CN116144708A - 一种全雄不育尼罗罗非鱼品系及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种全雄不育尼罗罗非鱼品系及其构建方法，所述全雄不育尼罗罗非鱼品系是CRISPR/Cas9基因编辑获得的尼罗罗非鱼类固醇合成酶编码基因cyp17a1纯合敲除系。本发明首次成功建立的cyp17a1纯合敲除突变系完全摆脱了对雄激素处理的依赖，是环境友好、生态绿色的养殖候选品种。同时不育和快速生长，可以避免突变鱼在野外养殖过程中造成野生遗传资源的污染，并且节约成本提高养殖效益。本发明提供的cyp17a1纯合敲除系还将为鱼类乃至脊椎动物研究性别分化、不育提供一个基因功能缺失平台，这个平台将有助于进一步认识cyp17a1基因作用机制。
Description
技术领域
本发明涉及渔业育种养殖方法，具体涉及一种全雄不育尼罗罗非鱼品系及其构建方法。
背景技术
罗非鱼(tilapia)为隶属于鲈形目(Perciformes)、丽鱼科(Cichlidae)的暖水性鱼类，原产自非洲大陆和中东地区咸淡水域。罗非鱼具有明显的性别二态性，其雄鱼比雌鱼的生长速度快上50％。另外，雌雄混养导致性成熟雌、雄鱼大量繁殖仔鱼，争氧耗饵，最终影响了成鱼的生长速度，因此培育全雄鱼苗是罗非鱼渔业养殖长期追求的目标。遗憾的是目前罗非鱼全雄鱼的制备主要有三种：人工选育，杂交育种和雄激素处理，而这些育种方式存在一定的缺点：1)人工选育的过程周期长，优良性状不稳定。2)杂交育种获得鱼苗的全雄率不高，仍然存在一定风险。3)激素处理存在药物残留和水污染的问题。由于种间生殖隔离的存在，远缘杂交难以形成可育品系。并且由于缺乏可供参考和借鉴的遗传和繁殖规律,我们难以预判远缘杂交后代可能会出现的后代类型。如果光凭表型优势互补来进行带有盲目性质的育种，容易导致杂交后代死亡、没有杂交优势、难以形成品系等不良结果。因此，杂交育种虽作为鱼类最常规的育种方式仍具有较多局限性。
基因编辑育种则具有明确的目的性，例如“抗冻”、“抗逆”、“瘦肉率高”等。并且基因编辑育种的落脚点在某个基因或者某几个基因。鉴于此，通过基因编辑获得全雄、不育和生长快的罗非鱼鱼苗，应是罗非鱼产业未来发展的重要方向。但目前此方法尚未成功获得目标品系。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术在尼罗罗非鱼中对类固醇合成酶编码基因cyp17a1进行敲除，得到的遗传上全雄不育且快速生长的尼罗罗非鱼突变系。该突变系完全摆脱对雄激素处理的依赖，是环境友好、生态绿色的养殖候选品种。
本发明提供的全雄不育尼罗罗非鱼品系是CRISPR/Cas9基因编辑获得的尼罗罗非鱼类固醇合成酶编码基因cyp17a1纯合敲除系。
本发明全雄不育尼罗罗非鱼品系的构建方法，包括步骤：
(1)将尼罗罗非鱼cyp17a1基因gRNA与Cas9 mRNA混合，并室温孵育获得gRNA与Cas9mRNA的复合物；向复合物中加入小分子染料酚红混合均匀即得CRISPR/Cas9基因编辑的显微注射液；
(2)使人工授精后一至四细胞期尼罗罗非鱼受精卵均匀平躺于培养皿中；
(3)将所述显微注射液转至微型针管中并利用显微注射仪将其注射至所述步骤(2)固定的受精卵中；
(4)注射后将受精卵转入28℃恒温循环水孵化系统中进行孵化；
(5)对孵化后受精卵进行基因编辑后阳性鱼突变筛选；
(6)从阳性鱼突变获得尼罗罗非鱼cyp17a1b纯合敲除系。
进一步，所述显微注射液中cyp17a1基因gRNA终浓度为500ng/μL；所述Cas9 mRNA的终浓度为500ng/μL；所述显微注射的体积为每个受精卵0.005μl。
进一步，所述cyp17a1基因gRNA制备方法为：针对CRISPR/Cas9基因编辑的cyp17a1基因靶位点设计gRNA特异性F引物，以gRNA质粒为模板用所述F引物和通用R引物进行扩增并回收片段得到gRNA DNA模板，将所述gRNA DNA模板体外转录后获得cyp17a1基因的gRNA；所述Cas9 mRNA制备方法为：将Cas9质粒线性化之后体外转录制备而成。
进一步，所述CRISPR/Cas9基因编辑的靶位点为SEQ ID NO:2所示核酸序列。
进一步，针对SEQ ID NO:2所示靶位点设计的gRNA特异性F引物序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步，所述通用引物序列如SEQ ID NO:3所示。
进一步，所述基因编辑后阳性鱼突变筛选方法包括：
A.提取基因组DNA并以基因组DNA为模板以设计的检测引物进行PCR扩增并回收产物；
B.利用HpyAV限制内切酶对回收产物进行酶切检测,可切开的序列为未突变，切不开的序列则为获得cyp17a1基因缺失突变；
C.所述阳性鱼为嵌合体，其序列只能被部分切开的筛选为突变阳性；
所述检测F引物为：如SEQ ID NO:4所示；
R引物为：如SEQ ID NO:5所示。
进一步，从阳性鱼突变鱼获得尼罗罗非鱼cyp17a1b纯合敲除系的方法包括:
a.将3月龄筛选得到的阳性鱼养殖于室内循环水系统中至成年以传代；
b.待雄鱼性成熟，将其与野生型雌鱼交配，从不同突变类型的F1代鱼中选取突变类型相同且碱基非3的倍数缺失的雌雄罗非鱼作为F1代亲鱼；
c.待F1代亲鱼性成熟，两者交配可得到含有纯合缺失cyp17a1b的F2代尼罗罗非鱼。
进一步，所述纯合缺失cyp17a1b的F2代尼罗罗非鱼鉴定方法为：
I.提取F2代鱼基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用PAGE引物扩增并将扩增产物进行PAGE，后经凝胶成像系统成像；
Ⅱ.通过条带显示判断：当扩增产物为一条带时，为野生型或纯合子；当扩增产物为四条带时，为杂合子；
Ⅲ.从野生型与纯合子中通过所述突变筛选方法得到尼罗罗非鱼cyp17a1b纯合敲除系，并通过测序确认检测结果；
所述PAGE F引物为：如SEQ ID NO:6所示；所述PAGEF R引物为：如SEQ ID NO:7所示。
发明人在研究中发现类固醇合成酶编码基因cyp17a1敲除导致由雌向雄完全的性逆转，即纯合突变个体无论XX还是XY的基因型，均发育为雄性个体。纯合突变体雄鱼精巢不能排精，从而导致不育。重要的是，发明人还发现cyp17a1基因纯合突变雄鱼的生长速度显著高于对照组。因此，本发明通过cyp17a1基因的敲除，建立了遗传全雄、不育，且快速生长的罗非鱼新品系。
本发明的有益效果在于：
1.本发明首次在尼罗罗非鱼中通过CRISPR/Cas9基因编辑技术成功建立了cyp17a1纯合敲除突变系，该突变系完全摆脱对雄激素处理的依赖，是环境友好、生态绿色的养殖候选品种。同时不育和快速生长，可以避免突变鱼在野外养殖过程中造成野生遗传资源的污染、节约成本提高养殖效益。
2.本发明提供的cyp17a1纯合敲除系，将为鱼类乃至脊椎动物研究性别分化、不育提供一个基因功能缺失平台，这个平台将有助于进一步认识cyp17a1基因作用机制。
3.本发明cyp17a1突变的全雄不育罗非鱼将为提高尼罗罗非鱼养殖产量提供重要支撑，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为尼罗罗非鱼cyp17a1敲除建系；
其中：图1A.Cyp17a1靶位点设计在第一个外显子上，含有酶切位点DdeⅠ；图1B.F2代cyp17a1基因靶位点测序；图1C.Cyp17a1基因敲除传代建系模式图；图1D.采用PCR和PAGE凝胶电泳技术对野生型、杂合子和纯合子鱼进行筛选，在野生型(81bp)和纯合突变体(77bp)中检测到纯双链，而在杂合突变体(+/-)中均发现纯双联和异源双链；图1E.Sanger测序分析发现cyp17a1-/-鱼与cyp17a1+/+鱼基因组缺失4bp(CCTG)；灰色阴影表示目标位点。
图2：尼罗罗非鱼cyp17a1纯合突变全雄鱼的表型鉴定；
其中：图2A-B.敲除前后雌鱼性腺形态；图2C-D.敲除前后雄鱼性腺形态。
图3为cyp17a1纯合突变产生全雄化及育性的检测；
其中：图3A.野生鱼和cyp17a1基因敲除雄鱼解剖精巢图；图3B.敲除前后性成熟系数(GSI，Gonadal somatic index)；图3C.形态学观察敲除前后雄鱼精巢H.E染色(图中虚线为输精管)；图3D.输精管大小(其中圆形表示__，三角形表示，正方形表示)；图3E.敲除前后雄鱼精液收集情况。统计实验结果为平均值±标准差。组间差异采用单因素方差(one-wayANOVA)分析Tukey post-hoc检验，显著性水平设置为P<0.05。
图4为cyp17a1纯合突变鱼形态及生长性征鉴定；
其中：图4A.cyp17a1+/+和cyp17a1-/-罗非鱼躯干头部、中部、尾部横截面；图4B.cyp17a1+/+和cyp17a1-/-罗非鱼躯干头部、中部、尾部横截面面积定量比较；图4C.体重(Body weight)；图4D.体长(Body length)；图4E.体高(Body height)；图4F.体宽(Bodywidth)测定；图4G.肌肉生成相关因子表达量上调(myodl:人肌分化因子；pamx3__？；fosab__？；midlb__？)。*表示显著性差异(P<0.05)，ns表示无显著差异(P＞0.05)。
图5为cyp17a1纯合突变罗非鱼肌肉组织学鉴定；
其中：图5A.Cyp17a1+/+和cyp17a1-/-罗非鱼躯干头部、中部、尾部肌纤维H&E染色；图5B.cyp17a1+/+和cyp17a1-/-罗非鱼躯干头部、中部、尾部骨骼肌单位面积肌纤维数量统计，***表示差异极显著(P<0.005)。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。通过实施例，科研人员可以对本发明有更清楚的了解，可以在此基础上对本发明做出一定的变更和修改，以获得不同的研究效果。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明均为常规方法。实验过程中涉及到的试剂均为常规试剂，使用均参照产品使用说明书使用。
本发明基于CRISPR/Cas9基因编辑技术在尼罗罗非鱼中对类固醇合成酶编码基因cyp17a1进行敲除获得了全雄不育尼罗罗非鱼新品系。具体步骤如下：
(一)尼罗罗非鱼cyp17a1纯合敲除系的建立
依托于CRISPR/Cas9基因编辑技术以及显微注射技术，本发明成功获得cyp17a1基因突变G0代阳性鱼。敲除靶位点设计在第一个外显子上，含DdeⅠ酶切位点(图1A)。G0代基因组酶切显示，在gRNA和Cas9 mRNA双注射的泳道，有未被切开的条带，表明在G0代基因组水平出现阳性突变(图1B)。将阳性雄鱼作为父本，以野生型雌鱼为母本,通过杂交得到F1代，再通过F1杂交得到纯合突变F2(图1C)。纯合子通过sanger测序及聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)进行鉴定(图1D,E)。测序峰图比较发现纯合子靶点处缺失4bp(AGCC)，PAGE结果显示：野生型只有一条带；杂合子含有四条带：位于上方的两条异源双链、位于下方的一条野生型带和一条突变带；纯合子只有一条突变带。综上所述，本发明在尼罗罗非鱼中成功地建立了cyp17a1纯合突变系。
(二)尼罗罗非鱼cyp17a1纯合突变全雄鱼的表型鉴定
组织学观察发现，孵化后180天，在野生型XX(图2A)雌鱼个体的性腺中能够观察到处于各时相的卵母细胞，但在cyp17a1纯合突变的XX(图2B)个体中没有观察到卵母细胞的存在，而是和cyp17a1敲除的XY(图2D)和野生型XY(图2C)雄鱼个体一样能够观察到大量的各发育阶段的生精细胞。
(三)尼罗罗非鱼cyp17a1纯合突变育性的检测
解剖发现cyp17a1基因敲除雄鱼的精巢变小(图3A)，性成熟系数(GSI，Gonadalsomatic index)与野生型雄鱼相比显著降低(图3B)。组织学观察发现与野生型雄鱼相比，cyp17a1敲除雄鱼的输精管变小(红色虚线)(图3C和D)。外部挤压野生型雄鱼的腹部能够收集到大量的精液，而挤压cyp17a1敲除的雄鱼的腹部无法得到精液(图3E)。因此本发明在敲除cyp17a1后成功得到了不育雄鱼。
(四)尼罗罗非鱼cyp17a1纯合突变形态及生长指标测定
通过观察统计发现cyp17a1基因敲除尼罗罗非鱼(n＝3)躯干头部、中部的横截面积均显著大于野生型，而尾部面积相差不大(图4A和B)。并对其体重、体长、体高、体宽，进行测量统计发现cyp17a1基因敲除罗非鱼的体重明显重于对照鱼(图4C)，而其余指标没有显著性差异。同时对肌肉生成因子进行表达分析发现，其表达均显著上升(图4D)。表明cyp17a1基因敲除罗非鱼会促进肌肉的生长从而达到体重的上升。
为了阐明cyp17a1基因敲除对罗非鱼骨骼肌肌纤维发育的影响，发明人任取躯干头部，中部，尾部骨骼肌进行了H&E染色并统计了单位面积肌纤维的数量(图5A和B)。结果显示cyp17a1基因敲除罗非鱼躯干头部，中部的单位面积肌纤维的数量(n＝3)显著低于对照鱼。这些数据表明导致cyp17a1基因敲除罗非鱼肌肉含量增加的原因是肌细胞肥大从而使其体重升高。
实施例1：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对尼罗罗非鱼cyp17a1基因进行有效打靶
1、靶点设计
在Zifit(http://zifit.partners.org/zifit/Disclaimer.aspx)上进行靶位点设计，设计原则及步骤见李明辉论文(罗非鱼基因敲除技术的建立及其在性别决定与分化研究中的应用，李明辉,2014)gRNA引物序列为(SEQ ID NO:1)：5’-TAATACGACTCACTATAGGG CAGCCTGCTGAGCCTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’。下划线序列为靶位点(SEQ ID NO:2)，5’端为T7启动子序列，3’端为gRNA模板质粒结合序列。引物由华大基因合成。
2、gRNA和Cas9合成及显微注射
2.1gRNA合成
1)以gRNA质粒为模板(质粒信息见Chang et al.,2013)，用设计好的F引物(SEQID NO:1)和通用R引物进行扩增并回收片段。(R引物序列：AGCACCGACTCGGTGCCAC(SEQ IDNO:3))体系如下：
反应条件：退火温度60℃；延伸时间10s
2)体外转录
以T7 RNA polymerase进行体外转录，体系如下：
混匀后，37℃水浴2h。加入2μl的DNase I，37℃水浴15分钟。加入50μl无水乙醇和2μl醋酸钠，混匀，-80℃过夜。4℃，12000rpm离心25分钟，弃上清；70％无水乙醇洗2次；空离5分钟，吸去多余酒精，超净吹干并加入适量无酶水；测浓度，电泳检测，-80℃保存。
2.2Cas9 mRNA合成
1)质粒线性化：质粒信息见(Chang et al.,2013)，线性化体系如下：
线性化条件：37℃水浴，3h。
2)切胶回收(胶浓度：1％)；
3)体外转录；
以上步回收产物为模板进行体外转录，体系如下：
2.3显微注射
将gRNA及Cas 9mRNA各稀释至1000ng/μL。按照1:1比例各1μl进行混合，并加入约0.4μl酚红溶液(起指示作用)。将混合液转至微型针管中并利用显微注射仪将其注射至1细胞-4细胞受精卵中,同时单独注射gRNA和Cas9做阴性对照。注射完成后，将其转入28℃恒温循环水孵化系统中进行孵化。
3、G0代阳性鱼的突变筛选
3.1突变检测引物设计
检测引物参照靶位点，F引物设计在离靶点上游80bp左右处(考虑到后续测序误差，故F引物离靶点较远)，R引物设计在靶点下游。PAGE引物长度控制在70-110bp间，包含靶位点。引物在NCBI Primer blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)上进行设计并检测其特异性。针对cyp17a1基因的靶点设计特异的上下游引物。检测及PAGE引物序列如下：
检测引物：
cyp17a1-T-F：5’-TGGGATGTTTCGGCTCTG-3’(SEQ ID NO:4)
cyp17a1-T-R：5’-AACATGCACAGGGCTCCA-3’(SEQ ID NO:5)
PAGE引物：
cyp17a1-page-F：5’-GCCACACCTCCCTGCACTAC-3’(SEQ ID NO:6)
cyp17a1-page-R：5’-TCATCAGCGAGTATGTATGTCCG-3’(SEQ ID NO:7)
3.2G0检测：
孵化后第三天收集部分鱼卵采用苯酚-氯仿-异戊醇抽提法提取DNA，具体步骤参考陈锦霖博士毕业论文(翻译延伸因子eEF1A1b和42Sp50在罗非鱼配子发生中的功能研究，陈锦霖,2014)。并以此为模板，用预先设计好的检测引物进行PCR扩增并回收产物，利用DdeI酶进行酶切检测。体系如下：
条件：37℃水浴，3h。
酶切完进行琼脂糖凝胶电泳(胶浓度，1.5％；时间，20min)。
由于序列改变，Dde I酶无法将酶切位点序列改变的片段切开，而未突变的序列则能被切开。由于G0阳性鱼为嵌合体，故其序列一部分能切开而另一部分不能被切开。以单独注射Cas9 mRNA或gRNA的鱼作为对照。
确定gRNA、Cas9 mRNA工作之后，进行批量注射，在3月龄进行同样的酶切检测，并将阳性鱼养殖于室内循环水系统中至成年以传代。
实施例2基于G0代阳性鱼的传代建系
1、获得杂合子cyp17a1突变F1代；
待阳性鱼性成熟(6月龄左右)，将其与野生型雌鱼交配，从而得到不同突变类型的F1代鱼，通过检测引物扩增结合测序技术对突变类型进行鉴定，选取突变类型相同(且碱基非3的倍数缺失)的雌雄罗非鱼作为F1代亲鱼。待F1代亲鱼性成熟，两者交配即可得到含有纯合缺失的F2代鱼。
2、获得纯合子cyp17a1突变F2代
纯合突变采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)结合测序技术进行检测。首先提取F2代鱼基因组DNA，以此为模板利用PAGE引物扩增并将扩增产物进行PAGE，后经凝胶成像系统成像。通过条带显示判断野生型(一条带)、杂合子(4条带)以及纯合子(1条带)。并将检测出的纯合鱼送测序以确认检测结果。
实施例3基于cyp17a1纯合突变鱼的表型鉴定
1、性腺组织学观察
2、纯合突变育性的检测
3、生长指标评估
3.1体重(Body weight)；
3.2体长(Body length)；
3.3体高(Body height)；
3.4体宽(Body width)；
4、肌肉组织学鉴定
5、显著性分析
数据在WPS Excel 2020上进行整理后，在SPASS 20.0上进行组间差异性分析，显著水平定为0.05，实验数据用平均值±标准误
表示。
6、数据处理
在WPS excel上对每个时期数据进行整理，并进行显著性分析，实验数据采用平均值±标准误
表示。作图在graphpad prism5.0上完成。
结论如前述。最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种全雄不育尼罗罗非鱼品系，其特征在于，所述尼罗罗非鱼品系是CRISPR/Cas9基因编辑获得的尼罗罗非鱼类固醇合成酶编码基因cyp17a1纯合敲除系。
2.权利要求1所述全雄不育尼罗罗非鱼品系的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括步骤：
(1)将尼罗罗非鱼cyp17a1基因gRNA与Cas9 mRNA混合，并室温孵育获得gRNA与Cas9mRNA的复合物；向复合物中加入小分子染料酚红混合均匀即得CRISPR/Cas9基因编辑的显微注射液；
(2)使人工授精后一至四细胞期尼罗罗非鱼受精卵均匀平躺于培养皿中；
(3)将所述显微注射液转至微型针管中并利用显微注射仪将其注射至所述步骤(2)固定的受精卵中；
(4)注射后将受精卵转入28℃恒温循环水孵化系统中进行孵化；
(5)对孵化后受精卵进行基因编辑后阳性鱼突变筛选；
(6)从阳性鱼突变获得尼罗罗非鱼cyp17a1b纯合敲除系。
3.根据权利要求2所述全雄不育尼罗罗非鱼品系的构建方法，其特征在于，所述显微注射液中cyp17a1基因gRNA终浓度为500ng/μL；所述Cas9 mRNA的终浓度为500ng/μL；所述显微注射的体积为每个受精卵0.005μl。
4.根据权利要求2所述全雄不育尼罗罗非鱼品系的构建方法，其特征在于，所述cyp17a1基因gRNA制备方法为：针对CRISPR/Cas9基因编辑的cyp17a1基因靶位点设计gRNA特异性F引物，以gRNA质粒为模板用所述F引物和通用R引物进行扩增并回收片段得到gRNADNA模板，将所述gRNA DNA模板体外转录后获得cyp17a1基因的gRNA；所述Cas9 mRNA制备方法为：将Cas9质粒线性化之后体外转录制备而成。
5.根据权利要求4所述全雄不育尼罗罗非鱼品系的构建方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9基因编辑的靶位点为SEQ ID NO:2所示核酸序列。
6.根据权利要求5所述全雄不育尼罗罗非鱼品系的构建方法，其特征在于，针对SEQ IDNO:2所示靶位点设计的gRNA特异性F引物序列如SEQ ID NO:1所示。
7.根据权利要求3所述全雄不育尼罗罗非鱼品系的构建方法，其特征在于，所述通用引物序列如SEQ ID NO:3所示。
8.根据权利要求2所述全雄不育尼罗罗非鱼品系的构建方法，其特征在于，所述基因编辑后阳性鱼突变筛选方法包括：
A.提取基因组DNA并以基因组DNA为模板以设计的检测引物进行PCR扩增并回收产物；
B.利用HpyAV限制内切酶对回收产物进行酶切检测,可切开的序列为未突变，切不开的序列则为获得cyp17a1基因缺失突变；
C.所述阳性鱼为嵌合体，其序列只能被部分切开的筛选为突变阳性；
所述检测F引物为：如SEQ ID NO:4所示；
R引物为：如SEQ ID NO:5所示。
9.根据权利要求2所述全雄不育尼罗罗非鱼品系的构建方法，其特征在于，从阳性鱼突变鱼获得尼罗罗非鱼cyp17a1b纯合敲除系的方法包括:
a.将3月龄筛选得到的阳性鱼养殖于室内循环水系统中至成年以传代；
b.待雄鱼性成熟，将其与野生型雌鱼交配，从不同突变类型的F1代鱼中选取突变类型相同且碱基非3的倍数缺失的雌雄罗非鱼作为F1代亲鱼；
c.待F1代亲鱼性成熟，两者交配可得到含有纯合缺失cyp17a1b的F2代尼罗罗非鱼。
10.根据权利要求9所述全雄不育罗非鱼品系的构建方法，其特征在于，所述纯合缺失cyp17a1b的F2代尼罗罗非鱼鉴定方法为：
I.提取F2代鱼基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用PAGE引物扩增并将扩增产物进行PAGE，后经凝胶成像系统成像；
Ⅱ.通过条带显示判断：当扩增产物为一条带时，为野生型或纯合子；当扩增产物为四条带时，为杂合子；
Ⅲ.从野生型与纯合子中通过所述突变筛选方法得到尼罗罗非鱼cyp17a1b纯合敲除系，并通过测序确认检测结果；
所述PAGE F引物为：如SEQ ID NO:6所示；所述PAGEF R引物为：如SEQ ID NO:7所示。
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