGGAGGTCAGA 140 growth/differentiation Acc:100710262 2 NED 2 SEQ31 ttatgttcagGTGCCAAGGTG 2 SEQ32 TGGCTGTGTGAGAAACGATGCTG 156 Gsdf factor 6-B-like ENSONIG00000007633 4 FAM 4 SEQ33 agATCTGGGCTGGGACA 4 SEQ34 tgttaactatacCTGTGTGTTGG 145 Follicle stimulating Acc:ZDB-GENE-020423-5 11 NED Intron10-11 SEQ35 ttttctccgcttgcttctgc 11 SEQ36 AAAGAGCTGAATAGGAGGAAGTT 137

FSHR hormone receptor ENSONIG00000015917 15 FAM 15 SEQ37 CATCTTGGCGTTCTTCTGTGT 15 SEQ38 CTTGAGGGCAGCTGAGATGGC 181 Acc:ZDB-GENE-001201-1 7 NED 7 SEQ39 GCAATCCTTGATGCTCCTTGAC 7 SEQ40 CTGAGACTCTATGTCGTTGATA 163 Vitellogenin Aa VtgAa ENSONIG00000007355 22 FAM 22 SEQ41 AGAAGATCATCAAACACATCACG 22 SEQ42 GACTTGTTGAGCAGTTGCATCAA 227 Acc:ZDB-GENE-001201-1 5 NED 5 SEQ43 ttttgtgatctagTCTGGAG 5 SEQ44 gctcttacAGCTTCACAATCAT 183 Vitellogenin Ab VtgAb ENSONIG00000007369 22 FAM 22 SEQ45 CTTCTGGACCAGTCATTGAG 22 SEQ46 AGACTTGTTGGAGCTAGAG 227 full gene name nome completo do gene Tilápia homolog gene Gene homólogo de Tilápia (alias) (alias) NCBI& Ensembl Accession Nº de acesso NCBI e Ensembl # Targeted exon Exão alvo

Label Marcador

Forward primer Primer direto SEQ ID NO SEQ ID Nº

Forward primer Primer direto Reverse primer Primer reverso SEQ ID NO SEQ ID Nº Reverse primer Primer reverso Amplicon size (bp) Tamanho do amplicon (bp) Cytochrome P450, family Citocromo P450, família 17, subfamília 17, subfamily A, A, polipeptídeo 1 polypeptide 1 Cytochrome P450, family Citocromo P450, família 19, subfamília 19, subfamily A, A, gene do polipeptídeo 1a polypeptide 1ª gene Tight junction protein Proteína de junção firme 1a 1a Casein Kinase II subunt Transcrição da subunidade 1a da transcript 1ª caseína quinase II Hippocampus abundant Transcrição abundante de hipocampo 1a transcript 1ª small ArfGAP2 ArfGAP2 pequeno Golgi-associated PDZ and PDZ associada ao Golgi e gene contendo coiled-coil motif motivo espiralado containing gene doublesex and mab-3 fator de transcrição 1 relacionado a related transcripiton duplosexo e mab-3 factor 1 growth/differentiation Tipo 6-B com fator de factor 6-B-like crescimento/diferenciação Follicle stimulating Receptor de hormônio folículo- hormone receptor estimulante Vitellogenin Aa Vitelogenina Aa Vitellogeinin Ab Vitelogenina Ab Tabela 1: Primers

Genotyping RT-PCR primers Tilapia homolog gene full gene name (alias) Forward Reverse Amplicon SEQ ID NO Forward primer sequence SEQ ID NO Reverse Primer sequence primer exon primer exon size (bp) cytochrome P450, family 1 SEQ47 GAACCAAACCCCTCTGTCACTG 1 SEQ48 GTAATTCACTCCGCAGGCTCAG 184 17, subfamily A, Cyp17 polypeptide 1 1 SEQ47 GAACCAAACCCCTCTGTCACTG 1 SEQ48 GTAATTCACTCCGCAGGCTCAG 184 cytochrome P450, family 1 SEQ49 ggcgATGAATCCTGTAG 1 SEQ50 ATGGCATTTGAGGTCACAGAGA 63 19, subfamily A, Cyp19a1a polypeptide 1a gene 9 SEQ5 TGATGGAGAGCTTCATCTACGAA 9 SEQ6 GTTCCAGGTTAAATTGATTG 186 15 SEQ51 GTTCAAGAAGGGAGAGAGT 15 SEQ52 AAAAATTCCCACATCGTT 61 Tight junction protein 1a Tjp1a 17 SEQ53 tgctttggcttcagTGTATC 17 SEQ54 AATGCGTTCGAATGTAGAA 71 Casein Kinase II subunit 5'UTR SEQ11 gtatttagaaggcggtgaaggtc 1 SEQ12 CAGTTTGGCACATGAGCATCGTA 153 Csnk2a2 alpha 1 SEQ13 ATGCTCATGTGCCAAACTG 2 SEQ14 cCTTCAGGATTTTCACCACCACT 222 Hippocampus abundant Intron3-4 SEQ15 tactgacacatccagcagcgtct Intron4-5 SEQ16 cagcactgagccgtcagtattct 211 Hiat1 transcript 1a 6 SEQ55 CATCTGCTTCATCCTGGTGGCTG 6 SEQ18 tactcacAGCGAAGGGGTCT 110 2 SEQ56 AATTTGGGCATCTTCATCTGTAT 2 SEQ57 GACAGACTTGACCTTGGAGATG 81 small ArfGAP2 Smap2 9 SEQ21 AGAGGAGGGCACAGTCAAGAAAC 10 SEQ22 TTGGATATCCCATTTGGTTCAT 226 Golgi-associated PDZ 1 SEQ58 ATGTCTGCTTCGACTGGATGC 1 SEQ59 GCCATCGAAACATGGACATACTG 76 and coiled-coil motif Gopc 80/248 containing gene Intron1-2 SEQ25 tgcccctttaaaccaccta 2 SEQ26 CTCAGCTTGGCCTTGCTTGACAT 207 doublesex and mab-3 5'UTR-1 SEQ27 ttgccaggacccATGAGCCAG 1 SEQ28 AGACACGTATCCGTGATTTCTAC 135 related transcription Dmrt1 factor 1 Intron2-3 SEQ29 ctcttcatcctctgtgtctcatc 3 SEQ30 GGGTTTCCAGCAGGAGGTCAGA 140 growth/differentiation 2 SEQ31 ttatgttcagGTGCCAAGGTG 2 SEQ32 TGGCTGTGTGAGAAACGATGCTG 156 Gsdf factor 6-B-like 4 SEQ33 agATCTGGGCTGGGACA 4 SEQ34 tgttaactatacCTGTGTGTTGG 145 Follicle stimulating Intron10-11 SEQ35 ttttctccgcttgcttctgc 11 SEQ36 AAAGAGCTGAATAGGAGGAAGTT 137

FSHR hormone receptor 15 SEQ37 CATCTTGGCGTTCTTCTGTGT 15 SEQ38 CTTGAGGGCAGCTGAGATGGC 181 7 SEQ39 GCAATCCTTGATGCTCCTTGAC 7 SEQ40 CTGAGACTCTATGTCGTTGATA 163 Vitellogenin Aa VtgAa 22 SEQ41 AGAAGATCATCAAACACATCACG 22 SEQ42 GACTTGTTGAGCAGTTGCATCAA 227 5 SEQ43 ttttgtgatctagTCTGGAG 5 SEQ44 gctcttacAGCTTCACAATCAT 183 Vitellogenin Ab VtgAb 22 SEQ45 CTTCTGGACCAGTCATTGAG 22 SEQ46 AGACTTGTTGGAGCTAGAG 227 full gene name nome completo do gene Tilapia homolog gene (alias) Gene homólogo de tilápia (alias) Genotyping RT-PCR primers Primers RT-PCR para genotipagem Forward primer exon Exão de primer direto SEQ ID NO SEQ ID Nº Forward primer sequence Sequência de primer direto Reverse primer exon Exão de primer reverso SEQ ID NO SEQ ID Nº Reverse Primer sequence Sequência de primer reverso Amplicon size (bp) Tamanho do amplicon (bp) cytochrome P450, Family 17, citocromo P450, família 17, subfamily A, polypeptide 1 subfamília A, polipeptídeo 1 cytochrome P450, Family 19, citocromo P450, família 19, subfamily A, polypeptide 1ª subfamília A, gene do gene polipeptídeo 1a Tight junction protein 1ª Proteína de junção firme 1a Casein Kinase II subunit Subunidade alfa da caseína alpha quinase II Hippocampus abundant Transcrição abundante de transcript 1ª hipocampo 1a small ArfGAP2 ArfGAP2 pequeno Golgi-associated PDZ and PDZ associada ao Golgi e gene coiled-coil motif containing contendo motivo espiralado gene doublesex and mab-3 related fator de transcrição 1 transcription factor 1 relacionado a duplosexo e mab-3 growth/differentiation factor Tipo 6-B com fator de 6-B-like crescimento/diferenciação Follicle stimulating hormone Receptor de hormônio folículo- receptor estimulante Vitellogenin Aa Vitelogenina Aa Vitellogenin Ab Vitelogenina Ab Tabela 2: Primers

[00118] Exemplo 2 - Uso de uma ferramenta de edição de genes para induzir knockout alélico duplo na geração de Tilápia F0

[00119] Tínhamos como alvo dois genes envolvidos na pigmentação de maneira independente, a saber, os genes que codificam a tirosinase (tyr) [2] e a proteína da membrana interna mitocondrial MpV17 (mpv17) (Krauss, Astrinides et al.

2013) [8]. Descobrimos que 50% e 46% de todos os embriões injetados apresentaram um alto grau de mutação nos loci tyr e mpv17, respectivamente (Fig. 4). Os alelos com perda de função resultam de forma autônoma em melanóforos não pigmentados no corpo do embrião (painel B da Fig. 4) e no epitélio pigmentar da retina (painel C da Fig. 4), produzindo fenótipos embrionários que variam de perda completa a parcial de melanina e pigmentação de iridóforo que são prontamente identificáveis se comparados ao fenótipo de tipo selvagem (painéis A e C da Fig. 4). Embriões que apresentavam uma ausência completa de pigmentação (10-30% dos peixes tratados) foram criados até os 3 meses de idade e todos não tinham sequências tyr e mpv17 de tipo selvagem. Esses peixes apresentam fenótipos transparentes e albinos (painel D da Fig. 4), indicando que estudos funcionais podem ser realizados em tilápias F0.

[00120] Exemplo 3 - Direcionamento de vários genes em tilápia

[00121] Testamos se vários loci genômicos podem ser direcionados simultaneamente e se a eficiência mutagênica medida em um loci é previsível de mutação em outros loci no genoma da tilápia. Para testar nossa hipótese, usamos Tyr e Dead-end1 (dnd) como alvo. Dnd é uma proteína de ligação ao RNA (RBP) específica para CGP que mantém o destino das células germinativas e a capacidade de migração[3]. Após a injeção de nucleases programadas, descobrimos que as mutações em ambos os alvos de gene tyr e dnd estavam altamente correlacionadas. Aproximadamente 95% dos mutantes albinos (tyr) também carregavam mutações nos loci dnd, demonstrando a adequação do defeito de pigmentação como um marcador (painel A da Fig. 5). Após análise adicional das gônadas de 10 peixes albinos, 6 eram testículos sem células germinativas translúcidos (painel B da Fig. 5). Surpreendentemente, a expressão de vasa, um marcador específico de células germinativas fortemente expresso em testículos de tipo selvagem, não foi detectada em testículos mutantes de dnd.

Este resultado indica que a expressão de dnd zigótica é necessária para a manutenção das células germinativas, e que o mRNA e/ou proteína de dnd de contribuição materna não pode recuperar a perda zigótica deste gene.

[00122] Exemplo 4 - Produção de gônadas sem células germinativas

[00123] Produzimos tilápia estéril implementando o silenciamento transitório do gene dnd em embriões por meio de microinjeção de oligonucleotídeos antisense modificados (dnd- Morfolino, bem como oligos dnd-AUM). Produzimos tilápia estéril após banho de imersão de embriões expostos a uma pequena molécula inicialmente descoberta em uma tela para ablação de CGPs em peixe-zebra [10]. Geramos ainda tilápia estéril usando estratégias de knockout de genes, conforme descrito para dnd na seção acima (Exemplo 3). Também descobrimos que a reprodução de linhagens mutadas heterozigóticas Elavl2M e a seleção da progênie mutada homozigótica permite a produção de adultos sem células germinativas de ambos os sexos (Fig. 6). Essas abordagens de KO de genes, juntamente com outras mencionadas acima, produzem tilápia infértil, exibindo papilas urogenitais femininas (UGP) e uma gônada semelhante a um fio ou UGP masculina e uma gônada semelhante a um tubo translúcido (Fig.

6). Essas metodologias, no entanto, não são soluções viáveis para a produção comercial de peixes estéreis porque apenas 25% da progênie de genitores mutados heterozigóticos são estéreis e outras abordagens de knockdown são insuficientemente robustas e confiáveis para garantir a esterilização completa de cada peixe em cada tratamento em lote.

Na presente invenção, a produção em massa de peixes estéreis depende de genitores de aluguel reprodutores que começam como peixes sem células germinativas, que depois recebem transplante de células-tronco germinativas e, por fim, produzem espermatozoides ou óvulos derivados de doadores.

A esterilização desses reprodutores receptores em nossa abordagem usa preferencialmente estratégias de knockout

(por exemplo, progênie nula de elavl2 de genitores heterozigóticos; ver Exemplo 11). Estratégias de knockout diferentes de Elavl2 podem ser usadas para produzir um receptor estéril, incluindo um mutante nulo de genes semelhantes a dead-end1, vasa, nanos3 ou piwi.

Esse receptor de knockout garante que apenas gametas derivados de doadores sejam produzidos após o transplante.

Dependendo da espécie de peixe, crustáceo ou molusco, estratégias alternativas para produzir repectores estéreis podem ser utilizadas, incluindo hibridização e triploidização (Benfey et al., 1984; Felip et al., 2001).

[00124] Exemplo 5 - Cyp17I é necessário para o desenvolvimento feminino em tilápia do Nilo

[00125] O equilíbrio dos hormônios esteroidogênicos pode governar a diferenciação sexual e a maturação das gônadas em peixes teleósteos, com o estrogênio desempenhando um papel essencial para a diferenciação feminina. No entanto, a diferenciação gonadal e a gametogênese na ausência de androgênio e estrogênio não foram investigadas. Para este fim, produzimos um modelo de tilápia in vivo sem o gene cyp17I (doravante denominado cyp17).

[00126] Na tilápia do Nilo, esta enzima é expressa exclusivamente nas células da teca e produz andrógenos em resposta ao hormônio luteinizante (LH) [13]. Os andrógenos são então convertidos em estrogênio pela aromatase induzida pelo hormônio folículo-estimulante (FSH) (cyp19a1a) nas células da granulosa vizinhas dos folículos em crescimento.

Consequentemente, a perda de função do cyp17 (via knockout da edição do gene) deve bloquear simultaneamente a síntese androgênica e estrogênica. Consistente com este modelo, descobrimos que 20 dos 22 mutantes F0 albinos/cyp17 selecionados se desenvolveram como machos fenotípicos, e exibiram UGP minúsculo (painel C da Fig. 8). A atrofia da genitália não é inesperada, dada a relação entre os andrógenos e a papila genital [14]. Porém, estes machos F0 permaneceram férteis, possivelmente devido a um fenótipo com perda parcial de função no contexto do mosaico F0. Para uma análise fenotípica completa, geramos indivíduos portadores da mesma mutação nula de Δ16-cyp17 em todas as células de seu corpo por meio de reprodução seletiva da progênie F1 (Fig.

7). O cruzamento entre organismos heterozigóticosF1 (cyp17+/−) produziu progênie de ~ 360 F2 e uma segregação Mendeliana típica de animais do tipo selvagem (n = 110; cyp17+/+), hemizigóticos (n = 159; cyp17+/−) e homozigotos (n = 91; cyp17-/-). Um total de 155 progênies F2 foram sexadas aos 6 meses de idade, com base nas características morfológicas de suas papilas urogenitais (UGP). Descobrimos que todos os 33 peixes homozigóticos se desenvolveram como machos fenotípicos, com UGP atrófica (painel A da Fig. 8).

Nossos resultados indicam que Cyp17 é indispensável para o desenvolvimento feminino.

[00127] Em seguida, quantificamos a quantidade de testosterona plasmática livre por ELISA em tilápia selvagem e mutada de cyp17. Uma média de 86pg/mL de testosterona foi medida na tilápia mutada selvagem (cyp17+/+) e heterozigótica (cyp17+/-), ao passo que nenhum nível detectável de testosterona foi encontrado na tilápia mutada homozigótica

(cyp17-/-) (painel B da Fig. 8). Isso confirma o papel essencial desta enzima na produção de andrógenos.

[00128] Examinamos ainda a morfologia e funcionalidade das gônadas em peixes deficientes em Cyp17. Irmãos machos de 5 meses de idade de cyp17+/+, cyp17+/- e cyp17-/- de tamanho idêntico foram dissecados e todos os órgãos, exceto as gônadas, foram removidos de sua cavidade corporal (painel A da Fig. 9). Mutantes do tipo selvagem e hemizigóticos apresentaram testículos de cor rosa tipicamente encontrados em peixes sexualmente maduros, enquanto mutantes homozigóticos exibiram testículos translúcidos (painéis A e B da Fig. 9). Além disso, os testículos de mutantes eram 50% menores do que dos controles (painel D da Fig. 9) e o volume de milt removível foi inferior a 20% dos selvagens (painel E da Fig. 9). Ademais, a concentração de espermatozoides em mutantes homozigóticos cyp17 foi reduzida em 20 e 6 vezes aos 5 e 6 meses de idade, respectivamente (painel F da Fig. 9).

Não encontramos nenhum defeito na morfologia, motilidade ou funcionalidade dos espermatozoides, como evidenciado pela fertilização bem-sucedida de óvulos do tipo selvagem com milt coletado de 10 mutantes nulos.

[00129] O fato de que mutantes nulos de cyp17 podem sofrer espermatogênese sugere que os andrógenos não são estritamente necessários para esse processo na tilápia do Nilo. Assim, uma mutação com perda de função neste gene pode não ser suficiente para produzir populações masculinas totalmente estéreis. Para identificar o mecanismo regulador responsável pela formação de espermatozoides funcionais, investigamos genes adicionais associados à infertilidade masculina em mamíferos.

[00130] Exemplo 6 - Candidatos a genes para direcionar a espermiogênese

[00131] Existem diferenças significativas na morfologia e função dos espermatozoides de mamíferos e peixes. Em particular, os espermatozoides dos peixes carecem de um acrossomo e são imóveis no líquido seminal, enquanto que os espermatozoides dos mamíferos possuem um acrossomo (uma organela-chave necessária para penetrar no córion do óculo) e é móvel no líquido seminal. Globozoospermia é uma forma rara e grave de infertilidade humana caracterizada por espermatozoides defeituosos tanto na morfologia quanto na função. Modelos desta doença em peixes, no entanto, não foram desenvolvidos, provavelmente porque os espermatozoides dos peixes não têm um acrossomo. Usando bancos de dados genômicos, identificamos in silico os ortólogos de tilápia dos seguintes genes de mamíferos: Csnk2a2 [15] Gopc [16, 17], Hiat1 [18], Tjp1a, Smap2 [21]. Para explorar sua função na tilápia, direcionamos 2 exões separados para cada gene (ver Figs. 10 a 14). Um gene de pigmentação (tirosinase) foi codirecionado e usado como um marcador de mutagênese.

[00132] Em conjunto com controles não tratados, aproximadamente 20 embriões por gene candidato exibindo defeitos de pigmentação foram criados até a idade adulta. Aos 5 meses de idade, o milt de machos F0 e controles do tipo selvagem foram separados para testar a densidade, motilidade e morfologia do esperma. Em comparação com os controles, todos os machos F0 mutados produziram espermatozoides diluídos. Sob o microscópio, os espermatozoides mutados produziram amplamente apenas um movimento trêmulo e encontramos frequências amplas (25% - 95%) de cabeças de formato anormal nos espermatozoides, características dos defeitos vistos em humanos e camundongos com globozoospermia (painel A da Fig. 15). Essas mutações causaram diminuições significativas nas taxas de fertilização (painel B da Fig.

15). Além disso, encontramos uma correlação positiva entre a gravidade do fenótipo de esterilidade e a frequência observada das deformidades dos espermatozoides, com a menor taxa de fertilização encontrada em mutantes Tjp1a, onde 95%

dos espermatozoides eram deformados (painéis A e B da Fig.

15). Descobrimos que todas as fêmeas nessas linhagens mutadas F0 são férteis.

[00133] Nossos resultados apontam para a existência de uma via evolutivamente conservada controlando a espermiogênese em peixes e mamíferos. Esses resultados apoiam a ideia de que a interrupção direcionada desses genes correspondentes causará um fenótipo de esterilidade em muitas outras espécies de teleósteos e, possivelmente, de forma mais ampla em outros taxa também.

[00134] Exemplo 7 - Peixes totalmente masculinos estéreis em fundo KO cyp17.

[00135] Para projetar a esterilidade masculina, primeiro avaliamos o efeito de mutações nulas no gene cyp17, que controla um importante ponto de ramificação na síntese de hormônios esteróides, regulando a produção de androgênio e estrogênio. Descobrimos que todos os peixes cyp17-/- se desenvolvem como machos. Surpreendentemente, o milt produzido por cyp17-/- continha um pequeno número de espermatozoides maduros que poderiam fertilizar oócitos por fertilização in vitro. Em seguida, investigamos a possibilidade de bloquear a espermiogênese. Nossas telas preliminares se concentraram em cinco genes associados à globozoospermia (coletivamente denominados genes específicos da espermiogênese ou genes SMS: Smap2, Cnsk2a2, Gopc, Hiat1 e Tjp1a), cujas mutações causaram subfertilidade em machos F0 com oligoastenoteratozoospermia grave, enquanto fêmeas F0 mutadas eram totalmente férteis. As caracterizações genéticas anteriores de peixes F0 com KO indicam que eles normalmente são portadores de mutações em mosaico nos loci alvo correspondentes, alguns dos quais sendo frequentemente in-frame, o que causa recuperação parcial do fenótipo. Assim, para medir o fenótipo com perda total de função, realizamos caracterização fenotípica adicional em mutantes nulos de SMS homozigóticos. Além disso, estabelecemos linhas de tilápia com mutações duplas homozigóticas para interrogar o efeito de prejudicar simultaneamente a espermiogênese e a síntese de hormônios esteróides.

[00136] Experimento: para avaliar a função in vivo de knockouts de genes duplos em cyp17 e um dos 5 genes SMS, cruzamos fêmeas mutadas F0 SMS com machos cyp17Δ16/+ . A prole (120 a 180 peixes) foi genotipada em cada locus alvo por análise de fragmentos de PCR (conforme descrito na Fig. 2)

[22]. Criamos apenas indivíduos portadores de um alelo mutante idêntico, doravante denominado m1 (Fig. 18), no locus

SMS selecionado (tipicamente 12-50% da população de progênie F1 compartilham o mesmo genótipo). Um mínimo de 10 organismos heterozigóticos duplos (por exemplo, cyp17Δ16/+; SMSm1/+) foram criados até a idade adulta. Esses heterozigóticos duplos foram intercruzados e sua progênie genotipada com 1 mês de idade por análise de desnaturação QPCR. Para cada um dos 9 possíveis genótipos F2 subsequentes (ver Fig. 9), um mínimo de 30 peixes estão sendo criados até a idade adulta e serão avaliados quanto à fertilidade. Fêmeas cyp17+/+; SMS+/m1 (por exemplo, cyp17+/+; Tjp1a+/m1) foram reservadas para estudos adicionais descritos na seção 2 abaixo. A Fig. 9 resume este esquema experimental, usando Tjp1a como um exemplo de um gene SMS alvo.

[00137] Sem nos limitarmos pela teoria, acreditamos que em peixes, como em mamíferos, mutações nulas em todos os 5 genes específicos da espermiogênese conservados resultarão em oligoastenoteratozoospermia e causarão infertilidade.

Esperamos que todos os mutantes homozigóticos duplos (cyp17- /-; SMS-/-) se desenvolvam como machos estéreis com contagens de espermatozoides ainda mais baixas do que qualquer macho KO com defeito na espermiogênese (SMS-/-). Na verdade, peixes cyp17-/- deve ser deficiente em 11-cetotestosterona, um regulador positivo da espermatogênese. Consistente com a ideia de que o androgênio desempenha um papel parácrino intratesticular na espermatogênese, a tilápia cip17-/- já havia demonstrado contagens baixas de espermatozoides. A Fig.

9 mostra os nove genótipos juntamente com quatro fenótipos correspondentes diferentes com as porcentagens esperadas: 1) ~56% de férteis para ambos os sexos, 2) ~19% de fêmeas férteis e machos estéreis, 3) ~19% de machos totalmente férteis; e 4) ~6% de machos totalmente estéreis. Olhando para cada característica individualmente, esperamos uma população de progênie com 62% machos, sendo 25% desses machos estéreis.

[00138] Exemplo 8 - Peixes totalmente masculinos estéreis em fundo KO cyp19a1a

[00139] Uma estratégia alternativa para gerar uma população totalmente masculina é inativando a aromatase Cyp19a1a (doravante denominada Cyp19). Criamos mutações out- of-frame na sequência de codificação do gene cyp19 da tilápia (Fig. 17). Esta enzima é produzida pela gônada somática e converte a testosterona em estrogênio. Consistente com este modelo, encontramos um forte viés masculino entre os 25 mutantes F0 Cyp19 selecionados, com 20 mutantes se desenvolvendo como machos fenotípicos (Tabela 3).

Notavelmente, esses machos mutados exibiam papilas urogenitais masculinas de aparência normal, indicando que a produção de androgênio não é prejudicada e as características sexuais masculinas secundárias se desenvolvem normalmente.

Isso contrasta com os machos com KO cyp17, que carecem de androgênio e, portanto, desenvolvem papilas urogenitais atróficas. A geração de populações de tilápia totalmente masculinas e estéreis, que expressam ou não os andrógenos (como em fundos KO cyp19 e KO cyp17, respectivamente), nos permitirá interrogar a influência do hormônio esteroide sexual masculino no desempenho de crescimento da tilápia. A ação estimuladora da testosterona na secreção e responsividade do GH está bem documentada em mamíferos. Para uma análise fenotípica completa, geramos indivíduos portadores das mesmas mutações nulas em todas as células de seu corpo. A prole heterozigótica de F1 cyp19 com deleções Δ10-cyp19 no primeiro exão foi selecionada para reproduzir a geração F2. Espera-se que esta mutação frameshift crie uma proteína truncada sem >98% de sua sequência de aminoácidos de tipo selvagem (Fig. 17). Esta geração F2 foi genotipada e sexada. Como esperado, descobrimos que todas as tilápias homozigóticas Δ10-cyp19 se desenvolvem como machos (n=38), enquanto as hemizigóticas (n=97) e do tipo selvagens (n=40) tiveram uma proporção sexual normal. Além disso,

estabelecemos linhas de tilápia com mutações duplas homozigóticas para interrogar o efeito de prejudicar simultaneamente a espermiogênese e a síntese de hormônios esteróides.

[00140] Experimento: primeiro cruzamos machos F1 heterozigóticos D10-cyp19a1a com as fêmeas mutantes heterozigóticas do Exemplo 7 (Gopc D8/+; Smap2 D17/+; Tjp1aD7/+; Csnk2a2 D22/+; Hiat1D17/+). Apenas os genes SMS que causam esterilidade masculina quando interrompidos em um fundo nulo de Cyp17 (resultados do Exemplo 7) serão selecionados. A progênie será genotipada e pelo menos 10 heterozigóticos duplos serão criados até a idade adulta, sexados e intercruzados. A progênie resultante será testada quanto à fertilidade conforme descrito no Exemplo 7. Um máximo de 5 machos com KO duplo diferentes serão gerados. Sem nos limitarmos pela teoria, esperamos que peixes com KO duplo cyp19-/-; SMS-/- se desenvolvam como machos estéreis e antecipamos uma população de progênie com 62% machos, sendo 25% deles estéreis.

Gene categories Categorias do gene Gene names Nomes do gene phenotype in F0 albino fenótipo em F0 albino Selected F1 genotypes Genótipos F1 selecionados (hemizygous) (hemizigóticos) Selected double hemizygous Mutante hemizigótico duplo mutante selecionado F2 homozygous F2 homozigótico 80% male (n=20) 80% masculinos (n=20) 75% male (n=23) 75% masculinos (n=23) Reduced fertility in males Fertilidade reduzida em (70-90%) machos (70-90%) 50% female (n=24) 50% femininos (n=24) 95% female (n=20) 95% femininos (n=20) Sterile females (2 in 6 Fêmeas estéreis (2 em 6 tested) testadas) Sterile females (3 in 5 Fêmeas estéreis (3 em 5 tested) testadas) Reduced fertility in females Fertilidade reduzida em (70-90%) fêmeas (70-90%)

Tabela 3: Descrição dos alelos mutantes de gene único,

alelos mutantes hemizigóticos duplos e alelos mutantes homozigóticos gerados neste estudo.

Os nomes dos genes são listados com base em seu papel específico na feminização (FEM), espermiogênese (SMS), masculinização (MA) e foliculogênese (FLS). Os fenótipos observados no mutante F0 selecionado são descritos.

[00141] Exemplo 9 - Avaliação de dois genes visando a diferenciação masculina em conjunto com dois outros genes que controlam a oogênese para produzir uma população estéril totalmente feminina.

[00142] O inibidor da transcrição fator derivado de soma gonadal (Gsdf) é um membro da superfamília TGF-b expresso apenas nas gônadas de peixes, predominantemente nas células de Sertoli. Da mesma forma, o fator de transcrição Dmrt1 é expresso preferencialmente em células pré Sertoli e Sertoli, bem como em células epiteliais do testículo. Ambos os genes são necessários para o desenvolvimento normal do testículo ([23, 24]).

[00143] Para produzir populações totalmente femininas de tilápia, geramos mutações nulas nos genes Dmrt1 ou Gsdf (genes de masculinidade ou MA) (Fig. 19 e Fig. 20).

Descobrimos que 19 de 20 tilápias Gsdf albinas mutadas se desenvolveram como fêmeas (Tabela 3). Em contraste, o mutante F0 apresentando defeito de pigmento em mosaico tinha proporção sexual normal. Postulando uma correlação positiva de frequência mutagênica entre os genes codirecionados da tirosinase e Gsdf, nosso resultado sugere que a alta taxa de mutação em Gsdf faz com que machos XY mudem para o sexo feminino. Surpreendentemente, não observamos um viés de sexo feminino entre o mutante F0 Dmrt1 selecionado (Tabela 3).

[00144] Para projetar a esterilidade em fêmeas, selecionamos genes envolvidos na maturação do folículo ovariano. Identificamos dois genes na via molecular que controla a foliculogênese: 1) FSHR que atua antes da síntese de estrogênio ovariano e 2) Vitelogeninas (Vtgs), que atuam após a síntese de estrogênio ovariano. As vitelogeninas são produzidas preferencialmente pelo fígado, enquanto o FSHR, o receptor do hormônio folículo-estimulante (FSH), é expresso nas células da teca que cercam os oócitos em desenvolvimento.

Para testar a necessidade de FSHR e Vtgs no desenvolvimento normal do ovário (genes específicos da foliculogênese ou FLS), produzimos mutações com perda de função nesses genes em linhagens F0 independentes (Figs. 22-24).

[00145] Descobrimos que o FSHR é indispensável para a foliculogênese e a interrupção do gene FSHR resultou em uma falha completa na ativação do folículo e esterilidade feminina (Fig. 26 e Tabela 3). Na tilápia, a mutação FSHR não foi seguida pela masculinização de fêmeas genéticas em machos, conforme descrito anteriormente no peixe-zebra [29].

No entanto, descobrimos que as fêmeas mutantes F0 FSHR tinham papilas urogenitais significativamente menores quando comparadas às fêmeas controle. Esta observação provavelmente reflete um nível reduzido de estrogênio nos mutantes FSHR, consistente com o papel do FSHR na regulação local da expressão da aromatase e produção de estrogênio. Não encontramos fenótipo reprodutivo significativo em machos mutados de F0 FSHR.

[00146] A tilápia do Nilo possui apenas 3 genes Vtg

[25], duas formas de Vtgs completos (VtgAa e VtgAb) e uma forma de vitelogenina teleóstica tipo C incompleta, sem três domínios de proteína (VtgC). Como VtgAa e VtgAb são expressos em um nível mais alto do que VtgC e considerados críticos para o desenvolvimento inicial do embrião, direcionamos esses dois genes individualmente, bem como em conjunto (Figs. 22, 23 e Tabela 3). Consistente com as funções na maturação do oócito e suporte nutricional para a embriogênese, descobrimos que 3 de 4 fêmeas F0 mutadas em VtgAa testadas fracassaram repetidamente em produzir progênie viável (Fig. 24). Também descobrimos que uma de 5 fêmeas F0 portadoras de mutações em

VtgAb produziu progênie de embriões que morreu antes da eclosão (dados não apresentados).

[00147] Para uma caracterização fenotípica completa, é essencial gerar mutações idênticas em todas as células do animal. Assim, iremos estabelecer e caracterizar 4 linhagens de tilápias deficientes tanto na masculinização quanto na vitelogênese.

[00148] Aos 6 meses de idade, fêmeas F0 XX MA m1-n com mosaico (por exemplo, Dmrt1 m1-n ou Gsdf m1-n) foram cruzadas com machos F0 FLS m1-n com mosaico (FSHRm1-n ou Vtgs m1-n) e sua progênie F1 genotipada para identificar mutantes heterozigóticos duplos (por exemplo, Dmrt1D7/+- FSHRD5/+) portando o mesmo indel específico de gene em cada locus (Tabela 3).

[00149] Experiência: um mínimo de 10 organismos heterozigóticos duplos (para cada uma das quatro combinações de genes) estão sendo criados até a idade adulta. Os alelos do tipo selvagem devem garantir que esses peixes F1 se desenvolvam como machos e fêmeas férteis. Esses mutantes heterozigóticos duplos serão então inter-cruzados e sua progênie genotipada com 1 mês de idade por análise de desnaturação QPCR. Para cada um dos 9 genótipos possíveis subsequentes (ver Fig. 25), um mínimo de 30 peixes serão criados até a idade adulta, depois sexados e testados quanto à fertilidade.

[00150] A Fig. 25 mostra nove genótipos e os quatro fenótipos diferentes correspondentes que esperamos com as seguintes proporções fracionárias: 1) ~56% de férteis para ambos os sexos, 2) ~19% de fêmeas férteis e machos estéreis, 3) ~19% de machos totalmente férteis; e 4) ~6% de fêmeas totalmente estéreis. Olhando para cada característica individualmente, esperamos uma população de progênie com 62% fêmeas, sendo 25% delas estéreis.

[00151] Nossas investigações fenotípicas em linhagens mutadas F0 (Tabela 3) concordam principalmente com nossa hipótese inicial e esperamos corroborar relações genótipo- fenótipo nas gerações subsequentes. Descobrimos que a deficiência em Gsdf causou feminização, enquanto a inativação de FSHR e Vtgs resultou em esterilidade feminina. Estes resultados sugerem fortemente que organismos com KO duplo FSHR-Gsdf se desenvolverão em populações monosexuadas de fêmeas estéreis caracterizadas por ovários atróficos contendo folículos presos no estágio pré-vitelogênico. A falta de um fenótipo de diferenciação sexual no mutante F0 Dmrt1 provavelmente reflete a edição incompleta, o mosaicismo regional e a compensação por células não mutadas. Porém, sem nos limitarmos pela teoria, acreditamos que os organismos com KO duplo FSHR-Dmrt1 nos quais as mutações foram herdadas através da linhagem germinativa se desenvolverão em populações totalmente femininas estéreis. Em nossa pesquisa de mutagênese F0, observamos que o bloqueio do precursor das principais proteínas da gema (como em KOs Vtg) compromete a qualidade do ovo e prejudica o desenvolvimento e a sobrevivência dos embriões. Como tal, esperamos que organismos com KO duplo Gsdf-Vtgs e Dmrt1-Vtgs se desenvolvam em populações monosexuadas de fêmeas estéreis.

[00152] Exemplo 10 - Propagação de linhagens estéreis totalmente masculinas e femininas por transplante de linhagem germinativa em adultos de aluguel estéreis

[00153] Os exemplos 8 e 9 acima ilustram como gerar peixes monosexuados estéreis através da criação de mutantes hemizigóticos duplos e da seleção individual da subpopulação de progênie com KO duplo. Esta abordagem, entretanto, pode não ser suficientemente eficiente e pode se tornar muito cara para ser usada em situações comerciais. A injeção intracitoplasmática de espermatozoides na reprodução assistida oferece uma solução para a propagação de reprodutores machos com defeito na espermiogênese. Porém,

esta abordagem também não é escalável para a produção em massa de estoques comerciais (pois requer a realização de métodos em 'um peixe por vez'). A chave para a produção em maior escala é gerar reprodutores machos e fêmeas que produzem apenas gametas mutantes, de forma que nenhuma seleção seja necessária para identificar a progênie com KO duplo. É importante ressaltar que esses gametas mutantes também devem ser funcionais, de modo que o acasalamento natural desses reprodutores possa ser usado para produzir uma população viável de progênie monosexuada estéril. Isso só é possível se a proporção sexual e a funcionalidade do gameta forem recuperadas nos reprodutores. Especulamos que isso pode ser alcançado pelo transplante de células-tronco da linhagem germinativa de um peixe mutante com KO duplo para um receptor sem células germinativas não mutado para os mesmos genes.

Esses reprodutores transplantados têm células somáticas normais, mas uma linhagem germinal mutada (ver Figs. 27-32).

Esses receptores quiméricos possuem gene(s) somático(s) MA ou FEM funcional(is) que garantem a proporção sexual normal (painéis C e D da Fig. 34) e genes somáticos SMS ou FLS funcionais para recuperar a espermiogênese (Fig. 28) ou oogênese (Figs. 29 e 30), assumindo que os genes mutados não funcionam nas células germinativas.

[00154] Como a falha espermatogênica pode resultar de defeitos nas células germinativas ou em seu ambiente somático, analisamos as expressões dos genes SMS para identificar aqueles preferencialmente não expressos nas células germinativas (Fig. 16). Nosso estudo de expressão dos genes SMS em testículos estéreis aponta para um papel das células somáticas da gônada no apoio ao desenvolvimento de células germinativas. Por exemplo, descobrimos que Tjp1a é altamente expresso em testículos estéreis em nível acima do observado em testículos de tipo selvagem, enquanto os níveis da expressão de Hiat1 e Gopc são apenas ligeiramente reduzidos em comparação com testículos férteis (Fig. 16).

[00155] Esses resultados sugerem que mutantes desses genes desenvolvem um microambiente testicular, onde a espermiogênese é prejudicada devido a defeitos específicos de Sertoli e/ou Leydig (Fig. 28). Consequentemente, esperamos que o transplante de células-tronco espermatogoniais de doadores macho inférteis para um ambiente testicular de tipo selvagem permissivo recupere a funcionalidade e a fertilidade dos espermatozoides (Fig. 28).

[00156] Da mesma forma, FSHR e Vtgs são estritamente expressos em células somáticas (células da teca e do fígado, respectivamente). Assim, os oócitos portadores de alelos nulos desses genes devem manter sua capacidade intrínseca de proliferar e se diferenciar, garantindo que as células-tronco oogoniais de um doador fêmea mutado estéril possam repovoar os ovários e se diferenciar em óvulos funcionais após o transplante para um receptor do tipo selvagem/ permissivo ( Figs. 29 e 30). Assim, acreditamos que os receptores machos ou fêmeas podem produzir gametas portadores do genótipo de doador.

[00157] Exemplo 11 - Receptores com KO Elavl2 podem produzir gametas funcionais

[00158] Para confirmar que os receptores com KO Elavl2 estéreis podem produzir gametas funcionais a partir de células germinativas derivadas de doadores, coletamos células-tronco espermatogoniais dos testículos de tilápia macho albina (tyr-/-) portadora de mutações (in-frame e out- of-frame) em um gene de referência (painel A da Fig. 33).

Transplantamos a suspensão de células testiculares de ambas as linhagens mutadas em progênie de embriões receptores depletados de células germinativas de genitores Elavl2-/+, tyr+/+. Genotipamos peixes transplantados para selecionar o mutante Elavl2-/- homozigótico e os criamos até a idade adulta. Aos 5 meses de idade, entre 31-50% dos machos Elavl2-

/- transplantados e 40% das fêmeas Elavl2-/- transplantadas com seis meses de idade produziram progênie exclusivamente albina quando cruzados com machos e fêmeas albinos.

Os controles Elavl2-/- não transplantados eram estéreis.

Assim,

os receptores Elavl2-/- podem produzir gametas derivados de um doador após o transplante de células-tronco da linhagem germinativa, o que ilustra a viabilidade de criar uma tilápia que produza apenas gametas derivados de um doador.

O uso de albinismo para testar gametas portadores de alelos tyr forneceu um teste de alto rendimento, quantificável e fácil para a eficácia de transmissão da linhagem germinativa de alelos mutantes, mas esses experimentos não demonstram que as mutações nulas foram propagadas com sucesso.

Para tanto,

extraímos e analisamos o DNA dos espermatozoides de um receptor fértil por ensaio de dimensionamento de fragmentos de PCR.

Os produtos da amplificação foram dimensionados usando eletroforese capilar (painel B da Fig. 33). Os resultados revelam que o peixe receptor produz apenas espermatozoides contendo fragmentos de deleção in-frame e out-of-frame (3 nt e 4 nt) derivados do doador, sugerindo que o alelo nulo (deleção 4 nt) pode colonizar a gônada e proliferar de forma tão eficiente quanto a mutação do controle positivo (deleção 3 nt) (painel B da Fig. 33).

[00159] Experimento: células-tronco espermatogoniais e oogoniais (SSCs, OSCs) serão isoladas de linhagens juvenis de tilápia (desenvolvidas de acordo com os Exemplos 7, 8 e 9).

Após a coleta, essas células-tronco da linhagem germinativa serão transplantadas em filhotes receptores com KO Elavl2, conforme descrito acima. Sem nos limitarmos pela teoria, esperamos a produção de espermatozoides funcionais e oócitos portadores dos genótipos doadores. Para avaliar a funcionalidade dos gametas derivados de doadores produzidos após o transplante, ensaios de fertilização in vitro serão realizados. Além disso, esperamos que apenas a progênie albina surja de um cruzamento entre o receptor naturalmente pigmentado portador de gametas de doadores albinos e linhagens albinas. Faremos a genotipagem de 10 progênies para mutações em genes específicos da espermatogênese e vitelogênese derivados de doadores.

[00160] Conforme ilustrado no painel B da Fig. 34, o cruzamento de mães de aluguel com machos de sexo oposto com KO duplo, obtido a partir do tratamento com inibidores da aromatase, produzirá progênie estéril totalmente feminina.

Alternativamente, o cruzamento de pais de aluguel com fêmeas mutadas com KO duplo e reversão de sexo recuperadas após tratamento com estrogênio produzirá populações estéreis totalmente masculinas (painel A da Fig. 34). A reversão do sexo em KO duplo com estrogênio (como no painel A da Fig. 34) ou inibidor de androgênio (como no painel B da Fig. 34) pode ser substituída pelo método de transplante de linhagem germinal para produzir reprodutores fêmea (painel C da Fig.

34) ou reprodutores macho (painel D da Fig. 34).

[00161] Exemplo 12 - Ensaios em tanques de crescimento

[00162] Há um contrabalanceamento direto entre crescimento e reprodução, pois a energia canalizada para as gônadas prejudica o crescimento somático. A tilápia do Nilo amadurece precocemente e pode se reproduzir ao longo do ano, com curtos períodos vitelogênicos [26], e um processo fisiológico que exige alta taxa metabólica. Além disso, as espécies de tilápia podem suprimir o crescimento para manter sua capacidade reprodutiva [27], e em outras espécies de peixes o início da puberdade pode ter um grande impacto em importantes parâmetros de produção na piscicultura, como apetite, taxa de crescimento, eficiência de conversão alimentar, qualidade da carne, aparência externa, saúde, bem- estar e taxas de sobrevivência. Assim, atrasar ou bloquear a maturação sexual provavelmente conferirá benefícios significativos aos produtores de aquicultura comercial. Em nossos esforços para desenvolver populações monosexuadas estéreis, temos como alvo genes cujas mutações bloqueiam ou atrasam o início da puberdade. No entanto, os genes direcionados para esses efeitos também podem ter efeitos pleiotrópicos, prejudiciais à linhagem, agindo por meio de alterações hormonais, fisiológicas ou comportamentais desconhecidas.

[00163] Experimento: para gerar grupos usados para testes de desempenho de crescimento, embriões de cruzamentos entre pares simples (pelo menos três cruzamentos separados) serão produzidos para cada linhagem de interesse. Os embriões de tratamento e controle serão criados separadamente usando procedimentos de incubação estabelecidos. Na fase de alimentação, metade dos animais de controle terá seu sexo invertido usando protocolos de tratamento com hormônio exógeno apropriado (ou seja, alimentação com metiltestosterona ou DES). Quando os peixes de um grupo (de tratamento e controle) atingirem peso médio de 60g, serão marcados com PIT e divididos em seis tanques de 1000L (3 de controle e 3 de tratamento, com 50 peixes/tanque). Todos os peixes serão alimentados três vezes ao dia, até a saciedade.

[00164] Cada peixe será pesado individualmente e o comprimento de cada peixe medido em intervalos de 4 semanas durante um período necessário para atingir o tamanho de mercado (680g Sdv: 77g, 8 meses). Ao final do experimento, os peixes serão sacrificados e sexados com base na estrutura do orifício urogenital. Serão registrados os pesos individuais das gônadas dissecadas e da carcaça para cálculo do índice gonadossomático (IGS) e índice de carcaça (n=60 por grupo). A taxa de crescimento específico (G) será calculada de acordo com a fórmula de Houde & Scheckter [28].

[00165] Sem nos limitarmos pela teoria, acreditamos que a maioria, senão todos os peixes com KO duplo criados nos Exemplos 7, 8 e 9 se desenvolverão como monosexuados e serão estéreis sem nenhum outro processo biológico prejudicado.

Assim, as mutações selecionadas não devem impactar negativamente o desempenho geral dos peixes. Pelo contrário, esperamos encontrar uma taxa de crescimento melhorada e taxas de conversão alimentar inversamente correlacionadas ao peso da gônada. As linhagens mutadas devem ser sexualmente atrasadas (machos estéreis) ou imaturas (fêmeas presas no estágio pré-vitelogênico). No caso improvável de atingirmos apenas a esterilização parcial das populações monosexuadas, esperamos que a melhoria na produtividade da tilápia seja proporcional à fração de peixes estéreis na população, como resultado do gasto energético reduzido. Em todos os casos,

prevemos que peixes estéreis e peixes com gônadas atróficas superem suas contrapartes totalmente férteis (por exemplo, populações monosexuadas derivadas de tratamentos com hormônios exógenos) em relação às características de crescimento.

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3762.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID Nº 1 COMPRIMENTO: 38 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer com cauda direta (FAM) SEQUÊNCIA: 1 TGTAAAACGACGGCCAGTttgaagttgctacataaaag SEQ ID Nº 2 COMPRIMENTO: 22 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 2

TGGTTGATGACAATCACACTGT SEQ ID Nº 3 COMPRIMENTO: 41 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer com cauda direta (NED) SEQUÊNCIA: 3 TAGGAGTGCAGCAAGCATtgttctacatcatcacccttctc SEQ ID Nº 4 COMPRIMENTO: 23 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 4

AGCAGACAGACGAGCAGTATCAG SEQ ID Nº 5 COMPRIMENTO: 41 TIPO: DNA

ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer com cauda direta (FAM) SEQUÊNCIA: 5

TGTAAAACGACGGCCAGTTGATGGAGAGCTTCATCTACGAA SEQ ID Nº 6 COMPRIMENTO: 20 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 6

GTTCCAGGTTAAATTGATTG SEQ ID Nº 7 COMPRIMENTO: 41 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer com cauda direta (NED) SEQUÊNCIA: 7 TAGGAGTGCAGCAAGCATgcgtgatttgctgacctttttac

SEQ ID Nº 8

COMPRIMENTO: 22

TIPO: DNA

ORGANISMO: sequência artificial

OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial:

primer

SEQUÊNCIA: 8 acacttacCCTGAGAATCTGG

SEQ ID Nº 9

COMPRIMENTO: 41

TIPO: DNA

ORGANISMO: sequência artificial

OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial:

primer com cauda direta (FAM)

SEQUÊNCIA: 9

TGTAAAACGACGGCCAGTGAAAAAGGATGgtgagggatgac

SEQ ID Nº 10

COMPRIMENTO: 23

TIPO: DNA

ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 10

GAGTGTGTCTACCACACGGAAAA SEQ ID Nº 11 COMPRIMENTO: 41 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer com cauda direta (FAM) SEQUÊNCIA: 11 TGTAAAACGACGGCCAGTgtatttagaaggcggtgaaggtc SEQ ID Nº 12 COMPRIMENTO: 23 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 12

CAGTTTGGCACATGAGCATCGTA

SEQ ID Nº 13 COMPRIMENTO: 37 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer com cauda direta (NED) SEQUÊNCIA: 13

TAGGAGTGCAGCAAGCATATGCTCATGTGCCAAACTG SEQ ID Nº 14 COMPRIMENTO: 23 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 14 cCTTCAGGATTTTCACCACCACT SEQ ID Nº 15 COMPRIMENTO: 41 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial

OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer com cauda direta (FAM) SEQUÊNCIA: 15 TGTAAAACGACGGCCAGTtactgacacatccagcagcgtct SEQ ID Nº 16 COMPRIMENTO: 23 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 16 cagcactgagccgtcagtattct SEQ ID Nº 17 COMPRIMENTO: 37 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer com cauda direta (NED) SEQUÊNCIA: 17

TAGGAGTGCAGCAAGCATTGGAGCCTACCTGTCTGAG

SEQ ID Nº 18

COMPRIMENTO: 20

TIPO: DNA

ORGANISMO: sequência artificial

OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial:

primer

SEQUÊNCIA: 18 tactcacAGCGAAGGGGTCT

SEQ ID Nº 19

COMPRIMENTO: 38

TIPO: DNA

ORGANISMO: sequência artificial

OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial:

primer com cauda direta (NED)

SEQUÊNCIA: 19

TAGGAGTGCAGCAAGCATgctcctctgcgaagactctc

SEQ ID Nº 20

COMPRIMENTO: 23

TIPO: DNA

ORGANISMO: sequência artificial

OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 20 aagacctccgacCTGGACTTGCT SEQ ID Nº 21 COMPRIMENTO: 41 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer com cauda direta (FAM) SEQUÊNCIA: 21

TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGAGGGCACAGTCAAGAAAC SEQ ID Nº 22 COMPRIMENTO: 22 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 22

TTGGATATCCCATTTGGTTCAT

SEQ ID Nº 23 COMPRIMENTO: 40 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer com cauda direta (NED) SEQUÊNCIA: 23 TAGGAGTGCAGCAAGCATtttaacggtgttggcagagatt SEQ ID Nº 24 COMPRIMENTO: 22 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 24

AGATCCACATCCACGAAAGCCT SEQ ID Nº 25 COMPRIMENTO: 37 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial

OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer com cauda direta (FAM) SEQUÊNCIA: 25 TGTAAAACGACGGCCAGTtgcccctttaaaccaccta SEQ ID Nº 26 COMPRIMENTO: 23 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 26

CTCAGCTTGGCCTTGCTTGACAT SEQ ID Nº 27 COMPRIMENTO: 39 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer com cauda direta (NED) SEQUÊNCIA: 27 TAGGAGTGCAGCAAGCATttgccaggacccATGAGCCAG

SEQ ID Nº 28 COMPRIMENTO: 23 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 28

AGACACGTATCCGTGATTTCTAC SEQ ID Nº 29 COMPRIMENTO: 41 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer com cauda direta (FAM) SEQUÊNCIA: 29 TGTAAAACGACGGCCAGTctcttcatcctctgtgtctcatc SEQ ID Nº 30 COMPRIMENTO: 22 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial

OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 30

GGGTTTCCAGCAGGAGGTCAGA SEQ ID Nº 31 COMPRIMENTO: 39 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer com cauda direta (NED) SEQUÊNCIA: 31 TAGGAGTGCAGCAAGCATttatgttcagGTGCCAAGGTG SEQ ID Nº 32 COMPRIMENTO: 23 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 32

TGGCTGTGTGAGAAACGATGCTG

SEQ ID Nº 33

COMPRIMENTO: 35

TIPO: DNA

ORGANISMO: sequência artificial

OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial:

primer com cauda direta (FAM)

SEQUÊNCIA: 33

TGTAAAACGACGGCCAGTagATCTGGGCTGGGACA

SEQ ID Nº 34

COMPRIMENTO: 23

TIPO: DNA

ORGANISMO: sequência artificial

OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial:

primer

SEQUÊNCIA: 34 tgttaactatacCTGTGTGTTGG

SEQ ID Nº 35

COMPRIMENTO: 38

TIPO: DNA

ORGANISMO: sequência artificial

OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer com cauda direta (NED) SEQUÊNCIA: 35 TAGGAGTGCAGCAAGCATttttctccgcttgcttctgc SEQ ID Nº 36 COMPRIMENTO: 23 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 36

AAAGAGCTGAATAGGAGGAAGTT SEQ ID Nº 37 COMPRIMENTO: 39 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer com cauda direta (FAM) SEQUÊNCIA: 37

TGTAAAACGACGGCCAGTCATCTTGGCGTTCTTCTGTGT

SEQ ID Nº 38 COMPRIMENTO: 21 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 38

CTTGAGGGCAGCTGAGATGGC SEQ ID Nº 39 COMPRIMENTO: 40 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer com cauda direta (NED) SEQUÊNCIA: 39

TAGGAGTGCAGCAAGCATGCAATCCTTGATGCTCCTTGAC SEQ ID Nº 40 COMPRIMENTO: 22 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial

OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 40

CTGAGACTCTATGTCGTTGATA SEQ ID Nº 41 COMPRIMENTO: 41 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer com cauda direta (FAM) SEQUÊNCIA: 41

TGTAAAACGACGGCCAGTAGAAGATCATCAAACACATCACG SEQ ID Nº 42 COMPRIMENTO: 23 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 42

GACTTGTTGAGCAGTTGCATCAA

SEQ ID Nº 43

COMPRIMENTO: 38

TIPO: DNA

ORGANISMO: sequência artificial

OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial:

primer com cauda direta (NED)

SEQUÊNCIA: 43

TAGGAGTGCAGCAAGCATttttgtgatctagTCTGGAG

SEQ ID Nº 44

COMPRIMENTO: 22

TIPO: DNA

ORGANISMO: sequência artificial

OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial:

primer

SEQUÊNCIA: 44 gctcttacAGCTTCACAATCAT

SEQ ID Nº 45

COMPRIMENTO: 41

TIPO: DNA

ORGANISMO: sequência artificial

OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer com cauda direta (FAM) SEQUÊNCIA: 45

TGTAAAACGACGGCCAGTAGAAGATCATCAAACACATCACG SEQ ID Nº 46 COMPRIMENTO: 23 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 46

GACTTGTTGAGCAGTTGCATCAA SEQ ID Nº 47 COMPRIMENTO: 22 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 47

GAACCAAACCCCTCTGTCACTG

SEQ ID Nº 48 COMPRIMENTO: 22 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 48

GTAATTCACTCCGCAGGCTCAG SEQ ID Nº 49 COMPRIMENTO: 17 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 49 ggcgATGAATCCTGTAG SEQ ID Nº 50 COMPRIMENTO: 22 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial

OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 50

ATGGCATTTGAGGTCACAGAGA SEQ ID Nº 51 COMPRIMENTO: 19 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 51

GTTCAAGAAGGGAGAGAGT SEQ ID Nº 52 COMPRIMENTO: 18 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 52

AAAAATTCCCACATCGTT

SEQ ID Nº 53 COMPRIMENTO: 20 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 53 tgctttggcttcagTGTATC SEQ ID Nº 54 COMPRIMENTO: 19 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 54

AATGCGTTCGAATGTAGAA SEQ ID Nº 55 COMPRIMENTO: 23 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial

OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 55

CATCTGCTTCATCCTGGTGGCTG SEQ ID Nº 56 COMPRIMENTO: 23 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 56

AATTTGGGCATCTTCATCTGTAT SEQ ID Nº 57 COMPRIMENTO: 22 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 57

GACAGACTTGACCTTGGAGATG

SEQ ID Nº 58 COMPRIMENTO: 21 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 58

ATGTCTGCTTCGACTGGATGC SEQ ID Nº 59 COMPRIMENTO: 23 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: primer SEQUÊNCIA: 59

GCCATCGAAACATGGACATACTG SEQ ID Nº 60 e 62 (Cyp17a1 de tipo selvagem) COMPRIMENTO: 1563bp e 521aa TIPO: cDNA (SEQ ID Nº 60) e Proteína (SEQ ID Nº 62) ORGANISMO: tilápia do Nilo

GAACCAAACCCCTCTGTCACTGATATGGCTTGGTTTTTGTGTCTGTGCGTGTTCATGGCG 60 1 -E--P--N--P--S--V--T--D--M--A--W--F--L--C--L--C--V--F- -M--A- 20 61

GTGGGCCTCACTTTGTTAGCACTGCAGTTCAAGTTCAGGATGTCTGCACATGGTTCTGGG 120 21 -V--G--L--T--L--L--A--L--Q--F--K--F--R--M--S--A--H--G- -S--G- 40 121

GAGCCGCCACACCTCCCTGCACTACCACTGATTGGCAGCCTGCTGAGCCTGCGGAGTGAA 180 41 -E--P--P--H--L--P--A--L--P--L--I--G--S--L--L--S--L--R- -S--E- 60 181

TTACCACCGCATGTGCTTTTCAAAGAACTGCAGGTAAAATACGGACATACATACTCGCTG 240 61 -L--P--P--H--V--L--F--K--E--L--Q--V--K--Y--G--H--T--Y- -S--L- 80 241

ATGATGGGCTCCCACAGTGTGATTGTCATCAACCAGCATGTGCACGCCAAAGAAGTCTTG 300 81 -M--M--G--S--H--S--V--I--V--I--N--Q--H--V--H--A--K--E- -V--L- 100 301

CTCAAGAAGGGAAAGACGTTTGCAGGAAGACCTAGAACTGTAACCACAGATATTCTGACT 360 101 -L--K--K--G--K--T--F--A--G--R--P--R--T--V--T--T--D--I- -L--T- 120 361

AGAGATGGGAAGGACATTGCATTTGGAGACTACAGTGCTACGTGGAAGTTCCACAGGAAG 420 121 -R--D--G--K--D--I--A--F--G--D--Y--S--A--T--W--K--F--H- -R--K- 140 421

ATAGTCCATGGAGCCCTGTGCATGTTTGGAGAAGGTTCTGCCTCTATTGAGAAGACCATT 480 141 -I--V--H--G--A--L--C--M--F--G--E--G--S--A--S--I--E--K-

-T--I- 160 481

TGTGCAGAGGCCCAGTCTCTGTGCTCCGTGCTGTCTGAGGCAGCAGATGTGGGACTGGCC 540 161 -C--A--E--A--Q--S--L--C--S--V--L--S--E--A--A--D--V--G- -L--A- 180 541

CTGGATCTTGCTCCTGAGCTGACTCGCGCTGTCACCAACGTTATCTGTTCTCTCTGCTTC 600 181 -L--D--L--A--P--E--L--T--R--A--V--T--N--V--I--C--S--L- -C--F- 200 601

AACTCGTCCTACTGCCGAGGCGACTCAGAGTTTGAGACAATGCTGCAGTACAGCCAGGGC 660 201 -N--S--S--Y--C--R--G--D--S--E--F--E--T--M--L--Q--Y--S- -Q--G- 220 661

ATTGTGGACACTGTGGCTAAAGACAGCCTGGTAGACATTTTCCCCTGGCTTCAGATCTTT 720 221 -I--V--D--T--V--A--K--D--S--L--V--D--I--F--P--W--L--Q- -I--F- 240 721

CCTAATGCGGACCTACGTCTCCTAAAACATTGTGTTTCCATCAGAGACAAACTTCTACAG 780 241 -P--N--A--D--L--R--L--L--K--H--C--V--S--I--R--D--K--L- -L--Q- 260 781

AGGAAATTTGATGAACACAAGGTGAATTACAATGATCACGTGCAGAGAGACTTGATAGAC 840 261 -R--K--F--D--E--H--K--V--N--Y--N--D--H--V--Q--R--D--L- -I--D- 280 841

GCTCTGCTAAGAGCCAAGCGCAGTGCGGAGAACAACAACACATCAGAGATAAGTGCAGAG 900 281 -A--L--L--R--A--K--R--S--A--E--N--N--N--T--S--E--I--S- -A--E- 300 901

TCTGTGGGCCTGAGTGATGACCACATTCTCATGACAGTGGGAGACATCTTTGGCGCTGGC

301 -S--V--G--L--S--D--D--H--I--L--M--T--V--G--D--I--F--G- -A--G- 320 961

GTGGAAACCACTACCACTGTGCTCAAATGGGCCATAACGTACCTCATTCATCACCCAGAG 1020 321 -V--E--T--T--T--T--V--L--K--W--A--I--T--Y--L--I--H--H- -P--E- 340 1021

GTGCAAAGACGTATCCAGGATGAGCTGGACAGGACGGTGGGTGACAGCCGCTCTCCTAAA 1080 341 -V--Q--R--R--I--Q--D--E--L--D--R--T--V--G--D--S--R--S- -P--K- 360 1081

CTCACCGACAGAGGCAGTCTGCCTTATCTGGAGGCCACCATTAGGGAAGTATTGCGGATT 1140 361 -L--T--D--R--G--S--L--P--Y--L--E--A--T--I--R--E--V--L- -R--I- 380 1141

CGCCCCGTGGCACCACTACTCATCCCCCATGTGGCTCTCTGTGACACCAGCATTGGAGAT 1200 381 -R--P--V--A--P--L--L--I--P--H--V--A--L--C--D--T--S--I- -G--D- 400 1201

TTCACAGTGAGAAAAGGAACTCGAGTCATTATCAACCTGTGGGCTCTGCACCATGATGAG 1260 401 -F--T--V--R--K--G--T--R--V--I--I--N--L--W--A--L--H--H- -D--E- 420 1261

AAGGAGTGGAAGAACCCAGAGCGGTTTGACCCTGGCCGGTTCTTGAAAAGTGAAGGCACA 1320 421 -K--E--W--K--N--P--E--R--F--D--P--G--R--F--L--K--S--E- -G--T- 440 1321

GGACTGACAATCCCATCACCCAGCTACCTGCCCTTTGGTGCTGGGCTGAGAGTATGTTTA 1380 441 -G--L--T--I--P--S--P--S--Y--L--P--F--G--A--G--L--R--V- -C--L- 460

GGTGAGGCCTTGGCCAAGATGGAGCTCTTTCTCTTCCTGTCCTGGATCCTGCAGCGCTTC 1440 461 -G--E--A--L--A--K--M--E--L--F--L--F--L--S--W--I--L--Q- -R--F- 480 1441

ACTCTGTCTGTCCCACCAGGCCACAGTCTGCCCAGTCTGGAGGGAAAGTTTGGAGTGGTC 1500 481 -T--L--S--V--P--P--G--H--S--L--P--S--L--E--G--K--F--G- -V--V- 500 1501

CTGCAGACAGCCAAGTACAAGGTGAATGCCACAATCAGACCAGACTGGGCAAGACATAAG 1560 501 -L--Q--T--A--K--Y--K--V--N--A--T--I--R--P--D--W--A--R- -H--K- 520 1561 TGC 1563 521 -C- 521 SEQ ID Nº 61 e 63 (alelo mutante Cyp17a1 - deleção 16nt) COMPRIMENTO: 1563bp e 44aa TIPO: cDNA (SEQ ID Nº 61) e Proteína (SEQ ID Nº 63) ORGANISMO: tilápia do Nilo 1

GAACCAAACCCCTCTGTCACTGATATGGCTTGGTTTTTGTGTCTGTGCGGTGGGCCTCAC 60 1 -E--P--N--P--S--V--T--D--M--A--W--F--L--C--L--C--G--G- -P--H- 20 61

TTTGTTAGCACTGCAGTTCAAGTTCAGGATGTCTGCACATGGTTCTGGGGAGCCACCTCC 120 21 -F--V--S--T--A--V--Q--V--Q--D--V--C--T--W--F--W--G--A- -T--S- 40

CTGCACTACCACTGATTGGCAGCCTGCTGAGCCTGCGGAGTGAATTACCACCGCATGTGC 180 41 -L--H--Y--H--*- 44 SEQ ID Nº 65 e 68 (Cyp19a1a de tipo selvagem) COMPRIMENTO: 1707bp e 511aa TIPO: cDNA (SEQ ID Nº 65) e Proteína (SEQ ID Nº 68) ORGANISMO: tilápia do Nilo 1

GCGATGAATCCTGTAGGCTTAGACGCCGTGGTGGCAGATCTCTCTGTGACCTCAAATGCC 60 ...-M--N--P--V--G--L--D--A--V--V--A--D--L--S--V--T--S- -N--A- 19 61

ATCCAATCGCATGGGATATCAATGGCAACCAGAACGCTGATACTGCTCGTCTGTCTGCTG 120 20 -I--Q--S--H--G--I--S--M--A--T--R--T--L--I--L--L--V--C- -L--L- 39 121

TTGGTTGCCTGGAGTCACACGGACAAGAAAATTGTGCCAGGTCCTTCTTTCTGTTTGGGT 180 40 -L--V--A--W--S--H--T--D--K--K--I--V--P--G--P--S--F--C- -L--G- 59 181

TTGGGCCCACTTCTGTCATATCTGAGATTTATCTGGACTGGCATAGGCACAGCCAGCAAC 240 60 -L--G--P--L--L--S--Y--L--R--F--I--W--T--G--I--G--T--A- -S--N- 79 241

TACTACAATAACAAGTATGGAGACATTGTTAGAGTCTGGATCAACGGAGAAGAGACGCTC 300

80 -Y--Y--N--N--K--Y--G--D--I--V--R--V--W--I--N--G--E--E- -T--L- 99 301

ATACTAAGCAGATCTTCAGCAGTGCACCATGTGCTGAAGAACGGAAACTATACTTCACGT 360 100 -I--L--S--R--S--S--A--V--H--H--V--L--K--N--G--N--Y--T- -S--R- 119 361

TTTGGGAGCATCCAGGGACTCAGCTGCCTCGGCATGAACGAGAGAGGCATCATATTCAAC 420 120 -F--G--S--I--Q--G--L--S--C--L--G--M--N--E--R--G--I--I- -F--N- 139 421

AACAACGTAACTCTGTGGAAAAAGATACGCACCTATTTTGCTAAAGCTCTGACAGGCCCA 480 140 -N--N--V--T--L--W--K--K--I--R--T--Y--F--A--K--A--L--T- -G--P- 159 481

AATTTGCAGCAGACGGCGGATGTTTGCGTCTCCTCCATACAGGCTCACCTGGACCACCTG 540 160 -N--L--Q--Q--T--A--D--V--C--V--S--S--I--Q--A--H--L--D- -H--L- 179 541

GACAGCCTGGGACACGTTGATGTCCTCAATTTGCTGCGCTGCACCGTGCTGGACATCTCT 600 180 -D--S--L--G--H--V--D--V--L--N--L--L--R--C--T--V--L--D- -I--S- 199 601

AACCGACTCTTCCTGGACGTACCTCTCAATGAGAAAGAGCTGATGCTGAAGATTCAAAAG 660 200 -N--R--L--F--L--D--V--P--L--N--E--K--E--L--M--L--K--I- -Q--K- 219 661

TATTTTCACACATGGCAGGATGTGCTTATCAAACCTGACATCTACTTCAAGTTCGGCTGG 720 220 -Y--F--H--T--W--Q--D--V--L--I--K--P--D--I--Y--F--K--F- -G--W- 239 721

ATTCACCACAGGCACAAGACAGCAACCCAGGAGTTACAAGATGCCATTAAACGTCTTGTA 780 240 -I--H--H--R--H--K--T--A--T--Q--E--L--Q--D--A--I--K--R- -L--V- 259 781

GATCAAAAGAGGAAAAATATGGAGCAGGCAGATACGCTGGACAACATCAACTTCACGGCA 840 260 -D--Q--K--R--K--N--M--E--Q--A--D--T--L--D--N--I--N--F- -T--A- 279 841

GAGCTCATATTTGCACAAAACCACGGTGAGCTGTCTGCTGAGAATGTGACGCAGTGCGTG 900 280 -E--L--I--F--A--Q--N--H--G--E--L--S--A--E--N--V--T--Q- -C--V- 299 901

CTGGAGATGGTGATTGCAGCTCCGGACACTCTGTCCCTCAGTCTCTTCTTCATGCTTCTG 960 300 -L--E--M--V--I--A--A--P--D--T--L--S--L--S--L--F--F--M- -L--L- 319 961

CTCCTCAAACAAAACCCGCACGTGGAGCCGCAGCTGCTACAGGAGATAGACGCTGTTGTG 1020 320 -L--L--K--Q--N--P--H--V--E--P--Q--L--L--Q--E--I--D--A- -V--V- 339 1021

GGTGAGAGACAGCTTCAGAACCAGGATCTTCACAAGCTGCAGGTGATGGAGAGCTTCATC 1080 340 -G--E--R--Q--L--Q--N--Q--D--L--H--K--L--Q--V--M--E--S- -F--I- 359 1081

TACGAATGCTTGCGCTTCCACCCAGTGGTGGACTTCACCATGCGTCGAGCCCTGTCTGAT 1140 360 -Y--E--C--L--R--F--H--P--V--V--D--F--T--M--R--R--A--L- -S--D- 379 1141

GACATCATAGAAGGCTACAGGATCTCGAAGGGCACAAACATCATTCTGAACACAGGCCGA 1200 380 -D--I--I--E--G--Y--R--I--S--K--G--T--N--I--I--L--N--T- -G--R- 399

ATGCACCGCACCGAGTTTTTCCTCAAAGCCAATCAATTTAACCTGGAACACTTTGAAAAC 1260 400 -M--H--R--T--E--F--F--L--K--A--N--Q--F--N--L--E--H--F- -E--N- 419 1261

AATGTTCCTCGGCGCTACTTTCAGCCGTTCGGTTCAGGCCCTCGCGCATGCATTGGCAAG 1320 420 -N--V--P--R--R--Y--F--Q--P--F--G--S--G--P--R--A--C--I- -G--K- 439 1321

CACATCGCCATGGTGATGATGAAATCCATTTTGGTGACACTGCTGTCTCAGTACTCTGTT 1380 440 -H--I--A--M--V--M--M--K--S--I--L--V--T--L--L--S--Q--Y- -S--V- 459 1381

TGTACTCACGAGGGCCCGATCCTGGACTGCCTCCCACAAACCAACAACCTTTCCCAGCAG 1440 460 -C--T--H--E--G--P--I--L--D--C--L--P--Q--T--N--N--L--S- -Q--Q- 479 1441

CCTGTAGAGCACCAGCAGGCGGAGACTGAACATCTCCACATGAGGTTCTTACCCAGGCAG 1500 480 -P--V--E--H--Q--Q--A--E--T--E--H--L--H--M--R--F--L--P- -R--Q- 499 1501

AGAAGCAGCTGTCAAACCCTCCGAGACCCGAACCTTTAGCTGTACCTGCACTTTTGTATA 1560 500 -R--S--S--C--Q--T--L--R--D--P--N--L--*- ..................... 511 1561

CTTAATTTGTATAATCTTATAACGACACACAGCTAGCCTTTATATTTTGATAGACGCAAA 1620 ............................................................ 1621

GATTGTATTTGTACTCAAACTGTATGCATGATGTGAAATGTACATTTAAACCTGCTAACA 1680

............................................................ 1681 CTGAAATAAATGTAAGTTATTGTGTCA 1707 ............................................................

SEQ ID Nº 66 e 69 (alelo mutante Cyp19a1a - deleção 7nt) COMPRIMENTO: 1707bp e 12aa TIPO: cDNA (SEQ ID Nº 66) e Proteína (SEQ ID Nº 69) ORGANISMO: tilápia do Nilo 1

GCGATGAATCCTGTAGGCTTAGACTGGCAGATCTCTCTGTGACCTCAAATGCCATCCAAT 60 ...-M--N--P--V--G--L--D--W--Q--I--S--L--*- 12 SEQ ID Nº 67 e 70 (alelo mutante Cyp19a1a - deleção 10nt) COMPRIMENTO: 1707bp e 11aa TIPO: cDNA (SEQ ID Nº 67) e Proteína (SEQ ID Nº 70) ORGANISMO: tilápia do Nilo 1

GCGATGAATCCTGTAGGCTGGTGGCAGATCTCTCTGTGACCTCAAATGCCATCCAATCGC 60 ...-M--N--P--V--G--W--W--Q--I--S--L--*- 11 SEQ ID Nº 71 e 73 (Tjp1a de tipo selvagem) COMPRIMENTO: 6674bp e 1652aa TIPO: cDNA (SEQ ID Nº 71) e Proteína (SEQ ID Nº 73) ORGANISMO: tilápia do Nilo 1

AAAGAGGAAAACAATGCATCATATAACTTTATAAGTAAGAGTGCGGCGATGGAGGAAACC 60 1 -K--E--E--N--N--A--S--Y--N--F--I--S--K--S--A--A--M--E- -E--T- 20

GTCATATGGGAACAGCACACAGTTACCCTTCACAGGGCCCCAGGATTTGGGTTTGGCATT 120 21 -V--I--W--E--Q--H--T--V--T--L--H--R--A--P--G--F--G--F- -G--I- 40 121

GCCATCTCGGGTGGGCGAGACAACCCTCATTTCCAGAGTGGTGAAACATCTATTGTAATA 180 41 -A--I--S--G--G--R--D--N--P--H--F--Q--S--G--E--T--S--I- -V--I- 60 181

TCGGATGTGCTGAAAGGAGGTCCTGCAGAGGGTCTGCTACAAGAAAATGATCGAGTAGTA 240 61 -S--D--V--L--K--G--G--P--A--E--G--L--L--Q--E--N--D--R- -V--V- 80 241

ATGGTCAATGCAGTCTCTATGGACAATGTAGAGCATGCCTATGCTGTTCAACAACTTCGA 300 81 -M--V--N--A--V--S--M--D--N--V--E--H--A--Y--A--V--Q--Q- -L--R- 100 301

AAGAGTGGCAAAAATGCAAAGATAACTATTCGCAGAAAAAGGAAAGTACAAATCCCAGCG 360 101 -K--S--G--K--N--A--K--I--T--I--R--R--K--R--K--V--Q--I- -P--A- 120 361

TCACGGCACGGGGACAGGGAGACGATGTCTGAGCACGAGGAGGAGGACAGCGATGAGGCT 420 121 -S--R--H--G--D--R--E--T--M--S--E--H--E--E--E--D--S--D- -E--A- 140 421

GATGCTTACGATCACCGCAGTGGACGTGGTGGACAAAACGATCGGGAGCGTAGCAGCAGT 480 141 -D--A--Y--D--H--R--S--G--R--G--G--Q--N--D--R--E--R--S- -S--S- 160 481

GGGAGGCGGGATCACAGTGCCTCACAGGAGAGGAGCATCTCACCACGCTCCGATCGCCGA 540

161 -G--R--R--D--H--S--A--S--Q--E--R--S--I--S--P--R--S--D- -R--R- 180 541

TCACAAGCCTCTTCTGCTCCACCCAGGCCCTCCAAGGTCACTCTTGTCAAGTCCCGCAAA 600 181 -S--Q--A--S--S--A--P--P--R--P--S--K--V--T--L--V--K--S- -R--K- 200 601

AACGAAGAATATGGACTGCGGCTGGCCAGCCATATCTTTGTGAAGGACATCTCTCCAGAG 660 201 -N--E--E--Y--G--L--R--L--A--S--H--I--F--V--K--D--I--S- -P--E- 220 661

AGCCTTGCAGCCAGAGATGGAAACATTCAGGAGGGAGATGTTGTACTTAAGATTAACGGC 720 221 -S--L--A--A--R--D--G--N--I--Q--E--G--D--V--V--L--K--I- -N--G- 240 721

ACAGTTACAGAGAACCTATCACTGACAGATGCCAAGAAGCTGATTGAGAGGTCAAAGGGC 780 241 -T--V--T--E--N--L--S--L--T--D--A--K--K--L--I--E--R--S- -K--G- 260 781

AAGCTGAAGATGGTAGTGCAGAGAGACGAGCGGGCCACGCTGCTCAATATTCCTGACCTT 840 261 -K--L--K--M--V--V--Q--R--D--E--R--A--T--L--L--N--I--P- -D--L- 280 841

GACGACAGCATCCCATCAGCCAATAACTCAGACAGAGATGACATTTCAGAGATACATTCA 900 281 -D--D--S--I--P--S--A--N--N--S--D--R--D--D--I--S--E--I- -H--S- 300 901

CTGACATCCGATCATTCCAATCGATCCCATGGGAGAGGAAGTCAATCCCATTCGCCTGAC 960 301 -L--T--S--D--H--S--N--R--S--H--G--R--G--S--Q--S--H--S- -P--D- 320 961

AGGGTTGAAACATCCGAGCATCTCCGCCACTCACCGCGGCAGATCAGCAATGGCAGTAAT 1020 321 -R--V--E--T--S--E--H--L--R--H--S--P--R--Q--I--S--N--G- -S--N- 340 1021

GGATTTCTCTGGGAAAGAGCTGAGGAATTAATCAAACAGGAATGGGTGGTGAAACAGGAA 1080 341 -G--F--L--W--E--R--A--E--E--L--I--K--Q--E--W--V--V--K- -Q--E- 360 1081

TGTTATTTTGCCTGTGCCCATACTATAAAATGTGTAATAACCGTGACAGTTTGGGCAAAA 1140 361 -C--Y--F--A--C--A--H--T--I--K--C--V--I--T--V--T--V--W- -A--K- 380 1141

AAACCCCAAAACAGTAACATGCCAGAACCAAAGCCAGTTTATGCACAGCCTGGTCAGCCT 1200 381 -K--P--Q--N--S--N--M--P--E--P--K--P--V--Y--A--Q--P--G- -Q--P- 400 1201

GACGTGGACCTGCCTGTCAGCCCATCTGATGCCCCTGTACCCAGTGCTGCACATGATGAC 1260 401 -D--V--D--L--P--V--S--P--S--D--A--P--V--P--S--A--A--H- -D--D- 420 1261

AGCATTCTCAGACCAAGTATGAAGCTGGTCAAGTTCAAGAAGGGAGAGAGTGTCGGTCTG 1320 421 -S--I--L--R--P--S--M--K--L--V--K--F--K--K--G--E--S--V- -G--L- 440 1321

AGGTTAGCAGGCGGAAACGATGTGGGAATTTTTGTGGCAGGAGTTTTGGAAGACAGCCCC 1380 441 -R--L--A--G--G--N--D--V--G--I--F--V--A--G--V--L--E--D- -S--P- 460 1381

GCAGCCAAGGAGGGGCTGGAAGAGGGAGACCAGATTCTCAGGGTGAACAACGTGGACTTT 1440 461 -A--A--K--E--G--L--E--E--G--D--Q--I--L--R--V--N--N--V- -D--F- 480

GCTAACATCATCCGGGAAGAGGCTGTGCTTTTTCTGCTCGATCTTCCAAAAGGAGATGAC 1500 481 -A--N--I--I--R--E--E--A--V--L--F--L--L--D--L--P--K--G- -D--D- 500 1501

GTTACTATTCTGGCTCAGAAGAAAAAGGATGTGTATCGAAGGATAGTGGAATCAGACGTG 1560 501 -V--T--I--L--A--Q--K--K--K--D--V--Y--R--R--I--V--E--S- -D--V- 520 1561

GGTGACTCCTTCTACATTCGAACGCATTTTGAATATGAAAAAGAGTCACCGTATGGGCTG 1620 521 -G--D--S--F--Y--I--R--T--H--F--E--Y--E--K--E--S--P--Y- -G--L- 540 1621

AGCTTTAACAAGGGAGAGGTTTTCCGTGTGGTAGACACACTCTATAATGGCAAATTAGGC 1680 541 -S--F--N--K--G--E--V--F--R--V--V--D--T--L--Y--N--G--K- -L--G- 560 1681

TCCTGGCTCGCTATCCGTATCGGCAAGAACCACCAGGAAGTGGAAAGAGGCATAATCCCC 1740 561 -S--W--L--A--I--R--I--G--K--N--H--Q--E--V--E--R--G--I- -I--P- 580 1741

AACAAGAATAGAGCCGAGCAGCTATCCAGTGTGCAGTACACCCTTCCTAAAACGCCTGGG 1800 581 -N--K--N--R--A--E--Q--L--S--S--V--Q--Y--T--L--P--K--T- -P--G- 600 1801

GGCGACAGAGCTGACTTCTGGAGGTTCAGAGGGCTGCGGAGTTCCAAGAGGAATTTGCGG 1860 601 -G--D--R--A--D--F--W--R--F--R--G--L--R--S--S--K--R--N- -L--R- 620 1861

AAAAGCAGGGAGGACCTGTCGGCCCAGCCTGTTCAGACCAAGTTCCCTGCCTATGAGAGG 1920

621 -K--S--R--E--D--L--S--A--Q--P--V--Q--T--K--F--P--A--Y- -E--R- 640 1921

GTGGTGCTGAGGGAAGCTGGGTTCCTGAGGCCTGTGGTTATCTTTGGGCCGATTGCAGAC 1980 641 -V--V--L--R--E--A--G--F--L--R--P--V--V--I--F--G--P--I- -A--D- 660 1981

GTGGCCCGAGAGAAACTGGCCAGGGAGGTGCCCGAAGTGTTTGAGCTAGCCAAGAGTGAA 2040 661 -V--A--R--E--K--L--A--R--E--V--P--E--V--F--E--L--A--K- -S--E- 680 2041

CCCAGGGATGCAGGAACAGACCAGAAGAGCTCTGGCATCATCCGCCTGCACACCATTAAG 2100 681 -P--R--D--A--G--T--D--Q--K--S--S--G--I--I--R--L--H--T- -I--K- 700 2101

CAGATCATTGATCGAGACAAGCATGCAGTGCTGGATATAACCCCGAATGCAGTGGACCGA 2160 701 -Q--I--I--D--R--D--K--H--A--V--L--D--I--T--P--N--A--V- -D--R- 720 2161

CTGAACTACGCTCAGTGGTATCCAATTGTGGTGTTTCTCAACCCGGACACCAAGCAGGGC 2220 721 -L--N--Y--A--Q--W--Y--P--I--V--V--F--L--N--P--D--T--K- -Q--G- 740 2221

ATCAAGAACATGAGGACACGGCTCTGCCCCGAGTCTAGGAAGAGCGCGAGAAAGCTTTAT 2280 741 -I--K--N--M--R--T--R--L--C--P--E--S--R--K--S--A--R--K- -L--Y- 760 2281

GATCGAGCCCTCAAGTTAAGAAAGAACAACCACCACCTCTTCACCACAACCATTAACTTG 2340 761 -D--R--A--L--K--L--R--K--N--N--H--H--L--F--T--T--T--I- -N--L- 780 2341

AACAACATGAACGATGGTTGGTTTGGAGCACTGAAAGAAATCATCCATCAGCAGCAGAAC 2400 781 -N--N--M--N--D--G--W--F--G--A--L--K--E--I--I--H--Q--Q- -Q--N- 800 2401

CAGCTGGTGTGGGTTTCAGAGGGCAAGGCTGATGGAGTTGGCGACGATGACCTGGACATC 2460 801 -Q--L--V--W--V--S--E--G--K--A--D--G--V--G--D--D--D--L- -D--I- 820 2461

CACGACGACCGCCTTTCCTACCTGTCGGCGCCAGGCAGTGAGTATTCCATGTACAGCACC 2520 821 -H--D--D--R--L--S--Y--L--S--A--P--G--S--E--Y--S--M--Y- -S--T- 840 2521

GACAGCCGCCACACCTCCGATTACGAGGACACGGACACAGAGGGAGGAGCCTACACCGAC 2580 841 -D--S--R--H--T--S--D--Y--E--D--T--D--T--E--G--G--A--Y- -T--D- 860 2581

CAGGAGCTGGATGAAACGCTGAACGATGACGTGGGTCCACCCACGGAGCCTGCCATCACG 2640 861 -Q--E--L--D--E--T--L--N--D--D--V--G--P--P--T--E--P--A- -I--T- 880 2641

CGGTCCTCTGAGCCTGTCCGTGAGGACCCGCCTGTCATCCAAGAGCCCCCTGGCTATGTC 2700 881 -R--S--S--E--P--V--R--E--D--P--P--V--I--Q--E--P--P--G- -Y--V- 900 2701

AGCTACCCGCACACAGTGCAGCCGGACCCCCTGAACCGCATCGACCCGGCTGGTTTCAAG 2760 901 -S--Y--P--H--T--V--Q--P--D--P--L--N--R--I--D--P--A--G- -F--K- 920 2761

GCACCAGCGCCGCAGCAGATGTTTCAGAAGGATCCGTACAGCACAGACAACATAGGCAGA 2820 921 -A--P--A--P--Q--Q--M--F--Q--K--D--P--Y--S--T--D--N--I- -G--R- 940

GGTGGTCACGGCATGAAGCCTGTGACGTACAACCCTCAGCAGGGGTATCACCCCGACGAG 2880 941 -G--G--H--G--M--K--P--V--T--Y--N--P--Q--Q--G--Y--H--P- -D--E- 960 2881

CAGCCATACAGAGATTACGATCACCCACCCAGCCGGTATGACATCAGCAGCAGTGGTGTC 2940 961 -Q--P--Y--R--D--Y--D--H--P--P--S--R--Y--D--I--S--S--S- -G--V- 980 2941

GGCGGTGGCTACCAGGAGCCAAAGTACCGTAACTATGAGAGCTATGAGAACAGCGTGCCT 3000 981 -G--G--G--Y--Q--E--P--K--Y--R--N--Y--E--S--Y--E--N--S- -V--P- 1000 3001

CACTACGACCAGCAACCGTGGAACCCCTACAACCAGCCGTTCTCCACTGCCAACACCCAG 3060 1001 -H--Y--D--Q--Q--P--W--N--P--Y--N--Q--P--F--S--T--A--N- -T--Q- 1020 3061

GCCTACGATCCCCGTCCTCCTTACGGTGAGGGCCCCGACTCTCATTACACCCCTCCCCTG 3120 1021 -A--Y--D--P--R--P--P--Y--G--E--G--P--D--S--H--Y--T--P- -P--L- 1040 3121

CGCTACGACGAGCCGCCACCTCAGCAGGGATTTGACGGACGGCCTCGCTACGGCAAACCG 3180 1041 -R--Y--D--E--P--P--P--Q--Q--G--F--D--G--R--P--R--Y--G- -K--P- 1060 3181

ACAGTTTCAGCACCTGTCCGTTACGATGATCTTCCGCCTCCCCCTCAGCCGTCTGAATTG 3240 1061 -T--V--S--A--P--V--R--Y--D--D--L--P--P--P--P--Q--P--S- -E--L- 1080 3241

CACTATGACCCAAATTCTCACCTGAGCACATACCCCTCAGCTGCCCGCTCACCAGAACCC 3300

1081 -H--Y--D--P--N--S--H--L--S--T--Y--P--S--A--A--R--S--P- -E--P- 1100 3301

GCTGCCCAGCGACCCGCCTATAACCAGGGACCAGCATCGCAGCAGAAAGGTTACAAACCT 3360 1101 -A--A--Q--R--P--A--Y--N--Q--G--P--A--S--Q--Q--K--G--Y- -K--P- 1120 3361

CAGCAGTACGATCCTGCTCCTGTGAACTCTGAATCCAGCCCCAGCCTTCATAAAGTCGAG 3420 1121 -Q--Q--Y--D--P--A--P--V--N--S--E--S--S--P--S--L--H--K- -V--E- 1140 3421

ACGCCCTCACCTTCACCTGCTGATGTTCCAAAAGCTGCACCTGCAAGAGATGAGCAGCAG 3480 1141 -T--P--S--P--S--P--A--D--V--P--K--A--A--P--A--R--D--E- -Q--Q- 1160 3481

GAGGAGGATCCAGCCATGCGGCCTCAGTCAGTACTGACGAGGGTCAAAATGTTTGAGAAC 3540 1161 -E--E--D--P--A--M--R--P--Q--S--V--L--T--R--V--K--M--F- -E--N- 1180 3541

AAACGCTCTGTGTCCATGGACCGAGCCAGAGATGCCGGGGATTCATTTGGGAATAAGGCA 3600 1181 -K--R--S--V--S--M--D--R--A--R--D--A--G--D--S--F--G--N- -K--A- 1200 3601

GCCGATTTGCCCTTGAAAGCTGGTGGAGTAATCCCTAAAGCAAATTCTCTGAGCAACCTG 3660 1201 -A--D--L--P--L--K--A--G--G--V--I--P--K--A--N--S--L--S- -N--L- 1220 3661

GATCAAGAGAAGACCTTTAGCAGAGGGCCAGAGCCTCAGAAGCCTCAGTCCAAGGGATCC 3720 1221 -D--Q--E--K--T--F--S--R--G--P--E--P--Q--K--P--Q--S--K- -G--S- 1240 3721

GATGACATCGTGCGCTCCAACCATTATGACCCTGATGAGGATGAGGACTACTACAGGAAA 3780 1241 -D--D--I--V--R--S--N--H--Y--D--P--D--E--D--E--D--Y--Y- -R--K- 1260 3781

CAGTTGTCTTACTTTGACAGACTGCAGACTGGCTCCAATAAACCCCAACCACAAGCACAG 3840 1261 -Q--L--S--Y--F--D--R--L--Q--T--G--S--N--K--P--Q--P--Q- -A--Q- 1280 3841

TCCAGCCACAGCTTCCCCAGCCATTATACACATTTTGGATATTCAAGTGTCTTTCTTTTC 3900 1281 -S--S--H--S--F--P--S--H--Y--T--H--F--G--Y--S--S--V--F- -L--F- 1300 3901

TTTTCCTTAATGATGGACTCTGTGGAGAAACCAAGCCCACTGGAGAAAAAATATGAACCA 3960 1301 -F--S--L--M--M--D--S--V--E--K--P--S--P--L--E--K--K--Y- -E--P- 1320 3961

GTTCCCCAAGTGACACCAGCTGTGCCACCGGCCACGCTGCCCAAGCCCTCACCTGATGGT 4020 1321 -V--P--Q--V--T--P--A--V--P--P--A--T--L--P--K--P--S--P- -D--G- 1340 4021

AAAATTGACTGTAGTCAGGATTTTTATCTCATCTCTTTGACTGATGTGCGTTGCTCTTCC 4080 1341 -K--I--D--C--S--Q--D--F--Y--L--I--S--L--T--D--V--R--C- -S--S- 1360 4081

ACAGCCAAACCTCCTGCTCGAGAGGACACGGTCCAGACCAACTTTCTTCCTCACAAGAGC 4140 1361 -T--A--K--P--P--A--R--E--D--T--V--Q--T--N--F--L--P--H- -K--S- 1380 4141

TTCCCTGAGAAGTCTCCAGTCAATGGCACCAGTGAACAGCCTCCAAAGACGGTCACTAGC 4200 1381 -F--P--E--K--S--P--V--N--G--T--S--E--Q--P--P--K--T--V- -T--S- 1400

ACCGGGGGTTTGCCCACATCCACCTACAACCGCTTTGCGCCCAAGCCCTACACCTCCTCT 4260 1401 -T--G--G--L--P--T--S--T--Y--N--R--F--A--P--K--P--Y--T- -S--S- 1420 4261

GCCAAGCCTTTTTCGCGCAAGTTCGACAGTCCTAAATTCAACCACAACCTCCTGTCCAAT 4320 1421 -A--K--P--F--S--R--K--F--D--S--P--K--F--N--H--N--L--L- -S--N- 1440 4321

GACAAGCCTGAGAGTGCTCCCAAGGGACGGAGCTCGAGTCCGGTAAAGCCTCAGGTACCC 4380 1441 -D--K--P--E--S--A--P--K--G--R--S--S--S--P--V--K--P--Q- -V--P- 1460 4381

CCACAGCCCCAGAACGCAGACCAAGACAGTGGCCTGGACACTTTCACACGCACAACGGAC 4440 1461 -P--Q--P--Q--N--A--D--Q--D--S--G--L--D--T--F--T--R--T- -T--D- 1480 4441

CCCCGATCCAAATACCAGCAGAACAACGTAAACGCCGTGCCCAAGGCCATCCCTGTGAGC 4500 1481 -P--R--S--K--Y--Q--Q--N--N--V--N--A--V--P--K--A--I--P- -V--S- 1500 4501

CCCAGTGCCCTAGAGGATGATGAAGATGAAGACGAAGGTCACACTGTGGTGGCAACAGCT 4560 1501 -P--S--A--L--E--D--D--E--D--E--D--E--G--H--T--V--V--A- -T--A- 1520 4561

CGTGGCATCTTCAACTCTAACGGTGGCGTTCTGAGCTCCATCGAGACAGGTGTCAGCATC 4620 1521 -R--G--I--F--N--S--N--G--G--V--L--S--S--I--E--T--G--V- -S--I- 1540 4621

ATTATCCCACAGGGTGCCATCCCCGACGGCGTGGAGCAAGAGATTTACTTCAAGGTCTGT 4680

1541 -I--I--P--Q--G--A--I--P--D--G--V--E--Q--E--I--Y--F--K- -V--C- 1560 4681

CGAGACAACAGCATCCTGCCGCCACTCGACAAGGAGAAAGGAGAGACTCTGCTCAGCCCT 4740 1561 -R--D--N--S--I--L--P--P--L--D--K--E--K--G--E--T--L--L- -S--P- 1580 4741

CTGGTGATGTGTGGACCTCACGGCCTAAAGTTCCTGAAGCCTGTGGAGCTACGCTTACCT 4800 1581 -L--V--M--C--G--P--H--G--L--K--F--L--K--P--V--E--L--R- -L--P- 1600 4801

CACTGTGCGTCAATGACCCCTGATGGTTGGTCTTTTGCTCTAAAATCCTCCGACTCCTCG 4860 1601 -H--C--A--S--M--T--P--D--G--W--S--F--A--L--K--S--S--D- -S--S- 1620 4861

TCGGGTGATCCAAAAAGCTGGCAGAACAAGTCTCTCACCGGAGACCCCAACTACCTGGTG 4920 1621 -S--G--D--P--K--S--W--Q--N--K--S--L--T--G--D--P--N--Y- -L--V- 1640 4921

GGAGCCAACTGTGTCTCTGTGCTCATTGACCACTTTTAAAGAAGAAGCAGCAGGTGTGAT 4980 1641 -G--A--N--C--V--S--V--L--I--D--H--F--*- ..................... 1652 4981

GTTACTGAATGTGGAAGAATGGCGGATGAAATGAAGACGATGGAAACGCACGCACGCAAA 5040 ............................................................ 5041

CACACACATATACCACTACACACACACACACACTGACAGACGCACTCCAAGCAAACCAAC 5100 ............................................................ 5101

ACACAGCATAGAGTATGAAGAAGACCCAGACAGTGCTGGACGAAGGAGAGACACCAATGA 5160

............................................................ 5161

TCGTTACGAGCTGTTCTTTAAACTCAATTTCAAAGTTTTGATGTAAAATGATGCATGCCC 5220 ............................................................ 5221

AACGTCACTGACGATTGACACTTATATATAAAGCAATGTTTAATGTAATTTTTCTTTTTT 5280 ............................................................ 5281

CTTTTTTTACAAAAGTATAGATGGATGTATGGCTTTTGAGGCAGCATACATGCTTGAAAA 5340 ............................................................ 5341

ATCTGTGTCAATGTATTTATGCTATATATGCCTACAGTATATATAGAAGAATAGAGAAGA 5400 ............................................................ 5401

AATTGGACTCGAATTCGATCGCCAGTCAACATCTTGTTGTTTTTTCAGTTCAGGGGACTG 5460 ............................................................ 5461

GATTTTTTGTTTGTTTGTTTGTTTGTTTTTTTCCCTTCCACATTGAAGGAATCTTACTGA 5520 ............................................................ 5521

AGGTTTGATACAGTTGGTTTAAGGAGGTGGCAAGACATGAGCTGGACATGAACCCAAGCA 5580 ............................................................ 5581

GCAGCAACAGCACACTTTTAGAGACGTTCTTCCTACACTTCTCACTTTGTTCTTCCTTTT 5640 ............................................................ 5641

CTTACCTTTTGTAGCTTCCTCTCTTACTGAGCACCACCTCTCTCCTTCCAGCCTGAGGGA 5700

............................................................ 5701

GATCTATGCATGTTCTTTACTCAGGTCCAGTAGCCTCCTCGGTTCCTTCCTCACATCTAC 5760 ............................................................ 5761

TTAATATCTTTCCTTTCTCTGTGCACTCTTTGCACTCACACAAATAAGCAGTGATGCCTT 5820 ............................................................ 5821

ATCTGCAGATTATTCACTTTTCATTAAGAAAAAAAAGTAAGTTATGATAAATTATGGTAT 5880 ............................................................ 5881

AATGTCATTTGTTTTGCCATTTTTTTGTGAACCCTCTGTATAAATAAACTTGGGTTTAGC 5940 ............................................................ 5941

ACACGCAGAAACAGTCGATAAAAGATAACAAAGGTATGCTCTTCTTTTATCTGCTATGCA 6000 ............................................................ 6001

TTGCTTAAAAACAAAAAACCATCAGAGAAGAAGTGGCTGTAAATAAAGCTAGCATATTGC 6060 ............................................................ 6061

CTTGTTTCTTTTTTGTTGTAAATGAACTTTTTGTATGTCTTTCTTTTTTGTATAAAACTT 6120 ............................................................ 6121

AGAGAAAACATGTTTTAAAAAAGCAGAAGGAAGTGAAAGTGGTTATCTTTGTATTATGGG 6180 ............................................................ 6181

CATACCTTCAAGCCTTTGAATTGTAACCTAACAATAATACATCACACCTTTTCTACCGAT 6240 ............................................................

ATGTTGCCGCCGCTATTTTACCGTCTCAAAAAGGTCGTCTTTTTTTATTTTTATTTCTAT 6300 ............................................................ 6301

TTTTATTACTTTGTCCACGTAGGGTTAAGGAAAGTATTTGCGGCTCAGATGCATTTAAAA 6360 ............................................................ 6361

CATCTTCATTTGGAAGGGTGTGCTCTCAAAGTGTCCCTCTCACTGATTTCTGATACTGGA 6420 ............................................................ 6421

TGCTATATTGTGTGCCCTTAAATGTATTTTTGTACTAATAGACAATATATTACGTATGGC 6480 ............................................................ 6481

ACACCAGTACTGTTTTACTTTTAGATATAACACGGCTTTATTGGATATTAGCTCTTCACT 6540 ............................................................ 6541

TGTGGCTGACTTTTTTTTTTTTCCCCTCTGCAACACAATTTTAAGTATACCACTGTATTA 6600 ............................................................ 6601

ATAAATAAAATCATTTTTAAATTAAAGAGTGTGTAAGGATTTTTTATTTTTTTTTACCCT 6660 ............................................................ 6661 ACAGGGTTTTGTAT 6674 ..............

SEQ ID Nº 72 e 74 (alelo mutante Tjp1a - deleção 7nt) COMPRIMENTO: 6674bp e 439aa TIPO: cDNA (SEQ ID Nº 72) e Proteína (SEQ ID Nº 74)

ORGANISMO: tilápia do Nilo 1

AAAGAGGAAAACAATGCATCATATAACTTTATAAGTAAGAGTGCGGCGATGGAGGAAACC 60 1 -K--E--E--N--N--A--S--Y--N--F--I--S--K--S--A--A--M--E- -E--T- 20 61

GTCATATGGGAACAGCACACAGTTACCCTTCACAGGGCCCCAGGATTTGGGTTTGGCATT 120 21 -V--I--W--E--Q--H--T--V--T--L--H--R--A--P--G--F--G--F- -G--I- 40 121

GCCATCTCGGGTGGGCGAGACAACCCTCATTTCCAGAGTGGTGAAACATCTATTGTAATA 180 41 -A--I--S--G--G--R--D--N--P--H--F--Q--S--G--E--T--S--I- -V--I- 60 181

TCGGATGTGCTGAAAGGAGGTCCTGCAGAGGGTCTGCTACAAGAAAATGATCGAGTAGTA 240 61 -S--D--V--L--K--G--G--P--A--E--G--L--L--Q--E--N--D--R- -V--V- 80 241

ATGGTCAATGCAGTCTCTATGGACAATGTAGAGCATGCCTATGCTGTTCAACAACTTCGA 300 81 -M--V--N--A--V--S--M--D--N--V--E--H--A--Y--A--V--Q--Q- -L--R- 100 301

AAGAGTGGCAAAAATGCAAAGATAACTATTCGCAGAAAAAGGAAAGTACAAATCCCAGCG 360 101 -K--S--G--K--N--A--K--I--T--I--R--R--K--R--K--V--Q--I- -P--A- 120 361

TCACGGCACGGGGACAGGGAGACGATGTCTGAGCACGAGGAGGAGGACAGCGATGAGGCT 420 121 -S--R--H--G--D--R--E--T--M--S--E--H--E--E--E--D--S--D- -E--A- 140

GATGCTTACGATCACCGCAGTGGACGTGGTGGACAAAACGATCGGGAGCGTAGCAGCAGT 480 141 -D--A--Y--D--H--R--S--G--R--G--G--Q--N--D--R--E--R--S- -S--S- 160 481

GGGAGGCGGGATCACAGTGCCTCACAGGAGAGGAGCATCTCACCACGCTCCGATCGCCGA 540 161 -G--R--R--D--H--S--A--S--Q--E--R--S--I--S--P--R--S--D- -R--R- 180 541

TCACAAGCCTCTTCTGCTCCACCCAGGCCCTCCAAGGTCACTCTTGTCAAGTCCCGCAAA 600 181 -S--Q--A--S--S--A--P--P--R--P--S--K--V--T--L--V--K--S- -R--K- 200 601

AACGAAGAATATGGACTGCGGCTGGCCAGCCATATCTTTGTGAAGGACATCTCTCCAGAG 660 201 -N--E--E--Y--G--L--R--L--A--S--H--I--F--V--K--D--I--S- -P--E- 220 661

AGCCTTGCAGCCAGAGATGGAAACATTCAGGAGGGAGATGTTGTACTTAAGATTAACGGC 720 221 -S--L--A--A--R--D--G--N--I--Q--E--G--D--V--V--L--K--I- -N--G- 240 721

ACAGTTACAGAGAACCTATCACTGACAGATGCCAAGAAGCTGATTGAGAGGTCAAAGGGC 780 241 -T--V--T--E--N--L--S--L--T--D--A--K--K--L--I--E--R--S- -K--G- 260 781

AAGCTGAAGATGGTAGTGCAGAGAGACGAGCGGGCCACGCTGCTCAATATTCCTGACCTT 840 261 -K--L--K--M--V--V--Q--R--D--E--R--A--T--L--L--N--I--P- -D--L- 280 841

GACGACAGCATCCCATCAGCCAATAACTCAGACAGAGATGACATTTCAGAGATACATTCA 900 281 -D--D--S--I--P--S--A--N--N--S--D--R--D--D--I--S--E--I-

-H--S- 300 901

CTGACATCCGATCATTCCAATCGATCCCATGGGAGAGGAAGTCAATCCCATTCGCCTGAC 960 301 -L--T--S--D--H--S--N--R--S--H--G--R--G--S--Q--S--H--S- -P--D- 320 961

AGGGTTGAAACATCCGAGCATCTCCGCCACTCACCGCGGCAGATCAGCAATGGCAGTAAT 1020 321 -R--V--E--T--S--E--H--L--R--H--S--P--R--Q--I--S--N--G- -S--N- 340 1021

GGATTTCTCTGGGAAAGAGCTGAGGAATTAATCAAACAGGAATGGGTGGTGAAACAGGAA 1080 341 -G--F--L--W--E--R--A--E--E--L--I--K--Q--E--W--V--V--K- -Q--E- 360 1081

TGTTATTTTGCCTGTGCCCATACTATAAAATGTGTAATAACCGTGACAGTTTGGGCAAAA 1140 361 -C--Y--F--A--C--A--H--T--I--K--C--V--I--T--V--T--V--W- -A--K- 380 1141

AAACCCCAAAACAGTAACATGCCAGAACCAAAGCCAGTTTATGCACAGCCTGGTCAGCCT 1200 381 -K--P--Q--N--S--N--M--P--E--P--K--P--V--Y--A--Q--P--G- -Q--P- 400 1201

GACGTGGACCTGCCTGTCAGCCCATCTGATGCCCCTGTACCCAGTGCTGCACATGATGAC 1260 401 -D--V--D--L--P--V--S--P--S--D--A--P--V--P--S--A--A--H- -D--D- 420 1261

AGCATTCTCAGACCAAGTATGAAGCTGGTCAAGTTCAAGAAGGGAGAGAGTGTCGGTTAG 1320 421 -S--I--L--R--P--S--M--K--L--V--K--F--K--K--G--E--S--V- -G--*- 439

SEQ ID Nº 75 e 77 (Hiat1a de tipo selvagem) COMPRIMENTO: 5281bp e 491aa TIPO: cDNA (SEQ ID Nº 75) e Proteína (SEQ ID Nº 77) ORGANISMO: tilápia do Nilo 1

TTCTGCTTCGCCCTTGTATTAGACAGCCAATCGCTGGACGTCACTCCGCCAGAAGGGGTG 60 ............................................................ 61

GGTTGACGTAGTACAGGAAGCCAGGCGAGGTGAGGTGGGGAGGAGAGATCACAAAATTGT 120 ............................................................ 121

TAGCTCGCTGCTAGCTGCCTCCTCCGATTTGCCCGAAGTGCGATGAGCCCAGGAGGCGAA 180 ............................................................ 181

ATTTGTGGGGTTTTTTGGTTTTGATTGGCGCGACGATGACCCTCTGACCCTAAGAATGGA 240 ............................................................ 241

CATAAGTTAATGATGACGGGGGAGAAGAAGAAGAAGAAGCGGCTGAACCGCAGCATTCTT 300 .........-M--M--T--G--E--K--K--K--K--K--R--L--N--R--S- -I--L- 17 301

CTTGCAAAGAAAATTATAATAAAAGATGGAGGAAGTCCTCAGGGAATCGGGGAGCCCAGT 360 18 -L--A--K--K--I--I--I--K--D--G--G--S--P--Q--G--I--G--E- -P--S- 37 361

GTTTACCATGCTGTGGTGGTCATCTTCCTGGAGTTTTTTGCATGGGGTCTGCTCACTACC 420 38 -V--Y--H--A--V--V--V--I--F--L--E--F--F--A--W--G--L--L-

-T--T- 57 421

CCGATGCTCACGGTATTACACCAGACATTCCCCCAACACACATTCCTGATGAATGGGCTC 480 58 -P--M--L--T--V--L--H--Q--T--F--P--Q--H--T--F--L--M--N- -G--L- 77 481

ATTCATGGTGTGAAGGGCCTGTTATCATTTCTCAGTGCTCCGCTAATTGGAGCGTTGTCA 540 78 -I--H--G--V--K--G--L--L--S--F--L--S--A--P--L--I--G--A- -L--S- 97 541

GACGTATGGGGACGCAAGTCCTTCCTGCTGCTAACGGTCTTCTTCACTTGCGCGCCCATT 600 98 -D--V--W--G--R--K--S--F--L--L--L--T--V--F--F--T--C--A- -P--I- 117 601

CCGCTGATGAAGATCAGTCCATGGTGGTACTTTGCAGTCATCTCGATGTCCGGTGTTTTT 660 118 -P--L--M--K--I--S--P--W--W--Y--F--A--V--I--S--M--S--G- -V--F- 137 661

GCCGTCACCTTCTCTGTGATCTTTGCCTATGTGGCAGACATCACACAAGAGCATGAGAGG 720 138 -A--V--T--F--S--V--I--F--A--Y--V--A--D--I--T--Q--E--H- -E--R- 157 721

AGCACAGCTTATGGTTTGGTATCAGCTACCTTTGCAGCAAGCCTGGTTACCAGCCCAGCC 780 158 -S--T--A--Y--G--L--V--S--A--T--F--A--A--S--L--V--T--S- -P--A- 177 781

ATTGGAGCCTACCTGTCTGAGGCTTACAGTGACACCTTGGTTGTGATCCTGGCCACAGCC 840 178 -I--G--A--Y--L--S--E--A--Y--S--D--T--L--V--V--I--L--A- -T--A- 197 841

ATCGCACTGCTCGACATCTGCTTCATCCTGGTGGCTGTACCAGAGTCGCTGCCGGAGAAG

198 -I--A--L--L--D--I--C--F--I--L--V--A--V--P--E--S--L--P- -E--K- 217 901

ATGAGGCCAGCGTCATGGGGAGCGCCCATCTCCTGGGAACAGGCAGACCCCTTCGCTTCT 960 218 -M--R--P--A--S--W--G--A--P--I--S--W--E--Q--A--D--P--F- -A--S- 237 961

CTGCGTAAAGTGGGCCAGGACTCTACGGTGCTCCTCATCTGTATCACAGTGTTCCTCTCC 1020 238 -L--R--K--V--G--Q--D--S--T--V--L--L--I--C--I--T--V--F- -L--S- 257 1021

TACCTCCCTGAGGCCGGCCAGTACTCCAGCTTCTTCCTCTATCTCAGACAGGTCATAGGC 1080 258 -Y--L--P--E--A--G--Q--Y--S--S--F--F--L--Y--L--R--Q--V- -I--G- 277 1081

TTCTCCTCAGAGACAGTGGCTGCCTTCATCGCTGTTGTGGGAATCCTCTCAATATTAGCT 1140 278 -F--S--S--E--T--V--A--A--F--I--A--V--V--G--I--L--S--I- -L--A- 297 1141

CAGACGGTCGTGTTGGGGATCCTGATGCGCTCTATAGGAAATAAGAACACAATCCTGCTC 1200 298 -Q--T--V--V--L--G--I--L--M--R--S--I--G--N--K--N--T--I- -L--L- 317 1201

GGCCTCGGCTTTCAGATCCTCCAGCTGGCCTGGTATGGCTTTGGATCTCAGCCCTGGATG 1260 318 -G--L--G--F--Q--I--L--Q--L--A--W--Y--G--F--G--S--Q--P- -W--M- 337 1261

ATGTGGGCAGCTGGAGCCGTTGCTGCCATGTCCAGCATCACGTTCCCCGCCATCAGCGCC 1320 338 -M--W--A--A--G--A--V--A--A--M--S--S--I--T--F--P--A--I- -S--A- 357

ATTGTGTCCCGTAATGCGGATCCTGACCAGCAAGGTGTTGTTCAGGGCATGATCACTGGA 1380 358 -I--V--S--R--N--A--D--P--D--Q--Q--G--V--V--Q--G--M--I- -T--G- 377 1381

ATTCGAGGCCTCTGTAACGGTTTGGGTCCTGCTCTTTACGGCTTCGTCTTCTACTTATTC 1440 378 -I--R--G--L--C--N--G--L--G--P--A--L--Y--G--F--V--F--Y- -L--F- 397 1441

CACGTGGAGCTGACCGACACGGACGGCTCTGAGAAAGGTGCCAAAGGGAACATGGCCAAC 1500 398 -H--V--E--L--T--D--T--D--G--S--E--K--G--A--K--G--N--M- -A--N- 417 1501

CCCACTGACGAGAGTGCCATCATCCCAGGTCCTCCCTTCCTCTTTGGTGCATGCTCAGTG 1560 418 -P--T--D--E--S--A--I--I--P--G--P--P--F--L--F--G--A--C- -S--V- 437 1561

CTGCTGTCTCTGCTGGTGGCGCTGTTCATCCCGGAGCACACTGGGCCCGGTATGAGGCCC 1620 438 -L--L--S--L--L--V--A--L--F--I--P--E--H--T--G--P--G--M- -R--P- 457 1621

GGCTCCTACAAGAAGCACAGCAACGGGGCACAGAGTCACTCCCACAGCCCGCAAGGCAGC 1680 458 -G--S--Y--K--K--H--S--N--G--A--Q--S--H--S--H--S--P--Q- -G--S- 477 1681

GGGGCAGAGGGCAAGGAGCCGCTGCTGGAGGACAGCAGCGTATAACCTCAGCTCAGGGGG 1740 478 -G--A--E--G--K--E--P--L--L--E--D--S--S--V--*- ............... 491 1741

GGCAGACTCCCTCGCTCCACCTCAAAATGCCCTGCACACATGGACAGATACACATAATTT 1800

............................................................ 1801

ATCACAAGGACACACACGCACCTCAGGCACACGTCACACTCGAGTGCCGCAAAGAGATGT 1860 ............................................................ 1861

TTGTCTGTTTTGCTGTCCACAGCACAAAGTTGGGCGCTCCTTCCTTAGCAACCCTTTTCT 1920 ............................................................ 1921

TTATAATAGCTGGGTTATTGTGAGGACTTTCTAAAGACCCTGTGTGAAGAAAGTGTGTCG 1980 ............................................................ 1981

AGCATCATCAGGGCTGCAGTGGAAGACCGTGTATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT 2040 ............................................................ 2041

GTGTGTGTGGCTGAGCTGAGCTGAGCTGGACTCCAATCTTTGGTTTGTCTGAAGTTGTAA 2100 ............................................................ 2101

CAGTGGAGCACACAACAGCTTGTCCCCCTCCTGGCGCGAAACAGGACTGAAGTGACTTTG 2160 ............................................................ 2161

GTTTAATGTGCGAGTGGGGATATATCTCTGATACGTTACTAAATACCTGTGTGACTCTTG 2220 ............................................................ 2221

ATTATTCCTCTTTAGTTAGCCAAGTGGCACCTTCGTTTGTCAGAGGAGAGCGTGACGAAC 2280 ............................................................ 2281

GCCCTCTCACATGCTAATACTTCTGTTCTGATGCTTGTCTTTATGACTACAGCTCTGTTT 2340 ............................................................

AGGCGTCCAAGAAGGAAACATAGTTCTTCCTCTGTGTGGACAACAGGGGAGCGCAGCAGC 2400 ............................................................ 2401

TGTTAAACCTGTGAAAGGAGCCTGCAAACCAGTATTGGAGAGGCGCTGCCTAATTGCAGT 2460 ............................................................ 2461

CAGGGTTGGCAACCAGTTCAGATACAAAAAGCTTTGTTAGGACCAGGTTTTGTTCAAATA 2520 ............................................................ 2521

TCAAACTTCTTACAGAGAGATGACTAGAAGAGACCACTTTATTAGCTCAAAATGGTTTTT 2580 ............................................................ 2581

CAATGTTTACTTGCCATTCTCTAGATTAGTAGTACAGTTTGGGTTGTATATTTTTCTCTG 2640 ............................................................ 2641

TTCAAACTGAAGGCTAGTTGTGCTTCAAGTTTTTATTCAAGAAACAAATGTTGCCTTGAA 2700 ............................................................ 2701

GTGACTTAAGATATATATGGAGACATTACGTAACCTGTATGAAGACCGAGGTCTGAGAAG 2760 ............................................................ 2761

GCTCTGTAATCTTGCGCTATTGCTCCCATCGGAGCCGTTACACACTTTTTATTCCTTTGT 2820 ............................................................ 2821

ATTCATGCCCTTCCTGTTACTTTGTTTCCTGACATTTATCACCATCAAGTTGAGGCTTAC 2880 ............................................................ 2881

AGAGACACGGTTTTATTTTTAAAAAGCCTCTGGACCATTTGGAGCTGGAGCATTGCTATC 2940 ............................................................ 2941

AGGATGTCGGTGTCTGCACTGACTGTTTGAGTTGATATCATTAGGTTCAGCAGAATATCA 3000 ............................................................ 3001

GCCATGCTGCTGCAGTAGTAAATACAAAGGTTAATCAGTGTGGCGTAAAGTGGTGGATAA 3060 ............................................................ 3061

GAATTATAACTGTGTCTTGTAGTCCCTGACATTTAAGCTAACATGCGTACACTCAAAGAG 3120 ............................................................ 3121

GCAGGCCACACTTCTCCCAATGCCTAACATGAAGCACCTCACGGACGTGTCTGGCAACTT 3180 ............................................................ 3181

GTGTAGAAGCTCTGCAGATGCCAGCCTGCGCCACCTAAGAGGCAGAAACAAATAGCAGTA 3240 ............................................................ 3241

GTGGAGTAGATGGCTGGAAATGTTCATGTTATCCTCAAACAGTGAAGCAAAGTAAAAATC 3300 ............................................................ 3301

TGGAGGTTGTGTCAATGTGGAGAGTATTGCGAAATCTGCAATGATCCCAGATTTCATTAG 3360 ............................................................ 3361

TTTAAAAAAAAGAGAAAATAAGAAGAAGAAGAAAATCCACTTAAAAGTGTAAATCCTGAA 3420 ............................................................ 3421

TTTTTATTATCGTTCAGATCTGCAGATGTCTCTGGGTTTTTCTGCAGGTCTGAACTGCTG

............................................................ 3481

CTGCCACGTTTATTTTTATTTTCCCCGGTCAACAGGTGGCGCAGTCTGTACCTGGCATGC 3540 ............................................................ 3541

CTGTAAGGTGCTCGTGTGGTTTTTGTTTTCTTTTTTTCAGTCATGTGGATCAGCGATACT 3600 ............................................................ 3601

GCGTTCCCTTCATTCACATACTATGTCGCCACCTTTCCACATTGTAACTTTGATCTGTGA 3660 ............................................................ 3661

ATGCCTCTCGTAGCTAACAACTGGTTTCATGCTGTTTAACATCTGTATGAACTGAAACAT 3720 ............................................................ 3721

ACGTCACGTATTTAGTGCCATATCTTCTTGATTTGCTTTTTTCTTTTGTACTGTGTGTGT 3780 ............................................................ 3781

GAATGTACACTTGTGTGATTTGAGTGTTTTTGTTGTTCTTTTTATTTTCTCTTGTCTTAA 3840 ............................................................ 3841

TTTCTTTGACTGAAGATTTAAGTTTTAATGCTATTTTTTTAATAGCTTTTTAAAACTTCA 3900 ............................................................ 3901

GTCATTTTTTTAGGATTAATTGTCAAAATTGGATGGTAAATTATCAAATGTCCATCTGTC 3960 ............................................................ 3961

CCCTTTGTTATGTTGTTTGTTTTTGATTTCAGCCTCGGTCTTCATTTAATAACAAGCATT 4020

............................................................ 4021

TCACCATGGTTTGTTAAGCTCATAATTTTTTCCCAGATTTCTCTGAATGTTTCCAATGAA 4080 ............................................................ 4081

ACTGAACATGTTGACCACACAGTACCCTCAATCTTTAGGTTTTTTTTGTTTTGTCTTTTA 4140 ............................................................ 4141

AGAGGGGATGTTACTACACAGGAGGCCATTATTCCCGTTTTTTTTTTTTTGTTTGTTTTT 4200 ............................................................ 4201

TTTAAATCATGTAATTGAACAACAGAAAATCGGATCCTGGTAAGATTCTGCACCAGCCCC 4260 ............................................................ 4261

CCACCACCACCACCCACGTGCACACCTACAGCCTCCAAGCAGACGACTGTAAATGTACAA 4320 ............................................................ 4321

AAATCACCTGTACCTAGAGAAAAATGTATATATTTATTCCTCAAGGAGATGGCCACCTCT 4380 ............................................................ 4381

TGGTCAATTTGGTTGTATGGTGCAATTATTATTATAATTATTATATATTTCTCCAGAATT 4440 ............................................................ 4441

ACCTGCTAGCCACTCCTGTTTTTAGTACAATGTGGTTTGTGGCCTGAACTCCCCTCTCTG 4500 ............................................................ 4501

TGTGCCTAAAATTAGCCAAGAAATGAGTATGGCAACCTAAGTAAGTAAAATGGTGGTTAT 4560

............................................................ 4561

TAATGTAAATATGGGAAACTAATGATAAACTATTTATTAAAGGTTTATTGTACAATGAAA 4620 ............................................................ 4621

CGTTTCGGGTTGCCTCTGTGGTTTCTGGGTGGGTAACACAGGTGAAATCATGTTACTGTA 4680 ............................................................ 4681

GCAGTGAGTGAGCATCTGAGCAGCGATAATCATTTGGTCGTTGCATTTACGGCGATGATC 4740 ............................................................ 4741

CTATAGTTAATGGCTGCTAAATCCCAGTAAGTCTCACTATAAACTGGTAGCATTCCTGTT 4800 ............................................................ 4801

GGGCTTTACTTGCTGTTATATTACTGCACCCCCATTTTTTTTTTAATGTAATGCTCTGAC 4860 ............................................................ 4861

TTTGCTGGCTGTTGGTTTTGTAAACCTGCCCTTTGAAGCTTAATGTTACCGCTAATGCCT 4920 ............................................................ 4921

CCTCCACCTACACAGTGTATATAGTCGTGCATTGACCTGAGCTCATTTATGGGCGGTGGA 4980 ............................................................ 4981

TTTGTAATTAAATCCACATGGAGGCAGTAGTTACATCTGGCAGGAACTTTAAAGAGTCTT 5040 ............................................................ 5041

CTCCCTGAATAACAGTGAACGCAAAGTGGGAGATGTCACAAAATGTGATATTTATCCAAA 5100 ............................................................

ATAAAGAATACGATAAAGTGGCCAGAACAATTTATTTTTGTTATTAATGTAGTGTAGGGG 5160 ............................................................ 5161

AATTTAATGTCTTATAATTAGCAGCTAATAACTTGCCCATCATTTTGTTGAATTTCTGTG 5220 ............................................................ 5221

TGAATGATGAAGTTTTACTGGGTCAATGCTCAAATCTTAAGGTGATTAATGAGTATTTGC 5280 ............................................................ 5281 A 5281 .

SEQ ID Nº 76 e 78 (alelo mutante Hiat1a - deleção 17nt) COMPRIMENTO: 5281bp e 234aa TIPO: cDNA (SEQ ID Nº 76) e Proteína (SEQ ID Nº 78) ORGANISMO: tilápia do Nilo 1

TTCTGCTTCGCCCTTGTATTAGACAGCCAATCGCTGGACGTCACTCCGCCAGAAGGGGTG 60 ............................................................ 61

GGTTGACGTAGTACAGGAAGCCAGGCGAGGTGAGGTGGGGAGGAGAGATCACAAAATTGT 120 ............................................................ 121

TAGCTCGCTGCTAGCTGCCTCCTCCGATTTGCCCGAAGTGCGATGAGCCCAGGAGGCGAA 180 ............................................................ 181

ATTTGTGGGGTTTTTTGGTTTTGATTGGCGCGACGATGACCCTCTGACCCTAAGAATGGA 240 ............................................................ 241

CATAAGTTAATGATGACGGGGGAGAAGAAGAAGAAGAAGCGGCTGAACCGCAGCATTCTT 300 .........-M--M--T--G--E--K--K--K--K--K--R--L--N--R--S- -I--L- 17 301

CTTGCAAAGAAAATTATAATAAAAGATGGAGGAAGTCCTCAGGGAATCGGGGAGCCCAGT 360 18 -L--A--K--K--I--I--I--K--D--G--G--S--P--Q--G--I--G--E- -P--S- 37 361

GTTTACCATGCTGTGGTGGTCATCTTCCTGGAGTTTTTTGCATGGGGTCTGCTCACTACC 420 38 -V--Y--H--A--V--V--V--I--F--L--E--F--F--A--W--G--L--L- -T--T- 57 421

CCGATGCTCACGGTATTACACCAGACATTCCCCCAACACACATTCCTGATGAATGGGCTC 480 58 -P--M--L--T--V--L--H--Q--T--F--P--Q--H--T--F--L--M--N- -G--L- 77 481

ATTCATGGTGTGAAGGGCCTGTTATCATTTCTCAGTGCTCCGCTAATTGGAGCGTTGTCA 540 78 -I--H--G--V--K--G--L--L--S--F--L--S--A--P--L--I--G--A- -L--S- 97 541

GACGTATGGGGACGCAAGTCCTTCCTGCTGCTAACGGTCTTCTTCACTTGCGCGCCCATT 600 98 -D--V--W--G--R--K--S--F--L--L--L--T--V--F--F--T--C--A- -P--I- 117 601

CCGCTGATGAAGATCAGTCCATGGTGGTACTTTGCAGTCATCTCGATGTCCGGTGTTTTT 660 118 -P--L--M--K--I--S--P--W--W--Y--F--A--V--I--S--M--S--G- -V--F- 137

GCCGTCACCTTCTCTGTGATCTTTGCCTATGTGGCAGACATCACACAAGAGCATGAGAGG 720 138 -A--V--T--F--S--V--I--F--A--Y--V--A--D--I--T--Q--E--H- -E--R- 157 721

AGCACAGCTTATGGTTTGGTATCAGCTACCTTTGCAGCAAGCCTGGTTACCAGCCCAGCC 780 158 -S--T--A--Y--G--L--V--S--A--T--F--A--A--S--L--V--T--S- -P--A- 177 781

ATTGGAGCCTACCTGTCTGAGGCTTACAGTGACACCTTGGTTGTGATCCTGGCCACAGCC 840 178 -I--G--A--Y--L--S--E--A--Y--S--D--T--L--V--V--I--L--A- -T--A- 197 841

ATCGCACTGCTCGACATCTGCTTCATCCTGGTGGCTGTACCAGAGTCGCTGCCGGAGAAG 900 198 -I--A--L--L--D--I--C--F--I--L--V--A--V--P--E--S--L--P- -E--K- 217 901

ATGAGCGCCCATCTCCTGGGAACAGGCAGACCCCTTCGCTTCTCTGCGTAAAGTGGGCCA 960 218 -M--S--A--H--L--L--G--T--G--R--P--L--R--C--V--S--A--*- 234 SEQ ID Nº 79 e 81 (Smap2 de tipo selvagem) COMPRIMENTO: 4207bp e 429aa TIPO: cDNA (SEQ ID Nº 79) e Proteína (SEQ ID Nº 81) ORGANISMO: tilápia do Nilo 1

ATGACGGGCAAATCTGTGAAAGACGTTGACAGATACCAGGCTGTCCTCAACTCTTTACTG 60 1 -M--T--G--K--S--V--K--D--V--D--R--Y--Q--A--V--L--N--S- -L--L- 20 61

GCGCTGGAGGAGAACAAATACTGCGCTGACTGTGAATCGAAAGGTCCACGATGGGCATCC 120 21 -A--L--E--E--N--K--Y--C--A--D--C--E--S--K--G--P--R--W- -A--S- 40 121

TGGAATTTGGGCATCTTCATCTGTATCCGCTGTGCTGGTATCCATCGAAACCTGGGGGTT 180 41 -W--N--L--G--I--F--I--C--I--R--C--A--G--I--H--R--N--L- -G--V- 60 181

CACATCTCCAAGGTCAAGTCTGTCAACCTGGATCAGTGGACGCAGGAGCAAGTCCAGTGT 240 61 -H--I--S--K--V--K--S--V--N--L--D--Q--W--T--Q--E--Q--V- -Q--C- 80 241

GTTCAAGAGATGGGAAATGCCAAGGCCAAACGGCTCTACGAGGCTTTTTTACCCGAGTGC 300 81 -V--Q--E--M--G--N--A--K--A--K--R--L--Y--E--A--F--L--P- -E--C- 100 301

TTCCAGCGTCCCGAGACAGACCAGGCTGCCGAGATCTTCATTAGGGACAAATACGAAAAG 360 101 -F--Q--R--P--E--T--D--Q--A--A--E--I--F--I--R--D--K--Y- -E--K- 120 361

AAGAAATACATGGATAAAGTTATTGACATCCAGATGCTCAGGAAAGAAAAGAGTTGTGAC 420 121 -K--K--Y--M--D--K--V--I--D--I--Q--M--L--R--K--E--K--S- -C--D- 140 421

AACATCCCAAAGGAGCCAGTTGTATTTGAGAAGATGAAATTGGTAGTTAAAAAGGAGAAC 480 141 -N--I--P--K--E--P--V--V--F--E--K--M--K--L--V--V--K--K- -E--N- 160

ACTAAGAAAAAAGACGTCAGCCCAAAGACAGATTCCCAGTCTGTCACAGACCTGCTCGGA 540 161 -T--K--K--K--D--V--S--P--K--T--D--S--Q--S--V--T--D--L- -L--G- 180 541

CTAGAACTGCTTTTATGTTGCAAGTCTGCACCTAAAAAGCAAATAAACACGTCAGACTCT 600 181 -L--E--L--L--L--C--C--K--S--A--P--K--K--Q--I--N--T--S- -D--S- 200 601

GCCCTGGATCTCTTCAGCTCCCTCGCAGCCCCCTCCCCTGCTTCCTCTACAAAAAGCACG 660 201 -A--L--D--L--F--S--S--L--A--A--P--S--P--A--S--S--T--K- -S--T- 220 661

GTAGTAGACACCATGCCTCAGAGCAGAGTGACTGCCTCAGTGCCTGAGAATCTGAGCTTG 720 221 -V--V--D--T--M--P--Q--S--R--V--T--A--S--V--P--E--N--L- -S--L- 240 721

TTCTTAGGCCCAGCACCCAAAGCAGAGGAGGGCACAGTCAAGAAACTATCCAAGGACTCC 780 241 -F--L--G--P--A--P--K--A--E--E--G--T--V--K--K--L--S--K- -D--S- 260 781

ATTCTTTCCCTGTACGCCTCCACTCCCTCGGTACATGCCAGCAGTATGGCCGCACATGGC 840 261 -I--L--S--L--Y--A--S--T--P--S--V--H--A--S--S--M--A--A- -H--G- 280 841

TTGTACATGAACCAAATGGGATATCCAACACACCCGTACGGTCCATACCATTCTTTAGCC 900 281 -L--Y--M--N--Q--M--G--Y--P--T--H--P--Y--G--P--Y--H--S- -L--A- 300 901

CAGGCAGGGGGAATGGGAGGCACTATGATGACATCACAGATGGCCATGATGGGGCAGCAG 960

301 -Q--A--G--G--M--G--G--T--M--M--T--S--Q--M--A--M--M--G- -Q--Q- 320 961

CAGAGCGGGGTGATGGCGGTGCCACAAAACAGCATGATTGGAATTCAGCAGAACTGCATG 1020 321 -Q--S--G--V--M--A--V--P--Q--N--S--M--I--G--I--Q--Q--N- -C--M- 340 1021

ATGGGGCAGCAGAATGGCTTAATGGGACAGCAACAAAGTGGGATGATAGGACAGCAGCAG 1080 341 -M--G--Q--Q--N--G--L--M--G--Q--Q--Q--S--G--M--I--G--Q- -Q--Q- 360 1081

CAGGTTGGGGGTTTGCCCGCATTACCCCAGCAGCAGGCTTACGGAGTCCAGCAAGCCCAG 1140 361 -Q--V--G--G--L--P--A--L--P--Q--Q--Q--A--Y--G--V--Q--Q- -A--Q- 380 1141

CAGCTACAGTGGAACATCAGCCAGATGACTCAGCACATGGCCGGCGTGAATCTTTACAAC 1200 381 -Q--L--Q--W--N--I--S--Q--M--T--Q--H--M--A--G--V--N--L- -Y--N- 400 1201

ACCAGCGGTATGATGGGATACAGCGGTCAACAAATGGGAGGTTCAGCAGCTCCAAGTTCG 1260 401 -T--S--G--M--M--G--Y--S--G--Q--Q--M--G--G--S--A--A--P- -S--S- 420 1261

GCACACATGACAGCGCACGTGTGGAAATGAGCTTGTCTATCTGAGATTCGATGGAGTGCC 1320 421 -A--H--M--T--A--H--V--W--K--*- .............................. 429 1321

AACGACCCACAAAAGGAGAAGAGAAACGCCGTGGATCAGACTCTCCATTAAACATTTTCT 1380 ............................................................ 1381

GATGCAAGGGAGGAGGAGGAGGAGAAGAAGAAGAAGAAGGTTTGAGAAACCACTACTACC

............................................................ 1441

TCTCTCTCTCCTCTCTGGCCGCGCTTCCTCTTGCCGTCTCATGCATAGCCATGTTCTGCA 1500 ............................................................ 1501

GATTTCCATGTTTGCCTTCAGGACCTTTTCATATGATGACTAAGACAAGGGGGTTCTGAG 1560 ............................................................ 1561

GCCACTGGTTAGGACTCCAGAGCTTTCTTTCTGCCTAGCCTTTATGAGAGAGCGCTCGTG 1620 ............................................................ 1621

TGCAGAAACATTATGAGGGTATCAAGCAGCTGCAGAATTGCACTGTTTCTTATTTAATCA 1680 ............................................................ 1681

GATGGCACTGGGGTTGGCATTGGGGTTAGCCTAGCTTTAAAAGCTCAAATAGACCGAGAT 1740 ............................................................ 1741

ATATAATCTGGTAACCTAAATAGGTGGCTCATACTTTAAATTCATTAGCCCTACATTACC 1800 ............................................................ 1801

AGTATTTACCCAACTGATGGAGCGACATTTAGTGATGATATGTACAGTGGCCCTGAGAGG 1860 ............................................................ 1861

TCAAACACACTGCAGCCTAATAAAACACCAGCAAAAATGAAAAATGGTGCAAAAGCACAC 1920 ............................................................ 1921

AAAACATAATGGAAGGTCAATAAAACCCAATGGAAATAGAAAGAAAAACACTGGAGAAGC 1980

............................................................ 1981

TAGCAGAAAAAAATCTCACAAAACACAACAGAAATGTTTTTGGCTAAAATGTGACGGCTA 2040 ............................................................ 2041

ACAGCTAACAGTAAACGGCTAACAGCAACCATGTACCTACAGTGTCCATTGTGTTTTGTC 2100 ............................................................ 2101

AGAATTTTTTTTTCTATGTCCATTGTATTTTAATCAACTTCTGTGGTGCTTTTGCAAAAT 2160 ............................................................ 2161

TTTTCTGTTTTGCTGGTGTTTCCTACAGTTGCAGTGCATGTGACCTCTCAGGGCCACCGT 2220 ............................................................ 2221

AGACATAGCTACATTTTAACAGCAGCCATATTTGCAAAGTGTAGCAACTACAACTTTATT 2280 ............................................................ 2281

CAGCCAATTTCAAGGTAGAGATTTAGAGCTTTTCAAAAGTATATTTTCACATAAGTGAGA 2340 ............................................................ 2341

TGAGCTGCTGCTAATTCACTTAATAATCATTAACAAATATAAAAGCTAGGCTAGCCTAAT 2400 ............................................................ 2401

AGTCCCTTCATGCTGCATGCAGAAGACAAATACACATAACCATTTTTAGCAACATATATC 2460 ............................................................ 2461

TAGAAATTTCTACTCATTTAACAATATTTAATTCAAGCAACAAAACCTACCTACACAGCC 2520

............................................................ 2521

CGTAATATTGATGTCTTCATCTCAATTTCTAGAGGGCTTCTTTTAGAATCTTTAATCTTG 2580 ............................................................ 2581

ACTTTAAAGTGTCAAAAGTCCAAAACCATATTTTGGGAGACCAAAGATCAACACTAGCTT 2640 ............................................................ 2641

TACTGTAAGTGGACAGTATTCCTGTATGCTTATTCCTGTTCAACCACTTAACTAGTGATT 2700 ............................................................ 2701

AATAGAAAAAAAAAACAGCAATTCAGCAGTCCGGCATCACTGTCTTCACTGTGCTGTTCT 2760 ............................................................ 2761

TTCACCAAGGGTAGGACACTTAAAAAAAAGAAAAAGAAGAAAGAAATCATTTTGCATGCA 2820 ............................................................ 2821

GTGTCATCAGCGCCCGCACACCTCCAGTTAAGAATCTACCTGGTGCATTAGTGGCCTCAA 2880 ............................................................ 2881

ATAACGTTGAATGTCTGTAAATAGGAGGTGAACAGAGAAGTGGGAGTAGAGACGGAAAAC 2940 ............................................................ 2941

TTCAAGGTGAAGGTCAGCCGGGTTTCAGATGCTTCCACTGAATTGCATGAAAAGAATGTG 3000 ............................................................ 3001

TATCTAGCTCTGATTGTATGTACTGTACTGTATGTTTGTTAAGATTTGCGAATGTGTCTC 3060 ............................................................

TCTGAATGTTTCTCCCTCTGACTCAGTCTTTGACAAAGACTGACAAAAAAACTATAAAAA 3120 ............................................................ 3121

AAAATAGGTAAAACATATGTTCTGAATGTGATCTCGGTTGACTCGTTTGATCGCGCGCAA 3180 ............................................................ 3181

TTGTTCTTCGGTGTGTTTTTGTTTTTTATATATTCCTTGTCTAGAAACGTACACCTTGTG 3240 ............................................................ 3241

TCTCTGGAATGTCTGTGCTCGATGGCATCCTGTGGGTTTCCAGTTTTGCTGTAACGGCCT 3300 ............................................................ 3301

CACCTTTGCGTTGGGGGCAAACAGTGAGCTGTTTTGTTTTTTTTTTCTTTTTGAGAGGGG 3360 ............................................................ 3361

ATGGGAGTATTTAACAATCTGGCCAAACCACATCGTGAAGCATAAAGCGATTGTAAAACC 3420 ............................................................ 3421

ACAATCTTTCACGTCTGTTTAAGCTGATGCTTGTACGCTTCTCCCACACAAACCATCTCT 3480 ............................................................ 3481

GTGCCCCGATTTCTCTTAAAAGTGTTGCTAAATCTGCCTTTTCTGATAAATGCTTATGGA 3540 ............................................................ 3541

AATGCTGTGTTTCTCTTATTTAATTTTATTTGACACTTGTGTTAAGCTGGTAAGATGCTG 3600 ............................................................ 3601

CTTTTAATGTGAGTGGCAGCAATATAGGAGGTGCCTATGTGCAGCATATAAGGTCTTATT 3660 ............................................................ 3661

TCACAACAGTGTGACAGCAGCAGTCACCTTCTCCACTGAGAGCAACATTTATATAAGAGA 3720 ............................................................ 3721

GAGCACATCCAGCACAGCAACAGCAAATCTGTCAGTCAACAAAAGTTTCTGGAAAGGCAG 3780 ............................................................ 3781

TGCAAGTCCACCTCTGTGGACGCTCAGGCCTCACCTGAGTTTTTCCATTTGTGATCAGGC 3840 ............................................................ 3841

TACTTTTTTTTTGGTCCGATATTTTTTCAATGAAACAAAAACGAATAAAGGAATGTAACT 3900 ............................................................ 3901

TTGTACGTACTTGTCGATCAAGATACTGTATATTTTAATTCTTTATCAAAATATCGCTGT 3960 ............................................................ 3961

ATATTATGTTTCTTAAACAACATGTTCTGTATATTAGTTTTTCTTTTCCACATGCTTTGC 4020 ............................................................ 4021

CCCACTTTACACAATTTCAATAAAATTTAACAATGTATATGTGACATATGATAATTGTCC 4080 ............................................................ 4081

CTGTGAAAACATGCAAATAAATATTGTTTTGGTTAAATTTTATGTTGTTTTGTTTGTTGT 4140 ............................................................ 4141

GTTCATTGCTGGGTGTCAGGAGTTTTCCTGTTATGCAACTCAGGTCAGAATAAAACGCTC

............................................................ 4201 AGACAGG 4207 .......

SEQ ID Nº 80 e 82 (alelo mutante Smap2 - deleção 17nt) COMPRIMENTO: 4207bp e 118aa TIPO: cDNA (SEQ ID Nº 80) e Proteína (SEQ ID Nº 82) ORGANISMO: tilápia do Nilo 1

ATGACGGGCAAATCTGTGAAAGACGTTGACAGATACCAGGCTGTCCTCAACTCTTTACTG 60 1 -M--T--G--K--S--V--K--D--V--D--R--Y--Q--A--V--L--N--S- -L--L- 20 61

GCGCTGGAGGAGAACAAATACTGCGCTGACTGTGAATCGAAAGGTCCACGATGGGCATCC 120 21 -A--L--E--E--N--K--Y--C--A--D--C--E--S--K--G--P--R--W- -A--S- 40 121

TGGAATTTGGGCATCTTCATCTGTATCCGCTGTGCTGGGGGTTCACATCTCCAAGGTCAA 180 41 -W--N--L--G--I--F--I--C--I--R--C--A--G--G--S--H--L--Q- -G--Q- 60 181

GTCTGTCAACCTGGATCAGTGGACGCAGGAGCAAGTCCAGTGTGTTCAAGAGATGGGAAA 240 61 -V--C--Q--P--G--S--V--D--A--G--A--S--P--V--C--S--R--D- -G--K- 80 241

TGCCAAGGCCAAACGGCTCTACGAGGCTTTTTTACCCGAGTGCTTCCAGCGTCCCGAGAC 300 81 -C--Q--G--Q--T--A--L--R--G--F--F--T--R--V--L--P--A--S-

-R--D- 100 301

AGACCAGGCTGCCGAGATCTTCATTAGGGACAAATACGAAAAGAAGAAATACATGGATAA 360 101 -R--P--G--C--R--D--L--H--*- 118 SEQ ID Nº 83 e 85 (Csnk2a2 de tipo selvagem) COMPRIMENTO: 1053bp e 350aa TIPO: cDNA (SEQ ID Nº 83) e Proteína (SEQ ID Nº 85) ORGANISMO: tilápia do Nilo 1

ATGCCTGGCCCCACACCGACCATCAGCAAAGCTCGGGTTTACACCGACGTTAATACACAG 60 1 -M--P--G--P--T--P--T--I--S--K--A--R--V--Y--T--D--V--N- -T--Q- 20 61

AAGAACAGAGAGTACTGGGACTACGATGCTCATGTGCCAAACTGGAGTAATCAAGACAAC 120 21 -K--N--R--E--Y--W--D--Y--D--A--H--V--P--N--W--S--N--Q- -D--N- 40 121

TATCAGCTGGTGCGTAAACTGGGCAGAGGGAAGTACAGTGAAGTGTTTGAGGCCATAAAT 180 41 -Y--Q--L--V--R--K--L--G--R--G--K--Y--S--E--V--F--E--A- -I--N- 60 181

GTGACCAATAATGAGAAAGTGGTGGTGAAAATCCTGAAGCCTGTCAAGAAGAAGAAGATC 240 61 -V--T--N--N--E--K--V--V--V--K--I--L--K--P--V--K--K--K- -K--I- 80

AAACGCGAAATCAAAATTCTTGAAAACTTGCGAGGAGGAACCAACATCATCCGCCTGGTG 300 81 -K--R--E--I--K--I--L--E--N--L--R--G--G--T--N--I--I--R- -L--V- 100 301

GACACGGTCAAAGACCCGGTGTCCAGAACACCAGCGCTAGTCTTTGAGTACATCAATAAC 360 101 -D--T--V--K--D--P--V--S--R--T--P--A--L--V--F--E--Y--I- -N--N- 120 361

ACAGATTTTAAGGAGCTTTACCAGAAGCTGACAGACTACGATATCCGTTACTACATGTAT 420 121 -T--D--F--K--E--L--Y--Q--K--L--T--D--Y--D--I--R--Y--Y- -M--Y- 140 421

GAGCTTCTAAAGGCTCTGGACTTCTGTCACAGTATGGGGATCATGCACAGGGACGTGAAG 480 141 -E--L--L--K--A--L--D--F--C--H--S--M--G--I--M--H--R--D- -V--K- 160 481

CCGCACAATGTGATGATTGACCACCAGCTGAGGAAGCTGCGTCTTATAGATTGGGGTTTG 540 161 -P--H--N--V--M--I--D--H--Q--L--R--K--L--R--L--I--D--W- -G--L- 180 541

GCTGAATTTTACCATCCCGCTCAGGAATATAATGTCAGGGTGGCCTCGCGCTATTTCAAA 600 181 -A--E--F--Y--H--P--A--Q--E--Y--N--V--R--V--A--S--R--Y- -F--K- 200 601

GGCCCCGAGCTGCTAGTGGACTATCAGATGTATGATTACAGTTTGGACATGTGGAGTCTC 660 201 -G--P--E--L--L--V--D--Y--Q--M--Y--D--Y--S--L--D--M--W- -S--L- 220 661

GGCTGCATGTTGGCCAGTATGATTTTCCTGAAGGAACCGTTTTTTCATGGCCAGGACAAC 720

221 -G--C--M--L--A--S--M--I--F--L--K--E--P--F--F--H--G--Q- -D--N- 240 721

TATGACCAGCTGGTCCGCATCGCTAAGGTTCTCGGCACCGATGAGCTCTTTGGCTACCTG 780 241 -Y--D--Q--L--V--R--I--A--K--V--L--G--T--D--E--L--F--G- -Y--L- 260 781

CACAAATATCACATAGAACTGGACACTCGCTTCAAAGACATGCTGGGGCAGCAAACACGG 840 261 -H--K--Y--H--I--E--L--D--T--R--F--K--D--M--L--G--Q--Q- -T--R- 280 841

AAACGCTGGGAGCAGTTCATCCAATCAGAGAACCAGCACCTGGTGAGTCCAGAGGCTCTG 900 281 -K--R--W--E--Q--F--I--Q--S--E--N--Q--H--L--V--S--P--E- -A--L- 300 901

GACCTGCTGGACAAGCTGCTGCGCTATGACCACCAGCAGAGGCTGACGGCGGCCGAGGCC 960 301 -D--L--L--D--K--L--L--R--Y--D--H--Q--Q--R--L--T--A--A- -E--A- 320 961

ATGCAGCACCCGTACTTCTATCCTGTGGTGAAGGAACAAGCAAATGCCAACACAGATGGC 1020 321 -M--Q--H--P--Y--F--Y--P--V--V--K--E--Q--A--N--A--N--T- -D--G- 340 1021 TCAAAGGCAATAAGCAGCTCCAATGCAACATGA 1053 341 -S--K--A--I--S--S--S--N--A--T--*- 350 SEQ ID Nº 84 e 86 (alelo mutante Csnk2a2 - deleção 22nt) COMPRIMENTO: 1053bp e 31aa TIPO: cDNA (SEQ ID Nº 84) e Proteína (SEQ ID Nº 86)

ORGANISMO: tilápia do Nilo 1

ATGCTCATGTGCCAAACTGGAGTAATCAAGACAACTATCAGCTGGTGCGTAAACTGGGCA 60 1 -M--L--M--C--Q--T--G--V--I--K--T--T--I--S--W--C--V--N-- W--A- 20 61

GAGGGAAGTACAGTGAAGTGTTTGAGGCCATAAATGTGACCAATAATGAGAAAGTGGTG 120 21 -E--G--S--T--V--K--C--L--R--P--*- 31 SEQ ID Nº 87 e 89 (Gope de tipo selvagem) COMPRIMENTO: 1335bp e 444aa TIPO: cDNA (SEQ ID Nº 87) e Proteína (SEQ ID Nº 89) ORGANISMO: tilápia do Nilo 1

ATGTCTGCTTCGACTGGATGCTCCCCATCGGGCCAGCACTCGGGCCTTGTCCCCAGTATG 60 1 -M--S--A--S--T--G--C--S--P--S--G--Q--H--S--G--L--V--P- -S--M- 20 61

TCCATGTTTCGATGGCTAGAAGTGCTGGAGAAGGAATTTGATAAGGCTTTCGTGGATGTG 120 21 -S--M--F--R--W--L--E--V--L--E--K--E--F--D--K--A--F--V- -D--V- 40 121

GATCTGTTGCTTGGAGAAATAGATCCAGATCAAGTGGATATAACGTATGAGGGTCGGCAG 180

41 -D--L--L--L--G--E--I--D--P--D--Q--V--D--I--T--Y--E--G- -R--Q- 60 181

AAGATGACCAGCCTCAGCTCCTGTTTCGCTCAGCTCTGTCATAAAACCCAGACTGTCTTC 240 61 -K--M--T--S--L--S--S--C--F--A--Q--L--C--H--K--T--Q--T- -V--F- 80 241

CAGCTCAACCATAAACTAGAGGCTCAGCTGGTGGACCTGCGCTCAGAGTTGACCGAAGCT 300 81 -Q--L--N--H--K--L--E--A--Q--L--V--D--L--R--S--E--L--T- -E--A- 100 301

AAAGCTGCACGGGTGGTGGCAGAAAGGGAGGTCCACGACTTGCTCCTGCAGCTTCATGCT 360 101 -K--A--A--R--V--V--A--E--R--E--V--H--D--L--L--L--Q--L- -H--A- 120 361

CTCCAACTGCAGCTTCATGTCAAGCAAGGCCAAGCTGAGGAGTCAGATACCATCAAAGAT 420 121 -L--Q--L--Q--L--H--V--K--Q--G--Q--A--E--E--S--D--T--I- -K--D- 140 421

AAACTGCCTACACCAACCTTAGAAGAGCTGGAACAGGAGCTCGAGGCCAGTAAGAAGGAG 480 141 -K--L--P--T--P--T--L--E--E--L--E--Q--E--L--E--A--S--K- -K--E- 160 481

AAATTAGCAGAGGCAAAAATGGAGGCAGAAACCAGACTATATAAGAAAGAAAACGAGGCC 540 161 -K--L--A--E--A--K--M--E--A--E--T--R--L--Y--K--K--E--N- -E--A- 180 541

CTTCGCAGGCACATGGCAGTACTGCAGGCCGAAGTCTACGGAGCCAGACTGGCTGCTAAA 600 181 -L--R--R--H--M--A--V--L--Q--A--E--V--Y--G--A--R--L--A- -A--K- 200 601

TACTTGGACAAGGAACTGGCTGGCAGGGTGCAGCAGATACAGTTACTGGGTCGTGACATG 660 201 -Y--L--D--K--E--L--A--G--R--V--Q--Q--I--Q--L--L--G--R- -D--M- 220 661

AAAGGGCCAGCACATGACAAGCTCTGGAATCAACTGGAGGCAGAAATTCACCTTCACCGC 720 221 -K--G--P--A--H--D--K--L--W--N--Q--L--E--A--E--I--H--L- -H--R- 240 721

CATAAAACTGTGATCCGAGCATGTAGAGGTCGAAGTGACCCTAAGAGACCTCTTCCCTCT 780 241 -H--K--T--V--I--R--A--C--R--G--R--S--D--P--K--R--P--L- -P--S- 260 781

CCTGTGGGACATGATCCAGACATGCTGAAGAAAACCCAGGGAGTTGGCCCTATCCGAAAG 840 261 -P--V--G--H--D--P--D--M--L--K--K--T--Q--G--V--G--P--I- -R--K- 280 841

GTTGTGCTGGTCAAAGAGGATCATGAGGGTCTAGGAATTTCCATTACAGGTGGGAAGGAG 900 281 -V--V--L--V--K--E--D--H--E--G--L--G--I--S--I--T--G--G- -K--E- 300 901

CACGGCGTTCCCATTTTAATTTCAGAGATCCATCCCAGTCAGCCCGCAGACAGATGTGGA 960 301 -H--G--V--P--I--L--I--S--E--I--H--P--S--Q--P--A--D--R- -C--G- 320 961

GGGCTGCATGTTGGAGATGCCATCCTTGCTGTCAACAGCATCAATTTGCGAGATGCCAAA 1020 321 -G--L--H--V--G--D--A--I--L--A--V--N--S--I--N--L--R--D- -A--K- 340 1021

CATAAGGAAGCTGTCACCATTCTCTCTCAGCAGCGAGGACAGATAGAGTTTGAGGTCGTG 1080 341 -H--K--E--A--V--T--I--L--S--Q--Q--R--G--Q--I--E--F--E- -V--V- 360

TACGTGGCTCCTGAAGTGGACAGCGATGATGAGAATGTGGAGTACGAGGATGACAGCGGT 1140 361 -Y--V--A--P--E--V--D--S--D--D--E--N--V--E--Y--E--D--D- -S--G- 380 1141

CATCGCTACAGACTCTACCTGGATGAACTGGATGACAGCATCACAGCACCACCTAGCAAC 1200 381 -H--R--Y--R--L--Y--L--D--E--L--D--D--S--I--T--A--P--P- -S--N- 400 1201

AGTTCAGCATCACTTCAAGCACTGGAGAAGTTGTCACTGAGCAATGGAGCAGAGTCTGGA 1260 401 -S--S--A--S--L--Q--A--L--E--K--L--S--L--S--N--G--A--E- -S--G- 420 1261

GATACTGGGATGTCCAGTGAGACACCTTCAGGGGAAACCCCTTCAAAGCCACCAGAAACT 1320 421 -D--T--G--M--S--S--E--T--P--S--G--E--T--P--S--K--P--P- -E--T- 440 1321 GACTGCTCTTCCTAG 1335 441 -D--C--S--S--*- 444 SEQ ID Nº 88 e 90 (alelo mutante Gope - deleção 8nt) COMPRIMENTO: 1335bp e 30aa TIPO: cDNA (SEQ ID Nº 88) e Proteína (SEQ ID Nº 90) ORGANISMO: tilápia do Nilo 1

ATGTCTGCTTCGACTGGATGCTCCCCAGCACTCGGGCCTTGTCCCCAGTATGTCCATGTT 60 1 -M--S--A--S--T--G--C--S--P--A--L--G--P--C--P--Q--Y--V- -H--V- 20

TCGATGGCTAGAAGTGCTGGAGAAGGAATTTGATAAGGCTTTCGTGGATGTGGATCTGTC 120 21 -S--M--A--R--S--A--G--E--G--I--*- 30 SEQ ID Nº 91 e 94 (DMRT-1 de tipo selvagem) COMPRIMENTO: 882bp e 293aa TIPO: cDNA (SEQ ID Nº 91) e Proteína (SEQ ID Nº 94) ORGANISMO: tilápia do Nilo 1

ATGAGCCAGGACAAACAGAGTAAGCAGGTACCGGATTGCAGCGGACCGATGTCCCCGACC 60 1 -M--S--Q--D--K--Q--S--K--Q--V--P--D--C--S--G--P--M--S- -P--T- 20 61

AAAGCCCAGAAATCCCCCAGGATGCCCAAGTGCTCTCGCTGTAGAAATCACGGATACGTG 120 21 -K--A--Q--K--S--P--R--M--P--K--C--S--R--C--R--N--H--G- -Y--V- 40 121

TCTCCACTGAAGGGACACAAGCGCTTTTGCAACTGGAGGGACTGCCAGTGTCCCAAATGC 180 41 -S--P--L--K--G--H--K--R--F--C--N--W--R--D--C--Q--C--P- -K--C- 60 181

AAATTGATCGCGGAGAGGCAGAGAGTCATGGCGGCCCAGGTTGCTCTGAGGAGGCAGCAG 240 61 -K--L--I--A--E--R--Q--R--V--M--A--A--Q--V--A--L--R--R-

-Q--Q- 80 241

GCCCAAGAAGAAGAGCTTGGGATTTGTAGTCCTGTGTCTCTGTCCGGTTCCGAGATGATG 300 81 -A--Q--E--E--E--L--G--I--C--S--P--V--S--L--S--G--S--E- -M--M- 100 301

GTCAAGAATGAAGTTGGAGCAGACTGCCTGTTCTCTGTGGAGGGACGGTCCCCGACACCT 360 101 -V--K--N--E--V--G--A--D--C--L--F--S--V--E--G--R--S--P- -T--P- 120 361

ACCAGCCACGCCACCTCTGCTGTCACAGGGACCCGCTCGGCATCGTCCCCCAGCCCATCT 420 121 -T--S--H--A--T--S--A--V--T--G--T--R--S--A--S--S--P--S- -P--S- 140 421

GCTGCTGCCAGGGCTCATACCGAGGGACCGTCTGACCTCCTGCTGGAAACCCCCTATTAC 480 141 -A--A--A--R--A--H--T--E--G--P--S--D--L--L--L--E--T--P- -Y--Y- 160 481

AATTTCTACCAGCCTTCGCGCTACCCCACCTACTATGGAAACCTTTACAACTACTCGCAG 540 161 -N--F--Y--Q--P--S--R--Y--P--T--Y--Y--G--N--L--Y--N--Y- -S--Q- 180 541

TACCAGCAGATGCCTCATGGTGATGGCCGCCTGCCCAGCCACAGCGTGTCGTCTCAGTAC 600 181 -Y--Q--Q--M--P--H--G--D--G--R--L--P--S--H--S--V--S--S- -Q--Y- 200 601

CGCATGCACTCCTACTACCCAGCAGCCACCTACCTGACTCAGGGCCTGGGCTCCACCAGC 660 201 -R--M--H--S--Y--Y--P--A--A--T--Y--L--T--Q--G--L--G--S- -T--S- 220 661

TGTGTGCCACCCTTCTTTAGCCTGGATGACAACAATAACAGCTGCTCTGAGACCATGGCA

221 -C--V--P--P--F--F--S--L--D--D--N--N--N--S--C--S--E--T- -M--A- 240 721

GCCTCCTTCTCACCCGGCAGCATCTCCGCTGGTCACGACTCCACCATGGTCTGCCGCTCC 780 241 -A--S--F--S--P--G--S--I--S--A--G--H--D--S--T--M--V--C- -R--S- 260 781

ATCAGCTCCCTGGTTAACGGCGACGCCAAGGCTGAATGCGAGGCCAGCAGCCAGGCAGCC 840 261 -I--S--S--L--V--N--G--D--A--K--A--E--C--E--A--S--S--Q- -A--A- 280 841 GGCTTCACCGTCGACGCCATCGAAGGCGGCGCCACCAAATAA 882 281 -G--F--T--V--D--A--I--E--G--G--A--T--K--*- 293 SEQ ID Nº 92 e 95 (alelo mutante DMRT-1 - deleção 7nt) COMPRIMENTO: 882bp e 40aa TIPO: cDNA (SEQ ID Nº 92) e Proteína (SEQ ID Nº 95) ORGANISMO: tilápia do Nilo 1

ATGAGCCAGGACAAACAGAGTAAGCAGGTACCGGATTGCAGCGGACCCCGACCAAAGCCC 60 1 -M--S--Q--D--K--Q--S--K--Q--V--P--D--C--S--G--P--R--P- -K--P- 20 61

AGAAATCCCCCAGGATGCCCAAGTGCTCTCGCTGTAGAAATCACGGATACGTGTCTCCAC 120 21 -R--N--P--P--G--C--P--S--A--L--A--V--E--I--T--D--T--C- -L--H- 40 121

TGAAGGGACACAAGCGCTTTTGCAACTGGAGGGACTGCCAGTGTCCCAAATGCAAATTGA

41 -*- 40 SEQ ID Nº 93 e 96 (alelo mutante DMRT-1 - deleção 13nt) COMPRIMENTO: 882bp e 38aa TIPO: cDNA (SEQ ID Nº 93) e Proteína (SEQ ID Nº 96) ORGANISMO: tilápia do Nilo 1

ATGAGCCAGGACAAACAGAGTAAGCAGGTACCGGATTGCAGCGGACCAAAGCCCAGAAAT 60 1 -M--S--Q--D--K--Q--S--K--Q--V--P--D--C--S--G--P--K--P- -R--N- 20 61

CCCCCAGGATGCCCAAGTGCTCTCGCTGTAGAAATCACGGATACGTGTCTCCACTGAAGG 120 21 -P--P--G--C--P--S--A--L--A--V--E--I--T--D--T--C--L--H- -*- 38 SEQ ID Nº 97 e 100 (GSDF de tipo selvagem) COMPRIMENTO: 840bp e 213aa TIPO: cDNA (SEQ ID Nº 97) e Proteína (SEQ ID Nº 100) ORGANISMO: tilápia do Nilo 1

AACAGGGGAAAAGTCTACAGTGTTAACTATGTCAAGGCCACCTTGGGGTACAAGCAGATA

............................................................ 61

AAAACCGTGGTTCTCAGACCCTGACAAACAATACCTAGGGCAGCATCCCAGTTTTGTCGC 120 ............................................................ 121

TACTATCTCCTCCTCCGACCAGACGTTCGGGACCAACCGCAGCTTTTGTCTGCAGCCAGT 180 ............................................................ 181

CTTACGTGTTCATCCACCATGGCCTTTCCATTCATTGTCATGACATTACTTTTGGGCTCT 240 ..................-M--A--F--P--F--I--V--M--T--L--L--L- -G--S- 14 241

TCCATGATGATGGCATTTGTCTTGGATCCATCCAGGAAAGAACCCGAAGCTGCCGTCTTA 300 15 -S--M--M--M--A--F--V--L--D--P--S--R--K--E--P--E--A--A- -V--L- 34 301

GGTGACAGGTGCCAAGGTGAGTCATGGCAGTCCATCAGAAAGAACCTCCTTAGGGTTCTG 360 35 -G--D--R--C--Q--G--E--S--W--Q--S--I--R--K--N--L--L--R- -V--L- 54 361

AACTTGCAGACTGAGCCGCAGCTACCTGCCGGTGCACTGGACAGTGTCAGAGAGCAGTGG 420 55 -N--L--Q--T--E--P--Q--L--P--A--G--A--L--D--S--V--R--E- -Q--W- 74 421

AACCGAACCTTCAGCATCGTTTCTCACACAGCCAAGCATACTGCAACCCCAGCAGTCCCA 480 75 -N--R--T--F--S--I--V--S--H--T--A--K--H--T--A--T--P--A- -V--P- 94 481

GGCTACTCTGCATCAGCTGATAATGGAAACAGTGCGAGCCTGAAGTGTTGTTCCATTGCC 540

95 -G--Y--S--A--S--A--D--N--G--N--S--A--S--L--K--C--C--S- -I--A- 114 541

TCAGAGATCTTCATGAAAGATCTGGGCTGGGACAGCTGGGTGATCCACCCGTTGAGTCTT 600 115 -S--E--I--F--M--K--D--L--G--W--D--S--W--V--I--H--P--L- -S--L- 134 601

ACCTATGTTCAGTGCGCAACCTGCAACTCTGCCATGACCACTGTTCAATGTCCATCATCC 660 135 -T--Y--V--Q--C--A--T--C--N--S--A--M--T--T--V--Q--C--P- -S--S- 154 661

CAAGTAAATGTCCAGGATGCCAACACACAGGACCAGGTGCCATGCTGTCGGCCCACCTCC 720 155 -Q--V--N--V--Q--D--A--N--T--Q--D--Q--V--P--C--C--R--P- -T--S- 174 721

CAAGAAGAGGTGCCCATAGTCTATATGGATGGATCCAGCGCCATTGTCATGTCCTCCATG 780 175 -Q--E--E--V--P--I--V--Y--M--D--G--S--S--A--I--V--M--S- -S--M- 194 781

CAGCTGACCCGCAGTTGTGGCTGTGAGCTGGGCAACTCTGAGGATCGTGGCAAGGAGTAG 840 195 -Q--L--T--R--S--C--G--C--E--L--G--N--S--E--D--R--G--K- -E--*- 213 SEQ ID Nº 98 e 101 (alelo mutante GSDF - deleção 5nt) COMPRIMENTO: 840bp e 56aa TIPO: cDNA (SEQ ID Nº 98) e Proteína (SEQ ID Nº 101) ORGANISMO: tilápia do Nilo 1

AACAGGGGAAAAGTCTACAGTGTTAACTATGTCAAGGCCACCTTGGGGTACAAGCAGATA

............................................................ 61

AAAACCGTGGTTCTCAGACCCTGACAAACAATACCTAGGGCAGCATCCCAGTTTTGTCGC 120 ............................................................ 121

TACTATCTCCTCCTCCGACCAGACGTTCGGGACCAACCGCAGCTTTTGTCTGCAGCCAGT 180 ............................................................ 181

CTTACGTGTTCATCCACCATGGCCTTTCCATTCATTGTCATGACATTACTTTTGGGCTCT 240 ..................-M--A--F--P--F--I--V--M--T--L--L--L- -G--S- 14 241

TCCATGATGATGGCATTTGTCTTGGATCCATCCAGGAAAGAACCCGAAGCTGCCGTCTTA 300 15 -S--M--M--M--A--F--V--L--D--P--S--R--K--E--P--E--A--A- -V--L- 34 301

GGTGACAGGTGCCAAGGTGAGTCATGGCAGTCCATCAGAAAGAACCTCCGTTCTGAACTT 360 35 -G--D--R--C--Q--G--E--S--W--Q--S--I--R--K--N--L--L--R- -S--E- 54 361

GCAGACTGAGCCGCAGCTACCTGCCGGTGCACTGGACAGTGTCAGAGAGCAGTGGAACCG 420 55 -L--A--*- 56 SEQ ID Nº 99 e 102 (alelo mutante GSDF - deleção 22nt) COMPRIMENTO: 840bp e 46aa TIPO: cDNA (SEQ ID Nº 99) e Proteína (SEQ ID Nº 102)

ORGANISMO: tilápia do Nilo 1

AACAGGGGAAAAGTCTACAGTGTTAACTATGTCAAGGCCACCTTGGGGTACAAGCAGATA 60 ............................................................ 61

AAAACCGTGGTTCTCAGACCCTGACAAACAATACCTAGGGCAGCATCCCAGTTTTGTCGC 120 ............................................................ 121

TACTATCTCCTCCTCCGACCAGACGTTCGGGACCAACCGCAGCTTTTGTCTGCAGCCAGT 180 ............................................................ 181

CTTACGTGTTCATCCACCATGGCCTTTCCATTCATTGTCATGACATTACTTTTGGGCTCT 240 ..................-M--A--F--P--F--I--V--M--T--L--L--L- -G--S- 14 241

TCCATGATGATGGCATTTGTCTTGGATCCATCCAGGAAAGAACCCGAAGCTGCCGTCTTA 300 15 -S--M--M--M--A--F--V--L--D--P--S--R--K--E--P--E--A--A- -V--L- 34 301

GGTGACAGGTGCCAAGGTGAGTCATGGCAGTCCATCTGAACTTGCAGACTGAGCCGCAGC 360 35 -G--D--R--C--Q--G--E--S--W--Q--S--I--*- 46 SEQ ID Nº 103 e 105 (FSHR de tipo selvagem) COMPRIMENTO: 5853bp e 689aa

TIPO: cDNA (SEQ ID Nº 103) e Proteína (SEQ ID Nº 105) ORGANISMO: tilápia do Nilo 1

GCATTCACTACTGCATGACAGAAAACACCAAAACACCTCACATTTCTCTCTAGCTGACCT 60 ............................................................

61

GGCGCCGAACCCTCGAGCGGACAGACAGGCAAAGGCGTTCATATCAAATGTGGAGTGTGG 120 ...............................................-M--W-- S--V-- 4 121

ACCAGAGACAATATCAGAGTAAAATACACAAAAGAAGACAAACTAGAAAAGTGAAACCAC 180 5 D--Q--R--Q--Y--Q--S--K--I--H--K--R--R--Q--T--R--K--V-- K--P-- 24 181

TCTGTGGACCCAGGCAGACTGAAATGATGCTGGTGATGTTTGGAGTCACGGCGTTTCCCT 240 25 L--C--G--P--R--Q--T--E--M--M--L--V--M--F--G--V--T--A-- F--P-- 44 241

CCAACATCTCCAACGCCCAGTGCCTGGAAGTTAAGCAGACGCAGATCAGAGAGATTCAGC 300 45 S--N--I--S--N--A--Q--C--L--E--V--K--Q--T--Q--I--R--E-- I--Q-- 64 301

AGGGCGCCCTCTCCAGCCTCCAGCATCTAATGGAACTGACCATTTCTGAGAACGACCTGC 360 65 Q--G--A--L--S--S--L--Q--H--L--M--E--L--T--I--S--E--N-- D--L-- 84 361

TGGAGAGTATCGGTGCTTTTGCCTTTTCTGGCCTCCCTCACCTCACCAAAATCTTAATAT 420 85 L--E--S--I--G--A--F--A--F--S--G--L--P--H--L--T--K--I--

L--I-- 104 421

CTAAAAATGCTGCTCTGAGGAATATCGGGGCTTTTGTTTTCTCCAACCTCCCTGAACTCA 480 105 S--K--N--A--A--L--R--N--I--G--A--F--V--F--S--N--L--P-- E--L-- 124 481

GTGAGATAATCATAACAAAATCAAAACACCTGAGTTTCATCCACCCCGATGCATTCAGGA 540 125 S--E--I--I--I--T--K--S--K--H--L--S--F--I--H--P--D--A-- F--R-- 144 541

ACATGGCAAGACTACGGTTCTTGACTATCTCCAACACCGGGCTGAGGATTTTTCCAGACT 600 145 N--M--A--R--L--R--F--L--T--I--S--N--T--G--L--R--I--F-- P--D-- 164 601

TCTCCAAGATCCATTCCACCGCCTGCTTTCTGCTGGATCTTCAGGACAACAGCCACATAA 660 165 F--S--K--I--H--S--T--A--C--F--L--L--D--L--Q--D--N--S-- H--I-- 184 661

AGAGAGTCCCTGCCAATGCCTTCAGAGGCCTCTGCACTCAAACCTTCGCAGAGATACGGC 720 185 K--R--V--P--A--N--A--F--R--G--L--C--T--Q--T--F--A--E-- I--R-- 204 721

TCACCAGAAATGGCATCAAGGAGGTGGCAAGTGACGCCTTCAACGGAACAAAGATGCACA 780 205 L--T--R--N--G--I--K--E--V--A--S--D--A--F--N--G--T--K-- M--H-- 224 781

GACTGTTCCTAGGAGGCAACCGACAGCTTACTCACATCAGTCCCAATGCCTTTGTGGGTT 840 225 R--L--F--L--G--G--N--R--Q--L--T--H--I--S--P--N--A--F-- V--G-- 244 841

CCAGTGAGTTGGTGGTACTAGACGTCTCCGAAACAGCCCTCACCTCTTTGCCAGACTCGA

245 S--S--E--L--V--V--L--D--V--S--E--T--A--L--T--S--L--P-- D--S-- 264 901

TCCTTGATGGCCTCAAGAGGCTGATTGCCGAGTCAGCCTTCAACCTGAAAGAACTTCCTC 960 265 I--L--D--G--L--K--R--L--I--A--E--S--A--F--N--L--K--E-- L--P-- 284 961

CTATTCAGCTCTTTACCAAACTGCACCAGGCAAAGCTGACATACCCATCACACTGCTGCG 1020 285 P--I--Q--L--F--T--K--L--H--Q--A--K--L--T--Y--P--S--H-- C--C-- 304 1021

CTTTCCTGAACATGCACAGAAACAGATCGAGATGGCACTCACTGTGTGACAACCCCGAGG 1080 305 A--F--L--N--M--H--R--N--R--S--R--W--H--S--L--C--D--N-- P--E-- 324 1081

CTAAAAATAACCTGCACTTCTTCAGGGAATACTGCTCCAACTCCACCAACATCACTTGCA 1140 325 A--K--N--N--L--H--F--F--R--E--Y--C--S--N--S--T--N--I-- T--C-- 344 1141

GCCCGGCCCCTGATGACTTTAACCCCTGTGAAGATATCATGTCTGCTACCCCCTTACGCA 1200 345 S--P--A--P--D--D--F--N--P--C--E--D--I--M--S--A--T--P-- L--R-- 364 1201

TCCTCATCTGGATCATCTCTGTCCTCGCCCTGCTGGGCAACGCAGTAGTTCTCCTTGTAT 1260 365 I--L--I--W--I--I--S--V--L--A--L--L--G--N--A--V--V--L-- L--V-- 384 1261

TGTTAGGCAGCCGCTATAAGCTGACTGTTCCTCGATTCCTCATGTGCCACCTGGCCTTTG 1320 385 L--L--G--S--R--Y--K--L--T--V--P--R--F--L--M--C--H--L-- A--F-- 404

CTGACCTCTGCATGGGCATCTACCTGGTAGTCATAGCAACCGTGGATATGCTCACACGTG 1380 405 A--D--L--C--M--G--I--Y--L--V--V--I--A--T--V--D--M--L-- T--R-- 424 1381

GACGGTACTACAACTATGCTATAGACTGGCAGATGGGCTTGGGCTGCAATGCTGCAGGCT 1440 425 G--R--Y--Y--N--Y--A--I--D--W--Q--M--G--L--G--C--N--A-- A--G-- 444 1441

TCTTCACGGTGTTCGCCAGTGAGCTGTCAGTGTTTACCTTGACAGCAATCACCGTGGAGC 1500 445 F--F--T--V--F--A--S--E--L--S--V--F--T--L--T--A--I--T-- V--E-- 464 1501

GCTGGCACACCATCACGCATGCTCTGCGACTTGACCGCAAACTTCGCCTGAGACACGCCT 1560 465 R--W--H--T--I--T--H--A--L--R--L--D--R--K--L--R--L--R-- H--A-- 484 1561

GCATCATCATGACAATAGGTTGGATCTTCTCCTTGCTGGCTGCACTGCTGCCCACAGTTG 1620 485 C--I--I--M--T--I--G--W--I--F--S--L--L--A--A--L--L--P-- T--V-- 504 1621

GGATCAGCAGCTATGGCAAAGTGAGCATCTGCCTCCCCATGGATGTTGAGTCCCTAGTCT 1680 505 G--I--S--S--Y--G--K--V--S--I--C--L--P--M--D--V--E--S-- L--V-- 524 1681

CCCAGTTCTACGTGGTCTGTCTTCTCCTCCTCAACATCTTGGCGTTCTTCTGTGTGTGCG 1740 525 S--Q--F--Y--V--V--C--L--L--L--L--N--I--L--A--F--F--C-- V--C-- 544 1741

GCTGCTACCTCAGCATCTACCTCACCTTTCGCAAGCCTTCATCAGCGGCAGCCCACGCCG 1800 545 G--C--Y--L--S--I--Y--L--T--F--R--K--P--S--S--A--A--A--

H--A-- 564 1801

ACACCCGTGTGGCTCAACGCATGGCCGTCCTCATCTTCACAGACTTCATCTGCATGGCTC 1860 565 D--T--R--V--A--Q--R--M--A--V--L--I--F--T--D--F--I--C-- M--A-- 584 1861

CGATCTCCTTCTTCGCCATCTCAGCTGCCCTCAAGCTCCCTCTCATCACCGTCTCAGACT 1920 585 P--I--S--F--F--A--I--S--A--A--L--K--L--P--L--I--T--V-- S--D-- 604 1921

CCAAGCTACTGTTGGTGCTATTCTACCCCATCAACTCGTGCTCCAACCCCTTCTTATATG 1980 605 S--K--L--L--L--V--L--F--Y--P--I--N--S--C--S--N--P--F-- L--Y-- 624 1981

CCTTTTTCACCCGTAACTTCAGAAGGGATTTCTTTCTCCTCGCAGCTCGCTTCGGGCTGT 2040 625 A--F--F--T--R--N--F--R--R--D--F--F--L--L--A--A--R--F-- G--L-- 644 2041

TTAAGACTCGAGCACAGATTTACCGGACAGAGGGTTCCTCGTGTCAGCAGCCAACATGGA 2100 645 F--K--T--R--A--Q--I--Y--R--T--E--G--S--S--C--Q--Q--P-- T--W-- 664 2101

CCTCTCCAAAGAACAGCCGTGTTATCTTGTATTCCTTGGTCAATACGTTAAGTCTAGATG 2160 665 T--S--P--K--N--S--R--V--I--L--Y--S--L--V--N--T--L--S-- L--D-- 684 2161

GAAAACAAGAGTGCTGACTTTTACGCACATTTACAGGTACGGACTGTTTGCCTTGATTGC 2220 685 G--K--Q--E--C--*- ........................................... 689 2221

ATATTATATCCATACAAACAGGCTGCTAATTCCTTAAAATGATGCCTCAGATCATGTCTT

............................................................ 2281

TTGATCACTACCTGGGAAAATTTTTCTATCTACTTAGACTAGAAAGAAAAAAAACACAAA 2340 ............................................................ 2341

AGGCAACCAAGTGGAAGGCAAAAGAGCTGAGAACTCTTTTTTGACAATTTGACCCAGGAG 2400 ............................................................ 2401

TCTGCAAAACACAGTGATTGTTAAAATAAACAATGCTCTTGCTCTTGCTTCTGTTTGTGC 2460 ............................................................ 2461

TCCTAATCTGATGCTGTGTTTTTTGGGCTTGAGCCAGTGAAGGCTTCCACTGAAGACTGC 2520 ............................................................ 2521

TCTTCAGTCAATAAATAGCATCCAGAGACCCAGCTCTCAACAGAGGTGATGATCCTCTAT 2580 ............................................................ 2581

ATAAAGATGTTGGTCAGTTCAACAAAGAAGTTGATGCTTGTCTCTGTGCAAGTCTGAGAT 2640 ............................................................ 2641

CTCTGTTAGGGATGTACATGTACAAGTGGTCAAGATTGGACTTCCAGGCCATGAGACCAG 2700 ............................................................ 2701

AGGTCTACAAGTCACAAAACCTTTTAAAGCTTTTTATAAAATTATATATATCTATGTCGC 2760 ............................................................ 2761

CACAATCTGAGCAGTTCAGACACTGATGATTCCAGACTGATCACTGACCCAAGAGAAAGC 2820

............................................................ 2821

ATGCATACATGTTCCCACCTGTCTTTTAAGGTTACACATAAATCAACATGTTTCAATCAC 2880 ............................................................ 2881

AATAGTATCAGTTGACTATTCAGCACAAAGTACACACAGCGTTCAGTGGCATGTCTAAAC 2940 ............................................................ 2941

CTGGTTACCTGAGCTATGCTCTGCAGCAATCCATGCAAACATGACCACAAAAGAACTAAT 3000 ............................................................ 3001

TATACACTCACTGGCCACTTTATTAGGTATACTTGTTTGGCTGCTTGGTAATGCAAATAC 3060 ............................................................ 3061

TTAATGAGCCAATCGCATGGTAGCAGCTCAGTGCATTTAGACATGTAATCTGGGGCATTT 3120 ............................................................ 3121

TTAAGATTTTTTAAATGTGGTGGCACGGCAGAGACCAAGAACACAGTAGAGGGGGACATT 3180 ............................................................ 3181

TAAATATTTGATTAGCAAAAAGATCAGAAAACTGACAGAAATTATTGGGCATGATTTTTG 3240 ............................................................ 3241

GTGTGCAACCTTATGTTTTATTACAAGTTTATTGTGTGAAAAGTGGTGCTGCAGAATGCT 3300 ............................................................ 3301

CTACATAGAATTTTGTGTTGGACAATTGTTTTGCAACGTGGAAAAAGAAGTATTTAGACT 3360

............................................................ 3361

TAACCTAAGTAAAAGTTGTAATTGCACTTAAATAGCTTAATAGTTCACAAGTTATATAAT 3420 ............................................................ 3421

CAAAATGTATTCAAAGTGCCTAAAGTAAACACACTCTTTATATAGAATGGCCCTTTTTTT 3480 ............................................................ 3481

CTCGTCTCTTTAATGAGGCAGCTGTTGATGAGTTTGATTCCTGATATATTGTTCAATAGA 3540 ............................................................ 3541

TTCATTTATAAAAAATACAATTAATGTACAAAATAAGAAGAAGCTAAAATAATTTGGGGT 3600 ............................................................ 3601

GGGCTAATGCCACTCCAAGCTCCTCCCCCTCCAAACATGCCTCTATGTAGACATAATCAA 3660 ............................................................ 3661

GACAACTTGCTAAAGTTCAAAATGAGCATCAGAATGGGAAAAAGGTGACTGAAGTGACTT 3720 ............................................................ 3721

TGAAAGTTTAATTGTTGTTGGTGCCAGATGGTCCCACATGTCGCCACAATCTGCTGGCCG 3780 ............................................................ 3781

GACTGCAAACTGATAGGAAAGCAACAGTAACTTAAATAACTTCTATACAATCAAGGTGTA 3840 ............................................................ 3841

CAAGTTACATAAGAAAACTGGGCATCACTTAGTCTGATAACTCTTGATTTCTATTCTGAC 3900 ............................................................

ATTCTTATAGTAGGTTCAGAGTTTGATTTAACTGAGCAAACTGAGTCACAAAGCTCAGAT 3960 ............................................................ 3961

CATCTAAAACTGATTTCTTGAAAATGAAAAGGAGTTCACCACAGTCACCACATTTCAATC 4020 ............................................................ 4021

CAGCAGAGCACATTTGGGATTTAGTCAAATGGGAGATTGCCATCACAGATGTGCAGCTGA 4080 ............................................................ 4081

CAAACTTGCAGCACCTGTGTGATGCTATCACATCAATATGGACCACAATCTCTGAGGAAT 4140 ............................................................ 4141

GTTTCCTCCACTCAATTCCAGTTGAATATATTTTAAAAATTAAGACAGTGTGAAGACAAA 4200 ............................................................ 4201

GGGGTGTTTAACCTAGCAAAATGTACCCAATAAAGTAGCTAGTGAGTGTAGTTTGACTAA 4260 ............................................................ 4261

ATCTGGGTCAGACAGCTCTTTTAGATACCCATGGGTTTCTTTTAACTCAAGTGAAGTGCC 4320 ............................................................ 4321

AGATGGGTGGAGTTCTCAGCAACATAATTTAGAGGTAAAAGAAGAAAAGAATGGAGGGGG 4380 ............................................................ 4381

GAGAAAACTAATGACTTCATCTACTATGTAACAAACACCATCCGTCTGGCATCCCAAGAT 4440 ............................................................ 4441

AATCTAACAAACTAAAATGCCTCAGAATGGTTTTTAAGCAGGTTGGATGCTTGGGATTTC 4500 ............................................................ 4501

AGCATATGCACACTGCAAAAGAAACATATTCATTCAACATTCAGTGCTGTGATTGAATGA 4560 ............................................................ 4561

TATTCATTAAGAAGAACACTGCAGGGACCTGCTGATTAACAATCTCCTCATACACCCAGT 4620 ............................................................ 4621

CTGCTGAACCTCTCAATGTCTACAATTTGCCACCAACTCCGTCTATTTTGTAAGCCACAG 4680 ............................................................ 4681

ACCTGTAATTATCTTTGAAATGTAATTATGTTTACGTTTTCAAACAAACATCCAATTAAG 4740 ............................................................ 4741

TGTCACTTTTGAATCTGTTTTCCTGAAGAATATTTCAATGTGCTGTTTTTTACACTATTT 4800 ............................................................ 4801

TATAAAGTGTTTTATTATATCCTCTCAGCTTGAATAGATTTTGTATGATGAATGTGAGCG 4860 ............................................................ 4861

TTTGAAGAGGCGTGACAAACAGAAAAACTCTCTCACACACACACATATGCAATAATTGAG 4920 ............................................................ 4921

CTGTCTTTATCTAGCAATGCTGTCCTTCAGAGCATCCAAAGCTTTCAAGGACAAAGTGAC 4980 ............................................................ 4981

CCTCCCAACCTCTGCTCTGTGCAGCAAAGTGGGTGGGTGGGCGTAGGAGGAGAGGTACGC

............................................................ 5041

AGCTGCTCTTTCTGCTTATTACGGGGGGATGGATATGGCAGCTAGATAAGCTGTGTGTGT 5100 ............................................................ 5101

GCGCGCACACACACACACACACACACACACAATAGCAACCCACACTCTCAAGGCTGCAGC 5160 ............................................................ 5161

TGCAAGAAGGAATCCAAGACCATCTCATTGATATGGATACACTGCCTCCTACATGCCAAC 5220 ............................................................ 5221

ATTCAAAGTTAGGGTGCAATTATATACTTTCACCACCAGGTGATGCTACTGGGGCTAGAT 5280 ............................................................ 5281

TTCTGGTGAGTTTACCTCCATCTGTTTGCACAAAAGTCCAAACAAATTCACCAGTCTCAG 5340 ............................................................ 5341

TAGATCCTACAAATTTTGCTCGATGTTGTCTTATGAGAAAAATAAATAAATAAATATTTT 5400 ............................................................ 5401

TTTCCTAAATTTGCTTTTTTTTAAAATAACTTTTTATTTCTACATAATTTTCATAAAAGA 5460 ............................................................ 5461

TTATATCAATTCCTGCATGAGGATTAATGCTCATCAGACAGTTACCTGTCCCCTACATAC 5520 ............................................................ 5521

ACTGTATTTCTTCTTCATTTTTATATCATATCATATAGTTTTCCAAGTAAAAGATAAATC 5580

............................................................ 5581

ACTCTAATGCATTTGCACTCAAATTTATGTGCACAAAAAAAAGTGAGTGTTGCAATACAG 5640 ............................................................ 5641

AAAGACATGCCGTTATGCTCTCTGACATCTTCTCTAGACAGCACTGGAGATGGTATAACA 5700 ............................................................ 5701

AAACACCCTCAGTATAAAGCCTTCAAGTTCATGACTAATCGTTGGCAGCTAAACAATGCC 5760 ............................................................ 5761

CTCTGGTGGTCGTCGTGCATAATAAATATACAAGTTAAAGTGTTAAAGTTGTATTCCACT 5820 ............................................................ 5821 CAAAATCTGTAATTTGGTTTGGGGTCAGTGTCC 5853 .................................

SEQ ID Nº 104 e 106 (alelo mutante FSHR - deleção 5nt) COMPRIMENTO: 5853bp e 264aa TIPO: cDNA (SEQ ID Nº 104) e Proteína (SEQ ID Nº 106) ORGANISMO: tilápia do Nilo 1

GCATTCACTACTGCATGACAGAAAACACCAAAACACCTCACATTTCTCTCTAGCTGACCT 60 ............................................................

61

GGCGCCGAACCCTCGAGCGGACAGACAGGCAAAGGCGTTCATATCAAATGTGGAGTGTGG 120

...............................................-M--W-- S--V-- 4 121

ACCAGAGACAATATCAGAGTAAAATACACAAAAGAAGACAAACTAGAAAAGTGAAACCAC 180 5 D--Q--R--Q--Y--Q--S--K--I--H--K--R--R--Q--T--R--K--V-- K--P-- 24 181

TCTGTGGACCCAGGCAGACTGAAATGATGCTGGTGATGTTTGGAGTCACGGCGTTTCCCT 240 25 L--C--G--P--R--Q--T--E--M--M--L--V--M--F--G--V--T--A-- F--P-- 44 241

CCAACATCTCCAACGCCCAGTGCCTGGAAGTTAAGCAGACGCAGATCAGAGAGATTCAGC 300 45 S--N--I--S--N--A--Q--C--L--E--V--K--Q--T--Q--I--R--E-- I--Q-- 64 301

AGGGCGCCCTCTCCAGCCTCCAGCATCTAATGGAACTGACCATTTCTGAGAACGACCTGC 360 65 Q--G--A--L--S--S--L--Q--H--L--M--E--L--T--I--S--E--N-- D--L-- 84 361

TGGAGAGTATCGGTGCTTTTGCCTTTTCTGGCCTCCCTCACCTCACCAAAATCTTAATAT 420 85 L--E--S--I--G--A--F--A--F--S--G--L--P--H--L--T--K--I-- L--I-- 104 421

CTAAAAATGCTGCTCTGAGGAATATCGGGGCTTTTGTTTTCTCCAACCTCCCTGAACTCA 480 105 S--K--N--A--A--L--R--N--I--G--A--F--V--F--S--N--L--P-- E--L-- 124 481

GTGAGATAATCATAACAAAATCAAAACACCTGAGTTTCATCCACCCCGATGCATTCAGGA 540 125 S--E--I--I--I--T--K--S--K--H--L--S--F--I--H--P--D--A-- F--R-- 144 541

ACATGGCAAGACTACGGTTCTTGACTATCTCCAACACCGGGCTGAGGATTTTTCCAGACT 600 145 N--M--A--R--L--R--F--L--T--I--S--N--T--G--L--R--I--F-- P--D-- 164 601

TCTCCAAGATCCATTCCACCGCCTGCTTTCTGCTGGATCTTCAGGACAACAGCCACATAA 660 165 F--S--K--I--H--S--T--A--C--F--L--L--D--L--Q--D--N--S-- H--I-- 184 661

AGAGAGTCCCTGCCAATGCCTTCAGAGGCCTCTGCACTCAAACCTTCGCAGAGATACGGC 720 185 K--R--V--P--A--N--A--F--R--G--L--C--T--Q--T--F--A--E-- I--R-- 204 721

TCACCAGAAATGGCATCAAGGAGGTGGCAAGTGACGCCTTCAACGGAACAAAGATGCACA 780 205 L--T--R--N--G--I--K--E--V--A--S--D--A--F--N--G--T--K-- M--H-- 224 781

GACTGTTCCTAGGAGGCAACCGACAGCTTACTCACATCAGTCCCAATGCCTTTGTGGGTT 840 225 R--L--F--L--G--G--N--R--Q--L--T--H--I--S--P--N--A--F-- V--G-- 244 841

CCAGTGAGTTGGTGGTACTAGACGTCTCCGAAACAGCCCTCTTTGCCAGACTCGATCCTT 900 245 S--S--E--L--V--V--L--D--V--S--E--T--A--L--F--A--R--L-- D--P-- 264 901

GATGGCCTCAAGAGGCTGATTGCCGAGTCAGCCTTCAACCTGAAAGAACTTCCTCCTATT 960 265 *- 264

SEQ ID Nº 107 e 110 (VtgAa de tipo selvagem) COMPRIMENTO: 4974bp e 1657aa TIPO: cDNA (SEQ ID Nº 107) e Proteína (SEQ ID Nº 110) ORGANISMO: tilápia do Nilo 1

ATGAGAGCGCTCGTGCTCGCCCTGATTCTGGCCTTTGTGGCTGGTGATCTTCAACATCAA 60 1 -M--R--A--L--V--L--A--L--I--L--A--F--V--A--G--D--L--Q- -H--Q- 20 61

GATCCTGTTTTTGAAGCTGATAAAACCTATGTGTACAAGTATGAGGCGCTGCTCCTGGCG 120 21 -D--P--V--F--E--A--D--K--T--Y--V--Y--K--Y--E--A--L--L- -L--A- 40 121

GGCCTGCTCGAGAAAGGTTCAGCGAGAGCTGGACTAAATATCAGCAGCAAAGTTAGCATC 180 41 -G--L--L--E--K--G--S--A--R--A--G--L--N--I--S--S--K--V- -S--I- 60 181

AATGCTATAGACCAGAACACATACTTCATTAAGCTTGAGGAACCTGAGCTCCAGGAGTAT 240 61 -N--A--I--D--Q--N--T--Y--F--I--K--L--E--E--P--E--L--Q- -E--Y- 80 241

AGTGGAATTTGGCCTGAGGATCCTTTTATCCCAGCAACTGAGCTGACTTCAGCCCTCCAA 300 81 -S--G--I--W--P--E--D--P--F--I--P--A--T--E--L--T--S--A- -L--Q- 100 301

GCTGAGCTCACGACTCCCATTAAGTTTGAATATGTCAATGGTGCTGTTGGAAAAGTCTTC 360 101 -A--E--L--T--T--P--I--K--F--E--Y--V--N--G--A--V--G--K- -V--F- 120

GCCCCTGAAACCGTCTCAACAACAGTGCTTAACATCTACAGAGGTATCCTGAATGTCTTT 420 121 -A--P--E--T--V--S--T--T--V--L--N--I--Y--R--G--I--L--N- -V--F- 140 421

CAGCTCAACGTCAAAAAGACACTAAATGTCTACGAGTTGCAGGAGGCTGGAACTCAGGGT 480 141 -Q--L--N--V--K--K--T--L--N--V--Y--E--L--Q--E--A--G--T- -Q--G- 160 481

GTGTGCAAGACACTTTACTCCATCACTGAGGACACAGAGGCTGAACGTGTCTATCTGAGA 540 161 -V--C--K--T--L--Y--S--I--T--E--D--T--E--A--E--R--V--Y- -L--R- 180 541

AAGACCAGGGACATGAGCCACTGTCAAGAAAGAATAACTAAAGACATGGGGTTAGCATAC 600 181 -K--T--R--D--M--S--H--C--Q--E--R--I--T--K--D--M--G--L- -A--Y- 200 601

ACAGAGAAATGTGGAAAGTGCCAGGAGGACACTAAAAACCTGAAAGGAGTTTCATCATAC 660 201 -T--E--K--C--G--K--C--Q--E--D--T--K--N--L--K--G--V--S- -S--Y- 220 661

AGTTACATCATGAAACCACTCGATAATGGCATCCAGATCAAGGAGGCATCGGTCCATGAG 720 221 -S--Y--I--M--K--P--L--D--N--G--I--Q--I--K--E--A--S--V- -H--E- 240 721

CTGATCCAGTTCTCACCTTTCAGTGAGCAGCATGGAGCCGCCCATATGGAGACCAAGCAA 780 241 -L--I--Q--F--S--P--F--S--E--Q--H--G--A--A--H--M--E--T- -K--Q- 260 781

TCCTTGATGCTCCTTGACGTTCGAAGACCCCCTTATGCACCCACTACACCACCACCCCAG 840 261 -S--L--M--L--L--D--V--R--R--P--P--Y--A--P--T--T--P--P-

-P--Q- 280 841

GCTGAGTATTCACACCGTGGAAATCTCACATATCAGTTCTCCACTGAGCTTCTTCAGTTA 900 281 -A--E--Y--S--H--R--G--N--L--T--Y--Q--F--S--T--E--L--L- -Q--L- 300 901

CCCATTCTGCTCCTCAATATCAACGACATAGAGTCTCAGCTCGAGGACACTCTGGTCAAA 960 301 -P--I--L--L--L--N--I--N--D--I--E--S--Q--L--E--D--T--L- -V--K- 320 961

CAGGCTGTAGAAAGAGTTCATGAAGATGCACCTCTGGAATTTTTGAAGTTTGTTCAACTC 1020 321 -Q--A--V--E--R--V--H--E--D--A--P--L--E--F--L--K--F--V- -Q--L- 340 1021

CTCCGTGCAGCCTCCAATGAAACTCTGGAGAACCTCTGGAGCAAACACTCAGGGATTTCT 1080 341 -L--R--A--A--S--N--E--T--L--E--N--L--W--S--K--H--S--G- -I--S- 360 1081

GCCCACAGAAAATGGATCATGGACGCCATCCCTGCTGTGGGAAATCCTGATGCTCTGAGA 1140 361 -A--H--R--K--W--I--M--D--A--I--P--A--V--G--N--P--D--A- -L--R- 380 1141

TTTATCAAAGAGAAATACCTAGCAGAAACCATAACTGTGTTTGAAGCCGTTCAGGCTTTG 1200 381 -F--I--K--E--K--Y--L--A--E--T--I--T--V--F--E--A--V--Q- -A--L- 400 1201

ATTACTTCATTTCACATGGTGACAGCAACCACTGAGGCCATTGAGGTCATCGAGAGCCTA 1260 401 -I--T--S--F--H--M--V--T--A--T--T--E--A--I--E--V--I--E- -S--L- 420 1261

ACAAAGGAAAGCAAAATAGTGAGAAACCCAGTTCTGCGTCAGATTGTATTCCTTGGCTAC

421 -T--K--E--S--K--I--V--R--N--P--V--L--R--Q--I--V--F--L- -G--Y- 440 1321

GGTACCATGATTTACAAACACTGCTATGAGAGGACTTCCTGTCCTGCTGAGCTCATACAG 1380 441 -G--T--M--I--Y--K--H--C--Y--E--R--T--S--C--P--A--E--L- -I--Q- 460 1381

CCCATTCAAGACCTTCTTGCGCAGGCACTGAAAGATGGAAACACAGAGGACATCATCCTG 1440 461 -P--I--Q--D--L--L--A--Q--A--L--K--D--G--N--T--E--D--I- -I--L- 480 1441

TTTGTGAAGGCTTTGGGAAATGCTGCGCATCCTTCTAGCCTCAAGAAAATCACAAAGATG 1500 481 -F--V--K--A--L--G--N--A--A--H--P--S--S--L--K--K--I--T- -K--M- 500 1501

CTGCCCCTACATAGTAAATTAGGTTCATCACTGCCAGTGAGAGTTCATGCTGAAGCCATG 1560 501 -L--P--L--H--S--K--L--G--S--S--L--P--V--R--V--H--A--E- -A--M- 520 1561

ATGGCCTTGAAGAACATCGCCAAAAAGGAGCCTAAAACGGTCCAGTATTTAGCCTTTCAG 1620 521 -M--A--L--K--N--I--A--K--K--E--P--K--T--V--Q--Y--L--A- -F--Q- 540 1621

CTCTACGGGGACAAGACTCTTCATTCAGAGATCCGCATGCTTGCGTGCATGGTGCTCTTT 1680 541 -L--Y--G--D--K--T--L--H--S--E--I--R--M--L--A--C--M--V- -L--F- 560 1681

GAGACAAAACCTTCAATGAGTTTGGTGTCAGCTGTTGTTCATATTGTGAAGACAGATACA 1740 561 -E--T--K--P--S--M--S--L--V--S--A--V--V--H--I--V--K--T- -D--T- 580

AATTTGCAAGTAGTAAGCTTCACCTATTCCCACATGAAGTCCCTGACTAGGAGCACCAGC 1800 581 -N--L--Q--V--V--S--F--T--Y--S--H--M--K--S--L--T--R--S- -T--S- 600 1801

GTTATTTATGCCTCAGTTGCTGCAGCATGCAAAGCTGCCCTGAGAATGTTGGGCCCAAAC 1860 601 -V--I--Y--A--S--V--A--A--A--C--K--A--A--L--R--M--L--G- -P--N- 620 1861

CTGGACAAACTGAGCTCACGTTTCAGCAAAGCCATCCATGTCGACGTCTATAGCAGTCCC 1920 621 -L--D--K--L--S--S--R--F--S--K--A--I--H--V--D--V--Y--S- -S--P- 640 1921

TTTATGCTTGGTGCTGCTGCGACTGCTTACTACATCAATGATGCTGCCACCATCATGCCC 1980 641 -F--M--L--G--A--A--A--T--A--Y--Y--I--N--D--A--A--T--I- -M--P- 660 1981

AAATCTATTACGACTAGGATCAAGGCTTTCTTTGCTGGAGCTGCTGCTGACATTCTGGAG 2040 661 -K--S--I--T--T--R--I--K--A--F--F--A--G--A--A--A--D--I- -L--E- 680 2041

GTTGGAGTAAGAACTGAGGGACTACAGGAGGCTTTTCTGAAAAACCCAGCAGTTTTTGAT 2100 681 -V--G--V--R--T--E--G--L--Q--E--A--F--L--K--N--P--A--V- -F--D- 700 2101

AGTGCTGACAGGGTCACCAGGATGAAACATGTCATTAAGGCTCTCTCTCACTGGAAGTCT 2160 701 -S--A--D--R--V--T--R--M--K--H--V--I--K--A--L--S--H--W- -K--S- 720 2161

GCACCCAACAGCAAATCCCTGACTTCCATCTATGTCAAGTTCTTTGGACAAGAAGTTGCC 2220 721 -A--P--N--S--K--S--L--T--S--I--Y--V--K--F--F--G--Q--E-

-V--A- 740 2221

TTTGTTGACTTTGACAAAATCTGGTTTGACAACATCTTTAATCTCATCTTTGCCAATAAC 2280 741 -F--V--D--F--D--K--I--W--F--D--N--I--F--N--L--I--F--A- -N--N- 760 2281

AATGCTGACACGTTTGGTAGAGATGTTTTCAAGGCTCTGCAGTCTGGTCCTACTTTGCGC 2340 761 -N--A--D--T--F--G--R--D--V--F--K--A--L--Q--S--G--P--T- -L--R- 780 2341

TTTGTTAAGCCTCTGCTGGCTAATGAGGTGAGACGTATCATGCCTACTATAGCTGGTTTT 2400 781 -F--V--K--P--L--L--A--N--E--V--R--R--I--M--P--T--I--A- -G--F- 800 2401

CCCATGGAGCTCGGTCTGTACACTGCTGCTGTGGCTGCTGTTCCTGGTCAAATCAAAGTC 2460 801 -P--M--E--L--G--L--Y--T--A--A--V--A--A--V--P--G--Q--I- -K--V- 820 2461

ACCACGACTCCAGCTCTGCCAGAAGACTTTTATCTCAGATACCTTCTCAAGGCAGATATA 2520 821 -T--T--T--P--A--L--P--E--D--F--Y--L--R--Y--L--L--K--A- -D--I- 840 2521

CACATTAGTACCAAGGTCACACCAAGTGTCGCTGTGAACACATTTGCTGTGTTTGGGATA 2580 841 -H--I--S--T--K--V--T--P--S--V--A--V--N--T--F--A--V--F- -G--I- 860 2581

AACACTGCCATACTCCAGGCTGTCATGGTATCCAGAGCCAAACTCTACTCCATCACACCA 2640 861 -N--T--A--I--L--Q--A--V--M--V--S--R--A--K--L--Y--S--I- -T--P- 880 2641

GCCAAAACTGAAGTCACATTTAACATCAATGAGGGCTACTTGAATTTCACAGCTCTTCCT

881 -A--K--T--E--V--T--F--N--I--N--E--G--Y--L--N--F--T--A- -L--P- 900 2701

GTTTCAGTGCCTGAAAACATTACAGCTGTGGAGGTTGAGACTTTTGCTGTGGTAAGAAAT 2760 901 -V--S--V--P--E--N--I--T--A--V--E--V--E--T--F--A--V--V- -R--N- 920 2761

CCTGCTTCGGGAGAAAGAATCACTCCTGTGATCCCTGCCAACCCAAGACAGATTCTTATA 2820 921 -P--A--S--G--E--R--I--T--P--V--I--P--A--N--P--R--Q--I- -L--I- 940 2821

TCCAGTAATACTTCTTCTGATGCTGTTAGTGAGTCAAGATCCGAAGAGTTCATTTCTCAG 2880 941 -S--S--N--T--S--S--D--A--V--S--E--S--R--S--E--E--F--I- -S--Q- 960 2881

CGTCAGAAAGCTGGCATGCACATCAAATCTAAAATGGTGAAGAGTAAGAAGAAGTACTGC 2940 961 -R--Q--K--A--G--M--H--I--K--S--K--M--V--K--S--K--K--K- -Y--C- 980 2941

GCTCAGACTGTTAACGCTGGACTCAAGGCCTGTCTCAAGATTGCCACTGCTTACACGGGG 3000 981 -A--Q--T--V--N--A--G--L--K--A--C--L--K--I--A--T--A--Y- -T--G- 1000 3001

GATGCTGCAGTGTATAAACTGGCTGGAAAGCACTCCGCTGCTTTTTCTGTCACACCAATT 3060 1001 -D--A--A--V--Y--K--L--A--G--K--H--S--A--A--F--S--V--T- -P--I- 1020 3061

GAAGGTGAAGCTGCTGAGAGACTGGAATTAGAGGTTCAACTTGGAAGTAAGGCTGCACAG 3120 1021 -E--G--E--A--A--E--R--L--E--L--E--V--Q--L--G--S--K--A- -A--Q- 1040

AAGATCATCAAACACATCACGCTTAGAGAAGAAGAAATCCCAGAGGAAACACCAGTCTTA 3180 1041 -K--I--I--K--H--I--T--L--R--E--E--E--I--P--E--E--T--P- -V--L- 1060 3181

ATGAAGCTCCACAAAATCCTGGCCTCTACCCAGAAGAATAGCACCATGTCCTCCTCATCC 3240 1061 -M--K--L--H--K--I--L--A--S--T--Q--K--N--S--T--M--S--S- -S--S- 1080 3241

TCCAGTTCCAGGAGCTCTCGCTTTCATGTCAGATCCTCTTCTTCCAATTCCAGCTCTTCA 3300 1081 -S--S--S--R--S--S--R--F--H--V--R--S--S--S--S--N--S--S- -S--S- 1100 3301

TCCCATTCTAGCAGGAAGACCATTGATGCAACTGCTCAACAAGTCTTCAGCTTCTCCACC 3360 1101 -S--H--S--S--R--K--T--I--D--A--T--A--Q--Q--V--F--S--F- -S--T- 1120 3361

TCTGTCAGTACTTCCAAGTCCAGCTTTGCATCGAGCTTTGCATCACTCTTCAGTCTTAGT 3420 1121 -S--V--S--T--S--K--S--S--F--A--S--S--F--A--S--L--F--S- -L--S- 1140 3421

TCAAGCTCTTCTCACTACAGTGCGCACCACAGAAAGCATCCTGCGAGTCGCCACAAACCC 3480 1141 -S--S--S--S--H--Y--S--A--H--H--R--K--H--P--A--S--R--H- -K--P- 1160 3481

AAGGAGAAACACAAGCATCCCACCTCTAAAGCCACATCGTCACAGGTTTTCAAAAGCAGA 3540 1161 -K--E--K--H--K--H--P--T--S--K--A--T--S--S--Q--V--F--K- -S--R- 1180 3541

AGCAGTGGCTCAAGCTTGGACGCTATCCAACATAAGAAGCGGTTCCTTGACAGTCAAGCT 3600 1181 -S--S--G--S--S--L--D--A--I--Q--H--K--K--R--F--L--D--S-

-Q--A- 1200 3601

GCTATCTTTGGCATGATCTTCCGTGCTGTTAAAGCTGACACGAAGAAGCAGGGATACCAG 3660 1201 -A--I--F--G--M--I--F--R--A--V--K--A--D--T--K--K--Q--G- -Y--Q- 1220 3661

TTCACTGCTTACATGGACAAAACCACCAGCAGACTTCAAATCATTCTAGATGACATTGTT 3720 1221 -F--T--A--Y--M--D--K--T--T--S--R--L--Q--I--I--L--D--D- -I--V- 1240 3721

CCTGATAACAACTGGAGGCTCTGTGCTGATGGAGCCGTGTTGAGCATGCACAAAGTCAAA 3780 1241 -P--D--N--N--W--R--L--C--A--D--G--A--V--L--S--M--H--K- -V--K- 1260 3781

GCTAAAATGAACTGGGGAGCAGAATGCAACCAATATGACACCACGATTACAACAGAAACT 3840 1261 -A--K--M--N--W--G--A--E--C--N--Q--Y--D--T--T--I--T--T- -E--T- 1280 3841

GGTCTTGTCGGTCGAAACCCTGCAGCTCGGCTGAAGGTGGACTGGAATCGGCTACCGTCT 3900 1281 -G--L--V--G--R--N--P--A--A--R--L--K--V--D--W--N--R--L- -P--S- 1300 3901

GATCTCAAGCACCATGCAAAGACGATGTATAAGTACATTTCTGCTCACATGCCTGCCGGC 3960 1301 -D--L--K--H--H--A--K--T--M--Y--K--Y--I--S--A--H--M--P- -A--G- 1320 3961

TTGATTCAGGAAAAGGACAGAAACAGCGACAAGCAGCTCTCGTTGACTGTGGCTGTAGTA 4020 1321 -L--I--Q--E--K--D--R--N--S--D--K--Q--L--S--L--T--V--A- -V--V- 1340 4021

TCTGACAAGATCATCGACCTGATTTGGAAAACACCGAGAAGCACTGTTCATAAGCGGGCT

1341 -S--D--K--I--I--D--L--I--W--K--T--P--R--S--T--V--H--K- -R--A- 1360 4081

TTGCATCTTCCCATCACTCTGCCACGTAACGAGATCAAAGATCTTACTTCCTTCAGTGAC 4140 1361 -L--H--L--P--I--T--L--P--R--N--E--I--K--D--L--T--S--F- -S--D- 1380 4141

GTCTCTGGAAAAGTCAAGCACTTGTTAGCTGCGGCTGGCGCAGCTGAATGTAGCTTCACC 4200 1381 -V--S--G--K--V--K--H--L--L--A--A--A--G--A--A--E--C--S- -F--T- 1400 4201

GACAATACGCTGACCACATTCAACAACAAGAAATTAAAGAACGAGATGCCCTCAAACTGC 4260 1401 -D--N--T--L--T--T--F--N--N--K--K--L--K--N--E--M--P--S- -N--C- 1420 4261

TATCAGGTTCTGGCACAGGATGGCACAGACGAGCTGAAATTCATCGTTCTACTGAGGAAG 4320 1421 -Y--Q--V--L--A--Q--D--G--T--D--E--L--K--F--I--V--L--L- -R--K- 1440 4321

GATCGCACTGAACAGAAGCAGATCAGTGTGAAAATTGCTCATATAGACATTGACCTCTAT 4380 1441 -D--R--T--E--Q--K--Q--I--S--V--K--I--A--H--I--D--I--D- -L--Y- 1460 4381

CAGAGGAGAACCAGTGTGACTGTGAATGTGAATGGGCTGGAAATACCCATGAGCAACCTG 4440 1461 -Q--R--R--T--S--V--T--V--N--V--N--G--L--E--I--P--M--S- -N--L- 1480 4441

CCATATCGTTATCCCCAAGCTGACATCCAGATCAAACAAAATGGCGAAGGCATCTCTGTG 4500 1481 -P--Y--R--Y--P--Q--A--D--I--Q--I--K--Q--N--G--E--G--I- -S--V- 1500

TATGCAGCTAGCTATGGTCTTCATGAAGTCTACTTTGACAAGAAGTCATGGAAGATTAAA 4560 1501 -Y--A--A--S--Y--G--L--H--E--V--Y--F--D--K--K--S--W--K- -I--K- 1520 4561

GTTGTGGACTGGATGAAGGGGAAGACTTGTGGGCTCTGTGGAAAGGCTGACGGGGAGACC 4620 1521 -V--V--D--W--M--K--G--K--T--C--G--L--C--G--K--A--D--G- -E--T- 1540 4621

ATGCAGGAGTATCGCACACCCACTGGATGGATAGCCACGACAGCAGTGAGCTTTGCTCAT 4680 1541 -M--Q--E--Y--R--T--P--T--G--W--I--A--T--T--A--V--S--F- -A--H- 1560 4681

TCTTGGATTCTGCCAGCTGAGAGCTGCAGAGACGCCACTGAGTGCCGTATGAGGCATGAA 4740 1561 -S--W--I--L--P--A--E--S--C--R--D--A--T--E--C--R--M--R- -H--E- 1580 4741

TCTGTGCAGCTGGAGAAACAGGAAAACGTGCAAGCTCAGAACTCCAAGTGCTACTCTGTC 4800 1581 -S--V--Q--L--E--K--Q--E--N--V--Q--A--Q--N--S--K--C--Y- -S--V- 1600 4801

GACCCTGTGCTGCGCTGCATGGCTGGGTGCTTCCCTGTGCGCACCACCAACGTCACTGTT 4860 1601 -D--P--V--L--R--C--M--A--G--C--F--P--V--R--T--T--N--V- -T--V- 1620 4861

GGCTTCCACTGCCTTCCAGCTGGTTCCAGCCCCTCCAGCATGTATACGAGCGTGGACCTG 4920 1621 -G--F--H--C--L--P--A--G--S--S--P--S--S--M--Y--T--S--V- -D--L- 1640 4921 ATGGAAACTACGGAGAGTCACCTCGCCTGCACCTGCACTGCTCAGTGTGCTTAA 4974 1641 -M--E--T--T--E--S--H--L--A--C--T--C--T--A--Q--C--A--*- 1657

SEQ ID Nº 108 e 111 (alelo mutante VtgAa - deleção 5nt) COMPRIMENTO: 4974bp e 279aa TIPO: cDNA (SEQ ID Nº 108) e Proteína (SEQ ID Nº 111) ORGANISMO: tilápia do Nilo 1

ATGAGAGCGCTCGTGCTCGCCCTGATTCTGGCCTTTGTGGCTGGTGATCTTCAACATCAA 60 1 -M--R--A--L--V--L--A--L--I--L--A--F--V--A--G--D--L--Q- -H--Q- 20 61

GATCCTGTTTTTGAAGCTGATAAAACCTATGTGTACAAGTATGAGGCGCTGCTCCTGGCG 120 21 -D--P--V--F--E--A--D--K--T--Y--V--Y--K--Y--E--A--L--L- -L--A- 40 121

GGCCTGCTCGAGAAAGGTTCAGCGAGAGCTGGACTAAATATCAGCAGCAAAGTTAGCATC 180 41 -G--L--L--E--K--G--S--A--R--A--G--L--N--I--S--S--K--V- -S--I- 60 181

AATGCTATAGACCAGAACACATACTTCATTAAGCTTGAGGAACCTGAGCTCCAGGAGTAT 240 61 -N--A--I--D--Q--N--T--Y--F--I--K--L--E--E--P--E--L--Q- -E--Y- 80 241

AGTGGAATTTGGCCTGAGGATCCTTTTATCCCAGCAACTGAGCTGACTTCAGCCCTCCAA 300 81 -S--G--I--W--P--E--D--P--F--I--P--A--T--E--L--T--S--A- -L--Q- 100 301

GCTGAGCTCACGACTCCCATTAAGTTTGAATATGTCAATGGTGCTGTTGGAAAAGTCTTC

101 -A--E--L--T--T--P--I--K--F--E--Y--V--N--G--A--V--G--K- -V--F- 120 361

GCCCCTGAAACCGTCTCAACAACAGTGCTTAACATCTACAGAGGTATCCTGAATGTCTTT 420 121 -A--P--E--T--V--S--T--T--V--L--N--I--Y--R--G--I--L--N- -V--F- 140 421

CAGCTCAACGTCAAAAAGACACTAAATGTCTACGAGTTGCAGGAGGCTGGAACTCAGGGT 480 141 -Q--L--N--V--K--K--T--L--N--V--Y--E--L--Q--E--A--G--T- -Q--G- 160 481

GTGTGCAAGACACTTTACTCCATCACTGAGGACACAGAGGCTGAACGTGTCTATCTGAGA 540 161 -V--C--K--T--L--Y--S--I--T--E--D--T--E--A--E--R--V--Y- -L--R- 180 541

AAGACCAGGGACATGAGCCACTGTCAAGAAAGAATAACTAAAGACATGGGGTTAGCATAC 600 181 -K--T--R--D--M--S--H--C--Q--E--R--I--T--K--D--M--G--L- -A--Y- 200 601

ACAGAGAAATGTGGAAAGTGCCAGGAGGACACTAAAAACCTGAAAGGAGTTTCATCATAC 660 201 -T--E--K--C--G--K--C--Q--E--D--T--K--N--L--K--G--V--S- -S--Y- 220 661

AGTTACATCATGAAACCACTCGATAATGGCATCCAGATCAAGGAGGCATCGGTCCATGAG 720 221 -S--Y--I--M--K--P--L--D--N--G--I--Q--I--K--E--A--S--V- -H--E- 240 721

CTGATCCAGTTCTCACCTTTCAGTGAGCAGCATGGAGCCGCCCATATGGAGACCAAGCAA 780 241 -L--I--Q--F--S--P--F--S--E--Q--H--G--A--A--H--M--E--T- -K--Q- 260

TCCTTGATGCTCCTTGACGTTCGAAGACCCCCTTATGCACCCACTACACCACCAGGCTGA 840 261 -S--L--M--L--L--D--V--R--R--P--P--Y--A--P--T--T--P--P- -G--*- 279 SEQ ID Nº 109 e 112 (alelo mutante VtgAa - deleção 25nt) COMPRIMENTO: 4974bp e 301aa TIPO: cDNA (SEQ ID Nº 109) e Proteína (SEQ ID Nº 112) ORGANISMO: tilápia do Nilo 1

ATGAGAGCGCTCGTGCTCGCCCTGATTCTGGCCTTTGTGGCTGGTGATCTTCAACATCAA 60 1 -M--R--A--L--V--L--A--L--I--L--A--F--V--A--G--D--L--Q- -H--Q- 20 61

GATCCTGTTTTTGAAGCTGATAAAACCTATGTGTACAAGTATGAGGCGCTGCTCCTGGCG 120 21 -D--P--V--F--E--A--D--K--T--Y--V--Y--K--Y--E--A--L--L- -L--A- 40 121

GGCCTGCTCGAGAAAGGTTCAGCGAGAGCTGGACTAAATATCAGCAGCAAAGTTAGCATC 180 41 -G--L--L--E--K--G--S--A--R--A--G--L--N--I--S--S--K--V- -S--I- 60 181

AATGCTATAGACCAGAACACATACTTCATTAAGCTTGAGGAACCTGAGCTCCAGGAGTAT 240 61 -N--A--I--D--Q--N--T--Y--F--I--K--L--E--E--P--E--L--Q- -E--Y- 80 241

AGTGGAATTTGGCCTGAGGATCCTTTTATCCCAGCAACTGAGCTGACTTCAGCCCTCCAA 300 81 -S--G--I--W--P--E--D--P--F--I--P--A--T--E--L--T--S--A- -L--Q- 100 301

GCTGAGCTCACGACTCCCATTAAGTTTGAATATGTCAATGGTGCTGTTGGAAAAGTCTTC 360 101 -A--E--L--T--T--P--I--K--F--E--Y--V--N--G--A--V--G--K- -V--F- 120 361

GCCCCTGAAACCGTCTCAACAACAGTGCTTAACATCTACAGAGGTATCCTGAATGTCTTT 420 121 -A--P--E--T--V--S--T--T--V--L--N--I--Y--R--G--I--L--N- -V--F- 140 421

CAGCTCAACGTCAAAAAGACACTAAATGTCTACGAGTTGCAGGAGGCTGGAACTCAGGGT 480 141 -Q--L--N--V--K--K--T--L--N--V--Y--E--L--Q--E--A--G--T- -Q--G- 160 481

GTGTGCAAGACACTTTACTCCATCACTGAGGACACAGAGGCTGAACGTGTCTATCTGAGA 540 161 -V--C--K--T--L--Y--S--I--T--E--D--T--E--A--E--R--V--Y- -L--R- 180 541

AAGACCAGGGACATGAGCCACTGTCAAGAAAGAATAACTAAAGACATGGGGTTAGCATAC 600 181 -K--T--R--D--M--S--H--C--Q--E--R--I--T--K--D--M--G--L- -A--Y- 200 601

ACAGAGAAATGTGGAAAGTGCCAGGAGGACACTAAAAACCTGAAAGGAGTTTCATCATAC 660 201 -T--E--K--C--G--K--C--Q--E--D--T--K--N--L--K--G--V--S- -S--Y- 220 661

AGTTACATCATGAAACCACTCGATAATGGCATCCAGATCAAGGAGGCATCGGTCCATGAG 720 221 -S--Y--I--M--K--P--L--D--N--G--I--Q--I--K--E--A--S--V- -H--E- 240

CTGATCCAGTTCTCACCTTTCAGTGAGCAGCATGGAGCCGCCCATATGGAGACCAAGCAA 780 241 -L--I--Q--F--S--P--F--S--E--Q--H--G--A--A--H--M--E--T- -K--Q- 260 781

TCCTTGATGCTCCTTGACGTTCGAAGACACCCCAGGCTGAGTATTCACACCGTGGAAATC 840 261 -S--L--M--L--L--D--V--R--R--H--P--R--L--S--I--H--T--V- -E--I- 280 841

TCACATATCAGTTCTCCACTGAGCTTCTTCAGTTACCCATTCTGCTCCTCAATATCAACG 900 281 -S--H--I--S--S--P--L--S--F--F--S--Y--P--F--C--S--S--I- -S--T- 300 901

ACATAGAGTCTCAGCTCGAGGACACTCTGGTCAAACAGGCTGTAGAAAGAGTTCATGAAG 960 301 -T--*- 301 SEQ ID Nº 113 e 115 (VtgAb de tipo selvagem) COMPRIMENTO: 5339bp e 1747aa TIPO: cDNA (SEQ ID Nº 113) e Proteína (SEQ ID Nº 115) ORGANISMO: tilápia do Nilo 1

CGCCATTTAGTTAATGATACATTTGATGGGCAACGTCAGCAAAAAATCTGCTTAAAAAGG 60 ............................................................ 61

ACGCCTCTGCCTGCAGATCCTCACATCCACCAGCCATGAGGGTGCTTGTACTAGCTCTTG 120 ...................................-M--R--V--L--V--L-- A--L-- 8 121

CTGTGGCTCTCGCAGTGGGGGACCAGTCCAACTTGGCCCCAGGATTCGCCTCTGTTAAGA 180 9 A--V--A--L--A--V--G--D--Q--S--N--L--A--P--G--F--A--S-- V--K-- 28 181

CCTACATGTACAAATATGAAGCGGTTCTTATGGGCGGCCTGCCTGAAGAGGGCCTGGCTC 240 29 T--Y--M--Y--K--Y--E--A--V--L--M--G--G--L--P--E--E--G-- L--A-- 48 241

GAGCTGGGGTTAAAATCCGGGGCAAAGTTTTGATCAGTGCAACAAGTGCCAACGACTACA 300 49 R--A--G--V--K--I--R--G--K--V--L--I--S--A--T--S--A--N-- D--Y-- 68 301

TTCTGAAGCTTGTAGACCCTCAGTTGCTGGAGTACAGTGGCATCTGGCCCAAAGATCCTT 360 69 I--L--K--L--V--D--P--Q--L--L--E--Y--S--G--I--W--P--K-- D--P-- 88 361

TCCATCCAGCCACCAAGCTCACCACAGCCCTGGCTACTCAGCTCTCGACACCGGTCAAGT 420 89 F--H--P--A--T--K--L--T--T--A--L--A--T--Q--L--S--T--P-- V--K-- 108 421

TTGAGTATACAAACGGCGTTGTTGGGAGACTGGCTGCACCTCCTGGGGTCTCCACAACAG 480 109 F--E--Y--T--N--G--V--V--G--R--L--A--A--P--P--G--V--S-- T--T-- 128 481

TGCTGAATATCTACAGGGGCATCATCAACCTCCTGCAGCTGAATGTAAAGAAGACACAGA 540 129 V--L--N--I--Y--R--G--I--I--N--L--L--Q--L--N--V--K--K-- T--Q-- 148

ATGTCTACGAGATGCAAGAGTCTGGAGCTCATGGTGTGTGCAAGACCAACTATGTGATCA 600 149 N--V--Y--E--M--Q--E--S--G--A--H--G--V--C--K--T--N--Y-- V--I-- 168 601

GGGAGGACGCGAGGGCCGAACGCATTCATCTGACCAAGACCAAGGACCTGAACCACTGCC 660 169 R--E--D--A--R--A--E--R--I--H--L--T--K--T--K--D--L--N-- H--C-- 188 661

AGGAGAAAATCATGAAGGCCATCGGCTTGGAACACGTAGAGAAATGCCATGATTGTGAAG 720 189 Q--E--K--I--M--K--A--I--G--L--E--H--V--E--K--C--H--D-- C--E-- 208 721

CTAGAGGAAAGAGCCTGAAGGGAACTGCTTCCTATAACTACATCATGAAGCCAGCACCCA 780 209 A--R--G--K--S--L--K--G--T--A--S--Y--N--Y--I--M--K--P-- A--P-- 228 781

GTGGTTCTCTGATTATGGAGGCTGTCGCTAGAGAGGTCATCGAGTTTTCACCTTTCAACA 840 229 S--G--S--L--I--M--E--A--V--A--R--E--V--I--E--F--S--P-- F--N-- 248 841

TTTTGAATGGCGCTGCTCAGATGGAGTCTAAGCAAATTCTGACCTTCCTGGATATTGAGA 900 249 I--L--N--G--A--A--Q--M--E--S--K--Q--I--L--T--F--L--D-- I--E-- 268 901

ACACCCCTGTGGATCATGCCAGATACACCTATGTTCACCGCGGATCCCTGCAGTATGAGC 960 269 N--T--P--V--D--H--A--R--Y--T--Y--V--H--R--G--S--L--Q-- Y--E-- 288 961

ATGGCAGCGAGATTCTCCAGACACCCATCCATCTTCTGAGGGTCACCCATGCCGAGGCTC 1020

289 H--G--S--E--I--L--Q--T--P--I--H--L--L--R--V--T--H--A-- E--A-- 308 1021

AGATTGTCAGCACTCTGAACCACCTGGTAGCCTCCAACGTGGCCAAGGTCCATGAAGATG 1080 309 Q--I--V--S--T--L--N--H--L--V--A--S--N--V--A--K--V--H-- E--D-- 328 1081

CCCCTCTGAAGTTTGTTGAGCTCATCCAGGTGATGCGTGTGGCCAGATTTGAGACTATTG 1140 329 A--P--L--K--F--V--E--L--I--Q--V--M--R--V--A--R--F--E-- T--I-- 348 1141

AGTCCCTCTGGGCTCAGTTTAAATCTAGACCTGATCACAGGTACTGGTTACTGAATGCTG 1200 349 E--S--L--W--A--Q--F--K--S--R--P--D--H--R--Y--W--L--L-- N--A-- 368 1201

TCCCCCACATTCGCACTCACGCTGCGCTTAAGTTCCTCATTGAGAAGCTCCTTGCTAATG 1260 369 V--P--H--I--R--T--H--A--A--L--K--F--L--I--E--K--L--L-- A--N-- 388 1261

AGTTAAGTGAGACTGAAGCTGCTATGGCTCTCTTGGAATGTCTGCACTCTGTGACAGCTG 1320 389 E--L--S--E--T--E--A--A--M--A--L--L--E--C--L--H--S--V-- T--A-- 408 1321

ACCAGAAAACCATTGAACTTGTCAGAAGCCTGGCTGAGAACCACAGAGTGAAACGTAACG 1380 409 D--Q--K--T--I--E--L--V--R--S--L--A--E--N--H--R--V--K-- R--N-- 428 1381

CTGTGCTCAACGAGATTGTGATGCTGGGCTGGGGCACTGTAATTTCCAGGTTCTGTAAAG 1440 429 A--V--L--N--E--I--V--M--L--G--W--G--T--V--I--S--R--F-- C--K-- 448 1441

CGCAGCCATCTTGCTCATCTGATCTTGTGACACCTGTACATAGACAAGTTGCAGAGGCTG 1500 449 A--Q--P--S--C--S--S--D--L--V--T--P--V--H--R--Q--V--A-- E--A-- 468 1501

TTGAAACTGGTGACATCGATCAGCTCACTGTCACTCTCAAATGCCTGGATAACGCTGGAC 1560 469 V--E--T--G--D--I--D--Q--L--T--V--T--L--K--C--L--D--N-- A--G-- 488 1561

ATCCTGCTAGCCTTAAGACAATCATGAAGTTCCTGCCTGGCTTTGGCAGTGCTGCTGCCC 1620 489 H--P--A--S--L--K--T--I--M--K--F--L--P--G--F--G--S--A-- A--A-- 508 1621

GAGTCCCACTCAAAGTTCAGGTTGACGCTGTTCTAGCCCTGAGGAGAATTGCAAAGAGGG 1680 509 R--V--P--L--K--V--Q--V--D--A--V--L--A--L--R--R--I--A-- K--R-- 528 1681

AACCCAAGATGGTCCAGGAAATAGCTGCTCAGTTGCTCATGGAAAAGCATCTCCATGCAG 1740 529 E--P--K--M--V--Q--E--I--A--A--Q--L--L--M--E--K--H--L-- H--A-- 548 1741

AACTGCGTATGGTTGCTGCCATGGTGCTCTTTGAGACTAAACTCCCCGTGGGTCTAGCAG 1800 549 E--L--R--M--V--A--A--M--V--L--F--E--T--K--L--P--V--G-- L--A-- 568 1801

CTAGCATTTCCACAGCCTTGATCAAAGAAAAGAACCTGCAGGTCGTTAGCTTTGTCTACT 1860 569 A--S--I--S--T--A--L--I--K--E--K--N--L--Q--V--V--S--F-- V--Y-- 588 1861

CTTACATGAAGGCCATGGCCAAGACCACATCCCCTGACCACGTTTCTGTTGCTGCAGCAT 1920 589 S--Y--M--K--A--M--A--K--T--T--S--P--D--H--V--S--V--A-- A--A-- 608

GTAATGTTGCCTTGAGGTTCCTCAACCCCAAATTAGGCAGACTGAACTTCCGCTACAGCC 1980 609 C--N--V--A--L--R--F--L--N--P--K--L--G--R--L--N--F--R-- Y--S-- 628 1981

GAGCCTTCCATGTGGATACCTATAACAATGCCTGGATGATGGGTGCTGCCGCCAGTGCCG 2040 629 R--A--F--H--V--D--T--Y--N--N--A--W--M--M--G--A--A--A-- S--A-- 648 2041

TCTTAATTAACGACGCTGCAACCGTGTTACCAAGAATGATTATGGCCAAAGCCCGTACTT 2100 649 V--L--I--N--D--A--A--T--V--L--P--R--M--I--M--A--K--A-- R--T-- 668 2101

ACATGGCCGGAGCTTATGTTGATGCTTTTGAGGTTGGAGTGAGGACTGAGGGAATCCAGG 2160 669 Y--M--A--G--A--Y--V--D--A--F--E--V--G--V--R--T--E--G-- I--Q-- 688 2161

AGGCTCTTTTGAAAAGACGACATGAAAATTCTGAGAATGCAGACAGGATCACCAAGATTA 2220 689 E--A--L--L--K--R--R--H--E--N--S--E--N--A--D--R--I--T-- K--I-- 708 2221

AACAAGCCATGAGAGCTCTTTCTGAGTGGAGGGCTAATCCTTCGAGCCAGGCCCTGGCCT 2280 709 K--Q--A--M--R--A--L--S--E--W--R--A--N--P--S--S--Q--A-- L--A-- 728 2281

CTATGTATGTGAAGGTCTTCGGACAAGAAATTGCATTTGCCAACATTGACAAATCCAAGG 2340 729 S--M--Y--V--K--V--F--G--Q--E--I--A--F--A--N--I--D--K-- S--K-- 748 2341

TTGACCAGCTTATCCAGTTTGCCAGTGGACCTTTGAGAAACGTATTCAGAGATGCTGTGA 2400

749 V--D--Q--L--I--Q--F--A--S--G--P--L--R--N--V--F--R--D-- A--V-- 768 2401

ATTCTGTGCTGTCTGGTTATGCAACACATTTTGCTAAACCAATGCTGCTCGGTGAGCTCC 2460 769 N--S--V--L--S--G--Y--A--T--H--F--A--K--P--M--L--L--G-- E--L-- 788 2461

GTCTCATCCTTCCCACCACTGTTGGGTTGCCCATGGAGATCAGCCTCATTACATCCGCTG 2520 789 R--L--I--L--P--T--T--V--G--L--P--M--E--I--S--L--I--T-- S--A-- 808 2521

TGACTGCTGCATCTGTTGACGTCCAAGCCACTGTGTCACCACCTCTGCCTGTCAACTACC 2580 809 V--T--A--A--S--V--D--V--Q--A--T--V--S--P--P--L--P--V-- N--Y-- 828 2581

GAGTTTCCCAGCTTCTGGAGTCCGATATCCAACTGAGGGCTACAGTTGCTCCAAGTCTTG 2640 829 R--V--S--Q--L--L--E--S--D--I--Q--L--R--A--T--V--A--P-- S--L-- 848 2641

CCATGCAGACCTATGCATTCATGGGTGTGAACACCGCCTTAATCCAGGCTGCAGTGATGA 2700 849 A--M--Q--T--Y--A--F--M--G--V--N--T--A--L--I--Q--A--A-- V--M-- 868 2701

CAAAAGCCAAAGTTTACACAGCTGTTCCTGCACAGATAAAAGCAAGGATTGACATTGTTA 2760 869 T--K--A--K--V--Y--T--A--V--P--A--Q--I--K--A--R--I--D-- I--V-- 888 2761

AGGGCAACTTGAAGGTTGAGTTCCTGTCACTCCAGGGCATTAACACAATTGCATCTGCAC 2820 889 K--G--N--L--K--V--E--F--L--S--L--Q--G--I--N--T--I--A-- S--A-- 908 2821

ATGCGGAGACGGTTGCCATTGCAAGAAATGTGGAAGACCTCCCAGCCGCAAGAAGCACAC 2880 909 H--A--E--T--V--A--I--A--R--N--V--E--D--L--P--A--A--R-- S--T-- 928 2881

CACTGATCTCATCTGAAACTGCATCACAACTTTCAAAGGCCTCTCTCAACTCAAAGATCT 2940 929 P--L--I--S--S--E--T--A--S--Q--L--S--K--A--S--L--N--S-- K--I-- 948 2941

CCAGGATGGCATCCTCTGTGACTGGTGGCATGTCTGCGTCATCTGAAATCATTCCTGCTG 3000 949 S--R--M--A--S--S--V--T--G--G--M--S--A--S--S--E--I--I-- P--A-- 968 3001

ACCTGCCAAGTAAGATTGGGAGGAAAATGAAACTCCCTAAAACCTACAGGAAGAAAATCC 3060 969 D--L--P--S--K--I--G--R--K--M--K--L--P--K--T--Y--R--K-- K--I-- 988 3061

GTGCTTCAAGCAGAATGCTAGGATTCAAGGCCTACGCTGAGATTAAATCTCACAATGCCG 3120 989 R--A--S--S--R--M--L--G--F--K--A--Y--A--E--I--K--S--H-- N--A-- 1008 3121

CCTACATCAGAGACTGCCCTCTCTACGCTCTGATCGGAAAGCATGCTGCTTCTGTTAGGA 3180 1009 A--Y--I--R--D--C--P--L--Y--A--L--I--G--K--H--A--A--S-- V--R-- 1028 3181

TTGCTCCAGCTTCTGGACCAGTCATTGAGAAGATTGAAGTTGAGATTCAGGTCGGAGATA 3240 1029 I--A--P--A--S--G--P--V--I--E--K--I--E--V--E--I--Q--V-- G--D-- 1048 3241

AAGCAGCAGAAAATATGATTAAAGCGATTGACATGAGCGAAGAGGAGGAAGCTCTTGAGG 3300 1049 K--A--A--E--N--M--I--K--A--I--D--M--S--E--E--E--E--A-- L--E-- 1068

ATAAGAATGTCCTCTTGAAAATCAAGAAAATACTGGCACCTGGTCTCAAGAACACCACAT 3360 1069 D--K--N--V--L--L--K--I--K--K--I--L--A--P--G--L--K--N-- T--T-- 1088 3361

CATCTTCCTCCAGCTCCTCCAGCTCCTCTTCATCCAGCTCTAGCTCCAACAAGTCTTCTT 3420 1089 S--S--S--S--S--S--S--S--S--S--S--S--S--S--S--S--N--K-- S--S-- 1108 3421

CATCCAGTTCCCGCTCCAGCAGCTCCCAGTCATCCAGCTCTCGTTCCCATAGGTCTCGCT 3480 1109 S--S--S--S--R--S--S--S--S--Q--S--S--S--S--R--S--H--R-- S--R-- 1128 3481

CCAGAAAGTCCCAGTCTAGCAGCTCTCAGTCAAGCCGCTCTCCCTCAAGCTCTTCCTCCT 3540 1129 S--R--K--S--Q--S--S--S--S--Q--S--S--R--S--P--S--S--S-- S--S-- 1148 3541

CTTCCTCCTCTTCATCATCCAGATCTTCTTCCAGGTCATCTTCCAGATCATCTTCCAGAT 3600 1149 S--S--S--S--S--S--S--R--S--S--S--R--S--S--S--R--S--S-- S--R-- 1168 3601

CTTCTTCTAGGTCCTCCTCTCGCTCCAGAACTAAGATGGCTGACATTGTTGCTCCTATTA 3660 1169 S--S--S--R--S--S--S--R--S--R--T--K--M--A--D--I--V--A-- P--I-- 1188 3661

TCACGACGTCCACCAGAGTGAGCAGTTCCTCCAGTCGATCAGCCTCTAACAGCTCCTCCA 3720 1189 I--T--T--S--T--R--V--S--S--S--S--S--R--S--A--S--N--S-- S--S-- 1208 3721

GCAGTGCTTCATACTTGCTCAGCTCATCTAAGTCATCAAGCTCTAGATCCTCTCGGCGCA 3780

1209 S--S--A--S--Y--L--L--S--S--S--K--S--S--S--S--R--S--S-- R--R-- 1228 3781

GTGCTCAGTCTAAGCAACAACTGCTTGCCTTGAAGTTCAGAAAGAACCACGTCCACAGGC 3840 1229 S--A--Q--S--K--Q--Q--L--L--A--L--K--F--R--K--N--H--V-- H--R-- 1248 3841

ATGCCATCTCCACACAGCGCGGCAGCAGTCACAGCAGTGCCCGCAGCTTCGATTCCATCT 3900 1249 H--A--I--S--T--Q--R--G--S--S--H--S--S--A--R--S--F--D-- S--I-- 1268 3901

ACAATAAGGCCAAGTACCTCGCTAACACACTCACTCCTGCCATGTCCATTGCAATCCGTG 3960 1269 Y--N--K--A--K--Y--L--A--N--T--L--T--P--A--M--S--I--A-- I--R-- 1288 3961

CCGTGAGAGTCGACCACAAGGTCCAGGGATACCAGCTAGCAGCTTACCTGGACAAACAGA 4020 1289 A--V--R--V--D--H--K--V--Q--G--Y--Q--L--A--A--Y--L--D-- K--Q-- 1308 4021

CCAATAGACTGCAGCTGATTTTTGCCAGAGTCGCTGAGAAGGACAACTGGAGAATCTGTG 4080 1309 T--N--R--L--Q--L--I--F--A--R--V--A--E--K--D--N--W--R-- I--C-- 1328 4081

CCGACATTGTGCAGCTGAGTTCGCACAAGATGATGGCCAAGATTGCCTGGGGTGCTGAAT 4140 1329 A--D--I--V--Q--L--S--S--H--K--M--M--A--K--I--A--W--G-- A--E-- 1348 4141

GCAAGCAATACTCCACCATGATTGTAGCTGAAACTGGTCTTTTGGGTCATGAGCCCGCAG 4200 1349 C--K--Q--Y--S--T--M--I--V--A--E--T--G--L--L--G--H--E-- P--A-- 1368 4201

CCCGCTTGAAGCTGACCTGGGACAAACTGCCAGGAAGCATAAAGCACTACGCAAAGAGGG 4260 1369 A--R--L--K--L--T--W--D--K--L--P--G--S--I--K--H--Y--A-- K--R-- 1388 4261

CGTTGAAATCCATTGTCCCTATTGCTCAAGAATATGGAGTAAACTACGCAAAGGCCAAGA 4320 1389 A--L--K--S--I--V--P--I--A--Q--E--Y--G--V--N--Y--A--K-- A--K-- 1408 4321

ATCCTCGTAATCAAATCAAACTGACTGTAGCTGTTGCTACTGAGACAAGCATGAATATTG 4380 1409 N--P--R--N--Q--I--K--L--T--V--A--V--A--T--E--T--S--M-- N--I-- 1428 4381

TGCTGAACACACCAAAGGCAATCATTTACAAGCGTGGGGTGTGTCTACCTGTTGCTTTAC 4440 1429 V--L--N--T--P--K--A--I--I--Y--K--R--G--V--C--L--P--V-- A--L-- 1448 4441

CAATTGGAAACACTGCTGCCGAGCTGCAAGCGACCCGGGACAACTGGGCTGACAAGATGT 4500 1449 P--I--G--N--T--A--A--E--L--Q--A--T--R--D--N--W--A--D-- K--M-- 1468 4501

CCTATTTGGTTACCAAAGCTAACGCAGTTGAATGCTCCCTCATCAACAACACACTGACCA 4560 1469 S--Y--L--V--T--K--A--N--A--V--E--C--S--L--I--N--N--T-- L--T-- 1488 4561

CATTCAACAACAGGAAAGCTAGAGATGAGCTGCCACACTCGTGCTACCAGGTCTTGGCTC 4620 1489 T--F--N--N--R--K--A--R--D--E--L--P--H--S--C--Y--Q--V-- L--A-- 1508 4621

AGGATTGCACACCAGAACTCAAATTCATGGTTCTGCTGAAGAAAGACCAAATACAGGATC 4680 1509 Q--D--C--T--P--E--L--K--F--M--V--L--L--K--K--D--Q--I-- Q--D-- 1528

AGAAGCAGATCAATGTTAAGATTTCAGACATCGATGTGGACATGTATCGGAAGAACAACG 4740 1529 Q--K--Q--I--N--V--K--I--S--D--I--D--V--D--M--Y--R--K-- N--N-- 1548 4741

CCATTGCGGTGATGGTTAACGGAGTTGAAATCCCTAACAGCAACCTGCCATACCTGCATC 4800 1549 A--I--A--V--M--V--N--G--V--E--I--P--N--S--N--L--P--Y-- L--H-- 1568 4801

CATCAGGTAACATACATATAAGACAGTCAAATGAAGGCATTACTCTCAATGCACCCAGCC 4860 1569 P--S--G--N--I--H--I--R--Q--S--N--E--G--I--T--L--N--A-- P--S-- 1588 4861

ATGGTCTTCAGGAGGTCTTCCTTGGCTTCAACGAGCTGAGGGTTAAAGTTGCAGACTGGA 4920 1589 H--G--L--Q--E--V--F--L--G--F--N--E--L--R--V--K--V--A-- D--W-- 1608 4921

TGAAAGGAAAGACTTGTGGTGCCTGTGGAACGGCAAGCGGAAATGTCGGAGACGAGTACC 4980 1609 M--K--G--K--T--C--G--A--C--G--T--A--S--G--N--V--G--D-- E--Y-- 1628 4981

GCACACCCAGTGAACAGGTGACCAAGGATGCCATCAGCTACGCCCACTCCTGGGTTCTGT 5040 1629 R--T--P--S--E--Q--V--T--K--D--A--I--S--Y--A--H--S--W-- V--L-- 1648 5041

CTTCAAACACCTGCCGTGATCCCTCCGAGTGTTCCATCAAGCAGGAATCTGTGAAGCTGG 5100 1649 S--S--N--T--C--R--D--P--S--E--C--S--I--K--Q--E--S--V-- K--L-- 1668 5101

AGAAGCGGGTGATCTTTGAAGGTGTGGAGTCCAAATGCTACTCTGTTGAGCCCGTGCTGC 5160

1669 E--K--R--V--I--F--E--G--V--E--S--K--C--Y--S--V--E--P-- V--L-- 1688 5161

AGTGCCTGCCCGGCTGTATCCCAGTGAGAACCACTACCGTCAACGTTGGCTTTCACTGCC 5220 1689 Q--C--L--P--G--C--I--P--V--R--T--T--T--V--N--V--G--F-- H--C-- 1708 5221

TGCCCAGTGACACAACTGTGGACCGTTCTGGTCTGAGCAGCTTCTTTGAGAAGAGCATCG 5280 1709 L--P--S--D--T--T--V--D--R--S--G--L--S--S--F--F--E--K-- S--I-- 1728 5281

ACCTGAGGGATACTGCAGAAGCCCACCTGGCCTGTCGCTGCACTCCTCAGTGTGCTTAA 5339 1729 D--L--R--D--T--A--E--A--H--L--A--C--R--C--T--P--Q--C-- A--*- 1747 SEQ ID Nº 114 e 116 (alelo mutante VtgAb - deleção 8nt) COMPRIMENTO: 5339bp e 202aa TIPO: cDNA (SEQ ID Nº 114) e Proteína (SEQ ID Nº 116) ORGANISMO: tilápia do Nilo 1

CGCCATTTAGTTAATGATACATTTGATGGGCAACGTCAGCAAAAAATCTGCTTAAAAAGG 60 ............................................................ 61

ACGCCTCTGCCTGCAGATCCTCACATCCACCAGCCATGAGGGTGCTTGTACTAGCTCTTG 120 ...................................-M--R--V--L--V--L-- A--L-- 8 121

CTGTGGCTCTCGCAGTGGGGGACCAGTCCAACTTGGCCCCAGGATTCGCCTCTGTTAAGA 180

9 A--V--A--L--A--V--G--D--Q--S--N--L--A--P--G--F--A--S-- V--K-- 28 181

CCTACATGTACAAATATGAAGCGGTTCTTATGGGCGGCCTGCCTGAAGAGGGCCTGGCTC 240 29 T--Y--M--Y--K--Y--E--A--V--L--M--G--G--L--P--E--E--G-- L--A-- 48 241

GAGCTGGGGTTAAAATCCGGGGCAAAGTTTTGATCAGTGCAACAAGTGCCAACGACTACA 300 49 R--A--G--V--K--I--R--G--K--V--L--I--S--A--T--S--A--N-- D--Y-- 68 301

TTCTGAAGCTTGTAGACCCTCAGTTGCTGGAGTACAGTGGCATCTGGCCCAAAGATCCTT 360 69 I--L--K--L--V--D--P--Q--L--L--E--Y--S--G--I--W--P--K-- D--P-- 88 361

TCCATCCAGCCACCAAGCTCACCACAGCCCTGGCTACTCAGCTCTCGACACCGGTCAAGT 420 89 F--H--P--A--T--K--L--T--T--A--L--A--T--Q--L--S--T--P-- V--K-- 108 421

TTGAGTATACAAACGGCGTTGTTGGGAGACTGGCTGCACCTCCTGGGGTCTCCACAACAG 480 109 F--E--Y--T--N--G--V--V--G--R--L--A--A--P--P--G--V--S-- T--T-- 128 481

TGCTGAATATCTACAGGGGCATCATCAACCTCCTGCAGCTGAATGTAAAGAAGACACAGA 540 129 V--L--N--I--Y--R--G--I--I--N--L--L--Q--L--N--V--K--K-- T--Q-- 148 541

ATGTCTACGAGATGCAAGAGTCTGGAGCTCATGGTGTGTGCAAGACCAACTATGTGATCA 600 149 N--V--Y--E--M--Q--E--S--G--A--H--G--V--C--K--T--N--Y-- V--I-- 168 601

GGGAGGGCCGAACGCATTCATCTGACCAAGACCAAGGACCTGAACCACTGCCAGGAGAAA 660 169 R--E--G--R--T--H--S--S--D--Q--D--Q--G--P--E--P--L--P-- G--E-- 188 661

ATCATGAAGGCCATCGGCTTGGAACACGTAGAGAAATGCCATGATTGTGAAGCTAGAGGA 720 189 N--H--E--G--H--R--L--G--T--R--R--E--M--P--*- 202 SEQ ID Nº 117 COMPRIMENTO: 18 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: sequência de extensão de primer com cauda 5' (FAM) SEQUÊNCIA: 1

TGTAAAACGACGGCCAGT SEQ ID Nº 118 COMPRIMENTO: 18 TIPO: DNA ORGANISMO: sequência artificial OUTRAS INFORMAÇÕES: descrição da sequência artificial: sequência de extensão de primer com cauda 5' (NED) SEQUÊNCIA: 3

TAGGAGTGCAGCAAGCAT

[00195] Na descrição anterior, para fins de explicação, vários detalhes são apresentados a fim de fornecer uma compreensão completa das aplicações. No entanto, será evidente para um especialista na técnica que estes detalhes específicos não são necessários.

[00196] As aplicações acima descritas destinam-se a servir apenas como exemplos. Alterações, modificações e variações podem ser efetuadas nas aplicações específicas por aqueles versados na técnica. O escopo das reivindicações não deve ser limitado pelas aplicações específicas estabelecidas neste documento, mas deve ser interpretado de uma maneira consistente com as especificações como um todo.

Claims (102)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para gerar um peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: reprodução (i) de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea, fértil, hemizigótico e mutado tendo pelo menos uma primeira mutação e uma segunda mutação com (ii) um peixe, crustáceo ou molusco macho, fértil, hemizigótico e mutado tendo pelo menos a primeira e a segunda mutações; e seleção de um progenitor que seja homozigótico por seleção genotípica, e este progenitor homozigótico mutado sendo o peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo, em que a primeira mutação interrompe um ou mais genes que especificam a diferenciação sexual, e em que a segunda mutação interrompe um ou mais genes que especificam a função do gameta.

2. Método para gerar um peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: reprodução (i) de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea, fértil, homozigótico e mutado tendo pelo menos uma primeira mutação e uma segunda mutação com (ii) um peixe, crustáceo ou molusco macho, fértil, homozigótico e mutado tendo pelo menos a primeira e a segunda mutações para produzir peixes, crustáceos ou moluscos estéreis determinados pelo sexo, em que a primeira mutação interrompe um ou mais genes que especificam a diferenciação sexual, em que a segunda mutação interrompe um ou mais genes que especificam a função do gameta, e em que a fertilidade do peixe, crustáceo ou molusco fêmea, homozigótico e fértil e o peixe, crustáceo ou molusco macho, homozigótico, fértil e mutado seja recuperada.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a recuperação da fertilidade compreende o transplante de células-tronco da linhagem germinativa.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a recuperação da fertilidade compreende ainda alteração de esteroides sexuais.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a alteração de esteroides sexuais é uma alteração de estrogênio ou uma alteração de um inibidor de aromatase.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que o transplante de células-tronco da linhagem germinativa compreende as etapas de:

obtenção de uma célula-tronco da linhagem germinativa de um peixe, crustáceo ou molusco macho, homozigótico e estéril com pelo menos a primeira e a segunda mutações ou uma célula-tronco da linhagem germinativa de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea, homozigótico e estéril com pelo menos a primeira e a segunda mutações; e transplante da célula-tronco da linhagem germinativa em um peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas, ou em um peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas são homozigóticos para uma mutação nula do gene semelhante a dnd, Elavl2, vasa, nanos3 ou piwi.

8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas são criados usando manipulação de ploidia.

9. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas são criados por hibridização.

10. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas são criados usando exposição a altos níveis de hormônios sexuais.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que o transplante de células-tronco da linhagem germinativa compreende as etapas de: obtenção de uma célula-tronco espermatogonial de um peixe, crustáceo ou molusco macho, homozigótico e estéril com pelo menos a primeira e a segunda mutações ou uma célula-tronco oogonial de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea, homozigótico e estéril com pelo menos a primeira e a segunda mutações; e transplante da célula-tronco espermatogonial em um testículo de um peixe, crustáceo ou molusco macho fértil sem células germinativas ou da célula-tronco oogonial em um ovário de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea fértil sem células germinativas.

12. Método de acordo com a reivindicação 11,

caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco macho fértil sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea fértil sem células germinativas são homozigóticos para a mutação do gene semelhante a dnd, Elavl2, vasa, nanos3 ou piwi.

13. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas são criados usando manipulação de ploidia.

14. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas são criados por hibridização.

15. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas são criados usando exposição a altos níveis de hormônios sexuais.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo é um peixe, crustáceo ou molusco macho estéril.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a primeira mutação compreende uma mutação em um ou mais genes que modula a síntese de androgênio e/ou estrogênio.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a primeira mutação compreende uma mutação em um ou mais genes que modulam a expressão da aromatase Cyp19a1a, Cyp17 ou uma combinação dos mesmos.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes que modulam a expressão da aromatase Cyp19a1a são um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em cyp19a1a, FoxL2 e um ortólogo dos mesmos.

20. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes que modulam a expressão de Cyp17 são cyp17I ou um ortólogo do mesmo.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a segunda mutação compreende uma mutação em um ou mais genes que modulam a espermiogênese.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a segunda mutação compreende uma mutação em um ou mais genes que causam a globozoospermia.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a segunda mutação em um ou mais genes que causam a globozoospermia causa espermatozoides com cabeça redonda, núcleo redondo, peça intermediária desorganizada, caudas parcialmente enroladas ou uma combinação dos mesmos.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a segunda mutação compreende uma mutação em um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em Gopc, Hiat1, Tjp1a, Smap2, Csnk2a2 e um ortólogo dos mesmos.

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo é um peixe, crustáceo ou molusco fêmea estéril.

26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 e 25, caracterizado pelo fato de que a primeira mutação compreende uma mutação em um ou mais genes que modulam a expressão de um inibidor da aromatase Cyp19a1a.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes que modulam a expressão de um inibidor da aromatase Cyp19a1a são um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em Gsdf, dmrt1, Amh, Amhr e um ortólogo dos mesmos.

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 e de 25 a 27, caracterizado pelo fato de que a segunda mutação compreende uma mutação em um ou mais genes que modulam a oogênese, foliculogênese ou uma combinação.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes que modulam a oogênese modulam a síntese de estrogênio.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes que modulam a síntese de estrogênio são FSHR ou um ortólogo do mesmo.

31. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes que modulam a foliculogênese modulam a expressão de vitelogeninas.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes que modulam a expressão de vitelogeninas são vtgs ou um ortólogo dos mesmos.

33. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes que modulam a expressão de vitelogeninas são uma mutação em um gene que codifica ou regula: Vitelogenina; Receptor1 de estrogênio; Citocromo p450, família 1, subfamília a; glicoproteína da zona pelúcida; Coriogenina H; Receptor ativado por proliferador de peroxissoma; Proteína reguladora aguda da esteroidogênese, ou um ortólogo dos mesmos.

34. Método para gerar um peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: reprodução (i) de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea fértil com uma mutação homozigótica com (ii) um peixe, crustáceo ou molusco macho fértil com uma mutação homozigótica para produzir peixes, crustáceos ou moluscos estéreis determinados pelo sexo, em que a mutação interrompe direta ou indiretamente a espermiogênese e/ou interrompe diretamente a vitelogênese, e em que a fertilidade do peixe, crustáceo ou molusco fêmea fértil e o peixe, crustáceo ou molusco macho fértil seja recuperada.

35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a mutação que interrompe direta ou indiretamente a espermiogênese é uma mutação em Gopc, Hiat1, Tjp1a, Smap2, Csnk2a2 ou um ortólogo da mesma.

36. Método de acordo com a reivindicação 34 ou 35, caracterizado pelo fato de que a mutação que interrompe diretamente a vitelogênese é uma mutação em um gene que codifica ou regula: Vitelogenina; Receptor1 de estrogênio; Citocromo p450, família 1, subfamília a; glicoproteína da zona pelúcida; Coriogenina H; Receptor ativado por proliferador de peroxissoma; Proteína reguladora aguda da esteroidogênese, ou um ortólogo dos mesmos.

37. Método de acordo com a reivindicação 34, 35 ou 36, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco fêmea fértil e o peixe, crustáceo ou molusco macho fértil têm uma pluralidade de mutações homozigóticas que, em combinação: interrompem direta ou indiretamente a espermiogênese; interrompem diretamente a vitelogênese; ou ambos.

38. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 37, caracterizado pelo fato de que a recuperação da fertilidade compreende o transplante de células-tronco da linhagem germinativa.

39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que a recuperação da fertilidade compreende ainda alteração de esteroides sexuais.

40. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a alteração de esteroides sexuais é uma alteração de estrogênio ou uma alteração de um inibidor de aromatase.

41. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 40, caracterizado pelo fato de que o transplante de células-tronco da linhagem germinativa compreende as etapas de: obtenção de uma célula-tronco da linhagem germinativa de um peixe, crustáceo ou molusco macho, homozigótico e estéril com pelo menos a mutação homozigótica ou uma célula-tronco da linhagem germinativa de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea, homozigótico e estéril com pelo menos a mutação homozigótica; e transplante da célula-tronco da linhagem germinativa em um peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas, ou em um peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas.

42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas são homozigóticos para uma mutação nula do gene semelhante a dnd, Elavl2, vasa, nanos3 ou piwi.

43. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas são criados usando manipulação de ploidia.

44. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas são criados por hibridização.

45. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas são criados usando exposição a altos níveis de hormônios sexuais.

46. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 45, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco fêmea fértil e o peixe, crustáceo ou molusco macho fértil têm uma mutação homozigótica adicional que especifica a diferenciação sexual.

47. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que a mutação que especifica a diferenciação sexual modula a expressão da aromatase Cyp19a1a, Cyp17, um inibidor da aromatase Cyp19a1a ou uma combinação dos mesmos.

48. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que a mutação que modula a expressão de Cyp17 é uma mutação em cyp17I ou um ortólogo da mesma.

49. Método de acordo com a reivindicação 47 ou 48, caracterizado pelo fato de que a mutação que modula a expressão do inibidor da aromatase Cyp19a1a é uma mutação em Gsdf, dmrt1, Amh, Amhr ou um ortólogo da mesma.

50. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 45, caracterizado pelo fato de que a etapa de reprodução compreende hibridização ou manipulação hormonal e estratégias de reprodução para especificar a diferenciação sexual.

51. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 50, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco é um peixe.

52. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado para produzir um peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo, onde o peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado tem pelo menos uma primeira mutação e uma segunda mutação, caracterizado pelo fato de que a primeira mutação interrompe um ou mais genes que especificam a diferenciação sexual, que a segunda mutação interrompe um ou mais genes que especificam a função do gameta e que a fertilidade do peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado foi recuperada.

53. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que a recuperação da fertilidade compreende o transplante de células-tronco da linhagem germinativa.

54. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a recuperação da fertilidade compreende ainda alteração de esteroides sexuais.

55. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que a alteração de esteroides sexuais é uma alteração de estrogênio ou uma alteração de um inibidor da aromatase.

56. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 55, caracterizado pelo fato de que o transplante de células-tronco da linhagem germinativa compreende as etapas de: obtenção de uma célula-tronco da linhagem germinativa de um peixe, crustáceo ou molusco macho, homozigótico e estéril com pelo menos a primeira e a segunda mutações ou uma célula-tronco da linhagem germinativa de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea, homozigótico e estéril com pelo menos a primeira e a segunda mutações; e transplante da célula-tronco da linhagem germinativa em um peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas, ou em um peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas.

57. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas são homozigóticos para uma mutação nula do gene semelhante a dnd, Elavl2, vasa, nanos3 ou piwi.

58. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas são criados usando manipulação de ploidia.

59. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas são criados por hibridização.

60. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas são criados usando exposição a altos níveis de hormônios sexuais.

61. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 55, caracterizado pelo fato de que o transplante de células-tronco da linhagem germinativa compreende as etapas de: obtenção de uma célula-tronco espermatogonial de um peixe, crustáceo ou molusco macho, homozigótico e estéril com pelo menos a primeira e a segunda mutações ou uma célula-tronco oogonial de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea, homozigótico e estéril com pelo menos a primeira e a segunda mutações; e transplante da célula-tronco espermatogonial em um testículo de um peixe, crustáceo ou molusco macho fértil sem células germinativas ou da célula-tronco oogonial em um ovário de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea fértil sem células germinativas.

62. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco macho fértil sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea fértil sem células germinativas são homozigóticos para a mutação do gene semelhante a dnd, Elavl2, vasa, nanos3 ou piwi.

63. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas são criados usando manipulação de ploidia.

64. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas são criados por hibridização.

65. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas são criados usando exposição a altos níveis de hormônios sexuais.

66. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 a 65, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo é um peixe, crustáceo ou molusco macho estéril.

67. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 a 66, caracterizado pelo fato de que a primeira mutação compreende uma mutação em um ou mais genes que modula a síntese de androgênio e/ou estrogênio.

68. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que a primeira mutação compreende uma mutação em um ou mais genes que modulam a expressão da aromatase Cyp19a1a, Cyp17 ou uma combinação dos mesmos.

69. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes que modulam a expressão da aromatase Cyp19a1a são um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em cyp19a1a, FoxL2 e um ortólogo dos mesmos.

70. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes que modulam a expressão de Cyp17 são cyp17I ou um ortólogo do mesmo.

71. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 a 70, caracterizado pelo fato de que a segunda mutação compreende uma mutação em um ou mais genes que modulam a espermiogênese.

72. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que a segunda mutação compreende uma mutação em um ou mais genes que causam a globozoospermia.

73. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que a segunda mutação em um ou mais genes que causam a globozoospermia causa espermatozoides com cabeça redonda, núcleo redondo, peça intermediária desorganizada, caudas parcialmente enroladas ou uma combinação dos mesmos.

74. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que a segunda mutação compreende uma mutação em um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em Gopc, Hiat1, Tjp1a, Smap2, Csnk2a2 e um ortólogo dos mesmos.

75. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 a 65, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo é um peixe, crustáceo ou molusco fêmea estéril.

76. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 a 65 e 75, caracterizado pelo fato de que a primeira mutação compreende uma mutação em um ou mais genes que modulam a expressão de um inibidor da aromatase Cyp19a1a.

77. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes que modulam a expressão de um inibidor da aromatase Cyp19a1a são um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em Gsdf, dmrt1, Amh, Amhr e um ortólogo dos mesmos.

78. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 a 65 e de 75 a 77, caracterizado pelo fato de que a segunda mutação compreende uma mutação em um ou mais genes que modulam a oogênese, foliculogênese ou uma combinação.

79. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes que modulam a oogênese modulam a síntese de estrogênio.

80. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes que modulam a síntese de estrogênio são FSHR ou um ortólogo do mesmo.

81. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes que modulam a foliculogênese modulam a expressão de vitelogeninas.

82. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes que modulam a expressão de vitelogeninas são vtgs ou um ortólogo do mesmo.

83. Peixe, crustáceo ou molusco homozigótico, fértil e mutado de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes que modulam a expressão de vitelogeninas são uma mutação em um gene que codifica ou regula: Vitelogenina; Receptor1 de estrogênio; Citocromo p450, família 1, subfamília a; glicoproteína da zona pelúcida; Coriogenina H; Receptor ativado por proliferador de peroxissoma; Proteína reguladora aguda da esteroidogênese, ou um ortólogo dos mesmos.

84. Peixe, crustáceo ou molusco fértil com uma mutação homozigótica para produzir um peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo, caracterizado pelo fato de que a mutação interrompe direta ou indiretamente a espermiogênese e/ou interrompe diretamente a vitelogênese, e que a fertilidade do peixe, crustáceo ou molusco fértil foi recuperada.

85. Peixe, crustáceo ou molusco fértil de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que a mutação que interrompe direta ou indiretamente a espermiogênese é uma mutação em Gopc, Hiat1, Tjp1a, Smap2, Csnk2a2 ou um ortólogo da mesma.

86. Peixe, crustáceo ou molusco fértil de acordo com a reivindicação 84 ou 85, caracterizado pelo fato de que a mutação que interrompe diretamente a vitelogênese é uma mutação em um gene que codifica ou regula: Vitelogenina; Receptor1 de estrogênio; Citocromo p450, família 1, subfamília a; glicoproteína da zona pelúcida; Coriogenina H; Receptor ativado por proliferador de peroxissoma; Proteína reguladora aguda da esteroidogênese, ou um ortólogo dos mesmos.

87. Peixe, crustáceo ou molusco fértil de acordo com a reivindicação 84, 85 ou 86, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco fértil tem uma pluralidade de mutações homozigóticas que, em combinação: interrompem direta ou indiretamente a espermiogênese; interrompem diretamente a vitelogênese; ou ambos.

88. Peixe, crustáceo ou molusco fértil de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a 87, caracterizado pelo fato de que a recuperação da fertilidade compreende o transplante de células-tronco da linhagem germinativa.

89. Peixe, crustáceo ou molusco fértil de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de que a recuperação da fertilidade compreende ainda alteração de esteroides sexuais.

90. Peixe, crustáceo ou molusco fértil de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que a alteração de esteroides sexuais é uma alteração de estrogênio ou uma alteração de um inibidor da aromatase.

91. Peixe, crustáceo ou molusco fértil de acordo com qualquer uma das reivindicações 88 a 90, caracterizado pelo fato de que o transplante de células-tronco da linhagem germinativa compreende as etapas de: obtenção de uma célula-tronco da linhagem germinativa de um peixe, crustáceo ou molusco macho, homozigótico e estéril com pelo menos a mutação homozigótica ou uma célula-tronco da linhagem germinativa de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea, homozigótico e estéril com pelo menos a mutação homozigótica; e transplante da célula-tronco da linhagem germinativa em um peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas, ou em um peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas.

92. Peixe, crustáceo ou molusco fértil de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas são homozigóticos para uma mutação nula do gene semelhante a dnd, Elavl2, vasa, nanos3 ou piwi.

93. Peixe, crustáceo ou molusco fértil de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas são criados usando manipulação de ploidia.

94. Peixe, crustáceo ou molusco fértil de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas são criados por hibridização.

95. Peixe, crustáceo ou molusco fértil de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco macho receptor sem células germinativas e o peixe, crustáceo ou molusco fêmea receptor sem células germinativas são criados usando exposição a altos níveis de hormônios sexuais.

96. Peixe, crustáceo ou molusco fértil de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a 95, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco fértil tem uma mutação homozigótica adicional que especifica a diferenciação sexual.

97. Peixe, crustáceo ou molusco fértil de acordo com a reivindicação 96, caracterizado pelo fato de que a mutação que especifica a diferenciação sexual modula a expressão da aromatase Cyp19a1a, Cyp17, um inibidor da aromatase Cyp19a1a ou uma combinação dos mesmos.

98. Peixe, crustáceo ou molusco fértil de acordo com a reivindicação 97, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes que modulam a expressão da aromatase Cyp19a1a são um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em cyp19a1a, FoxL2 e um ortólogo dos mesmos.

99. Peixe, crustáceo ou molusco fértil de acordo com a reivindicação 97, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes que modulam a expressão de um inibidor da aromatase Cyp19a1a são um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em Gsdf, dmrt1, Amh, Amhr e um ortólogo dos mesmos.

100. Peixe, crustáceo ou molusco fértil de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a 95, caracterizado pelo fato de que a produção de um peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo compreende uma etapa de reprodução consistindo de hibridização ou manipulação hormonal e estratégias de reprodução para especificar a diferenciação sexual.

101. Peixe, crustáceo ou molusco fértil de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 a 100, caracterizado pelo fato de que o peixe, crustáceo ou molusco fértil é um peixe.

102. Método para fazer um peixe, crustáceo ou molusco fértil, homozigótico e mutado que gera um peixe, crustáceo ou molusco estéril determinado pelo sexo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: reprodução (i) de um peixe, crustáceo ou molusco fêmea, fértil, hemizigótico e mutado tendo pelo menos uma primeira mutação e uma segunda mutação com (ii) um peixe, crustáceo ou molusco macho, fértil, hemizigótico e mutado tendo pelo menos a primeira e a segunda mutações; seleção de um progenitor que é homozigótico por seleção genotípica; e recuperação da fertilidade do progenitor homozigótico,

em que a primeira mutação interrompe um ou mais genes que especificam a diferenciação sexual, e em que a segunda mutação interrompe um ou mais genes que especificam a função do gameta.