CN116814676A - 基于rna干扰技术提高植物抗虫性的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物防治技术领域，尤其涉及一种基于RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法及其应用。所述方法包括：将害虫靶标基因的CDS序列和靶向所述靶标基因的dsRNA的编码序列整合进植物细胞核基因组中，使所述植物能够同时表达产生所述靶标基因的mRNA和靶向所述靶标基因的dsRNA。本发明基于前述方法得到的转基因植物，靶标基因mRNA可作为模板，在植物细胞内RNA依赖的RNA聚合酶的作用下，基于植物细胞内的传递性沉默机制快速有效积累siRNA，当该植物组织被害虫取食后，结构稳定性强的siRNA可稳定穿过害虫肠道并有效激活RNAi通路，进而显著提高害虫RNAi效率，增强植物抗虫性能和对害虫的防治效果。

Description

基于RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物防治技术领域，特别涉及一种基于RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法及其应用。

背景技术

在生物体内引入与靶基因序列相同的外源双链RNA而导致的靶基因表达水平下降的现象被称为RNA干扰(RNA interference，RNAi)。RNAi机制在植物、真菌、昆虫、脊椎动物等真核生物中普遍存在，是真核生物用于对抗病毒、外来转基因和转座元件的保守性基因组防御机制。

基于害虫体内RNAi机制抑制或沉默昆虫特定基因的表达，探索害虫防治的新策略，为农业可持续发展提供了一条全新解决途径。植物介导RNAi抗虫技术通过转基因技术使寄主植物表达靶标害虫关键基因的双链RNA(dsRNA)，当害虫取食该转基因植物以后，dsRNA随着植物组织一同被害虫肠道吸收，dsRNA的摄入激活害虫体内的RNAi通路并诱发基因沉默现象，即：当dsRNA被吸收进入真核细胞以后，胞内的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成21-24nt的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，随后siRNA与胞内的AGO蛋白等形成RNA诱导沉默复合体(siRNA-induced silencing complex，RISC)，随即，其正义链被降解，激活后的RISC在反义链的引导下，通过碱基互补配对原则识别靶标mRNA，由Agonaute(AGO)蛋白对与siRNA互补的mRNA进行切割，导致靶标mRNA降解，进而干扰害虫关键基因的表达，导致害虫的生长发育受到显著抑制甚至造成死亡，最终达到防治害虫、保护植物的目的。植物介导RNAi抗虫技术因其特异性高、杀虫专一性强、对环境友好、对非靶标生物无害等特点，在农业害虫防治领域应用前景广泛。

尽管植物介导的RNAi害虫防治策略已经取得了一定成效，但其针对不同种类害虫的防治效果存在差异，尤其是对鳞翅目害虫的防治效果相对较低，已有研究表明，导致鳞翅目昆虫RNAi效率普遍较低的主要原因包括：1)、鳞翅目昆虫肠道分泌的dsRNA酶对摄入dsRNA的降解，导致dsRNA被内化进植物细胞的量减少，无法有效地被加工成siRNA以触发持续性RNAi现象；2)、鳞翅目昆虫体内不存在RNAi信号放大机制，限制了RNAi的效率；3)、昆虫体内不存在系统性RNAi机制，无法将RNAi信号扩散。因此，亟需解决鳞翅目昆虫RNAi效率普遍较低的问题，提高植物介导RNAi策略对昆虫尤其是鳞翅目害虫的防治效果。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种基于RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法，并提供了由该方法制备得到的转基因植物在在害虫防治中的应用，本发明通过同时在植物细胞内表达害虫靶标基因的CDS序列和靶向害虫靶标基因的dsRNA编码基因，可基于传递性沉默机制快速大量积累用于基因沉默的siRNA，进而高效激活取食转基因植物的害虫的RNAi通路，实现高效抗虫。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明的第一方面提供了一种基于RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法，包括以下步骤：

将害虫靶标基因的CDS序列和靶向所述靶标基因的dsRNA的编码序列整合进植物细胞核基因组中，使所述植物能够同时表达产生所述靶标基因的mRNA和靶向所述靶标基因的dsRNA。

进一步地，所述靶标基因选自昆虫特有的基因、昆虫管家基因、与昆虫抗性或免疫相关的基因或与昆虫行为有关的基因中的一种或多种。

更进一步地，所述靶标基因选自乙酰胆碱酯酶基因、AV2基因、GPCR基因、ATPase基因、ATP合酶基因、Cathespin基因、IAP基因、APN基因、Ace1基因、Dhc64C基因和ABCC2基因中的一种或多种。

进一步地，所述dsRNA为hpRNA，所述hpRNA由所述靶标基因的300-500bp片段、内含子序列和所述300-500bp片段的反向互补序列三部分构成。

进一步地，将害虫靶标基因的CDS序列和靶向所述靶标基因的dsRNA的编码序列整合进植物细胞核基因组中的方法包括以下步骤：

将所述靶标基因的CDS序列和所述dsRNA的编码序列构建到植物表达载体中，之后通过基因枪法、电击法、显微注射法或农杆菌介导法将所述植物表达载体导入植物细胞内，实现所述靶标基因的CDS序列和所述dsRNA的编码序列向植物细胞的转移与整合。

更进一步地，所述植物表达载体选自pCambia1300、pCambia1301或pCambia2300。

进一步地，所述害虫选自草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、苹果小卷叶蛾、棉铃虫、菜粉蝶、小菜蛾、亚洲玉米螟和印度谷螟中一种或多种。

进一步地，所述植物选自松树、柏树、苹果、梨、菠萝、油菜、白菜、土豆、小麦、大麦、水稻、玉米、花生、高粱、马铃薯、大豆、烟草和棉花中一种或多种。

进一步地，所述靶标基因选自棉铃虫HaATPH基因，其CDS序列见SEQ ID NO.1所示，所述dsRNA的编码序列见SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二方面提供了如上所述的基于RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法制备得到的转基因植物在害虫防治中的应用。

本发明的第三方面提供了一种害虫防治的生物药物，所述药物的活性成分包括如上所述的基于RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法制备得到的转基因植物。

本发明的优点及积极效果为：

1、本发明通过将害虫靶标基因的CDS和dsRNA编码基因同时整合进植物细胞核基因组内，得到的转基因植物能够同时表达产生靶标基因mRNA和及其特异性dsRNA，其中，靶标基因mRNA可作为模板，在植物细胞内RNA依赖的RNA聚合酶的作用下，以初始表达的dsRNA切割产生的siRNA为引物扩增得到新合成的dsRNA，新合成的dsRNA进一步被Dicer酶切割成次级siRNA，进而基于植物细胞内的传递性沉默机制快速有效积累siRNA，当该转基因植物组织被害虫取食后，植物细胞内积累的大量siRNA由于结构稳定性强，可稳定穿过害虫肠道并有效激活害虫体内的RNAi通路，进而显著提高害虫RNAi效率，引发不利于害虫生长发育的征状，进而增强植物抗虫性能和对害虫的防治效果。

2、本发明通过同时表达靶标基因dsRNA及其mRNA序列导致siRNA在寄主植物积累量显著提高的新策略，不受寄主植物以及害虫种类的限制，适用范围广。

3、本发明的操作方法简单，实用性强，具有较强的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例的siRNA在植物细胞内积累的流程和植物细胞内的siRNA引起昆虫细胞内RNAi反应的原理图；

图2为本发明实施例靶向靶标基因HaATPH的siRNA在转基因烟草中积累量检测结果图，其中，图A为探针1-3结合HaATPH基因的位置图，图B为探针1检测siRNA表达量的凝胶电泳图，图C为探针2检测siRNA表达量的凝胶电泳图，图D为探针3检测siRNA表达量的凝胶电泳图；

图3为本发明实施例取食转基因烟草后害虫体内靶标基因HaATPH的相对表达量检测结果图，其中，图A为离体转基因烟草叶片喂养棉铃虫第2天中HaATPH基因相对表达量的变化图，图B为离体转基因烟草叶片喂养棉铃虫第4天中HaATPH基因相对表达量的变化图，图中不同小写字母表示差异性显著；

图4为本发明实施例取食转基因烟草后害虫体重变化结果图，其中，图A为离体转基因烟草叶片喂养棉铃虫第2天后幼虫体重的变化图，图B为离体转基因烟草叶片喂养棉铃虫第4天后幼虫体重的变化图，图中不同小写字母表示差异性显著。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本发明包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。另外，术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。

在本发明的前期研究中发现，植物细胞核转化表达dsRNA对害虫有一定的抗性，而质体转化表达dsRNA却没有表现出抗虫效果，这是因为激活害虫体内RNAi通路的关键分子并非dsRNA，而是dsRNA经Dicer蛋白切割后生成的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)。同时，siRNA相较于dsRNA在昆虫体内的稳定性更高，不易被昆虫肠道内的dsRNA酶降解。此外，细胞核转化表达的dsRNA能够被植物本身所表达的Dicer酶切割成siRNA，但在质体转化植物体内以dsRNA的形式存在。前述特征是导致细胞核转化表达dsRNA的植物对害虫表现出一定抗性、而质体转化表达dsRNA的植物抗虫效果弱的主要原因。因此，理论上认为，只要增加靶标害虫关键基因siRNA在寄主植物内的积累量，就能提高植物介导RNAi的效率，从而进一步提高植物的抗虫性能和对害虫的防治效果。

在植物体内，siRNA不仅会装载到AGO蛋白中对mRNA进行切割，同时，少部分siRNA以自身为引物，将RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)招募到该转录本上，扩增合成新的dsRNA。这些新合成的dsRNA会导致次级siRNA的产生和沉默信号的放大，这种机制被称为传递性沉默。RNAi的传递性不仅增加了siRNA介导的基因调控的可塑性，同时增强了沉默信号的强度。然而，由于RdRP的缺失，昆虫体内并不存在传递性沉默机制，siRNA触发的RNAi信号无法在昆虫体内被放大，因此，昆虫体内RNAi效率仍然具有相当大的提升空间。

基于上述发现和现有研究，本发明实施例提供了一种基于RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法，包括以下步骤：

将害虫靶标基因的蛋白质编码区(Coding sequence，CDS)序列和靶向所述靶标基因的双链RNA(dsRNA)的编码序列整合进植物细胞核基因组中，使所述植物能够同时表达产生所述靶标基因的mRNA和靶向所述靶标基因的dsRNA。

需要说明的是，同时表达产生所述靶标基因的mRNA和靶向所述靶标基因的dsRNA并不指代在同一时刻内产生，而仅表明转基因植物植物的同一细胞内能够产生这二种物质，其可以先后表达、也可以同时表达，即表达时序没有特定要求。

本发明基于植物细胞内存在传递性沉默机制，将其作为昆虫RNA干扰(RNAi)信号放大的工具，有利于快速产生大量与害虫靶标基因互补配对的siRNA(为描述方便，以下简称靶标基因siRNA)，图1示出了siRNA在植物细胞内积累的流程和引起昆虫细胞内RNAi的原理。具体而言，本发明通过将害虫靶标基因的CDS和dsRNA编码基因整合进植物细胞核基因组内，得到的转基因植物一方面能够表达dsRNA，dsRNA将被植物Dicer酶切割成初始siRNA(Primary siRNAs)，另一方面能够表达靶标基因mRNA，靶标基因mRNA将会被作为模板，在植物细胞内RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)的作用下，以siRNA为引物扩增(siRNAAmplification)得到新合成的dsRNA，新合成的dsRNA进一步被Dicer酶切割成次级siRNA(Secondary siRNAs)，由此可快速在转基因植物细胞大量积累siRNA，放大RNAi信号，这种放大效应保证了植物细胞内只有少量的dsRNA就可以产生很强的基因沉默效果，引起有效的siRNA积累和RNAi反应。siRNA是激活昆虫体内RNAi通路的直接作用分子，其不易被昆虫肠道内的dsRNA酶降解，可稳定穿过害虫肠道并有效激活害虫RNAi通路，显著提高RNAi效率，降低靶标基因的表达量，由此引发不利于害虫生长发育的征状，进而增强植物抗虫性能和对害虫的防治效果。

另外，本发明通过同时表达靶标基因dsRNA及其mRNA序列导致siRNA在寄主植物积累量显著提高的新策略，不受寄主植物以及害虫种类的限制，即siRNA的积累效率和RNAi反应程度与具体的昆虫、寄主植物、靶标基因种类无关，因此，适用范围广。即，只要在实验室条件下经过RNAi处理后对昆虫的生长产生显著抑制作用的基因均可作为本发明的靶标基因。而在寄主植物方面，只要能进行核基因的遗传转化且作为害虫的寄主具有害虫防控需求的作物均可作为候选对象。此为本领域的常规技术手段，在此不再赘述。

可选地，所述的害虫靶标基因通常选自害虫生命代谢中起重要作用的基因，用于本发明的针对害虫生命代谢中的关键基因没有特别限制，通常可分为：1)、昆虫特有的靶标基因，如几丁质酶基因、蜕皮激素受体基因，这类基因特异性强，安全性高，不会对其他非靶标生物造成为害；2)、高效安全的管家基因，如Snf7基因；3)、与昆虫抗性或免疫相关的基因，如P450酶基因、谷胱甘肽-S-转移酶基因；4)、与昆虫行为有关的基因，如与取食、繁殖等有关基因，如钙结合蛋白基因。害虫靶标基因CDS序列整合进植物核基因组中后以DNA形式存在，能够被正常转录为mRNA，其整合位点没有特殊要求，可随机整合在核基因组的任意位点。

具体地，针对害虫生命代谢关键基因包括但不限于：鳞翅目、双翅目或半翅目害虫的乙酰胆碱酯酶基因、AV2基因、GPCR基因、ATPase基因、ATP合酶基因、Cathespin基因、IAP基因、APN基因、Ace1基因、Dhc64C基因、ABCC2基因。

表达靶标基因hsRNA的DNA序列依据靶标基因来设计，一般而言由靶标基因300-500bp片段、内含子序列、前述靶标基因300-500bp片段的反向互补序列三部分构成，以形成发卡结构的RNA(hpRNA)。表达靶标基因hpRNA的DNA序列同靶标基因的CDS序列类似，对插入基因组的位置没有特殊需求。其设计原则为特异性高且脱靶效率低。如何根据靶标基因设计hpRNA为本领域常规技术手段，本发明对此不做限定。

通常采用遗传转化的方式将外源基因(在本发明中为靶标基因CDS序列和靶标基因dsRNA编码序列)整合进植物核基因组中，首先将本发明的靶标基因和表达靶标基因dsRNA的编码序列构建到植物表达载体中，之后通过基因枪法、电击法、显微注射法或农杆菌介导法等将表达载体导入植物细胞内，实现外源基因向植物细胞的转移与整合。在一些实施方式中，靶标基因CDS序列和靶标基因dsRNA编码DNA序列可以构建到同一个植物表达载体中；在另一些实施方式中，靶标基因CDS序列和靶标基因dsRNA编码DNA序列也可以分别构建到不同的植物表达载体中。表达载体包含在指定细胞如植物细胞中表达的调控元件(如启动子、增强子)。此为本领域的公知技术，在此不再详细介绍。

可选地，上述所述的植物表达载体选自pCambia1300、pCambia1301、pCambia2300或选自pcambia系列的其他载体中的任一种。

具体地，所述植物表达载体的构建方法包括：利用高保真酶和引入不同的酶切位点的上下游扩增引物，扩增得到所述靶标基因的CDS全长序列，通过前述酶切位点的限制性内切酶对所述CDS全长序列进行双酶切，同时通过相同的限制性内切酶对表达载体进行双酶切，得到线性化载体，最优通过同源重组的方式将所述CDS全长序列和所述线性化载体连接，构建得到插入有所述靶标基因的所述植物表达载体。

可选地，所述害虫通常选自鳞翅目、鞘翅目和半翅目等咀嚼式和刺吸式口器害虫。将害虫靶标基因和其dsRNA编码基因在转基因植物体内表达，害虫取食含有dsRNA的植物组织后可将siRNA一并吸收，从而在害虫体内引发高效的RNAi反应，使靶标基因的表达量下调或完全沉默，从而导致生长发育受阻或生存率下降等不利症状，达到防治目的。

由于鳞翅目昆虫客观上存在对RNAi不敏感的情况，相对而言，本发明由于能够放大昆虫体内RNAi干扰效率，对鳞翅目昆虫的防治而言意义更大。因此，优选地，所述害虫选自鳞翅目害虫，具体地，包括但不限于：草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、苹果小卷叶蛾、棉铃虫、菜粉蝶、小菜蛾、亚洲玉米螟和印度谷螟中一种或多种。

可选地，所述植物可以为任意遭受鳞翅目、鞘翅目和半翅目害虫影响的植物，包括但不限于林木、果树、蔬菜、粮食作物、经济作物，如松树、柏树、苹果、梨、菠萝、油菜、白菜、土豆、小麦、大麦、水稻、玉米、花生、高粱、马铃薯、大豆、烟草和棉花等。

在一个典型的实施方式中，害虫选自鳞翅目的重要害虫棉铃虫，靶标基因选自棉铃虫HaATPH基因，其CDS序列见SEQ ID NO.1所示，对应设计的hpRNA的编码序列(即DNA序列)见SEQ ID NO.2所示。以取食烟草做实验，在烟草细胞核内导入并表达HaATPH基因的CDS序列和其特异性dsRNA后，转基因烟草体内的靶标基因siRNA的积累量是只表达靶标基因特异性dsRNA的烟草积累量的1.5倍，siRNA的积累量显著提高，由此，取食该转基因烟草的棉铃虫体内的靶标基因的相对表达量在第2天下降了90％，RNAi效率大幅提升，并进一步导致棉铃虫体重增长缓慢，抗虫效果显著提高，在棉铃虫防治领域有着极大的应用潜力。

本发明又一实施例提供了如上所述的基于RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法制备得到的转基因植物在害虫防治中的应用，如可将转基因植物或其组织或其提取物制备成粉剂，作为生物农药供害虫取食，达到防控害虫的目的。

所述基于RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法制备得到的转基因植物在害虫防治中的应用优势与如上所述的基于RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法相对于现有技术所具有的优势相同，在此不再赘述。

本发明再一实施例提供了一种害虫防治的生物药物，所述药物的活性成分包括如上所述的基于RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法制备得到的转基因植物。

所述害虫防治的生物药物相对于现有技术的优势与如上所述的基于RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法相对于现有技术所具有的优势相同，在此不再赘述。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南(第四版)》中所述的条件，或者通常按照制造厂商所建议的条件。

下述具体实施例中，以棉铃虫的靶标基因HaATPH基因为例，设计hpRNA，考察本发明同时表达靶标基因hpRNA的DNA序列和靶标基因的CDS全长序列对昆虫体内SiRNA干扰效率的影响。

具体地，HaATPH基因的CDS序列(正义链)如下所示：

atggatccatacgacgaacaatttaatcctaaaaaggtgtttatcagagaagatatgattgcagccaccagcgtcttgcaaatccgtgcaagcgagatccgccaaactcagatcaattggcagtcttatctgcagtctcagatgatcacccaacgtgaccatgacttcattgtgaacttggatcagcgtggtcagaaggagctgcctgataggaacccag aaacctgtgctgaggtgttcatgaacttgctgacgcacatcagcaaggaccacaccatccagtacttgctggtcct gattgatgacatcctttctgaagacaaaagcagggtgaagatcttccgtgaggcgaggtctctgggcaacccgtgg cagccgttcctcaacctgctgaaccgtcaggatgagtttgtccagcacatgactgcgcgcatcatcgccaagctgg cttgctggcacccacacctgatggagaagagtgacctccacttctacctctcctggctcaaggaccaactgaaaatgaacgcggagaaaatgtctgccgagttagagcatgccgagcaggttatgttgctgcacgagaaacagcatttcgccgccgataaacttcagaaacatctgaaacatcaccacaaggaaaaagacagtgtcgacgctggcccagagaagtactcgagcctttacagctcctttgatgagctgaagccgcttgaggacttgccgcccggtctgcacaagaacaatgacta cattcaatcggtggctcgctgcctgcaaatgatgctgcgcgtcgacgagtaccgcttcgcgttcctgtctgttgac ggcatctccaccctgctgtctatcctggcctccagggtcaacttccaggtgcaataccagctggtgttctgcctgtgggtgctgactttcaacccgctgttagccgagaagatgaacaagttcaacgccatccccatcctggcagacatcctcagcgactctgtgaaggagaaggtcactcgtattgtgctcgctgtcttcaggaacctgattgagaagcctgaagatcatcaggtggccaaagaacattgcatcgccatggtgcagtgcaaggtcctgaaacagctttccatcttggagcagaagcgttctgatgatgaggacattatgaacgatgtggacttccttaacgaacgcctgcag(见SEQ ID NO.1)；注：下划线所示为hpRNA靶向位点。

靶向HaATPH基因的hpRNA的编码序列(正义链)(以下简称hpHaATPH)如下所示：

gcctgataggaacccagaaacctgtgctgaggtgttcatgaacttgctgacgcacatcagcaaggaccacaccatccagtacttgctggtcctgattgatgacatcctttctgaagacaaaagcagggtgaagatcttccgtgaggcgaggtctctgggcaacccgtggcagccgttcctcaacctgctgaaccgtcaggatgagtttgtccagcacatgactgcgcgcatcatcgccaagctggcttgctggcaaacaatgactacattcaatcggtggctcgctgcctgcaaatgatgctgcgcgtcgacgagtaccgcttcgcgttcctgtctgttgacggcatctccaccctgctgtctatcctggcctcca(见SEQ ID NO.2)。

实施例

1、pCambia1300重组载体构建

在上下游扩增引物序列引入酶切位点(上游Pst I，下游Kpn I)，利用高保真酶，扩增得到上下游含有不同酶切位点的靶标基因的CDS全长序列，用于载体构建。通过限制性内切酶对pCambia1300进行双酶切，得到线性化载体。酶切体系30μL包括：Pst I内切酶1μL、Kpn I内切酶1μL、酶切Buffer 3μL、载体或靶标基因CDS 30μg，双蒸水补足至30μL；在37℃条件下酶切1h。将酶切产物在DNA连接酶的催化作用下，将靶标基因的CDS全长序列与线性化的pCambia1300载体进行连接。连接体系10μL包括：T4连接酶5μL、靶标基因CDS 4μL和载体1μL；在16℃条件下连接1-2h。最后将连接产物转入大肠杆菌后，挑选单克隆菌株，测序检测连接成功后，过夜培养相应菌株并提取质粒，得到重组后的表达载体。在本发明中，载体和质粒表示相同含义。其中，引物序列如下：

上游引物F-Pst I：GGGGTACCATGGATCCATACGACGAACAATTTA(见SEQ ID NO.3)；

下游引物R-Kpn I：AACTGCAGGCGTTCGTTAAGGAAGTCCACAT(SEQ ID NO.4)。

2、农杆菌介导pCambia1300重组载体转化

利用农杆菌介导的转基因技术，将带有靶标基因CDS全长序列的重组载体导入植物细胞核基因组，具体操作如下：

(1)带有重组载体的农杆菌的获取：从-80℃冰箱中拿出农杆菌感受态细胞，冰上冻融(大约30min)，加入10μL pCambia1300重组载体；冰浴5min，液氮中速冻5min，37℃水浴热激5min，加入1mL YEB液体培养基，28℃、100-150rpm摇床振荡3h左右。离心机中用3000rpm速度离心4min，去一部分上清液，将剩余部分重悬，涂200μL于加入抗生素的YEB平板上(抗生素为终浓度50mg/L的Kan以及Rif)，28℃培养24-48h直至长出单菌落，挑取菌落做PCR鉴定，鉴定阳性菌落。

YEB液体培养基配方包括：牛肉浸膏5g/L、酵母浸膏1g/L、蛋白胨5g/L、蔗糖5g/L和MgSO₄·H₂O 0.5g/L，调节pH＝7.0，121℃高温高压灭菌20分钟后待冷却可使用。

(2)农杆菌转化烟草：挑取已经鉴定过的单菌落，放入10mL有抗生素的YEB液体培养基中，28℃、180rpm培养18h，直至OD₆₀₀在0.6-0.8之间。将上一步菌液200μL加入50mL瓶装YEB液体培养基中(可不加抗生素)，培养6h左右至OD₆₀₀在0.2-0.5之间。用冷冻离心机以4℃、2500rpm的速度离心7min，收集菌体，用40mL的MS液体培养基重悬，重悬后放入平板中备用。将幼嫩叶子切成0.5cm×0.5cm大小，放入菌液中浸泡10min，取出叶子放在滤纸上吸干水分，再贴到RMOP培养基上，28℃暗培养2day。将叶片放入选择培养基上，组培室光照下培养待不定芽长到1cm(一个月)左右，放入生根培养基中，做后续分子鉴定。

RMOP培养基配方包括：MS粉末4.4g/L、蔗糖30g/L和琼脂2.75g/L，调节PH＝5.8，121℃高温高压灭菌20分钟后加入1mg 6-BA以及0.1mg NAA，倒入平板中带冷却后可使用。

(3)选取在组培盒中培养了20天左右的植物，每株取顶端2-3片嫩叶片作为农杆菌转化的材料，将其切成0.5×0.5cm的小块并划出1-2条伤口，在重悬的农杆菌中浸泡10min后放至RMOP培养基上暗培养三天后转移到筛选培养基上，大约一个月后开始长出抗性芽，将芽切下转移到生根培养基上诱导生根，2周后移栽进土中在温室培养和后续实验。

hpHaATPH基因的转化方法同上述步骤1-2，本实施例不再赘述。通过上述方法分别构建了同时表达hpHaATPH和HaATPH全长的烟草株系Nt-SJ17-ZH9#3和Nt-SJ17-ZH9#8，并构建了只表达hpHaATPH烟草株系Nt-SJ17#11作为对照，同时以转基因烟草的供体株系Nt-wt作为对照株系。

3、靶标基因siRNA在转基因烟草中积累量检测

设计靶标基因的探针，通过Northern blot分析siRNA在转基因植物内的表达量，并与未转入靶标基因CDS全长序列的转基因植物体内siRNA表达量做比较。靶标基因的探针包括3条，分别命名为探针1-3，序列信息如下：

探针1(为靶标基因上游200bp位置的序列)：

gatccatacgacgaacaatttaatcctaaaaaggtgtttatcagagaagatatgattgcagccaccagcgtcttgcaaatccgtgcaagcg agatccgccaaactcagatcaattggcagtcttatctgcagtctcagatgatcacccaacgtgaccatgacttcattgtgaacttggatcagcgtgg tcagaaggagct(见SEQ ID NO.5)。

探针2(与hpHaATPH序列相同)：

gcctgataggaacccagaaacctgtgctgaggtgttcatgaacttgctgacgcacatcagcaaggaccacaccatccagtacttgctggtcctgattgatgacatcctttctgaagacaaaagcagggtgaagatcttccgtgaggcgaggtctctgggcaacccgtggcagccgttcctcaacctgctgaaccgtcaggatgagtttgtccagcacatgactgcgcgcatcatcgccaagctggcttgctggcaaacaatgactacattcaatcggtggctcgctgcctgcaaatgatgctgcgcgtcgacgagtaccgcttcgcgttcctgtctgttgacggcatctccaccctgctgtctatcctggcctcca(见SEQ ID NO.2)。

探针3(为靶标基因下游长约300bp的序列)：

ggcatctccaccctgctgtctatcctggcctccagggtcaacttccaggtgcaataccagctggtgttctgcctgtgggtgctgaccttcaacccgctgttagcagagaagatgaacaagttcaacgccatccccatcctggcagacatcctcagcgactccgtgaaggagaatgtcactcgtattgtgctcgctgtcttcagaacctgattgagaagcctgaagatcatcagtggccaaagaacactgcattgccatggtgcagtgcaaaggtcctgaaa cagctttccatcttggagcagaagcgttctgatgatgaagacattatgaacgatgtggacttccttaacg(见SEQ ID NO.6)。

Northern blot分析具体操作如下：

(1)电泳样品的制备：向含量为30μg的总RNA中加入等体积的RNA LoadingBuffer，用DEPC H₂O补足至20μL，在95℃金属浴加热5min后迅速在冰上冷却备用。

(2)电泳：在0.5×TBE电泳缓冲液中进行电泳，先用30V电压将样品跑出孔，之后再改用120V电压电泳2h左右。

(3)转膜：切下电泳后的凝胶的底部至3.5cm处，用万分之一的核酸染料染色拍照，后在冰上利用电流进行转膜，转膜装置从下到上依次为电源负极-海绵-两张和凝胶大小一致的润湿的滤纸-凝胶-NC膜-两张和凝胶大小一致的润湿的滤纸-海绵-电源正极，安装好装置后在冰上以20V的电压转膜1h。

(4)预杂交与杂交：转膜结束用紫外交联的方式将RNA固定在膜上，后在杂交炉中以37℃的温度预杂交6h，再用42℃的温度杂交10h左右。

(5)洗膜：配置冷洗液，具体配方为2×柠檬酸钠盐溶液与0.1％ SDS。用冷洗液在摇床上以75-85rpm的速度漂洗5min，重复三次；后在洗涤缓冲液(0.15M氯化钠，0.1M马来酸，0.3％吐温20，调Ph＝7.5)中漂洗5min。

(6)加入探针：加入20mL罗氏公司生产的1×Blocking Solution，在25℃下封闭30min，再加入1μL从罗氏公司购买的地高辛探针，25℃下杂交30min。

(7)洗膜及成像：用洗涤缓冲液在摇床上以75-85rpm的速度漂洗5min，重复三次。在检测缓冲液中浸泡3min。后将膜浸泡在碱性磷酸酶的底物中，等待30min后用AI600超灵敏化学发光成像仪对膜进行成像拍照。

结果见图2，其中图A示出了探针1-3结合HaATPH基因的位置，图B-D分别示出了探针1-3检测siRNA表达量的凝胶电泳图，黑色部分是提取RNA的凝胶电泳图，用于表示检测siRNA的总RNA量是相同的，每个泳道的RNA上样量为30μg，白色部分反映siRNA的量。从图中可以看出，同时表达hpHaATPH和HaATPH全长的烟草其叶片组织内靶标基因siRNA的积累量显著高于只表达hpHaATPH的烟草。通过Image J软件对图2中Nt-SJ17-ZH9和Nt-SJ17植株的条带的灰度值分析，同时表达hpHaATPH和HaATPH全长的烟草其叶片组织内靶标基因siRNA的积累量是只表达hpHaATPH的烟草积累量的150％。该结果表明，相比于传统的仅表达dsRNA的基因沉默技术，本发明通过同时表达dsRNA及其靶标基因的mRNA可以显著提高靶向靶标基因的siRNA在植物组织内的积累量。

4、取食转基因烟草的害虫体内靶标基因表达量检测

以转基因烟草和棉铃虫为例，通过荧光定量PCR技术定量检测靶标基因在昆虫体内的表达水平。具体操作如下：

(1)在28℃人工气候箱中孵化棉铃虫，将初孵幼虫转移到人工饲料上培养，挑取一龄末期的棉铃虫幼虫用于测试。

(2)将用于实验的烟草种子消毒后播撒于MS平板上，两周后选取幼苗移栽到温室土壤中，再生长两周后进行生测。

(3)取长势相同的叶片放于饲养盒中，将一龄末幼虫挑到叶片上，放置于饲养盒与28℃人工气候箱中，每天更换新鲜叶片并记录棉铃虫体重，定期取样提取总RNA，通过RT-qPCR试剂盒(购自擎科公司，商品名：TSINGKE TSE201 2×Master qPCR Mix(SYBR Green I)，货号：TSE201)检测靶标基因的相对表达量。

通过检测取食转基因烟草后害虫体内靶标基因的相对表达量，以明确转入靶标基因CDS全长植物相对于未转入靶标基因CDS全长植物，对害虫靶标基因的RNAi效率是否显著提高。结果见图3，其中，图A-B分别示出了离体转基因植物叶片喂养棉铃虫第2天和第4天中HaATPH基因相对表达量的变化(mean±SEM，n＝7)，图中小写字母a、b、c由方差分析(ANOVA分析)得到，a、b、c表示两组之间差异显著(P<0.01)。荧光定量分析结果显示，取食同时表达hpHaATPH和全长HaATPH烟草的棉铃虫相比于取食仅仅表达hpHaATPH烟草的棉铃虫，其体内HaATPH的表达量显著下调。与取食野生型烟草的棉铃虫相比，取食仅仅表达hpHaATPH烟草的棉铃虫，其体内HaATPH基因的表达量在第2天和第4天分别下降70％与60％，而取食同时表达hpHaATPH和HaATPH全长烟草的棉铃虫在第2天和第4天HaATPH基因的表达量分别下降90％和75％。该结果表明，本发明的方案可以显著提高棉铃虫体内的RNAi效率。

5、转基因烟草抗虫性测试

以烟草和棉铃虫为研究对象，具体操作如下：

(1)在28℃人工气候箱中孵化棉铃虫，将初孵幼虫转移到人工饲料上培养，挑取一龄末期的棉铃虫幼虫用于测试。

(2)将用于实验的烟草种子消毒后播撒于MS平板上，两周后选取幼苗移栽到温室土壤中，再生长两周后进行生测。

(3)取长势相同的叶片放于饲养盒中，将一龄末幼虫挑到叶片上，放置于饲养盒与28℃人工气候箱中，每天更换新鲜叶片并记录棉铃虫体重。

通过比较分析取食转入靶标基因CDS全长的转基因烟草与取食未转靶标基因CDS全长的转基因烟草的棉铃虫体重，明确两种转基因策略对害虫的抑制作用是否存在显著性差异。结果见图4，其中，图A-B分别示出了离体转基因植物叶片喂养棉铃虫第2天和第4天后的幼虫体重的变化(mean±SEM，n＝25)，图中小写字母a、b、c由方差分析(ANOVA分析)得到，a、b、c表示两组之间差异显著(P<0.01)。从图中可以看出，与取食仅仅表达hpHaATPH的烟草相比，取食同时表达hpHaATPH和全长HaATPH烟草的棉铃虫体重显著下降。与取食野生型烟草相比，取食只表达hpHaATPH的烟草的棉铃虫，体重在第2天和第4天分别下降25％与27％，而取食同时表达hpHaATPH和全长HaATPH烟草的棉铃虫在第2天和第4天相比于野生型体重下降一倍以上，表明同时表达hpHaATPH和全长HaATPH烟草的抗虫效果显著提高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将害虫靶标基因的CDS序列和靶向所述靶标基因的dsRNA的编码序列整合进植物细胞核基因组中，使所述植物能够同时表达产生所述靶标基因的mRNA和靶向所述靶标基因的dsRNA。

2.根据权利要求1所述的基于RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法，其特征在于，所述靶标基因选自昆虫特有的基因、昆虫管家基因、与昆虫抗性或免疫相关的基因或与昆虫行为有关的基因中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的基于RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法，其特征在于，所述靶标基因选自乙酰胆碱酯酶基因、AV2基因、GPCR基因、ATPase基因、ATP合酶基因、Cathespin基因、IAP基因、APN基因、Ace1基因、Dhc64C基因和ABCC2基因中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的基于RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法，其特征在于，所述dsRNA为hpRNA，所述hpRNA由所述靶标基因的300-500bp片段、内含子序列和所述300-500bp片段的反向互补序列三部分构成。

5.根据权利要求1所述的基于RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法，其特征在于，将害虫靶标基因的CDS序列和靶向所述靶标基因的dsRNA的编码序列整合进植物细胞核基因组中的方法包括以下步骤：

将所述靶标基因的CDS序列和所述dsRNA的编码序列构建到植物表达载体中，之后通过基因枪法、电击法、显微注射法或农杆菌介导法将所述植物表达载体导入植物细胞内，实现所述靶标基因的CDS序列和所述dsRNA的编码序列向植物细胞的转移与整合。

6.根据权利要求5所述的基于RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法，其特征在于，所述植物表达载体选自pCambia1300、pCambia1301或pCambia2300。

7.根据权利要求1所述的基于RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法，其特征在于，所述害虫选自草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、苹果小卷叶蛾、棉铃虫、菜粉蝶、小菜蛾、亚洲玉米螟和印度谷螟中一种或多种；

所述植物选自松树、柏树、苹果、梨、菠萝、油菜、白菜、土豆、小麦、大麦、水稻、玉米、花生、高粱、马铃薯、大豆、烟草和棉花中一种或多种。

8.根据权利要求1所述的基于RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法，其特征在于，所述靶标基因选自棉铃虫HaATPH基因，其CDS序列见SEQ ID NO.1所示；

所述dsRNA的编码序列见SEQ ID NO.2所示。

9.如权利要求1-8任一项所述的基于RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法制备得到的转基因植物在害虫防治中的应用。

10.一种害虫防治的生物药物，其特征在于，所述药物的活性成分包括如权利要求1-8任一项所述的基于RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法制备得到的转基因植物。