CN114015688B - 一种用于干扰三疣梭子蟹性别决定基因表达的RNAi试剂及其RNAi方法和应用 - Google Patents
一种用于干扰三疣梭子蟹性别决定基因表达的RNAi试剂及其RNAi方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于干扰三疣梭子蟹性别决定基因表达的RNAi试剂及其RNAi方法和应用。所述RNAi试剂中包含形成一个双链区的一条有义链和一条反义链；所述有义链的序列如SEQ ID No.2所示，所述反义链的序列如SEQ ID No.3所示。本发明利用所述的RNAi试剂能够高效敲降Dmrt基因在三疣梭子蟹早期发育时期的表达，且对三疣梭子蟹的损害较小，进而能够应用于三疣梭子蟹性别决定机制解析和性别控制技术研究，该方法操作简单，有助于梭子蟹单性养殖技术的突破，因此，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因干扰技术领域，具体涉及一种用于干扰三疣梭子蟹性别决定基因表达的RNAi试剂及其RNAi方法和应用。
背景技术
甲壳动物大多数具有性别二态性，具有雌雄差异，实现单性养殖能够显著提高经济效益，目前，十足目经济甲壳动物仅在罗氏沼虾中通过在幼体时期敲降性别决定关键的基因的表达而实现。
三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）属甲壳纲、十足目、梭子蟹科，俗称梭子蟹，是我国重要的大型海洋经济蟹类。研究表明，Dmrt基因是三疣梭子蟹重要的性别决定基因，然而目前尚未有就三疣梭子蟹Dmrt基因的敲降方法。
RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已经被广泛应用于探索基因功能和疾病等领域。但是由于RNAi多数采用注射等方法，对个体有一定程度的损害且对个体大小也有一定的要求，因此并不适用于水产幼体。
发明内容
本发明提供了一种用于干扰三疣梭子蟹性别决定基因表达的RNAi试剂及其RNAi方法和应用。所述RNAi试剂能够高效敲降三疣梭子蟹性别决定关键Dmrt基因的表达，且使用方法简单。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种用于干扰三疣梭子蟹性别决定基因表达的RNAi试剂，所述RNAi试剂中包含形成一个双链区的一条有义链和一条反义链；所述有义链的序列如SEQ IDNo.2所示，或者与所述有义链序列中相差1个核苷酸的含有21个连续核苷酸的核苷酸序列。
进一步的，所述反义链的序列如SEQ ID No.3所示，或者与所述有义链序列至少90%互补的含有21个连续核苷酸的核苷酸序列。
进一步的，所述RNAi试剂中包含一条有义链和一条反义链，序列如下：
有义链：GCGCAUCCAUACUAACAAATT（SEQ ID No.2）；
反义链：UUUGUUAGUAUGGAUGCGCTT（SEQ ID No.3）。
进一步的，所述三疣梭子蟹性别决定基因为核苷酸序列如SEQ ID No .1所示的Dmrt基因。
本发明还提供了一种利用所述的RNAi试剂敲降三疣梭子蟹性别决定基因表达的RNAi方法，所述RNAi方法包括以下步骤：
（1）将RNAi试剂进行稀释；
（2）利用稀释后的RNAi试剂浸泡轮虫2 h ~3h；
（3）利用浸泡后的轮虫投喂三疣梭子蟹，每天投喂三次，连续投喂24h-72h；
（4）提取三疣梭子蟹的RNA并反转录为cDNA，对cDNA进行实时荧光定量检测其敲降效果。
进一步的，所述步骤（1）中RNAi试剂利用DEPC水进行稀释，稀释浓度为3μg/ml~4μg/ml。
进一步的，所述步骤（3）中轮虫的投喂量与三疣梭子蟹养殖用水的体积比为1:3000-5000。
进一步的，所述步骤（4）中实时荧光定量检测的引物序列如SEQ ID No .4和SEQID No .5所示。
进一步的，所述步骤（4）中实时荧光定量检测的扩增条件：预变性95℃ 30s；变性95℃ 5s，退火60℃ 34s，共重复40个循环。
进一步的：所述三疣梭子蟹为三疣梭子蟹幼体。
本发明还提供了所述的RNAi试剂在用于制备控制三疣梭子蟹性别的制剂中的应用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
1、本发明设计得到的三疣梭子蟹性别决定关键基因RNAi试剂能够高效敲降三疣梭子蟹性别决定关键基因Dmrt基因，有效降低Dmrt基因在三疣梭子蟹早期发育时期的表达，进而能够用于三疣梭子蟹早期蟹苗的性别干扰，有利于突破梭子蟹单性养殖技术。
2、利用本发明提供的RNAi试剂进行基因干扰，方法准确可靠、操作简单，辅助三疣梭子幼蟹早期实现基因干扰，提高三疣梭子幼蟹的基因干扰成功率，并且利用投喂的方法来进行RNAi步骤，不需要特殊的试剂和仪器，对三疣梭子蟹的损害较小，因此具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明中RNAi方法检测的qPCR结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
实施例1
一、RNAi试剂的制备
将序列如SEQ ID No.1所示的Dmrt基因序列发至生工生物工程（上海）股份有限公司，进行引物设计以及制备成RNAi试剂，该RNAi试剂中包含形成一个双链区的一条有义链（Sense）和一条反义链（Antisense），序列如下：
Sense：GCGCAUCCAUACUAACAAATT（SEQ ID No.2）；
Antisense：UUUGUUAGUAUGGAUGCGCTT（SEQ ID No.3）。
二、RNAi试剂浸泡轮虫
将制备的RNAi试剂用DEPC水进行稀释，稀释至浓度为3.3 μg/ml后，浸泡轮虫2-3h，准备投喂。
三、三疣梭子蟹的投喂
本发明所用的三疣梭子蟹均来自中国水产科学研究院黄海水产研究所昌邑海丰水产有限公司实验基地。将母蟹放置于养殖池（500cm×300cm×150cm）中暂养至卵孵化成幼体，暂养期间水温保持在25±1℃，加水至130 cm，pH 8.2±0.5，持续供氧；晚上每隔1h观察一次是否孵化，孵化后将幼体养殖于养殖池内。
每天按时给三疣梭子蟹幼体投喂经RNAi试剂浸泡后的轮虫。每天分别于早中晚投喂三次，每次投喂2ml浸泡后的轮虫至10L水中，达到饱食投喂。根据投喂时间的不同（投喂后12h、24h、36h、48h、60h、72h共6个时间点）对三疣梭子蟹幼体进行取样，取样后保存于冻存管中，放于液氮保存以备进行qPCR检测。
四、RNAi干扰效果验证
采用实时荧光定量的方法对RNAi干扰效果进行验证：
（1）根据Dmrt基因序列设计引物，产物大小控制在100-150 bp，引物退火温度控制在60℃左右；设计的检测引物及其序列如下：
Qd1-F：CCTAAAGCACCGTGTCACTGTT（SEQ ID No.4）；
Qd1-R：ATCACCAAGAAAGCCAGCCCGT（SEQ ID No.5）。
（2）利用设计好的引物，并以提取的三疣梭子蟹幼体材料为模板进行qPCR扩增；
（3）对qPCR结果进行统计分析。
具体的操作步骤如下：
将上述投喂浸泡RNAi试剂的轮虫组的三疣梭子蟹为实验组（G），同时设置空白组（K），该组三疣梭子蟹没有经过特殊处理；以及对照组（NC），该组三疣梭子蟹投喂等量的浸泡无意义干扰链的轮虫，三组三疣梭子蟹饲养环境和饲养方法完全相同。
分别提取上述三组三疣梭子蟹幼体的RNA，并反转录成cDNA作为模板，以Qd1-F和Qd1-R为扩增引物，以Actin引物（Actin-F：CGAAACCTTCAACACTCCCG；Actin-R：GGGACAGTGTGTGAAACGCC）作为内参，进行目的基因qPCR扩增。
PCR体系为：模板 1μl，正向引物（10 μM）0.4 μl，反向引物（10μM）0.4 μl，TBGreen Premix Ex Taq Ⅱ 5 μl，Rox Reference Dye 0.2 μl，ddH2O 3 μl。
按照上述体系加入样品后，再按照如下的反应条件进行qPCR扩增：预变性95℃30s；变性95℃ 5s，退火60℃ 34s，共重复40个循环。
对扩增的表达量进行分析，结果如图1所示，在12h、24h、36h、48h、60h、72h共6个时间点进行检测后发现，Dmrt基因在48h的表达量最低，说明RNAi试剂在48h的干扰效果最为明显，且能降低约90%的Dmrt基因表达，说明本发明的RNAi试剂对三疣梭子蟹性别决定关键Dmrt基因的干扰效果很好，能够高效敲降Dmrt基因的表达，有利于三疣梭子蟹的单性养殖。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所
<120> 一种用于干扰三疣梭子蟹性别决定基因表达的RNAi试剂及其RNAi方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2484
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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caacattgat tacctactgt cctccctaat ctacctacct ggtccagcgg aagaatcgat 1260
gcttgtaaag ggatgcagct atttccacgt gccaaattcc gcacacagtc ttcatctgct 1320
tgcaggaaac tggtaacgcg ataaattgcc ttgcgttcaa actatgtaac gctacatatg 1380
attgaatatg ttttgacaag gtttgtagag taatccttgc aatgtttaga taaagaaaca 1440
acataatcag atatataaat gttgactgaa aatgctcagt tagtaagaat acaatgataa 1500
cgtctaccta cgaataaccc tcgctaatcg gatttttcct catagagaca accactctta 1560
taataagtaa acaataggtc tttaaagaga taaaactaaa aaaaaaaaaa atatatcaac 1620
cgggatgcta ccttcaggaa tttatgctga ttagatgatc gttcattcta tgagctaaag 1680
ccaaattgaa tttcttgatg tcagatatcc aatttgaaaa tagaacagca ccccttaccc 1740
agcgagcaac tgtgtgggtt aatgtttgtg tcggggtgtg caggattaca attatctatt 1800
gcaatggagc gaggcgccag ttaagcgacc acctgcatta catagatttg atataaatct 1860
tattcacaac aattacttaa acaatagtgg cagccacgtg cgcatccata ctaacaaaga 1920
tgattattat atgccacacc gagggtcttc tctgagactg aagtattatt tttaccagtg 1980
attaattctc ataactacta aatcttaaag tgtccaagac gcatgtaaga tgccgtacat 2040
ttagcagctg acaccactta ccgctggact agggaaggca tacaggctgt gaaaagtggc 2100
actaggatta tactccattc gccgatatcc aatataacaa caataataat aataataata 2160
ataataataa taataataat aataataatg ataataataa taataataat aataataata 2220
ataatgataa taataataat aataataata acaataataa caatgatgat gatactacta 2280
ctatgttagc atgtccttta ttttcccata ctccttttct gtctgacgtc acgtctttcc 2340
cctcagtcct cgctcgctgc cgcccgaggt tgacacgtac gcctcctgcc tcttgtttgc 2400
tcggtttaca cttgttgtgt agtgtgctac cgtaaataca ctttcataat accaaaaaaa 2460
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2484
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgcauccau acuaacaaat t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
uuuguuagua uggaugcgct t 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctaaagcac cgtgtcactg tt 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atcaccaaga aagccagccc gt 22
Claims (9)
1.一种用于干扰三疣梭子蟹性别决定基因表达的RNAi试剂，其特征在于，所述RNAi试剂中包含形成一个双链区的一条有义链和一条反义链；所述有义链的序列如SEQ ID No.2所示；所述反义链的序列如SEQ ID No.3所示。
2.根据权利要求1所述的RNAi试剂，其特征在于，所述三疣梭子蟹性别决定基因为核苷酸序列如SEQ ID No .1所示的Dmrt基因。
3.一种利用权利要求1所述的RNAi试剂敲降三疣梭子蟹性别决定基因表达的RNAi方法，其特征在于，所述RNAi方法包括以下步骤：
（1）将RNAi试剂进行稀释；
（2）利用稀释后的RNAi试剂浸泡轮虫；
（3）利用浸泡后的轮虫投喂三疣梭子蟹，每天投喂三次，连续投喂24h-72h；
（4）提取三疣梭子蟹的RNA，并反转录为cDNA，对cDNA进行实时荧光定量检测其敲降效果。
4.根据权利要求3所述的RNAi方法，其特征在于，所述步骤（1）中RNAi试剂利用DEPC水进行稀释，稀释浓度为3μg/ml~4μg/ml。
5.根据权利要求3所述的RNAi方法，其特征在于，所述步骤（3）中轮虫的投喂量与三疣梭子蟹养殖用水的体积比为1:3000-5000。
6.根据权利要求3所述的RNAi方法，其特征在于，所述步骤（4）中实时荧光定量检测的引物序列如SEQ ID No .4和SEQ ID No .5所示。
7.根据权利要求3所述的RNAi方法，其特征在于，所述步骤（4）中实时荧光定量检测的扩增条件：预变性95℃ 30s；变性95℃ 5s，退火60℃ 34s，共重复40个循环。
8.根据权利要求3所述的RNAi方法，其特征在于，所述三疣梭子蟹为三疣梭子蟹幼体。
9.权利要求1所述的RNAi试剂在用于制备控制三疣梭子蟹性别的制剂中的应用。
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-
2021
- 2021-10-22 CN CN202111234458.XA patent/CN114015688B/zh active Active
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