CN103261423A - 使用小干扰性RNA（siRNA）用于植物中线虫控制的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种包括反义链和有义链的双链RNA分子，其中该反义链的核苷酸序列与大豆囊胞线虫Hg-rps-23基因的核苷酸序列的一部分互补，编码该RNA分子的核酸分子和包括本发明核酸分子和RNA分子的组合物，以及使用它们增强植物或植物细胞对线虫侵染和感染的抗性的方法。

Description

使用小干扰性RNA(siRNA)用于植物中线虫控制的方法和组合物

优先权声明

本申请在35U.S.C.§119(e)下要求于2010年12月9日提交的美国临时申请系列号61/421,275的权益，其全部内容通过引用结合在此。

发明领域

本发明涉及使用小干扰性RNA（siRNA）控制植物中的线虫寄生。

发明背景

植物寄生体（有害生物和病原体）每年造成全球数十亿美元的作物损失。线虫，具体地大豆囊胞线虫（SCN）是大豆的头号病原体。

线虫是专性定栖的体内寄生体，其以超过2,000种植物的根、叶以及茎，果实，以及观赏植物为食，造成全球大约1千亿美元的作物损失。

线虫存在于美国各地，但是在南部以及西部的温暖潮湿地区以及在沙壤土中是一个主要的问题。1954年在北卡罗来纳州首次发现了大豆胞囊线虫（SCN，Heterodera glycines）。它是大豆植物最严重的有害生物。一旦SCN存在于大田里，不能使用已知方法可行地根除之。尽管大豆是受SCN攻击的主要经济作物，然而SCN还寄生于总计约50种宿主中，包括大田作物、蔬菜、观赏植物及杂草。

线虫损害的迹象包括叶发育不良以及黄化，以及在炎热时节植物的萎蔫。然而，线虫（包括SCN）可以造成严重的产量损失，同时没有明显的地上症状。植物中的感染SCN可以1)导致矮化根或发育不良的根，2)减少根上的固氮根瘤的数目，并且3)使根更易受其他土源性植物病原体攻击。

SCN具有由卵期、四个幼虫期以及成虫期组成的生命周期。在卵内部第一次蜕皮之后，SCN二龄幼虫（J2）孵化，移动穿过土壤，穿透根并向维管柱移动。J2是线虫可以感染大豆根的唯一生命阶段。移动的幼虫选择皮层、内皮层或中柱鞘内的宿主细胞并且引起宿主细胞融合作为形成永久采食部位（称作合胞体）的一部分。在此时，线虫变为定栖并且分化成三龄幼虫（J3）以及四龄幼虫（J4）并且然后成熟为雌性或雄性成虫。因此活跃采食的线虫从植物窃取必需营养，导致产量损失。随着线虫采食，它们膨大并且最终雌性线虫变得如此之大以至于它们突破根组织并暴露于根的表面上。

雄性线虫（它们作为成虫不膨大）经历变态以便在J4阶段恢复蠕虫状形态并且从根迁移返回以使雌性成虫受精。雄性随后死亡，而雌性线虫仍附着于根系并继续采食。受精之后，雌性产卵，多数卵仍留在体内。死亡之后，雌性躯体发育为一种包裹这些卵的硬化胞囊。胞囊最终释放并游离存在于土壤中。胞囊的外壁变得十分坚韧，从而为其中含有的200-400个卵提供保护。SCN卵在胞囊内存活直至出现适当的孵化条件。尽管这些卵中有许多可以在第一年之内孵化，但是有许多将在这些胞囊中存活数年。

用于管理SCN的常规实践包括：在SCN侵染的土地中维持适当的肥力以及土壤pH水平；控制其他植物疾病连同昆虫与杂草有害生物；使用卫生实践，例如仅在耕种未侵染的田地后才翻耕、播种和中耕SCN侵染的田地；在受侵染的田地耕作之后彻底清洁设备；不使用来自侵染土地上生长的植物的种子播种未侵染的田地，除非该种子已经经过适当清洁；轮转侵染的田地并且用非宿主作物（例如玉米、燕麦和苜蓿）轮换宿主作物；使用杀有害生物剂或熏蒸剂（例如杀线虫剂）；以及种植抗性大豆品种。虽然这些实践中许多可能是有效的，但是除了实施费时并且代价昂贵之外，这些方法中有一些不再可行，例如施加杀线虫剂，原因在于它们的毒性和负面环境影响。如此，目前没有高效和有效的方法来控制植物中的线虫感染。因此，需要用于预防、控制以及减少植物中线虫寄生的组合物和方法。

因此，本发明通过提供用于控制植物中线虫侵染、感染和疾病的包括小干扰性RNA的组合物和方法克服本领域中的这些缺陷。

发明概述

本发明提供一种包括反义链和有义链的双链RNA分子，其中该反义链的核苷酸序列与大豆囊胞线虫Hg-rps-23基因的核苷酸序列的一部分互补，该部分基本上由SEQ ID号:931的约18至约25个连续核苷酸（Hg-rps-23的481nt序列）组成；其中该双链RNA分子抑制Hg-rps-23基因的表达。

此外，本发明提供一种嵌合核酸分子，包括与植物微RNA前体分子操作地相关的具有SEQ ID号:464-926中任一个的核苷酸序列的反义链。

在此还提供一种人工植物微RNA前体分子，包括具有SEQ ID号:464-926中任一个的核苷酸序列的反义链。

此外，本发明提供一种组合物，包括本发明的两种或更多种RNA分子，其中这两种或更多种RNA分子各自包括不同的反义链。

也提供一种组合物，包括本发明的两种或更多种嵌合核酸分子，其中这两种或更多种嵌合核酸分子各自包括不同的反义链，以及一种组合物，包括本发明的两种或更多种人工植物微RNA前体分子，其中这两种或更多种人工植物微RNA前体分子各自包括不同的反义链。

本发明也提供一种转化植物细胞，包括本发明的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物，其中与对照植物细胞相比，这一转化植物细胞具有对大豆囊胞线虫感染的增强的抗性。

此外，本发明提供一种转基因植物，包括本发明的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物，其中与对照植物相比，该转基因植物具有对大豆囊胞线虫感染的增强的抗性。

进一步构思，可以在各种方法中使用本发明的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物。因此，本发明额外地提供一种增强植物细胞对线虫感染的抗性的方法，该方法包括向这种植物细胞导入本发明的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物，因此增强这种植物细胞对这种线虫感染的抗性。

在此还提供一种用于控制线虫对植物细胞感染的方法，该方法包括使感染这种植物细胞的线虫与任何本发明的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物接触，因此控制线虫对这种植物细胞的感染。

额外的实施例包括一种增强植物对线虫感染的抗性的方法，该方法包括向这种植物的细胞导入本发明的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物，因此增强这种植物对这种线虫感染的抗性。

本发明也提供一种用于控制线虫对植物感染的方法，该方法包括使感染这种植物的线虫与本发明的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物接触，因此控制线虫对这种植物的感染。

本发明的其他方面包括一种减少受线虫感染的植物的根上线虫囊胞发育的方法，该方法包括向这种植物的细胞导入本发明的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物，因此减少这种植物的根上的线虫囊胞发育。

额外地，在此提供一种产生具有对线虫感染的增强的抗性的转化植物细胞的方法，该方法包括向这种植物细胞导入本发明的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物，因此产生相对于对照植物细胞具有对线虫感染的增强的抗性的转化植物细胞。

此外，本发明提供一种产生具有对线虫感染的增强的抗性的转转基因植物的方法，该方法包括将该植物的细胞用本发明的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物转化，因此产生相对于对照植物具有对线虫感染的增强的抗性的转基因植物。

额外的实施例包括产生具有对线虫感染的增强的抗性的转基因植物的方法，该方法包括包括：a)将植物细胞用本发明的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物转化以产生转化植物细胞；和b)使这种转化植物细胞生长成转基因植物，由此转基因植物相对于对照植物具有对线虫感染的增强的抗性。

仍在另外的实施例中，本发明提供一种作物，包括在农田中栽种在一起的多株根据相应前述权利要求中任一项所述的转基因植物，以及一种改进作物产量的方法，该方法包括：a)将本发明的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物导入植物的细胞中；和b)将(a)的多株植物培育为作物，产生具有对线虫感染的增强的抗性的多株植物，因此改进作物产量。

本发明的这些以及其他方面将在本发明的以下描述中更详细地说明。

附图简要说明

图1.每种处理后J2的照片。

图2.在大豆上的RNAi浸泡和繁殖测定法（误差线=标准误）。

图3.植物内shRNA对SCN发育的影响（误差线=标准误）。

图4.amiR-rps23须根-SCN测定法（n=事件；误差线=标准误）。

图5.检测si-rps23-1小RNA的RNA印迹物。Si-rps23-1（箭头）在须根样品中产生（泳道3、4、5）。泳道2=阴性对照根。泳道1=分子标记。

图6A-图6E.sh-rps23-1对转基因完整植株中SCN胞囊形成的影响。与无效亦或杂合植株相比，相同事件的纯合植株的平均胞囊减少。A.事件SYNR092608A003A；B.事件SYNR093000A003A；C.事件SYNR093002A002A；D.事件SYNR093008A004A；E.SYNR093000A007A。

本发明的详细说明

本说明不意在是一个可以实施本发明的全部不同方式或可以添加至本发明的全部特征的详细目录。例如，关于一个实施例所说明的特征可以结合入其他实施例中，并且关于一个特别实施例所说明的特征可以从那个实施例删除。此外，鉴于本披露，本领域普通技术人员将显而易见针对在此提出的不同实施例的多个变体和附加，它们不偏离本发明。因此，以下描述意在说明本发明的一些具体实施例，并且并不意在排他地叙述它们的全部排列、组合或变体。

除非另外限定，否则在此所用的全部技术术语和科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在此本发明的说明中所用的术语仅用于描述具体实施例的目的，并且不意在限制本发明。在此提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其全文结合在此

本发明基于出人意料的发现：小干扰性RNA可以用来控制植物中的线虫侵染并且赋予植物对线虫侵染和/或感染的增强的抗性。因此，在一个方面，本发明提供一种包括反义链和有义链的双链RNA分子，其中该反义链的核苷酸序列与大豆囊胞线虫Hg-rps-23基因的核苷酸序列的一部分互补，该部分基本上由SEQ ID号:931的约18至约25个连续核苷酸组成；其中该双链RNA分子抑制Hg-rps-23基因的表达。这种双链RNA分子可以包括约18至约25个（例如，18，19、20、21、22、23、24或25个）核苷酸、基本上由其组成或由其组成。可以在3'末端、5'末端或3'和5'末端二者处添加额外的核苷酸，以促进RNA分子的操作但是不实质地影响双链RNA分子在RNA干扰（RNAi）时的基本特征或功能。

在一些实施例中，将本发明的RNA分子设计成靶向Hg-rps-23基因的核苷酸序列的部分，该部分基本上由SEQ ID号:1-463（表1）中任一个的核苷酸序列组成。本发明的RNA分子的非限制性实例包括靶向Hg-rps-23基因的核苷酸序列的部分的RNA分子，其中该部分基本上由SEQ ID号:64的核苷酸序列组成，以及靶向Hg-rps-23基因的核苷酸序列的部分的RNA分子，其中该部分基本上由SEQ ID号:258的核苷酸序列组成。

因此，在本发明的双链RNA分子的不同实施例中，反义链的核苷酸序列可以基本上由SEQ ID号:464-926（表2）中任一个的核苷酸序列组成，并且在具体的非限制性实例中，反义链的核苷酸序列可以基本上由SEQ ID号:863的核苷酸序列组成或反义链的核苷酸序列可以基本上由SEQ ID号:669的核苷酸序列组成。应理解，SEQ ID号:464-926的核苷酸序列（表2），包括SEQ ID号:863和SEQ ID号:669（均为19个核苷酸长度），可以在3'亦或5'末端处缺失1个核苷酸或可以在3'末端、5'末端或两个末端处添加处于任何组合的至多到6个核苷酸，以便实现基本上由SEQ ID号:464-926（表2）中任一个的核苷酸序列组成的反义链，因此将理解的是，缺失1个核苷酸或添加至多到6个核苷酸不实质地影响被确定为SEQ ID号:464-926（表2）中任一个的双链RNA分子的基本特征或功能。这类额外的核苷酸可以是沿靶序列延伸反义链互补性的核苷酸和/或这类核苷酸可以是促进RNA分子或编码这种RNA分子的核酸分子的操作的核苷酸，如本领域普通技术人员将已知。例如，在此提供的示例性siRNA分子中，在3'末端存在TT突出端，它用来稳定siRNA双链体并且不影响siRNA的特异性。

在本发明的一些实施例中，双链RNA分子的有义链可以完全互补于反义链，或者有义链可以基本上互补或部分互补于反义链。“基本上或部分互补”意指有义链和反义链可以按约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸配对错配。可以将这类错配引入有义链序列中，例如，靠近3'末端，以便增强双链RNA分子由切酶Dicer加工，以便在插入本发明的嵌合核酸分子或人工微RNA前体分子内的siRNA分子中重复错配样式（见实例部分）等，如本领域技术人员将已知。这类修饰将在双链体的一个末端削弱碱基配对作用并且产生链非对称性，因此增大反义链（而非有义链）受到加工的和沉默预期基因的几率（Geng（耿）和Ding（丁）“Double-mismatched siRNAs enhanceselective gene silencing of a mutant ALS-causing Allele1（双错配siRNA增强造成突变ALS的等位基因1的选择性基因沉默）”Acta Pharmacol.Sin.（中国药理学报）29:211-216（2008）；Schwarz（施瓦茨）等人，“Asymmetry in theassembly of the RNAi enzyme complex（RNAi酶复合体的组合体中的非对称性）”Cell（细胞）115:199-208（2003））。其中已经将错配导入有义序列中的反义/有义链对的非限制性实例包括针对si-rps23-2的有义链AUUGCAAAUUGUUUUGAAATT（包括3'TT的SEQ ID号:928；表3）和相应反义链UUUCAGAGCAAUUUGCAAUTT（包括3'TT的SEQ ID号:836）和针对si-rps23-3的有义链UUGCAUCCUUGGUGAUUAATT（包括3'TT的SEQ ID号:929；表3）和相应反义链UUGGUCGCCAAGGAUGCAATT（包括3'TT的SEQ ID号:740）。

本发明也包括其中双链RNA分子可以为短发夹RNA（shRNA）分子的实施例。编码本发明shRNA的核苷酸序列的非限制性实例包括gaagcgcaatttccgagaatatcaagagtattctcggaaattgcgcttctgttttttt(SEQ ID号:932)，它是针对sh-rps23-1的shRNA序列，和acctgaagaagttgaacaatatcaagagtattgttcaacttcttcaggttgttttttt(SEQ ID号:933)，它是针对sh-rps23-4的shRNA序列。本发明的任何这类shRNA的设计和产生是本领域熟知的。

在本发明的一些实施例中，提供一种嵌合核酸分子，包括与植物微RNA前体分子操作地相关的具有SEQ ID号:464-926（表2）中任一个的核苷酸序列的反义链，该反义链在一些实施例中可以是大豆微RNA前体分子并且在具体实施例中可以是gma-MIR164。

在其他实施例中，本发明提供一种人工植物微RNA前体分子，包括具有SEQ ID号:464-926（表2）中任一个的核苷酸序列的反义链，该反义链在一些实施例中可以是大豆微RNA前体分子并且在具体实施例中可以是gma-MIR164。

人为植物微RNA递送感兴趣的核苷酸序列（例如，人工miRNA；siRNA/siRNA*）至植物中的用途是本领域熟知的（见，例如，Schwab（施瓦布）等人，“Highly specific gene silencing by artificial microRNAs inArabidopsis（在拟南芥中由人工微RNA引起的高度特异性基因沉默）”ThePlant Cell（植物细胞）18:1121-1133（2006）和在此的实例部分）。在本发明中，这类人为植物微RNA是其中插入植物微RNA前体主链和线虫（即，动物）siRNA序列的嵌合或杂合分子。如本领域技术人员将理解，典型地希望维持错配，这些错配正常情况下在植物微RNA前体序列中存在于被置换入植物微RNA前体主链中的任何核苷酸序列内。例如，为了产生在此所述的名为amiRrps23-1的人工微RNA前体分子，在si-rps-231si-rps-23-1*序列中维持在miR164/miR164*双链体上的错配位置（见实例部分），从而产生以下序列：ggatccagctccttgtttctcggaaattgcgcttcttagtctcttggatctcaaatgccactgaacccaagaagcgcaacctccgagaacaacacgggtttgagctc(SEQ ID号:934)。

任何植物微RNA（miRNA）前体适合本发明的组合物和方法。非限制性实例包括以下植物miRNA前体的任何家族成员：miR156、miR159、miR160、miR161、miR162、miR163、miR164、miR165、miR166、miR167、miR168、miR169、miR170、miR171、miR172、miR173、miR319、miR390、miR393、miR395、miR396、miR397、miR398、miR399、miR408、miR447连同目前已知或稍后鉴定的任何其他植物miRNA前体。

另外，在此提供一种核酸构建体（例如，载体或质粒），包括编码本发明的双链核酸分子、嵌合核酸分子和/或植物微RNA前体分子的核苷酸序列。

本发明进一步提供一种组合物，包括本发明的两种或更多种RNA分子，其中这两种或更多种RNA分子各自包括不同的反义链。这两种或更多种RNA分子可以在相同的核酸构建体上、在不同的核酸构建体上或其任何组合上存在。

在具体的实施例中，本发明的双链核酸分子可以包括以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：基本上SEQ ID号:863（si-rps23-1反义）的核苷酸序列组成的反义链和/或基本上SEQ ID号:669（si-rps23-4反义）的核苷酸序列组成的反义链。

另外，在此提供一种组合物，包括本发明的两种或更多种核酸构建体，其中这两种或更多种核酸构建体各自包括不同的反义链。

此外，本发明提供一种组合物，包括本发明的两种或更多种核酸分子，其中这两种或更多种核酸分子各自编码不同的反义链。

另外，在此提供一种组合物，包括本发明的两种或更多种编码核酸分子（编码反义链）的核酸构建体，其中这两种或更多种核酸构建体各自包括编码不同反义链的核酸分子。

本发明也提供一种组合物，包括本发明的两种或更多种嵌合核酸分子，其中这两种或更多种嵌合核酸分子各自包括不同的反义链。

仍在另外的实施例中，本发明提供一种组合物，包括本发明的两种或更多种人工植物微RNA前体分子，其中这两种或更多种人工植物微RNA前体分子各自包括不同的反义链。

应理解，本发明的组合物可以按任何组合并以相对彼此的任何比率包括以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：任何该核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子和/或人工微RNA前体分子。此外，“两种或更多种”意指2、3、4、5、6、7、8、9、10种等至多到本发明核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子和/或人工微RNA前体分子的总种数。

本发明涵盖根据本发明实施例的植物细胞和植物，因此，在一些实施例中，本发明提供提供一种转化植物细胞，包括本发明的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物，其中与对照植物细胞相比，这一转化植物细胞具有对大豆囊胞线虫感染的增强的抗性。

在此还提供一种转基因植物，包括本发明的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物，其中与对照植物相比，该转基因植物具有对大豆囊胞线虫感染的增强的抗性。

在一些实施例中，本发明的转化植物细胞可以是豆科植物的细胞。此外，本发明的转基因植物可以是豆科植物。本发明的豆科植物的非限制性实例包括大豆（栽培和野生）、嫩菜豆、四季豆、干豆（dry bean）、红豆（red bean）、利马豆、绿豆、菜豆和矮菜豆。

在另外的实施例中，本发明的转化植物细胞可以是任何植物的细胞，其中该植物可以是线虫（例如，大豆囊胞线虫）感染的宿主植物。本发明的转基因植物可以是任何植物，其中该植物可以是线虫感染的宿主植物。这类宿主植物的非限制性实例包括胡枝子、野豌豆（普通野豌豆、毛苕子或冬野豌豆）、羽扇豆、车轴草（绛车轴草、猩红车轴草或杂种车轴草）、草木樨、鸟足豆、小冠花、豌豆、豆角、黑眼豆、刺槐、亮兔唇花、繁缕、球序卷耳、毛蕊花、决明子、毛地黄钓钟柳（Digitalis penstemon）、美洲商陸、马齿苋、野荠菜、落基山蜜蜂花（Rocky Mountain beeplant）、斑点老鹳草、云兰属植物（toadflax）、翼藜（winged pigweed）、野豌豆（美洲野豌豆、加州野豌豆或林生野豌豆）、苜蓿、南苜蓿（toothed medic）、达利菊（dalea）、加拿大黄芪、玻璃苣、旱金莲藤、藏茴香、灯笼草、珊瑚钟（coralbell）、紫杯花、翠雀、毛地黄、路边青（geum）、普通夏至草、罂粟、鼠尾草、金鱼草、甜罗勒（basil）、香豌豆、马鞭草、佛座、黄花苜蓿、扭荚山绿豆（beggars weed）、山毛榉（tick clover）、麦仙翁、两型豆（hogpeanut）、乳豆、玉米、大麦、卡诺拉油菜、小麦、棉花、烟草、糖料甜菜（sugarbeet）、马铃薯、番茄、卷心菜、黄瓜、莴苣缬草和野菜豆。

在此提供了使用本发明核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工微RNA前体和/或组合物的不同方法。因此，在一个方面，本发明提供一种增强植物细胞对线虫感染的抗性的方法，该方法包括向这种细胞导入本发明的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物，由此增强该植物细胞对线虫感染的抗性。

在此还提供一种用于控制线虫对植物细胞感染的方法，该方法包括使感染这种植物细胞的线虫与本发明的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物接触，因此控制线虫对植物细胞的感染。

此外，本发明提供一种增强植物对线虫感染的抗性的方法，该方法包括向这种植物的细胞导入本发明的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物，因此增强该植物对线虫感染的抗性。

进一步提供一种用于控制线虫对植物感染的方法，该方法包括使感染这种植物的线虫与本发明的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物接触，由此控制线虫对该植物的感染。

本发明的额外实施例包括一种减少受线虫感染的植物的根上线虫囊胞发育的方法，该方法包括向这种植物的细胞导入本发明的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物，由此减少该植物的根上的线虫囊胞发育。

此外，本发明提供一种产生具有对线虫感染的增强的抗性的转化植物细胞的方法，该方法包括向这种细胞导入本发明的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物，由此产生相对于对照植物细胞具有对线虫感染的增强的抗性的转化植物细胞。本发明也提供由这种方法产生的转化植物细胞。

额外地，在此提供一种产生具有对线虫感染的增强的抗性的转基因植物的方法，该方法包括将这种植物的细胞用根据相应前述权利要求中任一项所述的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物转化，因此产生相对于对照植物具有对线虫感染的增强的抗性的转基因植物。还提供由这种方法产生的转基因植物。

本发明的另外方面包括一种产生具有对线虫感染的增强的抗性的转基因植物的方法，包括：a)将植物细胞用根据相应前述权利要求中任一项所述的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物接转化以产生转化植物细胞；并且b)使这一转化植物细胞生长成转基因植物，由此转基因植物相对于对照植物具有对线虫感染的增强的抗性。在此也提供由这种方法产生的转基因植物。

本发明的线虫包括但不局限于大豆囊胞线虫（Heterodera glycines）、根结线虫物种（根结线虫属某些物种（Meloidogyne spp.））、其他囊胞线虫物种（孢囊线虫属某些物种（Heterodera spp.））、根腐线虫（lesion nematode）物种（短体属某些物种（Pratylenchus spp.））、肾形线虫（肾形线虫（Rotylenchulusreniformis））、穿孔线虫（香蕉穿孔线虫（Radopholus similis））、柑橘线虫（半穿刺线虫（Tylenchulus semipenetrans））、矛线虫（纽带线虫属某些物种（Hoplolaimus spp.））、矮化线虫（矮化属某些物种（Tylenchorhynchus spp.））、螺旋线虫（螺旋属某些物种（Helicotylenchus spp.））、刺线虫（刺线虫属某些物种（Belonoluimus spp.））和环线虫（环属某些物种（Criconema spp.））。

根据本发明，使寄生线虫与本发明的siRNA分子接触，该siRNA分子特异性抑制对线虫存活、变态或繁殖必需的靶基因的表达。优选地，寄生线虫在进入其中存在本发明siRNA的植物后与siRNA接触。在一个实施例中，siRNA由已经转化入感染植物的祖先中核酸构建体（例如，载体）编码。表达这siRNA的核酸构建体可以处于根特异性启动子或寄生线虫饲养细胞特异性启动子的转录性控制下。

在具体实施例中，本发明提供双链RNA，其含有与待抑制的靶基因的一部分完全互补的核苷酸序列。然而，应理解，为实践本发明，不要求双链RNA分子的反义链和靶序列之间的100%互补性。因此，可以容忍可能由于遗传突变、株系多态性或进化趋异性而预期到的序列变异。相对于靶序列具有插入、缺失和单点突变的RNA序列也可以有效用于抑制。因此，可以通过本领域已知的序列比较及比对算法（参见Gribskov（哥博斯科夫）和Devereux，Sequence Analysis Primer（序列分析引物）,Stockton Press出版,1991）并且用例如Smith（史密斯）-Waterman（沃特曼）算法（计算核苷酸序列之间的差异百分比，如使用默认参数在BESTFIT软件程序中所执行那样（例如，威斯康星大学遗传学计算集团（University of Wisconsin Genetic ComputingGroup）），优化序列同一性和互补性。优选在抑制性RNA和靶基因的部分之间大于90%互补性或甚至大于100%互补性。可替代地，可以将RNA的双链体区功能性地定义为能够与靶基因转录物的一部分杂交在严格条件（例如，400mM NaCl，40mM PIPES pH6.4，1mM EDTA，60　C杂交12-16小时；随后洗涤）下的核苷酸序列。

本发明的dsRNA可以在任一末端或两个末端任选地包括单链突出端。可以通过自身互补性RNA单链（即，形成发夹环）或两条互补性RNA链形成双链结构。可以在细胞内部亦或外部启动RNA双链体形成。当本发明的dsRNA形成发夹环时，它可以任选地包括内含子和/或核苷酸间隔区序列（它是互补性RNA链之间的核苷酸段）以便在细胞中稳定发夹序列。RNA可以按允许递送每个细胞至少一个拷贝的量导入。双链物质的更高剂量可以产生更有效的抑制。

在一些实施例中，本发明提供包括核酸的核酸构建体，该核酸核酸编码本发明的dsRNA分子，其中该核酸构建体在植物细胞（例如，转化植物细胞）中的表达导致与该植物细胞的野生型种类（例如，对照植物细胞或未转化植物细胞）相比，对线虫的增加的抗性。如在此使用的，术语“核酸构建体”意指能够运输与之连接的另一个核酸分子的核酸。一个类型的核酸构建体是载体，它可以是转化载体或表达载体。另一个类型的本发明核酸构建体是“质粒”，它是指可以向其中连接至额外核酸区段内的环状双链核酸环。另一个类型的核酸构建体是病毒载体，其中额外的核酸区段可以连接至病毒基因组中。某些载体能够在导入它们的植物细胞中自主复制。其他载体一旦导入植物主细胞中则整合入这种植物细胞的基因组中，并且随后与植物细胞基因组一起复制。此外，某些载体可以指导与它们有效连接的基因或编码序列的表达。此类载体在此称作“表达载体”。在本发明的一些实施例中，表达载体可以是病毒载体（例如，马铃薯病毒X；烟草脆裂病毒；双生病毒）。

本发明的表达载体可以包括处于下述形式的本发明核酸，其中该形式适合该核酸在植物细胞中表达，这意指这种表达载体包括基于待用于表达的植物细胞而选择的与待表达核酸序列操作地连接的一个或多个调节序列。关于表达载体，“操作地连接”意指感兴趣的核苷酸序列以一种方式连接至一个或多个调节序列，该方式允许该核苷酸序列（例如，当该载体导入植物细胞时，在植物细胞中）表达。术语“调节序列”意在包括如本领域熟知的启动子、增强子和其它表达控制元件（例如，多腺苷酸化信号）。调节序列包括指导核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中组成型表达的那些调节序列和指导这种核苷酸序列仅在某些宿主细胞中或在某些条件下表达的那些序列。本领域普通技术人员将理解，表达载体的设计可能取决于此类因素，如待转化的宿主细胞的选择、希望的dsRNA表达水平、等。可以将本发明的表达载体导入植物细胞，以便由此产生如在此所述的核酸编码的dsRNA分子。

在本发明的一些实施例中，表达载体可以包括与核苷酸序列操作地连接的调节序列，其中该核苷酸序列是要求保护的dsRNA分子的一条链或两条链的模板。在一个实施例中，这种核酸分子进一步包括侧部分布于该核酸分子任一末端的启动子，其中该启动子驱动每条独立DNA链的表达，因此产生杂交并形成dsRNA的两条RNA。在另一个实施例中，核酸分子包括在一个转录单元上转录成dsRNA的两条链的核苷酸序列，其中有义链从转录单位的5'末端转录并且反义链从从转录单位的3'末端，其中这两条链由约3至约500碱基对分隔，并且其中转录后，RNA转录物自身折叠以形成发夹。根据本发明，发夹转录物中的间隔区可以是任何核酸片段。

在本发明的一些实施例中，如果导入的核酸分子并入非染色体性自主复制子或整合至植物染色体中，则它可以在植物细胞中稳定地维持。可替代地，导入的核酸分子可以存在于染色体外的非复制型载体上并且瞬时地表达或瞬时有活性。无论是否在染色体外的非复制型载体或整合至染色体中的载体上存在，这种核酸分子均可以在植物表达盒中存在。植物表达盒可以含有在植物细胞中驱动基因表达的调节序列，其中这些调节序列操作地连接，从而每个序列可以实现其功能，例如，通过多腺苷酸化信号终止转录。示例性多腺苷酸化信号是从根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）t-DNA（例如Ti质粒pTiACH5（Gielen（吉伦）等人，EMBO J.（欧洲分子生物学学会杂志）3:835（1984））的称作章鱼碱合酶的基因）或其功能等同物起源的那些，不过在植物中有功能活性的全部其它终止子也是合适的。本发明的植物表达盒也可以含有其他有效连接序列如翻译增强子，例如过量驱动序列，该序列含有来自烟草花叶病毒的增强多肽/RNA比率的5'非翻译性前导序列（Gallie（加利）等人，Nucl.Acids Research（核酸研究）15:8693-8711（1987））。

本发明的核酸分子可以由本领域技术人员已知的任何方法导入细胞中。在本发明的一些实施例中，本发明植物细胞的转化可以包括细胞核转化。在其他实施例中，本发明植物细胞的转化可以包括质体转化（例如，叶绿体转化）。

用于转化植物的程序是本领域熟知和常规的，并且贯穿文献中描述。用于转化植物的方法的非限制性实例包括通过细菌介导的核酸递送（例如，通过农杆菌）、病毒介导的核酸递送、碳化硅或晶须介导的核酸递送、脂质体介导核酸递送的转化、微量注射、微粒子轰击、磷酸钙介导的转化、环糊精介导的转化、电穿孔、纳米粒子介导的转化，超声波处理法、浸润法、PEG介导的核酸摄取，以及导致向植物细胞导入核酸的任何其他电学、化学、物理（机械）和/或生物学机制，包括其任何组合。本领域已知的不同植物转化方法的一般指南包括Miki（米奇）等人，（“Procedures for Introducing ForeignDNA into Plants（用于将外来DNA导入植物中的程序）”，引自Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology（植物分子生物学和生物技术中的方法），Glick（格里克）,B.R.和Thompson（汤普森）,J.E.编辑，（CRC Press,Inc.出版公司,Boca Raton（波卡拉顿）,1993），第67-88页）和Rakowoczy（拉科沃奇）-Trojanowska（特罗扬诺夫斯卡）Cell.Mol.Biol.Lett.（细胞与分子生物学通讯）7:849-858（2002））。

因此，在一些实施例中，导入植物、植物部分和/或植物细胞中是借助细菌介导的转化、粒子轰击转化、磷酸钙介导的转化、环糊精介导的转化、电穿孔、脂质体介导的转化、纳米粒子介导的转化、聚合物介导的转化、病毒介导的核酸递送、晶须介导的核酸递送、微量注射、超声波处理法、浸润法、聚乙二醇介导的转化，以及导致向植物、植物部分和/或其细胞导入核酸的任何其他电学、化学、物理和/或生物学机制，或其任何组合进行的。

农杆菌介导的转化是用于转化植物、具体地双子叶植物的常用方法，因为其转化效率高和因为其对许多不同物种的广泛适用性。农杆菌介导的转化一般涉及转移携带外来感兴趣的DNA的双元载体至适当的农杆菌菌株，这可能取决于共驻Ti质粒或染色体上由宿主农杆菌菌株携带的vir基因的互补作用（Uknes（乌肯斯）等人，（1993）Plant Cell（植物细胞）5:159-169）。可以使用携带重组双元载体的大肠杆菌（Escherichia coli）、携带能够移动重组双元载体至靶农杆菌菌株的质粒的辅助大肠杆菌菌株通过三亲交配方法实现重组双元载体至农杆菌的转移。可替代地，可以通过核酸转化法将重组双元载体转移至农杆菌（

（霍芬）和Willmitzer（威尔米泽）（1988）NucleicAcids Res（核酸研究）.16:9877）。

通过重组农杆菌转化植物通常涉及农杆菌与来自该植物的外植体共培育并且遵循本领域熟知的方法。在选择培养基上再生在双元质粒T-DNA边界之间携带抗生素标记或除草剂抗性标记的转化组织。

另一种用于转化植物、植物部分和植物细胞的方法涉及将惰性粒子或生物活性粒子推向植物组织和细胞。参见，例如，美国专利4,945,050；5,036,006和5,100,792。通常，这种方法涉及在有效穿透细胞外表面并且导致并入其内部的条件下将惰性粒子或生物活性粒子推向植物细胞。当使用惰性粒子时，可以通过用含有本发明核酸的载体涂布这些粒子，将这种载体导入细胞中。可替代地，一个细胞或多个细胞可以由这种载体包围，从而通过激发粒子，将载体带入细胞中。也可以将生物活性粒子（例如，干燥的酵母细胞、干燥的细菌或噬菌体，各自含有一个或多个力图导入的核酸）推入植物组织中。

因此，在本发明的具体实施例中，植物细胞可以通过本领域已知和如在此所述的任何方法转化并且可以使用多种已知技术的任一项，从这些转化的细胞再生完整植株。例如在Evans（伊文思）等人，（Handbook of Plant CellCultures（植物细胞培养手册），第1卷，MacMillan Publishing Co.（麦克米兰出版公司），纽约（1983））；和Vasil（瓦西尔）I.R.（Cell Culture and SomaticCell Genetics of Plants（植物的细胞培养和体细胞遗传）,Acad.Press（学术出版社）,Orlando（奥兰多），第I卷（1984）和第II卷（1986））中描述从植物细胞、植物组织培养物和/或培养的原生质体中再生出植物。选择转化的转基因植物、植物细胞和/或植物组织培养物的方法是本领域常规的，并且可以用于在此提供的本发明方法中。

同样，经工程化进入上述的本发明的转基因种子和植物、植物部分和/或植物细胞的遗传特性可以通过有性繁殖或营养生长传递，并且因此可以在子代植物中维持并增殖。通常，维持和增殖利用为符合特定目的所开发的已知农业方法，例如收获、播种或耕作。

因此可以将核苷酸序列以本领域熟知的任何种类的方式导入植物、植物部分和/或植物细胞中。本发明的方法不取决于将一个或多个核苷酸序列导入植物的具体方法，只要它们进入这种植物的至少一个细胞内部即可。

将dsRNA导入线虫中的物理方法包括注射含有dsRNA的溶液或将线虫浸泡在dsRNA溶液中。优选地，将本发明的dsRNA在线虫摄取含有编码这种dsRNA的核酸构建体的转基因植物时导入线虫中。

因此，在一些实施例中，本发明提供植物、植物部分和/或植物细胞，它们具有由本发明方法产生的对线虫侵染或感染的增强或增加的抗性。在另外实施例中，本发明提供植物、植物部分和/或植物细胞，它们具有由本发明方产生的对大豆囊胞线虫侵染或感染的增加或增强的抗性。仍在其他实施例中，本发明提供大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞，它们具有由本发明方产生的对大豆囊胞线虫侵染或感染的增加或增强的抗性。

本发明的另外方面提供植物、植物部分和/或植物细胞，它们具有由本发明方产生的减少的大豆囊胞线虫胞囊形成。仍在另外方面中，本发明提供大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞，它们具有由本发明方产生的减少的大豆囊胞线虫胞囊形成。

仍在另外方面中，本发明提供作物，包括在农田中栽种在一起的多株本发明的任何转基因植物。在具体的实施例中，该作物可以是豆科植物作物并且在某些实施例中，该作物可以是大豆作物。

在此还提供一种改进作物产量的方法，该方法包括：a)将根据相应前述权利要求中任一项所述的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物导入植物的细胞；b)将(a)的多株植物培育为作物，产生具有对线虫感染的增强的抗性的多株植物，因此改进作物产量。定义

如在此使用的，“一种/一个（a/an）”或“该”（the）可以表示一或多于一。例如，一种细胞可以意指单个细胞或多个细胞。

如在此使用的，“和/或”指并且涵盖一个或多个相关的列出项的任何及全部可能组合，连同当以可替代性（或）解释时组合的缺少。

另外，当指可计量值（例如化合物或试剂、剂量、时间、温度等等的量）时，如在此使用的，术语“约（about）”意图包括所指值的±20%、±10%、±5%、±1%、±0.5%或甚至±0.1%的变化。

如在此使用的，过渡短语“基本上由……组成”意指一项权利要求的范围将要解释为包括该权利要求中所提到的指定材料或步骤以及不实质上影响要求保护的发明的基本特征和新特征的那些材料或步骤。因此，当用于本发明的权利要求中时，术语“基本上由……组成”并不意在解释为等同于“包括”（comprising）。

术语“植物”意在包括处于任何成熟或发育阶段的植物，以及取自或衍生自任何这类植物的任何组织或器官（植物部分），除非否则由上下文清晰地指明。本发明也包括由本发明转基因植物产生的转基因种子。在一个实施例中，与植物种子的野生型种类相比，这些种子对于增加的线虫侵染抗性是纯育的。在本发明的具体实施例中，植物是大豆植物。

如在此使用的，术语“植物部分”包括但不局限于花粉、种子、枝、果实、谷粒、耳部、穗轴、籽粒、茎秆、根尖、花药、茎、根、花、胚珠、雄蕊、叶、胚、分生组织区、愈伤组织、花药培养物、配子体、孢子体、花粉、小孢子、原生质体、须根培养物等，植物细胞，包括在植物和/或植物部分、植物原生质体、植物组织、植物细胞组织培养、植物愈伤组织、植物团块等中完整的植物细胞。另外，如在此使用的，“植物细胞”指植物的结构和生理单位，包括细胞壁并且也可以指原生质体。因此，如在此使用的，“植物细胞”包括，但不局限于原生质体、配子生产细胞和再生成为完整植株的细胞。植物的各种组织的组织培养和从中再生出植物是本领域熟知的。

本发明的植物细胞可以处于分离的单细胞形式，或者可以是培养细胞，或者可以是作为更高级组织化单位（例如，植物组织或植物器官）的一部分。

如在此使用的，术语“增强的抗性”或“增加的抗性”指与未转化植物细胞（例如，对照植物细胞）或非转基因植物（例如，对照植物）相比，在本发明的转化植物细胞和/或转基因植物中减少、延迟和/或阻止线虫侵染和/或感染。减少、延迟或组织线虫感染将引起植物具有增强或增加的线虫抗性，然而，这类增加的抗性不暗示这种植物必然具有100%侵染或感染抗性。在一些实施例中，与不抵抗线虫的野生型植物或植物细胞（例如，对照植物或对照植物细胞）相比，本发明的转化植物细胞或转基因植物中对线虫侵染或感染的抗性大于约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。植物对线虫感染的抗性可以是由于线虫在暴露于对必需基因特异性dsRNA时死亡、不育、发育停滞和/或活动性受损。

如在此使用的，术语“减少（reduce）”、“减少的（reduced）”、“减少（reducing）”、“减少（reduction）”、“减小（diminish）”以及“降低（decrease）”（及其语法上的变体）描述了植物上（例如，大豆）大豆胞囊线虫胞囊形成的降低，原因在于将本发明的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工微RNA前体分子和/或组合物导入植物，因此产生转基因植物，其具有在该转基因植物上降低或减少的胞囊形成。可以通过比较该核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工微RNA前体分子和/或组合物转化的植物上形成的胞囊的数目与未用该核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工微RNA前体分子和/或组合物转化的大豆植物上形成的胞囊的数目，观察到这种胞囊形成降低。

如在此使用的，术语“足以抑制表达的量”指dsRNA的浓度或量，它足以减少从线虫（例如，大豆囊胞线虫）中的靶基因（例如，hg-rps-23）产生mRNA或蛋白质的水平或稳定性。如在此使用的，“抑制表达”指不存在来自靶基因的蛋白质和/或mRNA产物或其水平的可观察下降。靶基因表达的抑制可能对线虫是致死性的，或者如果植物病害与线虫生活周期的特定阶段相关，则这种抑制可以延迟或阻止进入具体发育阶段（例如，变态）。可以通过线虫的检验外部特性证实抑制的结果（例如，如此处实例部分中所述）。

如在此使用的，“RNAi”或“RNA干扰”指（例如，线虫中）由双链RNA（dsRNA）介导序列特异性转录后基因沉默的过程。如在此使用的，“dsRNA”指部分或完全为双链的RNA。双链RNA也称作小干扰性RNA（siRNA）、小干扰核酸（siNA）、微RNA（mRNA）、以及类似物。在RNAi过程中，将包括与靶基因的一部分互补的第一个（反义）链和与第一反义链完全或部分互补的第二（有义）链的dsRNA导入有机体（例如，线虫）中，例如，通过浸泡和/或饲喂导入。在导入这种有机体后，靶基因特异性dsRNA被加工成相对小的片段（siRNAs）并且可以随后变得分布遍及该有机体，导致具有表型的功能丧失突变，该表型在一个世代时间内可能变得紧密类似于由靶基因完全和部分缺失所致的表型。可替代地，靶基因特异性dsRNA由含有RNAi加工装置（machinery）的植物细胞加工成相对短的片段；并且在植物加工的短dsRNA由寄生有机体（例如线虫）摄取时，获得致使功能丧失表型。

微RNA（miRNAs）是不编码蛋白质的RNA，总体上在约18至约25个核苷酸长度之间（植物中常地约20-24个核苷酸长度）。这些miRNas指导靶转录物的反式切割，负向调节参与各种调节及发育途径的基因的表达（Bartel,Cell,116:281-297（2004）；Zhang(张)等人，Dev.Biol.（发育生物学）289:3-16（2006））。照此，已经显示miRNA参与植物生长和发育的不同方面以及参与信号转导和蛋白质降解。此外，内源性小mRNA（包括miRNA）也可以参与生物胁迫反应，例如病原体攻击。自第一个miRNA在植物中发现以来（Reinhart（莱因哈特）等人，Genes Dev（基因和发育）.16:1616-1626（2002），Park（朴）等人，Curr.Biol（当代生物学）.12:1484-1495（2002）），已经鉴定了数百种miRNA。另外，已经示出许多植物miRNA是跨非常趋异性分类单元而高度保守的。（Floyd（弗洛依德）等人，Nature（自然）428:485-486（2004）；Zhang（张）等人，Plant J（植物杂志）.46:243-259（2006））。许多微RNA基因（MIR基因）已经鉴定并且是在数据库中公众可获的（miRBase；microrna.sanger.ac.uk/sequences）。美国专利公开2005/0120415和2005/144669A1中也描述了miRNA，该专利的全部内容通过引用结合在此。

编码miRNA的基因产生长度70bp至300bp的初级miRNA（称作“pri-miRNA”），其可以形成不完美的茎环结构。单个初级miRNA可以含有从1个至数个miRNA前体。在动物中，初级miRNA在细胞核中由RNA酶IIIDrosha及其辅因子DGCR8/Pasha加工成约65nt的更短发夹RNA（前miRNA）。这种前miRNA随后输出至细胞质，在那里，它由另一种RNA酶III切酶Dicer进一步加工，释放出大小约22nt的miRNA/miRNA*双链体。与动物相反，在植物中，初级miRNA加工为成熟miRNA完全在细胞核内利用单一RNA酶IIIDCL1（切酶Dicer样1）进行。（Zhu（朱）.Proc.Natl.Acad.Sci（美国科学院院刊）.105:9851-9852（2008））。关于微RNA生物生成和功能的许多综述是可获得的，例如，参见，Bartel（巴特尔）Cell（细胞）（116:281-297（2004），Murchison(默奇森)等人，Curr.Opin.Cell Biol(细胞生物学新见).16:223-229（2004），Dugas(杜加斯)等人，Curr.Opin.Plant Biol.(植物生物学新见)7:512-520（2004）和Kim（金姆）Nature Rev.Mol.Cell Biol（自然综述分子细胞生物学）.6:376-385（2005）。

如在此使用的，术语“植物微RNA前体分子”描述一种（约70nt-300nt）小非编码性RNA序列，它由植物酶类加工以产生约19-24核苷酸产物，称作成熟微RNA序列。这些成熟序列通过与信使RNA的互补性而具有调节作用。术语“人工植物微RNA前体分子”描述在加工之前的非编码miRNA前体序列，其中经由以下方式使用该前体序列作为递送siRNA分子的主链序列，将这种miRNA前体分子的内源性天然miRNA/miRNA*双链体置换为一种非天然异源性miRNA的双链体（amiRNA/amiRNA*；例如，si-rps23-1/si-rps-23-1*或siRNA/siRNA*），后一种双链体然后与该siRNA序列一起加工为成熟miRNA序列。

如在此使用的，术语“核酸”、“核酸分子’、“核苷酸序列”和“多核苷酸”指直链或分支、单链或双链的RNA或DNA或其杂交体。该术语还涵盖RNA/DNA杂交体。当合成产生dsRNA时，更不常见的碱基，例如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤和其他碱基也可以用于反义、dsRNA和核酶配对。例如，已经示出含有尿苷和胞苷的C-5丙炔类似物的多核苷酸以高亲和力结合RNA，并且示出为基因表达的强力反义抑制剂。也可以产生其他修饰，例如对RNA的磷酸二酯主链或核糖糖基团中2'-羟基的修饰。

如在此使用的，术语“核苷酸序列”指核苷酸的杂聚物或这些核苷酸从核酸分子5'至3'末端的序列并且包括DNA或RNA分子，包括cDNA、DNA片段、基因组DNA、合成性（例如，化学合的）DNA、质粒DNA、mRNA和反义RNA，其中任一种可以是单链或双链。术语“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”在在此也可互换用来指核苷酸的杂聚物。在此提供的核酸序列在此以5'至3'方向从左至右在此呈现，并且使用代表核苷酸字符的标准代码表示，如美国序列法，37CFR§§1.821-1.825和世界知识产权组织（WIPO）标准ST.25中所述。

如在此使用的，术语“基因”指能够用来产生mRNA、反义RNA、miRNA等的核酸分子。基因可以或可以不能够用来产生功能蛋白质。基因可以包括编码区和非编码区（例如，内含子、调节元件、启动子、增强子、终止序列和5'和3'非翻译区）。基因可以是“分离的”，这意指一种核酸，其基本上或实质地不含正常情况下发现在其天然状态下与这种核酸结合的组分。此类组分包括其他细胞物质、来自重组生产的培养基和/或在化学合成这种核酸时所用的不同化学品。

如在此使用的，当用于提及核酸分子或核苷酸序列时，术语“片段”或“部分”将理解为意指一种核酸分子或核苷酸序列，其相对于参考核酸分子或核苷酸序列而言，长度缩减并且包括以下项、基本由以下项组成和/或由以下项组成：与参考核酸或核苷酸序列相同或几乎相同（例如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、98%、99%相同）的连续核苷酸的核苷酸序列。在适当时，根据本发明，这种核酸片段可以包括于此片段作为组分的更大多核苷酸中。

本发明的“分离”的核酸分子或核苷酸序列或核酸构建体或双链RNA分子总体上不含从其衍生核酸的有机体的基因组DNA中插入感兴趣的核酸侧部的核苷酸序列（例如，在5'端或3'端存在的编码序列）。然而，本发明的核酸分子可以包括不有害地影响核酸的基本结构特征和/或功能特征的一些额外碱基或部分。“分离”不意指制备物在技术上是纯的（同质的）。

因此，“分离的核酸”或“分离的核酸分子”是这样的核苷酸序列（DNA亦或RNA），它在与自然界中找到这种核苷酸序列的形式或环境不同的形式或环境下存在，并且不紧密邻接于衍生此核苷酸序列的有机体的天然存在基因组中与这种核苷酸序列紧密邻接的核苷酸序列（一个在5'末端上和一个在3'末端上）。因此，在一个实施例中，分离的核酸包括紧密邻接于编码序列的一些或全部5'非编码序列（例如，启动子）序列。因此，该术语包括例如独立于其他序列并入载体、并入自主复制型质粒或病毒或并入原核生物或真核生物的基因组DNA或作为独立分子存在（例如，通过PCR或限制性核酸内切酶处理生的cDNA或基因组DNA片段）的重组核酸。因此，在自然界中存在的从其天然环境移出并且转化至植物内的核酸分子仍视为“分离的”，甚至被并入所产生的转基因植物的基因组时也是如此。它还包括重组核酸，该重组核酸是编码额外多肽或肽序列的杂交核酸的部分。

术语“分离”可以进一步指基本上不含细胞物质、病毒物质和/或培养基（例如，通过重组DNA技术产生时）或化学前体或其他化学品（例如，化学合成时）的核酸、核苷酸序列、多肽、肽或片段。此外，“分离的片段”是核酸、核苷酸序列或多肽的片段，该片段不天然地作为片段存在并且不会按照原样以天然状态被发现。“分离”不意指制备物在技术上是纯的（同质的），但它充分纯，以提供处于一种可以用于预期目的之形式的多肽或核酸。

在本发明的代表性实施例中，“分离的”核酸、核苷酸序列和/或多肽是至少约5%，10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%纯（w/w）或更纯。在其他实施例中，“分离的”核酸、核苷酸序列、和/或多肽表示与起始材料相比，实现这种核酸至少大约5-倍、10-倍、25-倍、100-倍、1000-倍、10,000-倍、100,000-倍或更高倍数的富集（w/w）。

如在此使用的，“互补”多核苷酸是能够根据标准Watson（沃森）-Crick（克里克）互补性规则发生碱基配的那些。确切地，嘌呤将与嘧啶发生碱基配对以形成鸟嘌呤与胞嘧啶配对(G:C)的组合和在DNA情况下腺嘌呤与胸腺嘧啶配对（A:T）或在RNA情况下腺嘌呤与尿嘧啶配对（A:U）的组合。例如，序列“A-G-T”与互补序列“T-C-A”结合。应理解，两种多核苷酸可以相互杂交，即便它们彼此并不完全互补，只要每种多核苷酸具有至少一个与另一种多核苷酸基本上互补的区域。

如在此使用的，术语“互补（complementary）”或“互补性（complementarity）”指多核苷酸在容许性盐条件和温度条件下通过碱基配发生天然结合。两单链分子之间的互补性可以是“部分的（partial）”，其中这些核苷酸中仅一些结合，或者当这些单链分子之间存在完全互补性时，这种互补性可以是完全的。核酸链之间互补性的程度对核酸链之间杂交的效率和强度具有明显影响。

如在此使用的，术语“基本上互补的”或“部分互补的”意指两个核酸序列互补至少约50%、60%、70%、80%或90%的核苷酸。在一些实施例中，两个核酸序列可以互补至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的它们的核苷酸。术语“基本上互补的”和“部分互补的”也可以意指两个核酸序列可以在高严格性条件下杂交并且这类条件是本领域熟知的。

如在此使用的，“异源的”指源自另一个物种亦或来自相同物种或有机体，但与其原始形式亦或细胞中主要表达的形式相比受到修饰的核酸序列。因此，衍生自与将一种核苷酸序列引入的细胞所属的有机体或物种不同的生物体或物种的这种核苷酸序列相对于那个细胞或细胞的子代而言是异源的。此外，异源核苷酸序列包括这样的一种核苷酸序列，它衍生自或被插入相同的天然原初细胞类型，但是却以非天然状态存在，例如，以不同拷贝数目存在，和/或处于与在自然界中存在的那些不同的调节序列控制下。

如在此使用的，术语术语“转化”和“转基因”指含有至少一种重组多核苷酸的全部或部分的任何植物、植物细胞、愈伤组织、植物组织或植物部分。在多种情况下，该重组多核苷酸的全部或部分稳定地整合至染色体或整合至稳定的染色体外元件，从而它被传递到后续世代中。出于本发明的目的，术语“重组多核苷酸”指已经通过基因工程改变、重排或修饰的多核苷酸。实例包括任何克隆的多核苷酸或与异源序列连接或接合的多核苷酸。术语“重组”不指因天然存在事件（例如自发突变）或因非自发诱变随后选择性育种所致的多核苷酸改变。

如在此使用的，术语“转基因”指在植物、动物或其他有机体的转化中使用的任何核酸序列。因此，转基因可以是编码序列、非编码序列、cDNA、基因或其片段或部分、基因组序列、调节元件以及类似物。“转基因”有机体，例如转基因植物、转基因微生物、或转基因动物，是已经向其中递送或导入转基因的有机体并且该转基因可以在这种转基因有机体中表达以产生一种产物，该产物的存在可以在这种有机体中赋予一种效果和/或表型。

具有同源性的不同核酸或多肽在此称作“同源物”。术语“同源物”包括来自相同或其他物种的同源序列以及来自相同或其他物种的直系同源序列。“同源性”指就位置同一性（即，序列相似性或同一性）而言，两个或更多个核酸和/或氨基酸序列之间的相似性水平。同源性也指不同核酸或蛋白之间相似功能特性的概念。

如在此使用的，术语“接触”、“导入”和“施用”互换使用并且指一个过程，通过该过程，将本发明的dsRNA或编码本发明dsRNA的核酸分子递送至细胞（例如，线虫细胞），以便抑制或改变或调节线虫中必需靶基因的表达。这种dsRNA可以按众多方式施用，包括但不局限于，直接导入细胞中（即，胞内地导入）和/或胞外导入线虫的体腔、间隙或循环中。也可以采用经口导入，其中可以通过在含有dsRNA和/或编码这种dsRNA的核酸分子的溶液中浸泡线虫，导入这种dsRNA和/或核酸，或这种dsRNA和/或核酸可以存在于食物源中。用于经口导入的方法包括dsRNA和/或核酸分子与线虫的食物直接混合，以及工程化方法，其中将用作食物的物种工程化以表达dsRNA，随后向要感染的有机体饲喂该物种。例如，可以将这种dsRNA施加至和/或喷洒到植物上和/或可以将dsRNA可以施加至根附近的土壤，由植物和/或线虫摄取和/或可以将植物进行基因工程化，以便按足以杀死一些或全部暴露于植物的线虫的量表达这种dsRNA。

在植物细胞或植物的语境下，“导入”意指以如此方式向物，植物部分和/或植物细胞提供核酸分子，从而核酸分子进入细胞的内部。在导入多于一个核酸分子的情况下，可以将这些核酸分子组装为单一多核苷酸或核酸构建体的部分或组装为独立的多核苷酸或核酸构建体，并且它们可以存在于相同或不同的核酸构建体上。因此，可以将这些多核苷酸以单个转化事件、以各自独立的转化事件或作为育种方案的部分导入植物细胞中。因此，如在此使用的，术语“转化”指将异源核酸导入细胞中。细胞的转化可以是稳定的或瞬时的。

在多核苷酸的语境下，“瞬时转化”意指将多核苷酸导入细胞并且它不整合到细胞的基因组中。

在被导入细胞中的多核苷酸的语境下，“稳定导入”或“稳定地导入”意指导入的多核苷酸稳定地并入细胞的基因组，并且因此这种该细胞经这种多核苷酸稳定转化。

如在此使用的，“稳定转化”或“稳定地转化”意指将一种核酸分子导入细胞中并且整合至细胞的基因组中。照此，整合的核酸分子能够由其子代、更具体地由多个连续世代的子代遗传。如在此使用的，“基因组”包括细胞核基因组和质体基因组，并且因此包括核酸整合至例如叶绿体基因组中。如在此使用的，稳定转化也可以指以染色体外方式（例如，作为微型染色体）维持的转基因。

瞬时转化可以通过例如酶联免疫吸附测定（ELISA）或蛋白质印迹来检测，它们可以检测由一个或多个导入有机体的转基因编码的肽和多肽的存在。细胞的稳定转化可以通过例如细胞的基因组DNA与多种核酸序列（这些序列与导入有机体（例如，植物）的转基因的核苷酸序列特异性杂交）的DNA印记杂交测定法检测。细胞的稳定转化可以通过例如细胞的RNA与多种核酸序列（这些序列与导入植物或其他有机体的转基因的核苷酸序列特异性杂交）的RNA印迹杂交测定法检测。细胞的稳定转化也可以通过例如聚合酶链反应（PCR）或如本领域熟知的其他扩增反应，使用特异性引物序列来检测，其中该特异性引物序列与转基因的靶序列杂交，导致转基因序列的扩增，这可以根据标准方法来检测也可以通过本领域熟知的直接测序方案和/或杂交方案检测到转化。

本发明的实施例针对设计成表达本发明核酸的表达盒。如在此使用的，“表达盒”意指具有与感兴趣的核苷酸序列操作地连接的至少一个控制序列的核酸分子。以这种方式，例如，在用于植物、植物部分和/或植物细胞中表达的表达盒中提供与本发明miRNA的核苷酸序列可操作相互作用的植物启动子。

如在此使用的，术语“启动子”指合并了用于有效表达编码序列的必需信号的核苷酸序列区域。这可以包括与RNA聚合酶结合的序列，但不局限于这类序列，并且可以包括与其他调节蛋白结合的区域，连同参与控制蛋白质翻译的区域，并且还可以包括编码序列。

此外，本发明的“启动子”是一种能够在植物的细胞中启动转录的启动子。这类启动子包括以组成型方式驱动核苷酸序列表达的那些、受诱导时驱动表达的那些，和以组织特异性或发育特异性方式驱动表达的那些，这些不同类型的启动子是本领域已知的。

出于本发明的目的，这些调节区（即启动子、转录调节区和翻译终止区）可以相对于植物、植物部分和/或植物细胞是天然的/类似的和/或这些调节区可以相对于其他调节区是天然的/类似的。可替代地，这些调节域可以相对于植物（和/或植物部分和/或植物细胞）和/或相对于彼此（即，这些调节区）是异源的。因此，例如，在一种启动子与这样一种多核苷酸有效连接，其中该多核苷酸来自与衍生这种多核苷酸的物种不同的物种时，则这种启动子可以是异源的。可替代地，一种启动子也可以相对于选择的核苷酸序列是异源的，如果这种启动子来自衍生这种多核苷酸的相同/类似物种，但是一者或二者（即，启动子和多核苷酸）均被实质地修饰而有别于其原始形式和/或基因组位点，或这种启动子不是这种有效连接的多核苷酸的天然启动子。

待使用的启动子的选择取决于几种因素，包括但不局限于，细胞-或组织-特异性表达、所需的表达水平、效率、可诱导性以及可选择性。例如，在需要在特定组织或器官中表达的情况下，可以使用组织特异性启动子（例如，根特异性启动子）。相反，在需要应答于刺激的表达情况下，可以使用诱导型启动子。在需要在植物的所有细胞中连续表达的情况下，可以使用组成型启动子。对于本领域技术人员而言，通过相对于一种核苷酸序列来适当地选择并且定位启动子和其他调节区而调节这种核苷酸序列的表达是一种惯例。

因此，在一些情况下，可以使用组成型启动子。组成型启动子的实例包括但不局限于，夜香树病毒启动子（cmp）（美国专利号7,166,770）、稻肌动蛋白1启动子（Wang（王）等人，（1992）Mol.Cell.Biol（分子细胞生物学）.12:3399-3406；以及美国专利号5,641,876）、CaMV35S启动子（Odell（奥德尔）等人，（1985）Nature（自然）313:810-812）、CaMV19S启动子（Lawton（劳顿）等人，（1987）Plant Mol.Biol（植物分子生物学）.9:315-324）、nos启动子（Ebert（艾伯特）等人，（1987）Proc.Natl.Acad.Sci USA84:5745-5749）、Adh启动子（Walker等人，（1987）Proc.Natl.Acad.Sci.USA（美国科学院院刊）84:6624-6629）、蔗糖合酶启动子（Yang（杨）和Russell（罗素）（1990）Proc.Natl.Acad.Sci.USA（美国科学院院刊）87:4144-4148）和泛素启动子。

此外，已经在植物中报道组织特异性调节的核酸和/或启动子。因此，在一些实施例中，可以使用组织特异性启动子。一些报道的组织特异性核酸包括那些编码种子贮藏蛋白（例如β-伴球蛋白、十字花科蛋白（cruciferin）、油菜籽蛋白和菜豆蛋白）、玉米醇溶蛋白或油体蛋白（例如油质蛋白）或者参与脂肪酸生物合成的蛋白质（包括酰基载体蛋白、硬脂酰-ACP去饱和酶和脂肪酸去饱和酶（fad2-1））及胚发育期间表达的其他核酸（例如Bce4，见，例如，Kridl（克里德尔）等人，（1991）Seed Sci.Res（种子科学研究）.1:209-219；以及欧洲专利号255378）。因此，可以在本发明中使用与这些组织特异性核酸相关的启动子。组织特异性启动子的额外实例包括但不局限于根特异性启动子RCc3（Jeong（郑）等人，Plant Physiol（植物生理学）.153:185-197（2010））和RB7（美国专利号5459252）、凝集素启动子（Lindstrom（林斯特龙）等人，（1990）Der.Genet.11:160-167；和Vodkin（沃德金）（1983）Prog.Clin.Biol.Res.（临床与生物研究进展）138:87-98）、玉米醇脱氢酶1启动子（Dennis（丹尼斯）等人，（1984）Nucleic Acids Res（核酸研究）.12:3983-4000）、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸合成酶（SAMS）（Vander Mijnsbrugge（范德麦金布鲁格）等人，（1996）Plant and Cell Physiology（植物与细胞生理学）,37(8):1108-1115）、玉米集光复合体启动子（Bansal（班塞尔）等人，（1992）Proc.Natl.Acad.Sci.USA（美国科学院院刊）89:3654-3658）、玉米热休克蛋白启动子（O'Dell（欧戴尔）等人，（1985）EMBO J.（欧洲分子生物学学会杂志）5:451-458；和Rochester（罗切斯特）等人，（1986）EMBO J.（欧洲分子生物学学会杂志）5:451-458）、豌豆小亚基RuBP羧化酶启动子（Cashmore（卡什莫尔）,“Nuclear genes encoding the small subunit ofribulose-l,5-bisphosphate carboxylase（编码小亚基of核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的核基因）”29-39，引自：Genetic Engineering of Plants（植物基因工程）（Hollaender（霍兰德尔）编辑，Plenum Press出版1983；和Poulsen（浦耳生）等人，（1986）Mol.Gen.Genet.（分子遗传学与普通遗传学）205:193-200）、Ti质粒甘露碱合酶启动子（Langridge（兰格里奇）等人，（1989）Proc.Natl.Acad.Sci.USA（美国科学院院刊）86:3219-3223）、Ti质粒胭脂碱合酶启动子（Langridge（兰格里奇）等人，（1989），上文）、碧冬茄查耳酮异构酶启动子（van Tunen（范杜能）等人，（1988）EMBO J.（欧洲分子生物学学会杂志）7:1257-1263）、菜豆甘氨酸丰富蛋白1启动子（Keller（凯勒）等人，（1989）Genes Dev.（基因与发育）3:1639-1646）、截短型CaMV35S启动子（O'Dell（欧戴尔）等人，（1985）Nature（自然）313:810-812）、马铃薯patatin启动子（Wenzler（文茨勒）等人，（1989）Plant Mol.Biol.（植物分子生物学）13:347-354）、根细胞启动子（Yamamoto（山本）等人，（1990）Nucleic AcidsRes.（核酸研究）18:7449）、玉米玉米醇溶蛋白启动子（Kriz（克里茨）等人，（1987）Mol.Gen.Genet.(分子遗传学与普通遗传学)207:90-98；Langridge（兰格里奇）等人，（1983）Cell（细胞）34:1015-1022；Reina（雷纳）等人，（1990）Nucleic Acids Res.（核酸研究）18:6425；Reina（雷纳）等人，（1990）Nucleic Acids Res.（核酸研究）18:7449；和Wandelt（万德尔特）等人，（1989）Nucleic Acids Res.（核酸研究）17:2354）、球蛋白-1启动子（Belanger（贝朗葛）等人，（1991）Genetics（遗传学）129:863-872）、α-微管蛋白cab启动子（Sullivan（沙利文）等人，（1989）Mol.Gen.Genet.（分子遗传学与普通遗传学）215:431-440）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶启动子（Hudspeth（哈得斯佩斯）和Grula（戈鲁拉）（1989）Plant Mol.Biol.（植物分子生物学）12:579-589）、R基因复合体相关启动子（Chandler（钱德勒）等人，（1989）Plant Cell（植物细胞）1:1175-1183）和查耳酮合酶启动子（Franken（弗兰肯）等人，（1991）EMBO J.（欧洲分子生物学学会杂志）10:2605-2612）。特别可用于种子特异性表达是豌豆的豌豆球蛋白启动子（Czako（切克）等人，（1992）Mol.Gen.Genet.（分子遗传学与普通遗传学）235:33-40；以及美国专利号5,625,136）。用于成熟叶中表达的其他有用启动子是在衰老开始时启动的那些，例如来自拟南芥的SAG启动子（Gan（甘）等人，（1995）Science（科学）270:1986-1988）。此外，可以使用在质体中有功能的启动子。这类启动子的非限制性实例包括噬菌体T3基因95'UTR和在美国专利号7,579,516中公开的其他启动子。随本发明可用的其他启动子包括但不局限于S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子和Kunitz胰蛋白酶抑制剂基因启动子（Kti3）。

在一些情况下，可以使用诱导型启动子。诱导型启动子的实例包括但不局限于四环素阻抑物系统启动子、Lac阻抑物系统启动子、铜诱导型系统启动子、水杨酸酯诱导型系统启动子（例如，PR1a系统）、糖皮质激素诱导型启动子（Aoyama（青山）等人，（1997）Plant J.（植物杂志）11:605-612）和蜕化素诱导性型系统启动子。其他诱导型启动子包括ABA-和膨压-诱导型启动子，植物生长激素结合蛋白基因启动子（Schwob（施沃布）等人，（1993）Plant J.（植物杂志）4:423-432）、UDP葡萄糖类黄酮糖基-转移酶启动子（Ralston（罗尔斯顿）等人，（1988）Genetics（遗传学）119:185-197）、MPI蛋白酶抑制剂启动子（Cordero（科尔德罗）等人，（1994）Plant J.（植物杂志）6:141-150）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子（Kohler（科勒）等人，（1995）Plant Mol.Biol.（植物分子生物学）29:1293-1298；Martinez（马丁内斯）等人，（1989）J.Mol.Biol.（分子生物学期刊）208:551-565；和Quigley（奎格利）等人，（1989）J.Mol.Evol.（分子演化杂志）29:412-421）。还包括苯磺酰胺诱导型（美国专利号5,364,780）和醇诱导型（国际专利申请公开号WO97/06269和WO97/06268）系统和谷胱甘肽S-转移酶启动子。同样地，可以使用Gatz（盖茨）（1996）Current Opinion Biotechnol.（生物技术新见）7:168-172和Gatz（盖茨）（1997）Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.（植物生理学和植物分子生物学年评）48:89-108中描述的任何诱导型启动子。

除上述启动子之外，表达盒也可以包括其他调节序列。如在此使用的，“调节序列”意指位于编码序列上游（5'非编码序列）、内部或下游（3'非编码序列）并影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调节序列包括但不局限于增强子、内含子、翻译前导序列和多聚腺苷化信号序列。

衍生自病毒的多个不翻译的前导序列也已知增强基因表达。确切地，来自烟草花叶病毒（TMV，“ω-序列”）、玉米褪绿斑驳病毒（MCMV）和苜蓿花叶病毒（AMV）的前导序列已经显示有效增强表达（Gallie（加利）等人，（1987）Nucleic Acids Res.（核酸研究）15:8693-8711；和Skuzeski（斯库泽斯基）等人，（1990）Plant Mol.Biol.（植物分子生物学）15:65-79）。本领域已知的其他前导序列包括但不局限于小RNA病毒前导序列例如脑心肌炎病毒（EMCV）5'非编码区前导序列（Elroy（埃尔罗伊）-Stein（斯坦因）等人，（1989）Proc.Natl.Acad.Sci.USA（美国科学院院刊）86:6126-6130）；马铃薯Y病毒前导序列如烟草蚀纹病毒（TEV）前导序列（Allison(艾利森)等人，（1986）Virology(病毒学)154:9-20）；玉米矮化花叶病毒（MDMV）前导序列（Allison(艾利森)等人，（1986），上文）；人免疫球蛋白重链结合蛋白（BiP）前导序列（Macejak（马策亚克）和Samow（萨摩）（1991）Nature（自然）353:90-94）；来自AMV外壳蛋白mRNA的非翻译前导序列（AMV RNA4；Jobling（乔布林）和Gehrke（格尔克）（1987）Nature（自然）325:622-625）；烟草花叶病毒TMV前导序列（Gallie（加利）等人，（1989）Molecular Biologyof RNA（RNA分子生物学）237-256）；和MCMV前导序列（Lommel（罗梅尔）等人，（1991）Virology（病毒学）81:382-385）。还见Della（黛拉）-Cioppa（塞奥帕）等人，（1987）Plant Physiol.（植物生理学）84:965-968。

表达盒也可以任选地包括在植物中有功能的转录和/或翻译终止区（即，终止区）。多种转录终止子可用于表达盒中并且是负责终止超出转基因范围的转录并校正mRNA多聚腺苷化。终止区可以相对于转录起始区是天然的，可以相对于有效连接的感兴趣的核苷酸序列是天然的，可以相对于植物宿主是天然的，或可以衍生自另一个来源（即，相对于启动子、感兴趣的核苷酸序列、植物宿主或其任何组合为外来或异源的来源）。适当的转录终止子包括但不局限于CAMV35S终止子、tml终止子、胭脂碱合酶终止子和豌豆rbcsE9终止子。这些转录终止子可以在单子叶植物和双子叶植物中使用。此外，可以使用编码序列的天然转录终止子。

信号序列可以与本发明的核酸操作地连接以指引核苷酸序列进入细胞区室中。以这种方式，表达盒将包括编码miRNA的核苷酸序列，该miRNA与一种信号序列的核酸序列操作地连接。这种信号序列可以在miRNA的N-或C末端处操作地连接。

无论所用的一个或多个调节序列的类型什么，它们可以均与miRNA的核苷酸序列操作地连接连接。如在此使用的，“操作地连接”意指核酸构建体（例如表达盒）的元件如此配置，从而执行它们的常见功能。因此，与感兴趣的核苷酸序列操作地连接的调节序列或控制序列（例如，启动子）能够影响感兴趣的核苷酸序列的表达。控制序列需要不与感兴趣的核苷酸序列连续，只要它们发挥作用指导其表达即可。因此，例如，不翻译但仍转录的间插序列可以在启动子和编码序列之间存在，并且仍可以将这种启动子序列视为“与编码序列操作地连接”。本发明的核苷酸序列（即，miRNA）可以与调节序列操作地连接，因此允许它在细胞和/或受试者中表达。

表达盒也可以包括可选择标记的核苷酸序列，该可选择标记可以用来选择转化的植物、植物部分或植物细胞。如在此使用的，“可选择标记”意指一种核酸，该核酸在表达时向表达这种标记的植物、植物部分或植物细胞赋予不同表型并且因此允许区分这类转化的植物、植物部分或植物细胞与没有这种标记的那些。此类核酸可以编码可选择标记亦或可筛选标记，这取决于这种标记是否赋予可以通过化学手段选择（例如通过使用选择剂（例如，抗生素、除草剂等））的性状，或取决于这种标记是否简单地是人可以通过观察或测试（例如筛选（例如，R-基因座性状））鉴定的性状。当然，合适可选择标记的许多实例是本领域已知的并且可以用于在此所述的表达盒中。

选择标记的实例包括但不局限于编码neo或nptII的赋予卡那霉素、G418抗性等的核酸（Potrykus（波特里科斯）等人，（1985）Mol.Gen.Genet.（分子遗传学与普通遗传学）199:183-188）；编码bar的赋予膦丝菌素抗性的核酸；编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸（EPSP）合酶的赋草甘膦抗性的核酸（Hinchee等人，（1988）Biotech.6:915-922）；编码腈水解酶（例如来自臭鼻克雷伯氏菌（Klebsiella ozaenae）的bxn）的赋予溴苯腈抗性的核酸（Stalker（斯德克）等人，（1988）Science（科学）242:419-423）；编码改变的乙酰乳酸合酶（ALS）的赋予咪唑啉酮、磺酰脲或其他ALS抑制性化学物抗性的核酸（欧洲专利申请号154204）；编码耐受甲氨蝶呤的二氢叶酸还原酶（DHFR）的核酸（Thillet（泰莱特）等人，（1988）J.Biol.Chem.（生物化学杂志）263:12500-12508）；编码茅草枯脱卤酶的赋予茅草枯脱卤酶的核酸；编码甘露糖-6-磷酸异构酶（也称作磷酸甘露糖异构酶（PMI））的赋予代谢甘露糖能力的核酸（美国专利号5,767,378和5,994,629）；编码改变的邻氨基苯甲酸酯合酶的赋予赋予5-甲基色氨酸抗性的核酸；和/或编码hph的赋予潮霉素抗性的核酸。本领域技术人员能够选择用于表达盒中的合适可选择标记。

额外的可选择标记包括但不局限于，编码β-葡糖醛酸糖苷酶的核酸或编码各种生色底物已知的酶的uidA（GUS）；编码调节植物组织中花青苷色素（红色）产生的产物的R-基因座核酸（Dellaporta等人，“Molecular cloningof the maize R-nj allele by transposon-tagging with Ac（通过转座子加Ac标签法对玉米R-nj等位基因的分子克隆）”263-282引自：Chromosome Structure andFunction:Impact of New Concepts（染色体结构和功能：新概念的影响）,18thStadler Genetics Symposium（第18届斯塔德勒遗传学研讨会）（Gustafson（古斯塔夫森）和Appels（阿佩尔斯）编辑，Plenum Press出版1988））；编码β-内酰胺酶（各种生色底物已知的酶）（例如，PADAC，生色头孢菌素）的核酸（Sutcliffe（苏利夫）（1978）Proc.Natl.Acad.Sci.USA（美国科学院院刊）75:3737-3741）；编码xylE（编码邻苯二酚加氧酶）的核酸（Zukowsky（祖考斯基）等人，（1983）Proc.Natl.Acad.Sci.USA（美国科学院院刊）80:1101-1105）；编码酪氨酸酶（一种能够将酪氨酸氧化成DOPA和多巴醌的酶，多巴醌转而缩合以形成黑色素）的核酸（Katz（卡兹）等人，（1983）J.Gen.Microbiol.（普通微生物学杂志）129:2703-2714）；编码β-半乳糖苷酶（一种存在生色底物的酶）的核酸；编码允许生物发光检测的萤光素酶（lux）的核酸（Ow（奥）等人，（1986）Science（科学）234:856-859）；编码可以在钙敏感生物发光检测中使用的水母发光蛋白的核酸（Prasher（普瑞舍）等人，（1985）Biochem.Biophys.Res.Comm.（生物化学与生物物理研究通讯）126:1259-1268）；或编码绿色荧光蛋白的核酸（Niedz（涅兹）等人，（1995）Plant Cell Reports（植物细胞报告）14:403-406）。本领域技术人员能够选择用于表达盒中的合适可选择标记。

本发明的表达盒也可以包括编码其他所需性状的核苷酸序列。这类序列可以与任何核苷酸序列组合叠加以产生具有所需表型的植物、植物部分或植物细胞。可以通过任何方法产生叠加的组合，该方法包括，但不局限于，通过任何常规方法学或通过遗传转化将植物杂交育种。如果通过遗传转化这些植物进行叠加，则感兴趣的核苷酸序列可以在任何时间并以任何顺序组合。例如，可以使用包括一个或多个所需性状的转基因植物作为靶以便通过后续转化导入其他性状。额外的核苷酸序列可以在共转化方案中随任何表达盒组合提供的本发明核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工微RNA前体分子和/或组合物同时导入。例如，若将导入两个核苷酸序列，则可以将它们在独立的盒中（反式）并入或可以在相同的转化盒上（顺式）并入。这些核苷酸序列的表达可以由相同启动子或由不同启动子驱动。另外认识到，可以使用位点特异性重组系统，在想要的基因组位置处叠加核苷酸序列。见，例如，国际专利申请公开号WO99/25821；WO99/25854；WO99/25840；WO99/25855和WO99/25853。

表达盒也可以包括针对多种农艺性状的一种或多种多肽的编码序列，该农艺性状有益于种子公司、栽培者或粮食加工者（grain processor），例如，细菌病原体抗性、真菌抗性、除草剂抗性、昆虫抗性、线虫抗性和病毒抗性。见例如美国专利号5,304,730；5,495,071；5,569,823；6,329,504和6,337,431。性状也可以是增加植物生长势或产量的一种性状（包括允许植物在不同温度、土壤条件和阳光及降水水平下生长的性状），或允许鉴定显示感兴趣的性状（例如，可选择标记、种皮颜色等）的植物的一种性状。不同感兴趣的性状以及将这些性状导入植物的方法例如在美国专利号4,761,373；4,769,061；4,810,648；4,940,835；4,975,374；5,013,659；5,162,602；5,276,268；5,304,730；5,495,071；5,554,798；5,561,236；5,569,823；5,767,366；5,879,903,5,928,937；6,084,155；6,329,504和6,337,431；以及美国专利申请公开号2001/0016956中描述。还参见lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/的全球资讯网。

已知多个核苷酸序列增强来自转录单位内部的表达，并且这些序列可以与本发明的核苷酸序列连同使用以便增加或增强转基因植物中的表达。例如，已经显示玉米Adhl基因的内含子和内含子1增强基因表达。见，例如，Callis（卡里斯）等人，（1987）Genes Develop（基因发育）.1:1183-1200。

在本发明的一些实施例中，表达盒可以包括与核苷酸序列操作地连接的表达控制序列，其中该核苷酸序列是该dsRNA的一条链或两条链的模板。这种dsRNA模板包括(a)第一（反义）链，它具有与SEQ ID号:931的核苷酸序列的约18至约25个连续核苷酸互补的序列；和(b)具有与第一链完全互补或基本上互补的核苷酸序列的第二（有义）链。在另外实施例中，启动子可以在模板核苷酸序列的任一末端侧部，其中该启动子驱动每条独立DNA链的表达，因此产生杂交并形成dsRNA的两条互补（或基本上互补）性RNA。在可选实施例中，核酸分子在一个转录单元上转录成这种dsRNA的两条链，其中有义链从转录单位的5'末端转录并且反义链从从转录单位的3'末端，其中这两条链由约3至约500碱基对分隔，并且其中转录后，RNA转录物自身折叠以形成短发夹RNA（shRNA）分子。

如在此使用的，“序列同一性”指两个最佳比对的多核苷酸或多肽序列在比对整个组分（例如核苷酸或氨基酸）的窗口范围内不变动的程度。可以通过已知方法轻易地计算“同一性”，该方法包括但不局限于在ComputationalMolecular Biology（计算分子生物学）（Lesk（莱斯克）,A.M.编辑）OxfordUniversity Press（牛津大学出版社）,纽约（1988）；Biocomputing:Informaticsand Genome Projects（生物运算:信息学和基因组项目）（Smith（史密斯）,D.W.编辑）Academic Press（学术出版社）,纽约（1993）；Computer Analysis ofSequence Data（序列数据的计算机分析），第I部分（Griffin（格里芬）,A.M.和Griffin（格里芬）,H.G.编辑）Humana Press（胡马纳出版社）,新泽西（1994）；Sequence Analysis in Molecular Biology（分子生物学中的序列分析）（vonHeinje（冯海耶）,G.编辑）Academic Press（学术出版社）（1987）；和SequenceAnalysis Primer（序列分析引物）（Gribskov（哥博斯科夫），M.和Devereux（德弗罗），J，编辑）Stockton Press出版,纽约（1991）中描述的那些。

如在此使用的，术语“基本上相同”或“对应于”意指两个核酸序列具有至少60%、70%、80%或90%序列同一性。在一些实施例中，两个核酸序列可以具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。

检验序列和参比序列的所比对节段的“同一性分数”是由这两个比对序列共有的相同组分的数目除以参比序列节段（即完整的参比序列或参比序列的更小限定的部分）中组分的总数目。如在此使用的，术语“序列同一性百分比”或“同一性百分比”指在两个序列最佳比对（在比较窗口范围内具有总计小于参考序列20%的适当核苷酸插入、缺失或空位）时，与检验（“对象”）多核苷酸分子（或其互补链）相比，参比（“查询”）多核苷酸分子（或其互补链）的直链多核苷酸序列中相同核苷酸的百分比。在一些实施例中，“同一性百分比”可以指氨基酸序列中相同氨基酸的百分比。

用于比对比较窗口的最佳序列比对是本领域技术人员熟知的并且可以通过工具（例如Smith（史密斯）和Waterman（沃特曼）的局部同源性算法、Needleman（尼德曼）和Wunsch（翁施）的同源性比对算法、Pearson（皮尔逊）和Lipman（利普曼）的相似性搜索方法）并且任选地通过这些算法的计算机化执行（例如作为

Wisconsin

（Accelrys Inc.Burlington,Mass.）的部分可获得的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)来实施。检验序列和参比序列的所比对节段的“同一性分数”是由这两个比对序列共有的相同组分的数目除以参比序列节段（即完整的参比序列或参比序列的更小限定的部分）中组分的总数目。序列同一性百分比表述为同一性分数乘以100。一个或多个多核苷酸序列的比较可以是相对于全长多核苷酸序列或其部分，或相对于更长的多核苷酸序列进行比较。出于本发明的目的，还可以使用针对翻译的核苷酸序列的BLASTX2.0版以及针对多核苷酸序列的BLASTN2.0版，确定“同一性百分比”。

可以使用序列分析软件包TM（版本10；Genetics Computer Group,Inc.（基因计算集团公司），Madison（麦迪逊），Wis.（威斯康辛州））的“Best Fit”或“Gap”程序确定序列同一性百分比。“Gap”使用Needleman（尼德曼）和Wunsch（翁施）算法（Needleman（尼德曼）和Wunsch（翁施）,J Mol.Biol.（分子生物学杂志）48:443-453,1970）来找到两个序列的使匹配数最大化并使空位数最小化的比对结果。“BestFit”执行两个序列之间最佳相似性区段的最佳比对并且使用Smith（史密斯）和Waterman（沃特曼）局部同源性插入空位以使匹配数最大化（Smith（史密斯）和Waterman（沃特曼）,Adv.Appl.Math.（应用数学进展）,2:482-489,1981,Smith（史密斯）等人，Nucleic AcidsRes.（核酸研究）11:2205-2220,1983）。

用于确定序列同一性的有用方法也在Guide to Huge Computers（大型计算机指南）（Martin J.Bishop（马丁J.毕夏普）编辑，Academic Press（学术出版社）,圣迭戈（1994））以及Carillo（卡里略）,H.和Lipton（立顿）,D.（Applied Math（应用数学）48:1073（1988））中披露。更具体地，用于确定序列同一性的优选计算机程序包括但不局限于基本局部比对搜索工具（BLAST）程序，它是在National Library of Medicine（国家医学图书馆）,National Institute of Health（国家卫生研究院）,Bethesda（贝塞斯达）,Md.20894的National Center Biotechnology Information（国家生物信息中心，NCBI）公开可获得；见BLAST手册，Altschul（阿尔丘尔）等人，NCBI，NLM，NIH；（Altschul（阿尔丘尔）等人，J.Mol.Biol.（分子生物学期刊）215:403-410（1990））；2.0或更高版本的BLAST程序允许向比对结果引入空位（缺失和插入）；对于肽序列，BLASTx可以用来确定序列同一性；并且对于多核苷酸序列，BLASTn可以用来确定序列同一性。

因此，本发明进一步提供与本发明的核苷酸序列具有显著序列同一性的核苷酸序列。显著序列相似性或同一性意指与另一个核苷酸序列至少70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、96%、97%、98%、99%和/或100%的相似性或同一性。

以下实施例不意在显示本发明的权利要求书范围，反而意在说明某些实施例。在向技术人员呈现的所例举方法中的任何变体意在落入本发明的范围内。如本领域技术人员将理解，对于要求保护的发明的每个方面，存在几个实施例和要素，并且因此预见了不同要素的全部组合，从而在此例举的具体组合不得解释为限制如要求保护的本发明范围。如果将特定要素移去或添加至组合中可获得的要素群组，则这种要素群图应解释为已经并入这种变化。

实例

实例1.靶向Hg-rps23EST的不同区域siRNA

概述.将4种不同小干扰性RNA（siRNA）双链体设计成靶向大豆囊胞线虫（SCN）的Hg-rps23EST（

数据库登录号BF014259；SEQ ID号:931）的不同区域。随后将SCN的二龄幼虫（J2）浸泡在这些化学合成的siRNA双链体中，接着在宿主植物上进行后续线虫繁殖测定。两种siRNA双链体示出使J2不动并减少宿主植物上形成的胞囊数目。

实验方法.设计并且化学合成靶向SCN的Hg-rps23EST的四siRNA双链体。该算法基于处http://www/genelink.com的在线工具。siRNA双链体的序列是：1.si-rps23-1，有义链：GAAGCGCAAUUUCCGAGAATT（包括3'TT的SEQ ID号:927（表3）），反义链：UUCUCGGAAAUUGCGCUUCTT（包括3'TT的SEQ ID号:863）；2.si-rps23-2，有义链AUUGCAAAUUGUUUUGAAATT（包括3'TT的SEQ ID号:928（表3）），反义链：UUUCAGAGCAAUUUGCAAUTT（包括3'TT的SEQ ID号:836）；3.si-rps23-3，有义链UUGCAUCCUUGGUGAUUAATT（包括3'TT的SEQ ID号:929（表3）），反义链：UUGGUCGCCAAGGAUGCAATT（包括3'TT的SEQ ID号:740）；4.si-rps23-4，有义链ACCUGAAGAAGUUGAACAATT（包括3'TT的SEQ ID号:930（表3）），反义链：UUGUUCAACUUCUUCAGGUTT（包括3'TT的SEQID号:669）。

一个对照是来自GeneLink（目录号#27-6411-20）的有义链序列和反义链序列未知的阴性siRNA双链体（si-对照）。另一个对照是H₂O。

将新鲜孵化的SCN J2在以下条件浸泡在96孔板中的siRNA溶液内：250条J2/孔，每个孔含有不同的siRNA双链体；siRNA双链体浓度=0.5μg/μl，奥克巴胺浓度=50μM，温度=26°C。

在暗处浸泡四日后，观察J2。结果是：

H₂O对照：大部分J2活跃地移动；si-对照：大部分J2活跃地移动；si-rps23-1：大部分J2不动；si-rps23-2：大部分J2活跃地移动，一些不动；si-rps23-3：一些J2s活跃地移动，一些不动；并且si-rps23-4：大部分J2不动

图1示出每个处理中J2的照片。弯曲的J2表示移动，并且直线或“C”型的J2表示不活动。从结果中显而易见：si-rps23-1和si-rps23-4可以使J2不动。

在另一个重复实验中，将以上对照和si-rps23-1和si-rps23-4在相同条件下用来处理SCN J2。每种处理中处理相等数目的J2，在处理后4日观察到相似结果。随后将线虫接种到小袋中生长的大豆籽苗上并且在26°C培养，伴以16hr光照/日。每只小袋含有一株大豆籽苗并且用来自一个处理的J2接种。一个月之后，计数每只小袋上的胞囊数目。随后将胞囊数字对siRNA处理作图并且在图2中呈现（n=重复数）。

从这些实验中得出结论：si-rps23-1和the si-rps23-4双链体能够使SCN J2不动并且显著地减少宿主植物上的胞囊形成。

将si-rps23-1和si-rps23-4以短发夹RNA（shRNA）的方式在转基因大豆须根中表达。sh-rps23-1的shRNA序列是gaagcgcaatttccgagaatatcaagagtattctcggaaattgcgcttctgttttttt(SEQ ID号:932)，而sh-rps23-4的shRNA序列是acctgaagaagttgaacaatatcaagagtattgttcaacttcttcaggttgttttttt(SEQ ID号:933)。实施大豆囊胞线虫测定法并且将这些转基因根上胞囊的数目与阴性对照比较。图3中显示结果。结果表明，过量表达sh-rps23-1的须根中胞囊的平均数目显著低于过量表达GUS基因的对照根。

采用过量表达人工微RNA（amiRNA）形式的si-rps23-1的另一个方法。使用大豆微RNA前体gma-MIR164作为主链。这个前体上的miR164/miR164*序列由si-rps23-1/si-rps23-1*序列替换，而在si-rps23-1/si-rps23-1*序列中维持miR164/miR164*双链体上的错配位置。将这种人工miRNA命名为amiRrps23-1，并且其序列是ggatccagctccttgtttctcggaaattgcgcttcttagtctcttggatctcaaatgccactgaacccaagaagcgcaacctccgagaacaacacgggtttgagctc(SEQ ID号:934)。将amiRrps23-1转化至大豆须根，并且用大豆囊胞线虫J2s接种多个事件。允许线虫在根上发育成胞囊，并且将不同事件上胞囊的平均数目与对照比较。在图4中示出这些结果。结果表明，过量表达amiR-rps23-1的须根中胞囊的平均数目显著低于过量表达amiR-GUS-2的对照根。

实例2.人工微RNA在植物宿主中的表达使有害生物/病原体中的靶基因沉默

设计人工微RNA。如Schwab（施瓦布）等人中所述（“Highly specific genesilencing by artificial microRNAs in Arabidopsis（在拟南芥中由人工微RNA引起的高度特异性基因沉默）”The Plant Cell（植物细胞）18:1121-1133（2006）设计人工微RNA以便在植物宿主细胞中表达抗有害生物的小RNA，其全部内容通过引用结合在此用于教授人工微RNA的用途），其中将amiRNA设计成靶向植物细胞中的单个基因或内源基因群。

对于本发明的研究，我们选择大豆miRNA前体gma-MIR164作为amiRNA的主链。gma-MIR164的序列如下：

agcuccuuguuggagaagcagggcacgugcaagucucuuggaucucaaaugccacugaacccuuugcacgugcuccccuucuccaacacggguuu(SEQ ID号:935)。转录物的折叠结构如下：

-  u  u  ca  --uc  -u  aucu

agc cc uguuggagaag  gggcacgugcaag  uc  ugg  c

uug gg acaaccucuuc  cucgugcacguuu  ag  acc  a

u  -  c  cc  ccca  uc  guaa

在由切酶dicer加工后，miR164/miR164*双链体将从前体产生，并且进一步加工将产生成熟的引导链miRNA164和载客链miR164*。

为设计这种amiRNA，将以上miR164/miR164*链替换为抗SCNsiRNA/siRNA*链，同时保持前体的其余部分。

作为实例，将miR164/miR164*链替换为靶向大豆囊胞线虫（SCN）hg-rps23基因的siRNA/siRNA*。在体外浸泡实验中，已经证明siRNA双链体si-rps23-1/si-rps23-1*使SCN J2不动。si-rps23-1/si-rps23-1*双链体的序列是：

si-rps23-1：uucucggaaauugcgcuucuu(SEQ ID号:863)

si-rps23-1*：gaagcgcaauuuccgagaa(SEQ ID号:927；表3)

在miR164/miR164*双链体中，在两条链之间在中部存在ca/cc错配，该错配可能对miRNA加工重要，因此，也突变si-rps23*-1的序列以便在相同的位置产生错配。突变的si-rps23-1*序列是：gaagcgcaaccuccgagaa(SEQ ID号:936)。

用si-rps23-1/si-rps23-1*的序列替换gma-MIR164前体中的miR164/miR164*后，amiRNA（amiR164-rps23-1）的序列是：agcuccuuguuucucggaaauugcgcuucuuagucucuuggaucucaaaugccacugaacccaagaagcgcaaccuccgagaacaacacggguuu(SEQ ID号:937)，并且amiRNA前体转录物的折叠结构如下：

-  u  u  --  aa  a-|c  u-  aucu

agc cc ugu uucucgga uugcgcuucuu gu uc ugg c

uug gg aca aagagccu aacgcgaagaa ca ag acc a

u  -c  ac  cc  cc^-  uc  guaa

转基因根产生。这个步骤的目的是产生过量表达si-rps23-1小RNA的转基因大豆根。

1.将以上amiRNA（amiR164-rps23-1）在CMP启动子之后克隆至双元载体中。

2.随后将这种双元载体转化至发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）菌株K599中。

3.将携带这种双元载体的发根农杆菌K599菌株接种到大豆子叶上并且数周后诱导转基因须根。

检测转基因根中的si-rps23-1。这个步骤的目的是检测转基因大豆根中si-rps23-1的表达。

1.从表达上述amiRNA前体的转基因大豆根提取RNA。

2.使用si-rps23-1小RNA特异性结合的探针，实施RNA印迹分析以检测si-rps23-1小RNA。图5中的结果显示si-rps23-1（箭头）在须根样品中产生（泳道3、4、5）。泳道2=阴性对照根，泳道1=分子标记。

在转基因根上的线虫生物测定。这个步骤的目的是检验si-rps23-1对SCN在转基因根上繁殖的影响。

1.过量表达isi-rps23-1的转基因根被SCN二龄幼虫（J2）感染。作为对照，过量表达靶向GUS基因的amiRNA的转基因根也被SCN J2感染。

2.将根和线虫培养1个月，并且在两个构建体之间比较根上形成的胞囊的数目。表4示出比较平均胞囊的概述。方差分析检验表明，过量表达amiR164-rps23-1的转基因根上的平均胞囊形成显著低于过量表达amiR164-GUS的转基因根（p<0.05）。

概述。使用植物miRNA的背景，设计抗有害生物小RNA并且以人工微RNA的形式过量表达。RNA印迹表明，植物细胞中产生这种小RNA，并且生物测定表明，这种小RNA能够减少有害生物繁殖。

实例3.在过量表达si-rps23-1的转基因植物上的线虫测定法。

将实例1中所述的sh-rps23-1转化入大豆栽培品种Williams82以产生转基因大豆植株。通过使用品种Williams82的不成熟种子靶，经由根癌农杆菌介导的转化，使用如2008年Hwang（黄）等人（PCT公开号WO/08112044）和Que（克）等人（PCT公开号WO/08112267）中所述的外植体材料和培养基配方（除以下标注处），实现这一点。使用这种方法，将转化质粒的左边界区和右边界区内部的遗传元件高效地转移并整合至植物细胞的基因组中，同时总体上不转移在这些边界区外部的遗传元件。来自温室生长的植物收获正在成熟的大豆荚，将它们用稀释的漂白液消毒并且用无菌水淋洗。随后将不成熟的种子从种荚中切下并用无菌水短暂淋洗。将外植体从消毒的不成熟种子中如2008年Hwang（黄）等人（PCT公开号WO/08112044）所述那样制备并且用携带转化双元载体的根癌农杆菌菌株EHA101感染，并且允许其温育额外30分钟至240分钟。通过抽吸移去过量的根癌农杆菌悬液，并且将外植体移至含有非选择性共培养培养基的平板。将外植体在23°C与剩余的根癌农杆菌在暗处共培养4日。随后将外植体转移至补充有抗生素混合物的恢复和再生培养基（由替卡西林（75mg/L）、头孢噻肟（75mg/L）和万古霉素（75mg/L）组成）并且在暗处温育7日。随后将外植体转移至再生培养，该再生培养含有潮霉素B（3mg/L至6mg/L）及由替卡西林（75mg/L）、头孢噻肟（75mg/L）和万古霉素（75mg/L）组成的抗生素混合物以抑制和杀死根癌农杆菌。在含有选择剂的伸长培养基中实施苗伸长。将再生的小植物移栽至如（PCT公开号WO/08112267）描述的土壤并且通过

PCR分析检验选标记序列和CMP启动子序列二者的存在（Ingham（英厄姆）等人，2001）。这种筛选允许选出携带T-DNA且不含载体主链DNA的转基因事件。将对为选择基因和CMP序列为阳性和对spec基因为阴性的植转移至温室。

当根是约2-3英寸时，则将植物移栽至1加仑钵中，该钵使用Fafard#3土壤和1/8杯（30克）掺入的Osmocote外加15-9-12。将这些植物彻底浇水并置于设定成16小时白昼的荧光灯照明下的柜内。温度设置是85oF-白昼和70oF-夜晚。将它们每日一次浇水。在已经进行二次采样后，则将植物置于自动滴灌系统上并且每日二次浇水。照明是具有400瓦和1000瓦灯泡的金属卤化物和钠蒸气固定装置的组合。计划这些进行10小时/日。温度设在79oF-白昼和70oF-夜晚。湿度是环境湿度。植物以这种方式维持直至豆荚达到成熟。随后收获豆荚，置于纸袋中，晾干2日并随后在80oF机器干燥另外2日。将豆荚脱皮并且收获T1种子并贮存在4℃和20%湿度直至将来测定。

来自15个T0事件中每一个事件的40粒T1种子在湿纸巾中在24°C萌发5日。将具有1.5英寸或更长根的萌发籽苗移栽至湿的萌发小袋中，每只小袋1株籽苗，并且在24°C培养24小时。每株籽苗随后用含有500个SCN J2的1ml水接种。随后以16小时/日光照在24°C培养籽苗35日，在此期间弃去存在真菌污染的籽苗。在SCN接种后21日，对每株籽苗的叶采样，用于

测定prAR6启动子的接合性。由于prAR6紧邻T-DNA上的sh-rps23-1基因上游，其拷贝数可能代表sh-rps23-1基因拷贝数。基于转基因的拷贝数，确定T1的接合性如下：无效（0拷贝）；杂合（1拷贝）；纯合（2个或更多个拷贝）。在SCN接种后35日，计数每株籽苗上胞囊的数目。比较相同T0事件的无效、杂合和纯合植株平均胞囊数。如图6中示出，与无效或杂合植株相比，相同事件的纯合植株的平均胞囊数减少。

所有这些公开物和专利申请均通过引用结合在此，其程度如同每个单独的公开物或专利申请被确切地并单独地指明通过引用而被结合。

尽管已经为了清楚理解的目的通过解释和实例详细地描述了以上发明，明显的是在以上实施例列表以及所附权利要求的范围内可以实践某些改变和变更。

表3:

针对hg-rps-23的有义siRNA序列

(SEQ ID号:927)gaagcgcaauuuccgagaa

(SEQ ID号:928)auugcaaauuguuuugaaa

(SEQ ID号:929)uugcauccuuggugauuaa

(SEQ ID号:930)accugaagaaguugaacaa

表4.

GOI	amiR164-GUS	amiR164-rps23-1
			#根事件	9	6
胞囊	38.6	22.7
			SD	15.5	5.3

Claims (62)

1.一种包括反义链和有义链的双链RNA分子，其中该反义链的核苷酸序列与一种大豆囊胞线虫的Hg-rps-23基因的核苷酸序列的一部分互补，该部分基本上由SEQ ID号:931的约18至约25个连续核苷酸组成；其中该双链RNA分子抑制Hg-rps-23基因的表达。

2.根据权利要求1所述的RNA分子，其中Hg-rps-23基因的核苷酸序列的该部分基本上由SEQ ID号:1-463（表1）中任一个的核苷酸序列组成。

3.根据权利要求1所述的RNA分子，其中Hg-rps-23基因的核苷酸序列的该部分基本上由SEQ ID号:64的核苷酸序列组成。

4.根据权利要求1所述的RNA分子，其中Hg-rps-23基因的核苷酸序列的该部分基本上由SEQ ID号:258的核苷酸序列组成。

5.根据权利要求1所述的RNA分子，其中该反义链的核苷酸序列基本上由SEQ ID号:464-926（表2）中任一个的核苷酸序列组成。

6.根据权利要求1所述的RNA分子，其中该反义链的核苷酸序列基本上由SEQ ID号:863的核苷酸序列组成。

7.根据权利要求1所述的RNA分子，其中该反义链的核苷酸序列基本上由SEQ ID号:669的核苷酸序列组成。

8.根据权利要求1所述的RNA分子，其中该有义链的核苷酸序列基本上与该反义链的核苷酸序列互补。

9.根据权利要求1所述的RNA分子，其中该有义链的核苷酸序列完全与该反义链的核苷酸序列互补。

10.根据权利要求1所述的RNA分子，其中该双链RNA分子是短发夹RNA（shRNA）分子。

11.一个核酸构建体，包括根据权利要求1-10中任一项所述的RNA分子。

12.一个核酸分子，编码根据权利要求1-10中任一项所述的RNA分子。

13.一个核酸构建体，包括根据权利要求12所述的核酸分子。

14.一个嵌合核酸分子，包括与植物微RNA前体分子操作地相关的具有SEQ ID号:464-926中任一个的核苷酸序列的反义链。

15.根据权利要求14所述的嵌合核酸分子，其中该植物微RNA前体分子是一个大豆微RNA前体。

16.根据权利要求15所述的嵌合核酸分子，其中该植物微RNA前体分子是gma-MIR164。

17.一个核酸构建体，包括根据权利要求14-16中任一项所述的嵌合核酸分子。

18.一个核酸分子，编码根据权利要求14-16中任一项所述的嵌合核酸分子。

19.一个核酸构建体，包括根据权利要求18所述的核酸分子。

20.一个人工植物微RNA前体分子，包括具有SEQ ID号:464-926中任一个的核苷酸序列的反义链。

21.根据权利要求20所述的人工植物微RNA前体分子，其中该微RNA前体分子是一个大豆微RNA前体分子。

22.根据权利要求21所述的人工植物微RNA前体分子，其中该微RNA前体分子是gma-MIR164。

23.一个核酸构建体，包括根据权利要求20-22中任一项所述的人工植物微RNA前体分子。

24.一个核酸分子，编码根据权利要求20-22中任一项所述的人为植物微RNA。

25.一个核酸构建体，包括根据权利要求24所述的核酸分子。

26.根据权利要求11、13、17、19、23或25中任一项所述的核酸构建体，其中该核酸构建体是一个表达载体。

27.组合物，包括两种或更多种根据权利要求1、2、5、8、9或10中任一项所述的RNA分子，其中这两种或更多种RNA分子各自包括一个不同的反义链。

28.根据权利要求27所述的组合物，其中这两种或更多种RNA分子在相同的核酸构建体上、在不同的核酸构建体上或其任何组合上存在。

29.根据权利要求27或28中任一项所述的组合物，包括了包括基本上由SEQ ID号:863的核苷酸序列组成的反义链的一个RNA分子和包括基本上由SEQ ID号:669的核苷酸序列组成的反义链的一个RNA分子。

30.组合物，包括两种或更多种根据权利要求11、17或23中任一项所述的核酸构建体，其中这两种或更多种核酸构建体各自包括一个不同的反义链。

31.一种组合物，包括两种或更多种根据权利要求12、18或24中任一项所述的核酸分子，其中这两种或更多种核酸分子各自编码一个不同的反义链。

32.一种组合物，包括两种或更多种根据权利要求13、19或25中任一项所述的核酸构建体，其中这两种或更多种核酸构建体各自包括编码不同反义链的一个核酸分子。

33.一种组合物，包括两种或更多种根据权利要求14-16所述的嵌合核酸分子，其中这两种或更多种嵌合核酸分子各自包括一个不同的反义链。

34.一种组合物，包括两种或更多种根据权利要求20-22中任一项所述的人工植物微RNA前体分子，其中这两种或更多种人工植物微RNA前体分子各自包括一个不同的反义链。

35.一种转化植物细胞，包括根据相应前述权利要求中任一项所述的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物，其中与一种对照植物细胞相比，这一转化植物细胞具有对大豆囊胞线虫感染的增强的抗性。

36.根据权利要求35所述的植物细胞，其中该植物细胞是一种豆科植物细胞。

37.根据权利要求36所述的植物细胞，其中该植物细胞是一种大豆植物细胞。

38.一种转基因植物，包括根据相应前述权利要求中任一项所述的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物，其中与一种对照植物相比，该转基因植物具有对大豆囊胞线虫感染的增强的抗性。

39.根据权利要求38所述的转基因植物，其中该转基因植物是一种豆科植物。

40.根据权利要求39所述的转基因植物，其中该转基因植物是一种大豆植物。

41.增强植物细胞对线虫感染的抗性的一种方法，包括向该植物细胞导入根据相应前述权利要求中任一项所述的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物，由此增强该植物细胞对该线虫感染的抗性。

42.用于控制线虫对植物细胞感染的一种方法，包括使感染该植物细胞的线虫与根据相应前述权利要求中任一项所述的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物接触，因此控制该线虫对该植物细胞的感染。

43.增强植物对线虫感染的抗性的一种方法，包括向该植物的细胞导入根据相应前述权利要求中任一项所述的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物，因此增强该植物细胞对该线虫感染的抗性。

44.用于控制线虫对植物感染的一种方法，包括使感染该植物的线虫与根据相应前述权利要求中任一项所述的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物接触，因此控制该线虫对该植物的感染。

45.减少受线虫感染的植物的根上线虫囊胞发育的一种方法，包括向该植物的细胞导入根据相应前述权利要求中任一项所述的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物，由此减少该植物的根上的线虫囊胞发育。

46.产生具有对线虫感染的增强的抗性的转化植物细胞的一种方法，包括向该植物细胞导入根据相应前述权利要求中任一项所述的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物，因此产生相对于一种对照植物细胞具有对线虫感染的增强的抗性的转化植物细胞。

47.一种转化植物细胞，由根据权利要求46所述的方法产生。

48.产生具有对线虫感染的增强的抗性的转基因植物的一种方法，包括将该植物的细胞用根据相应前述权利要求中任一项所述的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物转化，因此产生相对于一种对照植物具有对线虫感染的增强的抗性的一种转基因植物。

49.一种转基因植物，由根据权利要求48所述的方法产生。

50.产生具有对线虫感染的增强的抗性的转基因植物的一种方法，包括：

a)将植物细胞用根据相应前述权利要求中任一项所述的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物接转化以产生一种转化植物细胞；并且

b)使这一转化植物细胞生长成一种转基因植物，由此该转基因植物相对于一种对照植物具有对线虫感染的增强的抗性。

51.一种转基因植物，由根据权利要求50所述的方法产生。

52.根据权利要求49或51所述的转基因植物的一种子代植物，其中该子代植物是一种转基因植物。

53.根据权利要求49、51或52所述的转基因植物的种子，其中该种子是一种转基因种子。

54.根据权利要求41、42、46或47中任一项所述的方法，其中该植物细胞是一种豆科植物细胞。

55.根据权利要求54所述的方法，其中该植物细胞是一种大豆植物细胞。

56.根据权利要求43、44、48、49、50、51、52或53中任一项所述的方法，其中该植物是一种豆科植物。

57.根据权利要求56所述的方法，其中该植物是一种大豆植物。

58.根据权利要求41-57中任一项所述的方法，其中该线虫是一种大豆囊胞线虫。

59.一种作物，包括在农田中栽种在一起的多株根据相应前述权利要求中任一项所述的转基因植物。

60.一种改进作物产量的方法，包括：

a)将根据相应前述权利要求中任一项所述的核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微RNA前体分子和/或组合物导入一种植物的细胞；并且

b)将(a)的多株植物培育为作物，产生具有对线虫感染的增强的抗性的多株植物，因此改进作物产量。

61.根据权利要求59所述的作物或根据权利要求60所述的方法，其中该植物是一种豆科植物。

62.根据权利要求59所述的作物或根据权利要求60所述的方法，其中该植物是一种大豆植物。

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