CN108624619A - 罗非鱼pgr/mstn基因纯合敲除雌性完全不育品系及构建方法 - Google Patents
罗非鱼pgr/mstn基因纯合敲除雌性完全不育品系及构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108624619A CN108624619A CN201810169114.7A CN201810169114A CN108624619A CN 108624619 A CN108624619 A CN 108624619A CN 201810169114 A CN201810169114 A CN 201810169114A CN 108624619 A CN108624619 A CN 108624619A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pgr
- gene
- female
- mstn
- pures
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 101150096336 PGR gene Proteins 0.000 title claims abstract description 69
- 241000276701 Oreochromis mossambicus Species 0.000 title claims abstract description 36
- 101150048453 MSTN gene Proteins 0.000 title claims abstract description 34
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 claims abstract description 31
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 230000036512 infertility Effects 0.000 claims abstract description 17
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 claims abstract description 17
- 206010021928 Infertility female Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 claims abstract description 8
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 claims abstract description 8
- 208000007984 Female Infertility Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 18
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims description 14
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims description 9
- 101100228739 Danio rerio mstnb gene Proteins 0.000 claims description 8
- 230000035558 fertility Effects 0.000 claims description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 4
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 claims description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 241000276703 Oreochromis niloticus Species 0.000 description 4
- 208000026487 Triploidy Diseases 0.000 description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- POCJOGNVFHPZNS-ZJUUUORDSA-N (6S,7R)-2-azaspiro[5.5]undecan-7-ol Chemical compound O[C@@H]1CCCC[C@]11CNCCC1 POCJOGNVFHPZNS-ZJUUUORDSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- BSPUVYFGURDFHE-UHFFFAOYSA-N Nitramine Natural products CC1C(O)CCC2CCCNC12 BSPUVYFGURDFHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- POCJOGNVFHPZNS-UHFFFAOYSA-N isonitramine Natural products OC1CCCCC11CNCCC1 POCJOGNVFHPZNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000001072 progestational effect Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010056852 Myostatin Proteins 0.000 description 1
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 210000004246 corpus luteum Anatomy 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000000686 essence Substances 0.000 description 1
- 244000144992 flock Species 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108020004017 nuclear receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000017448 oviposition Effects 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000019100 sperm motility Effects 0.000 description 1
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0276—Knock-out vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/461—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from fish
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/40—Fish
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/10—Vectors comprising a non-peptidic targeting moiety
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于水产养殖及现代农业技术领域，一种罗非鱼pgr/mstn基因纯合敲除雌性完全不育品系及构建方法，证明了罗非鱼pgr基因纯合敲除导致雌性完全不育、雄性可育的特征，以及利用此特点构建pgr‑/‑/mstn‑/‑双基因敲除不育品系，构建养殖新品系的可行性。本发明成功建立并鉴定罗非鱼pgr基因纯合敲除雌性完全不育品系，pgr基因纯合敲除雄鱼可育品系，pgr基因纯合敲除雄性可以用于生产双基因敲除群体，筛选得到不育雌性后代，不育是稳定可靠的。同时，mstn‑/‑基因敲除个体的生长速度明显优于正常个体，敲除的雌性个体不能产生后代，不会对野生遗传资源造成基因组污染。
Description
技术领域
本发明属于水产及现代农业技术领域，尤其涉及鉴定了一种罗非鱼pgr基因纯合敲除雌性完全不育品系，以及利用其构建pgr-/-/mstn-/-双基因敲除罗非鱼养殖新品系的方法。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：罗非鱼是联合国粮农组织向世界推荐的优良养殖品系之一，我国罗非鱼产业发展迅猛，成为罗非鱼第一生产大国和出口国。尽管鱼类(包括罗非鱼)的新品种繁育有了迅猛发展，但凡涉及到基因操作的新品种繁育，都可能会造成对自然生态系统的潜在生态风险。长期以来，子代完全不育技术是基因操作新品系推广过程的瓶颈问题。而目前产生不育个体的主要方法是通过基因敲降，或者白硝胺处理抑制原始生殖细胞增殖，或者生产三倍体的方法获得不育个体，但这种不育的比率较低，且存在安全隐患，目前亟待通过新途径和新手段获得完全不育品系。
综上所述，现有技术存在的问题是：目前产生不育个体的主要方法是通过基因敲降，或者白硝胺处理抑制原始生殖细胞增殖，或者生产三倍体的方法获得不育个体，但这种不育的比率较低，存在安全隐患，亟待通过新途径和手段获得完全不育品系。
解决上述技术问题的难度和意义：完全不育是基因操作(基因敲除和转基因)新品系推广的前提和保障，但长期以来，研究者不断尝试通过早期生殖细胞特异基因敲除或者敲降，获得不育品系，但这种不育会完全杀死生殖细胞，雌雄均不育，所以是不能用于不同品系的杂交和传代的。而三倍体的构建过程繁琐，需要耗费大量的人力物力，同时最新研究表明，三倍体的不育是相对的，而不是绝对的，用于新品系的构建存在一定的风险。因此，发现的pgr基因敲除雌性群体是一种稳定可靠的不育品系，只需要通过pgr敲除的可育雄性与其它基因操作新品系杂交，获得的雌性个体就是具有优良养殖性状的不育群体。该技术方法能够节约成本，具有很强的可操作性和重复性。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种罗非鱼pgr/mstn基因纯合敲除雌性完全不育品系及构建方法，可靠且稳定的罗非鱼pgr基因纯合敲除雌性完全不育品系，以及pgr-/-/mstn-/-双基因编辑新品系的构建方法。
本发明是这样实现的：利用罗非鱼pgr基因纯合敲除可育雄性个体，与mstn基因敲除雌性个体杂交，筛选得到pgr-/-/mstn-/-双基因敲除的新品系，而雌性群体既具有生长快速的优良性状，又具有不育的特征，将用于水产养殖推广试验。
所述罗非鱼pgr/mstn基因纯合敲除雌性完全不育品系及构建方法的构建方法的罗非鱼pgr基因纯合敲除雌性具有完全不育，构建双基因敲除新品系的雌性不育群体作为养殖业推广对象；通过罗非鱼pgr基因纯合敲除品系和mstn纯合敲除品系构建双基因敲除品系。
进一步，所述罗非鱼pgr/mstn基因纯合敲除雌性完全不育品系及构建方法的构建方法利用罗非鱼pgr基因纯合敲除雌性完全不育品系及pgr基因纯合敲除雄性品系可育的特征，通过pgr纯合敲除可育雄性XY与mstn纯合敲除雌性XX杂交，构建pgr-/-/mstn-/-双基因敲除的新品系，筛选得到的雌性个体用于水产养殖推广。
进一步，所述罗非鱼pgr/mstn基因纯合敲除雌性完全不育品系及构建方法的构建方法包括以下步骤：
步骤一，通过CRISPR/Cas9构建pgr基因纯合敲除系，通过测序和酶切进行系列验证；通过组织学观察和分子生物学手段检测pgr基因敲除对雌、雄个体育性的影响；
步骤二，通过CRISPR/Cas9构建mstn基因纯合敲除系，获得纯合敲除的F3代个体，通过初步统计发现其生长速度显著优于正常个体；
步骤三，通过pgr-/-雄性与mstn-/-雌性纯合敲除系杂交，建立pgr-/-和mstn-/-双敲除的群体。
大量研究表明，鱼类孕激素(DHP)在卵子成熟和排出过程中发挥重要作用，本发明通过CRISPR/CAS9敲除技术，首次在养殖鱼类构建pgr基因(孕激素DHP的核受体基因)纯合敲除系，大量组织学和统计数据发现，雌性个体完全不育。其机制可能是因为脑垂体促黄体生成素(LH)合成水平显著降低，同时性腺LH的受体表达水平也降低，因此LH激增异常，性腺也不能正常响应脑垂体LH的促进排卵和产卵过程，最终导致雌性个体不能排卵而不育。但在雄性个体，pgr基因敲除导致精子发生和成熟过程在一定程度上受损，具体表现为精子数量减少，精子活力和运动能力降低，以及后代成活率降低，但仍然是部分可育的。因此pgr基因敲除雄性个体可以用于传代和杂交实验，而雌性不育是进行水产养殖推广的关键。另外，mstn由肌肉生长抑制素基因编码，可抑制肌细胞的增殖和分化，该基因敲除已成功创制双肌型牛和绵羊新品系，而在鱼类该基因敲除能够诱导生长加速和抗逆性强的新品系。因此，根据罗非鱼pgr基因纯合敲除雌性完全不育品系的特征和mstn基因敲除生长加速的特点，通过pgr敲除雄鱼与mstn基因敲除雌鱼，获得同时携带pgr和mstn双基因纯合敲除的不育新品系。所获得的不育雌性后代具有明显的生长优势，为罗非鱼养殖育种开辟了新的途径。
综上所述，本发明通过前期大量的实验验证，已经成功建立并鉴定了罗非鱼pgr基因纯合敲除雄鱼可育，但pgr基因纯合敲除雌性完全不育，因此这种雌性群体是不能够产生后代的，不会对野生品种造成威胁。同时，已经获得mstn基因纯合敲除F3代，具有明显的生长优势。本发明的技术关键是通过pgr敲除雄鱼与mstn基因新品系杂交，获得同时携带pgr和mstn基因纯合敲除不育新品系，而这些具有重要经济性状的不育雌性个体，可以作为重要养殖对象进行推广。同时本发明的推广，将为转基因和基因敲除新品系的推广保驾护航。
附图说明
图1是本发明实施例提供的罗非鱼pgr基因纯合敲除雌性完全不育品系的构建方法流程图。
图2是本发明实施例提供的罗非鱼pgr基因纯合敲除雌性完全不育品系的构建方法实现流程图。
图3是本发明实施例提供的pgr基因敲除的鉴定以及纯合鱼的筛选图。
图4是本发明实施例提供的pgr基因敲除雌性不育的组织切片及育性鉴定图。
图5是本发明实施例提供的pgr基因敲除雄性育性降低但可育的组织及育性鉴定图。
图6是本发明实施例提供的mstn基因敲除的鉴定及纯合鱼的筛选图。
图7是本发明实施例提供的mstn敲除个体和对照之间生长速率统计示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
尽管已有转基因三文鱼成功上市的先例，但通过基因操作产生的鱼类新品种，都仍然被“禁锢”在实验室内。因此生产既具有重要经济价值和优良性状，又有不育的特点的的养殖鱼类，才能避免在养殖或者增殖放流过程中对野生鱼类种质资源的影响。目前，通过基因敲除或者转基因已经生产出大量生长快，抗病抗逆性强的纯合转基因品系，但由于存在基因污染的安全隐患，不能广泛被消费者接受和商业推广，因此攻克完全不育技术才是打破转基因品系推广瓶颈的唯一出路。长期以来，消费者对于转基因食品的误解一直都没有消除过，而通过基因敲除构建具有优良性状的养殖新品系，不会出现大片段基因的导入，而仅仅是基因序列中几个核苷酸的插入或者缺失，这显然更容易被人们接受。因此，本发明的主旨是通过构建pgr基因纯合敲除和生长相关基因新品系的融合体，最终获得生长快、抗病、抗逆性强且完全不育的鱼类新品系。
如图1所示，本发明实施例提供的罗非鱼pgr基因纯合敲除雌性完全不育品系的构建方法包括以下步骤：
S101：通过CRISPR/Cas9构建pgr基因纯合敲除系，通过测序和酶切进行系列验证；通过组织学观察和分子生物学手段检测pgr基因敲除对雌、雄个体育性的影响；
S102：通过CRISPR/Cas9构建mstn基因纯合敲除系，获得纯合敲除的F3代个体，通过初步统计发现其生长速度显著优于正常个体；
S103：通过pgr-/-(雄性)与mstn-/-(雌性)纯合敲除系杂交，建立pgr-/-和mstn-/-双敲除的群体，其中因为携带pgr位点敲除，所以雌性不育；这种不育的双基因敲除雌性罗非鱼群体可以用于水产养殖推广的对象。
证明了罗非鱼pgr基因纯合敲除导致雌性完全不育、雄性可育的特征，以及利用此特点构建双基因敲除或者转基因不育品系的方法。通过前期大量的实验和抽样检测，本发明已经成功建立并鉴定了罗非鱼pgr基因纯合敲除雌性完全不育品系，但pgr基因纯合敲除雄鱼可育，因此这种pgr-/-雄性可以生产双基因敲除或者转基因群体，进而筛选得到不育雌性个体，这种不育是稳定可靠的，因此可以作为水产推广对象。同时，mstn基因敲除个体的生长速度明显优于正常个体，因此构建双基因编辑的雌性个体是不能够产生后代的，不会对野生遗传资源造成基因组污染。本发明的技术关键是通过pgr敲除雄鱼与其它基因敲除(mstn-/-)新品系杂交，获得同时携带pgr和mstn基因纯合敲除不育新品系(占群体的1/32)，而这些具有生长速度快的不育雌性个体，可以作为重要养殖对象进行推广。
证明部分(具体实施例/实验)
研究过程简述如下：
1.通过CRISPR/Cas9构建pgr基因纯合敲除系，通过测序和酶切进行系列验证。通过组织学观察和分子生物学手段检测了pgr基因敲除对雌、雄个体育性的影响。
2.同样，通过CRISPR/Cas9构建mstn基因纯合敲除系，获得纯合敲除的F3代个体。通过初步统计发现其生长速度显著优于正常个体。
3.通过pgr-/-(雄性)与mstn-/-(雌性)纯合敲除系杂交，最后建立了pgr-/-和mstn-/-双敲除的群体，其中因为携带pgr位点敲除，所以雌性不育。这种不育的双基因敲除雌性罗非鱼群体可以用于水产养殖推广的对象。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110> 西南大学
<120>罗非鱼pgr/mstn基因纯合敲除雌性完全不育品系及构建方法
<160> 2
<210> 1
<211> 1131
<212> DNA
<213> 尼罗罗非鱼(Tilapia nilotica;Oreochromis niloticus)
<400>1
ATGCATCTGTCTCAGATCGTGCTGTATCTGAGCTTGCTGATTGCGTTGGGTCCAGTAGTTCTGAGTGACCAAGAGGCGCACCAGCAGCCTTCCGTCAGCACCCCAGTAGACACGGATCAATGCGCTACCTGCGAGGTCCGGCAGCAGATTAAAACCATGCGATTAAACGCGATAAAGTCTCAGATTCTGAGCAAGCTGCGAATGAAGGAAGCTCCCAACATTAGCAGAGAGATCGTGAAGCAGCTCCTGCCCAAAGCGCCGCCGCTGCAGCAGCTTCTGGATCAGTACGACGTGCTGGGAGATGACAACAGGGAAGAAGTCCTGGAGGACGACGACGAGCACGCAACCACGGAGACAATTGTAATGATGGCAACTGAACCTGATTCCGCTGTCCAGGTGGACGGGCAACCAAAGTGCTGCTTTTTCTCAATTACGCAGAAGTTTCAAGCCAGTCGCGTAGTTCGAGCGCAGCTTTGGGTGCATCTGCGTCCATCGGAAGAAGTGACCACCGTGTTCCTGCAAATCTCCCGGCTTATACCGGTCACAGACGGGAACAGACACATACGAATCCGCTCCTTGAAGATCGACGTGAATGCCGGGGCCAGCTCTTGGCAAAGTATAGACGTCAAGCAAGTGTTGACTGTGTGGCTGCGGCAGCCGGAGACCAACTGGGGCATCGAGATCAACGCTTTCGATTCGAGGGGAAATGACTTAGCTGTGACCTTCGCAGAGCCGGGAGAGGAGGGTCTGCAACCGTTCATGGAGGTGAAGATTTCAGAGGGCCCCAGGCGTGCCCGGAGAGACTCGGGCCTGGACTGCGATGAGAACTCTCCAGAGTCCCGGTGCTGTCGCTACCCACTCACTGTGGACTTCGAGGACTTTGGCTGGGACTGGATTATTGCACCAAAACGCTACAAGGCCAACTATTGCTCTGGGGAGTGTGAGTACATGCACTTACAGAAGTACCCACACACCCACCTGGTGAACAAAGCCAACCCCAGAGGGACTGCAGGTCCCTGCTGTACCCCAACAAAGATGTCGCCAATCAACATGCTCTACTTTAACCGCAAAGAGCAAATCATCTATGGCAAGATCCCCTCCATGGTGGTGGACCGTTGTGGATGCTCCTGA
<210> 2
<211> 2022
<212> DNA
<213> 尼罗罗非鱼(Tilapia nilotica;Oreochromis niloticus)
<400>2
ATGGAGAATAAAGCAAACGGGAAGATGGGCACCAACAGTACTTCGGTCACCGATTCCACCGAAGCAAGCCTAAGTGATGTGATTGAAGCTGGATACAGTAGGTCGAATACAAAATTGCCGGCCGATTCACGGTCTCTAAATTGCACGTCCTCCGTGCGTAATTTTGGAAACGTTAACACAATGATCCAAGGTCTTAATTCAAGCCCTGACTGCGCAGTTTTTAAAGACTGTAACATACTCGAGCCTTCAGTTGGAGCAAAACATTTTTATGACCGTAACAGAGACTATCTGAAATGTGACGGTGTTCCATGGGAGGATTTTGTTATAGTTCAGAGGACAAACGTGGCCACATCCGAAAGTTTACCAGGCGCAAGTCTCCCCTCCACCTCCGGGGCTTGCAAGTTCATCAAAGATGAAAAGGAGCCTTCTGTGATTATGGACATCCCCTGTCAGAACTTTAATCCATCACCCGAGATTTCTGCTCTCGATACTGACACCGACAGAAAGCAGCACTTAGGGCTTAGCGAAGGTGAATCGACAAGTTTCGCATCAGCCGCTGCAGTTTCCCGACCGGGGCTGGAGGTCTCTCCAAACTTTCTTATGGACTTGAACCAGTCAGACCAGCTTGTGAACCCAGTAAGGGCTGACTCCAGATGTGGTTTGTCCGGGAAAGCTGCCATTAGCTTCGATCCCAACGCGCAAACAGCTGGGCAACTGTCGATATATAAGACTGATGTTCCTCGTTGGCAGATGCAAGCATCTCCAGGTGAGACCCAGTATTGGGGACAGTCGGCAGGGGTAAACGAGGACCCGTTCAGAACTAGTGGCTACAATGGGATGCAGAACCAGACCCAGACTCTTCCTCAGAGGAACCCATCTCCTTTCTCCACATTCCTCGGTATGCCACCCCAGAGACTGTGTGTGATCTGTAGTGATGAGGCATCTGGCTGCCACTATGGAGTCTTAACGTGTGGGAGCTGTAAAGTATTTTTTAAAAGAGCGGTTGAAGGCCATCACAGCTATCTCTGTGCTGGGCGGAATGACTGCATTGTGGACAAAATTCGGAGAAAAAATTGCCCCGCATGTCGCCTTCGAAAGTGCTATCAAGCAGGAATGATGCTTGGAGGGAGGAAACTGAAGCGCTTTGGGGCCTTGAAAGACACAGGTTTGACCCCATCCCTGATGTTCCGGTCCCACTTGACCATGCCCGGTGACAGCCAAGCCTTGACTCCCATGTCTTACATACCAGGCATTCATGACCTACAACTCTCCCAACAAATGATCAGCATCCTTGAAAACATCGAACCAGAGGTGGTGTACTCTGGTTATGACAACTCCCAGCCTGATGTTCCCCATCTTCTGCTCACCAGTCTCAACAGGCTGTGTGAGAAACAGCTGATGTGGATTGTGAAGTGGTCAAAATCTCTCCCAGGTTTTCGTAATCTACACATCAATGATCAGATGACACTCATCCAGTACTCATGGATGAACCTGATGGTGTTCTCTCTTGGGTGGCGCTCCTTTCAGAATGTCACCAGTGAATATTTATACTTTGCACCTGATCTGATTCTTAGCCAGGAGCAAATGAGGAGATCTCCAATTTACGACCTCTGCCTAGCAATACAGTTTATTCCTCAGGAGTTTGCAAATCTTCAAGTTTCACGCGAAGAGTTTCTTTGCATGAAAGCCATAATATTGCTTAACACAGTGCCTCTTGAAGGATTAAAAAGTCAGGCAGCATTTGATGAAATGAGACAAAACTACGTCCGGGAGCTGACCAAGGCTATTCACATGAAGGAGAAGGGCATCGTGGCATGTTCCCAGCGGTTCTACCACCTCACCAGACTCATGGATGCCATTCATGATATAGTAAAGAAGGTCAACCTATTCTGTTTGAGTACCTTCATCCAGGCAGATGCCATGAAAGTGGAGTTTCCAGAGATGATGTCAGAGGTCATTGCCTCCCAGCTTCCCAAGGTCCTTGCAGGCATGGTGAGGCCCCTCTTATTCCACAGCAAATGA
Claims (3)
1.一种罗非鱼pgr/mstn基因纯合敲除雌性完全不育品系及构建方法的构建方法，其特征在于，所述罗非鱼pgr/mstn基因纯合敲除雌性完全不育品系及构建方法的构建方法的罗非鱼pgr基因纯合敲除雌性具有完全不育，构建双基因敲除新品系的雌性不育群体作为养殖业推广对象；通过罗非鱼pgr基因纯合敲除品系和mstn纯合敲除品系构建双基因敲除品系。
2.如权利要求1所述的罗非鱼pgr/mstn基因纯合敲除雌性完全不育品系及构建方法的构建方法，其特征在于，所述罗非鱼pgr/mstn基因纯合敲除雌性完全不育品系及构建方法的构建方法利用罗非鱼pgr基因纯合敲除雌性完全不育品系及pgr基因纯合敲除雄性品系可育的特征，通过pgr纯合敲除可育雄性XY与mstn纯合敲除雌性XX杂交，构建pgr-/-/mstn-/-双基因敲除的新品系，筛选得到的雌性个体用于水产养殖推广。
3.如权利要求1所述的罗非鱼pgr/mstn基因纯合敲除雌性完全不育品系及构建方法的构建方法，其特征在于，所述罗非鱼pgr/mstn基因纯合敲除雌性完全不育品系及构建方法的构建方法包括以下步骤：
步骤一，通过CRISPR/Cas9构建pgr基因纯合敲除系，通过测序和酶切进行系列验证；通过组织学观察和分子生物学手段检测pgr基因敲除对雌、雄个体育性的影响；
步骤二，通过CRISPR/Cas9构建mstn基因纯合敲除系，获得纯合敲除的F3代个体，通过初步统计发现其生长速度显著优于正常个体；
步骤三，通过pgr-/-雄性与mstn-/-雌性纯合敲除系杂交，建立pgr-/-和mstn-/-双敲除的群体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810169114.7A CN108624619A (zh) | 2018-02-28 | 2018-02-28 | 罗非鱼pgr/mstn基因纯合敲除雌性完全不育品系及构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810169114.7A CN108624619A (zh) | 2018-02-28 | 2018-02-28 | 罗非鱼pgr/mstn基因纯合敲除雌性完全不育品系及构建方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108624619A true CN108624619A (zh) | 2018-10-09 |
Family
ID=63706134
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810169114.7A Withdrawn CN108624619A (zh) | 2018-02-28 | 2018-02-28 | 罗非鱼pgr/mstn基因纯合敲除雌性完全不育品系及构建方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108624619A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114438132A (zh) * | 2022-02-16 | 2022-05-06 | 西南大学 | 尼罗罗非鱼mstnb纯合敲除系的建立方法及以此获得的快速生长品系 |
| CN116144708A (zh) * | 2022-09-29 | 2023-05-23 | 西南大学 | 一种全雄不育尼罗罗非鱼品系及其构建方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105145438A (zh) * | 2015-09-30 | 2015-12-16 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 建立尼罗罗非鱼优良性状雌性纯系的方法 |
| CN106191114A (zh) * | 2016-07-29 | 2016-12-07 | 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 | 利用CRISPR‑Cas9系统敲除鱼类MC4R基因的育种方法 |
-
2018
- 2018-02-28 CN CN201810169114.7A patent/CN108624619A/zh not_active Withdrawn
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105145438A (zh) * | 2015-09-30 | 2015-12-16 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 建立尼罗罗非鱼优良性状雌性纯系的方法 |
| CN106191114A (zh) * | 2016-07-29 | 2016-12-07 | 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 | 利用CRISPR‑Cas9系统敲除鱼类MC4R基因的育种方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| OLDHAM J M等: "Molecular expression of myostatin and MyoD is greater in double-muscled than normal-muscled cattle fetuses", 《 AM J PHYSIOL REGUL INTEGR COMP》 * |
| 刘刚: "孕激素(DHP)在硬骨鱼类减数分裂启动过程中的作用机制研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》 * |
| 唐永凯等: "吉富罗非鱼MSTN基因结构及其多态性与生长性状的相关性", 《中国水产科学》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114438132A (zh) * | 2022-02-16 | 2022-05-06 | 西南大学 | 尼罗罗非鱼mstnb纯合敲除系的建立方法及以此获得的快速生长品系 |
| CN116144708A (zh) * | 2022-09-29 | 2023-05-23 | 西南大学 | 一种全雄不育尼罗罗非鱼品系及其构建方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Stevens et al. | Comparative genomics of 10 new Caenorhabditis species | |
| Mair et al. | Genetic manipulation of sex ratio for the large-scale production of all-male tilapia Oreochromis niloticus | |
| Cook | Sex determination in the Hymenoptera: a review of models and evidence | |
| White | Heterozygosity and genetic polymorphism in parthenogenetic animals | |
| Abe et al. | Retrotransposable elements on the W chromosome of the silkworm, Bombyx mori | |
| Rigaud et al. | The evolution of sex determination in isopod crustaceans | |
| CN103798169B (zh) | 一种快速建立yy超雄黄颡鱼改良繁育系的方法 | |
| Campos-Ramos et al. | Identification of putative sex chromosomes in the blue tilapia, Oreochromis aureus, through synaptonemal complex and FISH analysis | |
| CN110684777B (zh) | 一段分离的核苷酸序列在肌间刺减少的斑马鱼构建中的应用 | |
| WO2018141127A1 (zh) | 一种免疫缺陷大鼠模型的构建方法 | |
| CN111944911A (zh) | 一种影响绒山羊绒长性状的分子标记及应用 | |
| Tuan et al. | Sex determination and the feasibility of genetically male tilapia production in the Thai-Chitralada strain of Oreochromis niloticus (L.) | |
| WO2022111124A1 (zh) | 发育正常无肌间刺鱼类新品种培育方法 | |
| CN108624619A (zh) | 罗非鱼pgr/mstn基因纯合敲除雌性完全不育品系及构建方法 | |
| Chingjiang et al. | Genome manipulation in carp (Cyprinus carpio L.) | |
| Lu et al. | Changes in ploidy drive reproduction transition and genomic diversity in a polyploid fish complex | |
| Wan et al. | Genetic improvement of aquaculture performance for tetraploid Pacific oysters, Crassostrea gigas: A case study of four consecutive generations of selective breeding | |
| Nöthiger et al. | Genetic and developmental analysis of the sex-determining gene ‘double sex’(dsx) of Drosophila melanogaster | |
| CN109504781A (zh) | 一种提高苏尼特羊产羔数的单倍型遗传标记及其应用 | |
| Gross et al. | Intriguing evidence of translocations in Discus fish (Symphysodon, Cichlidae) and a report of the largest meiotic chromosomal chain observed in vertebrates | |
| Petitpierre | Cytogenetics, cytotaxonomy and chromosomal evolution of Chrysomelinae revisited (Coleoptera, Chrysomelidae) | |
| Crother et al. | Inferring developmental constraint and constraint release: primordial germ cell determination mechanisms as examples | |
| Wiberg et al. | Faster rates of molecular sequence evolution in reproduction-related genes and in species with hypodermic sperm morphologies | |
| CN110468132A (zh) | 一种sgRNA及转基因表达载体、表达品系、筛选方法 | |
| CN115807037A (zh) | 一种遗传可控的四倍体鱼的选育方法及三倍体鱼的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20181009 |
|
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |