BR112013001685B1 - Método para editar pelo menos uma sequência cromossômica endógena em uma célula pela inserção de uma sequência na sequência cromossômica - Google Patents
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Abstract
edição de genoma usando endonucleases-alvos e ácidos nucleicos de fita única. a presente invenção fornece métodos e kits para editar sequências cromossômicas específicas em células. em particular, endonucleases alvos e ácidos nucleicos de fita única são usados para editar a sequência cromossômica.
Description
[0001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório US Número 61/410.124, depositado em 4 de Novembro, 2010, Pedido Provisório US Número 61/382.965, depositado em 15 de Setembro, 2010, e Pedido Provisório US Número 61/367.022, depositado em 23 de Julho, 2010, cada um estando por este meio incorporado por referência em sua totalidade.
[0002] A presente invenção geralmente se refere ao uso de endonucleases-alvo e ácidos nucleicos de fita simples para editar sequências cromossômicas específicas.
[0003] A engenharia de genoma lógica tem um enorme potencial em pesquisa básica, descoberta de drogas, e medicamentos baseados em células. Muitos métodos existentes para o nocaute, mutagênese, ou integração do gene-alvo dependem da recombinação de homólogos. A baixa taxa de recombinação espontânea em muitas células, bem como a escala de esforço e tempo necessário para isolar o evento-alvo, no entanto, tem impedido o progresso neste campo de triagem. Desse modo, existe uma necessidade de uma tecnologia que pode rapidamente atingir a edição de genoma-alvo com precisão, eficiência e alta velocidade.
[0004] Entre os diversos aspectos da presente descrição está o fornecimento de um método para edição de pelo menos uma sequência cromossômica endógena em uma célula. O método compreende introduzir na célula (i) pelo menos uma endonuclease-alvo ou ácido nucleico codificando uma endonuclease-alvo, em que a endonuclease- alvo é capaz de introduzir uma ruptura de fita dupla em um sítio de clivagem-alvo na sequência cromossômica, e (ii) pelo menos um ácido nucleico de fita simples que compreende uma primeira porção tendo identidade de sequência substancial para a sequência cromossômica em pelo menos um lado do sítio de clivagem-alvo. O método adicionalmente compreende manter a célula em condições de modo que a ruptura de fita dupla introduzida por endonucleases-alvo seja reparada por um processo conduzido por homologia de modo que a sequência cromossômica seja trocada com a sequência do ácido nucleico de fita simples, editando desse modo a sequência cromossômica.
[0005] Outro aspecto fornece um kit para editar uma sequência cromossômica em uma célula. O kit compreende (a) pelo menos uma endonuclease-alvo ou ácido nucleico codificando uma endonuclease- alvo, em que a endonuclease-alvo é capaz de introduzir uma ruptura de fita dupla em um sítio de clivagem-alvo na sequência cromossômica, e (b) pelo menos um ácido nucleico de fita simples que compreende uma primeira porção tendo identidade de sequência substancial para a sequência cromossômica em pelo menos um lado do sítio de clivagem- alvo.
[0006] Outros aspectos e características da descrição são descritos mais detalhadamente abaixo.
[0007] O depósito do pedido contém pelo menos uma fotografia executada em cores. Cópias desta Publicação do Pedido de Patente com fotografias coloridas serão fornecidas pelo Escritório, mediante solicitação e pagamento da taxa necessária.
[0008] A figura 1 apresenta o projeto de oligonucleotídeos utilizados para modificar o lócus de quinase RSK2. A sequência genômica de quinase RSK2 tipo selvagem é apresentada na parte superior, com os sítios de ligação ZFN identificados. A sequência do oligonucleotídeo que abriga mutações específicas é apresentada na parte inferior.
[0009] A figura 2 documenta a integração do sítio BamHI para o lócus de quinase RSK2. "Pools" de células foram digeridos com BamHI e os fragmentos foram resolvidos por eletroforese em gel.
[00010] A figura 3 mostra clones de célula isolada única abrigando o sítio BamHI no lócus de quinase RSK2. O lócus RSK2 em clones individuais era PCR amplificado e digerido com BamHI.
[00011] A figura 4 esquematiza o projeto dos oligonucleotídeos usado para modificar o lócus de AAVS1. A sequência genômica tipo selvagem é apresentada na parte superior, com os sítios de ligação ZFN AAVS1 indicados. As sequências de oligonucleotídeos de senso e antissenso que compreendem um sítio são mostradas abaixo.
[00012] A figura 5 ilustra a integração do sítio HindIII para o lócus AAVS1. O painel superior mostra células entrando em contato com ZFN e oligonucleotídeo, e o painel inferior mostra células em contato com o oligonucleotídeo sozinho. Pools de células foram digeridos com HindIII e os fragmentos foram resolvidos por eletroforese em gel.
[00013] A figura 6 mostra clones de célula isolada única, abrigando o sítio da HindIII no lócus de AAVS1. O lócus de AAVS1 em clones individuais era PCR amplificado e digerido com Hndlll.
[00014] A figura 7 ilustra a integração do sítio HindIII para o lócus AAVS1 usando oligonucleotídeos de senso de comprimentos diferentes. O DNA genômico dos pools de células foi PCR amplificado e digerido com HindIII. Os números na parte superior referem-se à duração em nucleotídeos de cada do oligonucleotídeos. M significa marcadores, G representa o GFP (ou seja, sem controle ZFN), e Z representa o ZFN.
[00015] A figura 8 mostra a integração do sítio HindIII no lócus de AAVS1 usando oligonucleotídeos antissenso de comprimentos diferentes. O DNA genômico dos pools de células foi PCR amplificado e digerido com HindIII. Os números na parte superior referem-se à duração em nucleotídeos de cada oligonucleotídeo. M significa marcadores, G representa o GFP (ou seja, sem controle ZFN), e Z representa o ZFN.
[00016] A figura 9 mostra a integração do sítio HindIII no lócus de AAVS1 quando ZFNs foram liberados como mRNA ou DNA, em combinação com oligonucleotídeos de comprimentos diferentes. O DNA genômico dos pools de células foi PCR amplificado e digerido com Hndlll. Os números na parte superior referem-se à duração em nucleotídeos de cada oligonucleotídeo. R significa o RNA, D significa DNA, M significa marcadores, G representa o GFP (ou seja, sem controle ZFN), e Z representa o ZFN.
[00017] A figura 10 mostra um ensaio de Cel-1 de células que inclui o sítio de HindIII no lócus de AAVS1. Os números ao longo da parte superior referem-se ao comprimento em nucleotídeos de cada oligonucleotídeo. M significa marcadores, G representa o GFP (ou seja, sem controle ZFN), e Z representa o ZFN.
[00018] A figura 11 ilustra o uso de oligonucleotídeos homólogos versus não homólogos para a integração do sítio HindIII no lócus de AAVS1. 1, 8 senso, de fita simples; 2, 9, antissenso, fita simples; 3, 10, senso mais antissenso; 4 senso, fita simples (2 x); 5, 11 fita dupla (pré- anelada); 6, 12 oligonucleotídeo sozinho (sem ZFN), e 7 tipo selvagem.
[00019] A figura 12 ilustra a exclusão-alvo de DNA genômico de 0,1 a 100 kb em um lócus específico com oligonucleotídeos de DNA de fita simples (ssODN) e ZFNs.
[00020] A figura 12A ilustra uma exclusão que é 5' para o sítio de clivagem ZFN. A figura 12B ilustra uma exclusão que é 3 para o sítio de clivagem ZFN. A região de ponto de extremidade distante da exclusão na sequência cromossômica é designada como I, e o sítio de ligação do ZFN perto do sítio de clivagem-alvo é designado como II. O doador de ssODN compreende uma região (designada como I') que tem identidade de sequência para a região do ponto de extremidade distante da exclusão e de uma região (designada como II) que tem identidade de sequência para o sítio de ligação do ZFN perto do sítio de clivagem- alvo.
[00021] A figura 13 retrata a confirmação do PCR da exclusão de DNA genômico-alvo no lócus de AAVS1 em K562 com oligonucleotídeos de fita simples e ZFNs. As rotas rotuladas como "1" usaram células K562 expostas para oligonucleotídeos e ZFN, e assim, os fragmentos PCR foram derivados do alelo de exclusão. As rotas rotuladas como "2" usaram células K562 expostas apenas ao oligonucleotídeo, mas sem ZFN e fragmentos de PCR resultantes são do alelo tipo selvagem (sem exclusão). As rotas rotuladas como "3" usaram células K562 expostas para ZFN apenas, e assim os produtos PCR indicaram os fragmentos do alelo tipo selvagem também. O tamanho esperado dos fragmentos de PCR de alelo tipo selvagem e os fragmentos de PCR de alelo de exclusão apresentaram-se acima de cada grupo das rotas na figura 13 e que a exclusão de DNA genômico- alvo de cerca de 0,1 kb, 0,5 kb, 1,0 kb, 1,5 kb, 2 kb, 2,5 kb, 3,0 kb, 3,5 kb, 4,0 kb, 4,5 kb, 5,0 kb, 10,0 kb, 10,2 kb, 20,0 kb, 20,2 kb, 50 kb e 100 kb usando oligonucleotídeos de fita simples e ZFN foi apresentada e verificada. Entre os grupos de rotas, os grupos com um "*" indicaram a exclusão de "3" do sítio de corte ZFN; os grupos sem "*" indicaram a exclusão de 5' do sítio de corte de ZFN; o único grupo com duplo asterisco "**" indicou tanto a exclusão de 5' quanto de 3' do sítio de corte ZFN. M significa marcador de DNA.
[00022] A figura 14 apresenta a confirmação de PCR de exclusão de DNA genômico-alvo 5 kb no lócus de AAVS1 em diferentes tipos de células com oligonucleotídeos de fita dupla e fragmentos PCR de alelo ZFNs. A exclusão em todas as amostras de células, incluindo células K562, HCT116, U2OS, A549, HEK293, HepG2 e MCF7 têm o tamanho esperado de 303 bp. "1" representa "oligonucleotídeo + ZFN"; "2" representa "oligonucleotídeo apenas"; "3" representa "ZFN apenas"; e M significa marcador de DNA. O fragmento de PCR de alelo tipo selvagem esperado é 5303 bp e o fragmento de PCR de alelo esperado exclusão é 303, bp.
[00023] A figura 15 mostra a confirmação de PCR de exclusão de DNA genômico-alvo no lócus IRK4, RSK2 e RSK4 em K562 com oligonucleotídeos de fita simples e ZFNs. Os fragmentos de PCR do alelo de exclusão em todas as amostras de células têm o tamanho esperado de 334 bp para o lócus IRAK4, 281 bp para o lócus RSK2 e 190 bp para o lócus RSK4, respectivamente. "1" representa o "oligonucleotídeo de + ZFN"; "2" representa o "oligonucleotídeo apenas"; "3" representa "ZFN apenas"; e M significa marcador de DNA.
[00024] A figura 16 ilustra um esquema exemplar para obter exclusões e inserções genômicas-alvo simultâneas em células com oligonucleotídeos ssDNA e ZFNs. A região do ponto de extremidade distante de exclusão é designada como I, e o sítio de ligação de ZFN perto do sítio de clivagem-alvo é designado como II. O doador de ssODN compreende uma região (designada como I') que tem identidade de sequência para a região do ponto de extremidade distante de exclusão, uma região (designada como II) que tem uma identidade de sequência para o ZFN ligando o sítio perto do sítio de clivagem-alvo, e a sequência IoxP (designada III). O iniciador frontal (A) e o iniciador reverso (B) flanqueiam as regiões I e II e podem ser usados para verificar a exclusão-alvo. O iniciador C compreende nucleotídeos no sítio de junção para o braço de ligação direito ZFN e o DNA genômico vizinho, de modo que o iniciador para o iniciador frontal (A) e o iniciador reverso C podem ser usados para verificar a inserção-alvo.
[00025] A figura 17 mostra a verificação de PCR da exclusão-alvo da sequência genômica de 5 kb que gerou um fragmento de PCR de 303 bp esperado do alelo de exclusão (Rota 6: AAVS1 - ZFN e AAVS1 - 5 kb ssODN) utilizando os iniciadores A e B indicados na figura 16. A verificação do PCR da inserção-alvo de sítios IoxP foi mostrada pelo fragmento de PCR com tamanho esperado na rota 10 utilizando os iniciadores A e C. As rotas 1 e 2 representam marcadores de DNA; a rota 3 representa GFP; a rota 4 representa AAVS1 ZFN (mRNA) apenas; a rota 5 representa o doador do oligonucleotídeo apenas; a rota 6 representa o doador de oligonucleotídeo AAVS1 ZFN +; a rota 7 representa GFP; a rota 8 representa AAVS1 ZFN (mRNA); a rota 9 representa o doador do oligonucleotídeo apenas; a rota 10 representa o doador de oligonucleotídeo AAVS1 ZFN +.
[00026] A figura 18 apresenta a sequência de junção 5' (SEQ ID NO: 29) e análise de sequências, confirmando a integração da sequência do doador na junção 5'. A sequência verde em destaque representa os iniciadores utilizados para amplificação por PCR (o menor caso não foi de resultados de sequenciamento), a sequência de letras negras representa a sequência de plasmídeo de camundongo Rosa26 no doador de oligonucleotídeo; a sequência em letras azuis representa a sequência de plasmídeo de camundongo Rosa26 no doador de oligonucleotídeo; a sequência em letras vermelhas representa a sequência de AAVS1 no doador de oligonucleotídeo; a sequência em letras cor de rosa representa a sequência de AAVS1 no doador de oligonucleotídeo.
[00027] A figura 19 apresenta a sequência de junção 3' (SEQ ID NO: 30) e análise de sequências, confirmando a integração da sequência dos doadores na junção 3'. A sequência verde em destaque representa os iniciadores utilizados para amplificação por PCR (o menor caso não foi de resultados de sequenciamento), as sequências de letras pretas representa a sequência de plasmídeo de camundongo Rosa26 no doador de oligonucleotídeo; a sequência em letras azuis representa a sequência de plasmídeo de camundongo Rosa26 no doador de oligonucleotídeo; a sequência em letras vermelhas representa a sequência de AAVS1 no doador de oligonucleotídeo; a sequência em letras cor de rosa representa a sequência de AAVS1 no doador de oligonucleotídeo.
[00028] A figura 20 mostra que somente os clones (Z+O+D) expostos a dois ZFNs (Z), dois doadores de oligonucleotídeos (O), e um doador de plasmídeo (D) compreendiam o fragmento de PCR do sítio de junção 5' de tamanho de 390 bp (figura 20A) e fragmento de PCR do sítio de junção 3' de tamanho de 309 bp (figura 20B) indicativo de integração de sequência do doador.
[00029] A figura 21 mostra a relação da identidade de sequência do oligonucleotídeo (com a sequência-alvo) e a eficiência da exclusão oligomediada-alvo de uma sequência genômica de 10 kb. A eficiência da exclusão 10 kb foi medida por SYBR Green de PCR em tempo real. 1 = identidade 100%; 2 = identidade 98%; 3 = identidade 90%; 4 = identidade 50%; 5 = controle negativo.
[00030] A figura 22 apresenta o esquema dos métodos de inserção de plasmídeo universal, mediados por oligonucleotídeos ssDNA e ZFNs. Os ZFNs fazem rupturas de fita dupla (DSB). Os dois doadores de oligonucleotídeo então se ligam às extremidades de DSB usando as seções que são complementares ao sítio de corte ZFN. A homologia nas extremidades 5' dos dois doadores do oligonucleotídeo para a sequência de estrutura principal do plasmídeo (universal ou não) em cada extremidade a sequência do plasmídeo desejada provoca invasão em doadores de plasmídeo. Quando DSB é resolvido usando o plasmídeo do doador, a sequência desejada do plasmídeo do doador é introduzida e inserida no sítio de corte de ZFN.
[00031] A presente descrição fornece métodos para edição de sequências cromossômicas endógenas usando endonucleases-alvo e ácidos nucleicos de fita simples. Em particular, a endonuclease-alvo é capaz de introduzir uma ruptura de fita dupla no sítio pretendido na sequência cromossômica, e o ácido nucleico de fita simples compreende uma região tendo uma identidade de sequência substancial para a sequência cromossômica em pelo menos um lado do sítio de clivagem-alvo. A ruptura de fita dupla introduzida por endonucleases-alvo é reparada por um processo de reparação conduzido por homologia usando o ácido nucleico de fita simples, de modo que a sequência cromossômica é trocada com a sequência do ácido nucleico de fita simples, editando desse modo a sequência cromossômica. A sequência cromossômica editada pode incluir uma inserção de pelo menos um nucleotídeo, uma exclusão de pelo menos um nucleotídeo, uma substituição de pelo menos um nucleotídeo, ou combinações das mesmas. Além disso, são apresentados kits com os reagentes apropriados para a edição de sequências cromossômicas usando os métodos divulgados neste documento.
[00032] Um aspecto da presente descrição fornece um método para editar pelo menos uma sequência cromossômica endógena em uma célula. O método compreende introduzir na célula (a) pelo menos uma endonuclease-alvo ou ácido nucleico codificando uma endonuclease- alvo, a endonuclease-alvo, sendo capaz de introduzir uma ruptura de fita dupla em um sítio de clivagem-alvo na sequência cromossômica e (b) pelo menos um ácido nucleico de fita dupla que compreende uma sequência com uma identidade de sequência para a sequência cromossômica em pelo menos um lado do sítio de clivagem-alvo de ácidos nucleicos. O método adicionalmente compreende manter a célula em condições de modo que a ruptura de fita dupla introduzida por endonucleases-alvo seja reparada por um processo de reparação conduzido por homologia de modo que a sequência cromossômica seja trocada com a sequência de pelo menos um dos ácidos nucleicos de fita simples, editando desse modo a sequência cromossômica. Os componentes do método são detalhados abaixo.
[00033] O método compreende introduzir na célula pelo menos uma endonuclease-alvo ou ácido nucleico codificando uma endonuclease- alvo. Uma endonuclease-alvo é uma entidade que reconhece e liga uma sequência de DNA cromossômica de fita dupla específica e introduz uma ruptura de fita dupla em um sítio de clivagem-alvo na sequência cromossômica. A endonuclease-alvo pode ser uma proteína de ocorrência natural ou uma proteína projetada. Como alternativa, a endonuclease-alvo não pode conter nenhuma proteína (por exemplo, uma ruptura de fita dupla de DNA-alvo induzindo um agente).
[00034] O tipo de endonuclease-alvo pode e irá variar. Em algumas modalidades, as endonucleases-alvo podem ser uma nuclease de dedo de zinco. Em outras modalidades, a endonuclease-alvo pode ser um meganuclease ou endonuclease homing. Em ainda outras modalidades, a endonuclease-alvo pode ser uma nuclease efetora tipo ativador de transcrição (TALE). Em outras modalidades, a endonuclease-alvo pode ser uma nuclease específica do sítio. Em ainda outras modalidades, a endonuclease-alvo pode ser uma ruptura de fita dupla de DNA-alvo artificial induzindo o agente.
[00035] Em uma modalidade, a endonuclease-alvo introduzida na célula pode ser uma nuclease do dedo de zinco (ZFN). Normalmente, uma nuclease do dedo de zinco compreende um domínio de ligação de DNA (isto é, o dedo de zinco) e um domínio de clivagem (ou seja, nuclease), os quais são descritos abaixo.
[00036] Os domínios de ligação do dedo de zinco podem ser projetados para reconhecer e associar-se a qualquer sequência de ácido nucleico de escolha. Vide, por exemplo, Beerli et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol 10:411-416; Zhang et al. (2000) J. Biol Chem. 275 (43): 33850-33860; Doyon et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26:702-708; e Santiago et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:5809-5814. Um domínio de ligação do dedo de zinco engenheirado pode ter uma nova especificidade de ligação comparada a uma proteína do dedo de zinco que ocorre naturalmente. Métodos de engenharia incluem, mas não estão limitados a projeto lógico e diversos tipos de seleção. O projeto lógico inclui, por exemplo, utilizar bancos de dados compreendendo sequências de nucleotídeos duplas, triplas, e/ou quádruplas e sequências de aminoácidos de dedo de zinco individuais, em que cada sequência dupla, tripla ou quádrupla está associada a uma ou mais sequências de aminoácidos de dedos de zinco, que se liga a uma sequência tripla ou quádrupla específica. Vide, por exemplo, as Patentes US 6.453.242 e 6.534.261, as divulgações que são incorporadas por referência neste documento em sua totalidade. Como um exemplo, o algoritmo descrito na Patente US 6.453.242 pode ser utilizado para criar um domínio de ligação do dedo de zinco para direcionar uma sequência pré-selecionada. Métodos alternativos, tais como o projeto lógico, utilizando uma Tabela de códigos de reconhecimento não degenerada também podem ser usados para criar um domínio de ligação do dedo de zinco para uma sequência-alvo específica (Sera et al. (2002) Biochemistry 41:7074-7081). Ferramentas baseadas na web para identificar sítios-alvo potenciais em sequências de DNA e a criação de domínios de ligação de dedo de zinco podem ser encontradas em http://www.zincfingertools.org e http://bindr.gdcb.iastate.edu/ZiFiT/, respectivamente (Mandell et al. (2006). Nuc. Acid Res. 34:W516-W523; Sander et al. (2007). Acid Res. 35:W599-W605).
[00037] Um domínio de ligação de dedo de zinco pode ser criado para reconhecer e ligar uma sequência de DNA que varia de cerca de 3 nucleotídeos a cerca de 21 nucleotídeos de comprimento, ou, preferencialmente, de cerca de 9 a cerca de 18 nucleotídeos de comprimento. Em geral, os domínios de ligação de dedo de zinco de nucleases de dedo de zinco divulgados neste documento compreendem pelo menos três regiões de reconhecimento de dedo de zinco (isto é, os dedos de zinco). Em uma modalidade, o domínio de ligação de dedo de zinco pode incluir quatro regiões de reconhecimento de dedo de zinco. Em outra modalidade, o domínio de ligação de dedo de zinco pode incluir cinco regiões de reconhecimento de dedo de zinco. Em outra modalidade, o domínio de ligação do dedo de zinco pode incluir seis regiões de reconhecimento de dedo de zinco. Um domínio de ligação de dedo de zinco pode ser projetado para ligar a qualquer sequência de DNA-alvo adequada. Vide, por exemplo, Patentes US 6.607.882; 6.534.261 e 6.453.242, as divulgações que são incorporadas por referência neste documento em sua totalidade.
[00038] Métodos exemplares de selecionar uma região de reconhecimento de dedo de zinco podem incluir imagem de fago e dois sistemas híbridos e são divulgados nas Patentes US 5.789.538; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.410.248; 6.140.466; 6.200.759; e 6.242.568; bem como WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 e GB 2.338.237, cada um dos quais é incorporado por referência neste documento em sua totalidade. Além disso, o aprimoramento de especificidade de ligação para domínios de ligação de dedo de zinco tem sido descrito, por exemplo, no WO 02/077227.
[00039] Os domínios e métodos de ligação de dedo de zinco para o projeto e construção de proteínas de fusão (e polinucleotídeos codificando as mesmas) são conhecidos por aqueles versados na técnica e são descritos em detalhes nas Publicações de Pedidos de Patentes US 20050064474 e 20060188987, cada qual incorporada por referência neste documento em sua totalidade. Regiões de reconhecimento de dedo de zinco e/ou proteínas de dedo de zinco de múltiplos dedos podem ser ligadas usando sequências de ligante apropriadas, incluindo, por exemplo, ligantes de cinco ou mais aminoácidos de comprimento. Vide, Patentes US 6.479.626; 6.903.185; e 7.153.949, as divulgações que são incorporadas por referência neste documento em sua totalidade, para exemplos não limitantes de sequências de ligante de seis ou mais aminoácidos de comprimento. O domínio de ligação de dedo de zinco aqui descrito pode incluir uma combinação de ligantes adequada entre os dedos de zinco individuais da proteína.
[00040] Em algumas modalidades, a nuclease de dedo de zinco pode adicionalmente incluir um sinal de localização nuclear ou sequência (NLS). Uma NLS é uma sequência de aminoácidos que facilita o direcionamento da proteína de nuclease de dedo de zinco no núcleo para introduzir uma ruptura de fita dupla na sequência-alvo no cromossomo. Os sinais de localização nuclear são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Makkerh et al. (1996) Current Biology 6:1025-1027.
[00041] Uma nuclease de dedo de zinco inclui também um domínio de clivagem. Uma porção de domínio de clivagem de nuclease de dedo de zinco pode ser obtida a partir de qualquer endonuclease ou exonuclease. Exemplos não limitantes de endonucleases a partir das quais um domínio de clivagem pode ser derivado incluem, mas não estão limitados às endonucleases de restrição e endonucleases homing. Vide, por exemplo, 2002-2003 Catalog, New England Biolabs, Beverly, Mass; e Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388 ou www.neb.com. Enzimas adicionais que clivam DNA são conhecidas (por exemplo, Nuclease S1; nuclease mung bean; DNase I pancreática; nuclease de micrococos; endonuclease de levedura HO). Vide também Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993. Uma ou mais destas enzimas (ou fragmentos funcionais das mesmas) podem ser usadas como uma fonte de domínios de clivagem.
[00042] Um domínio de clivagem também pode ser derivado de uma enzima ou parte da mesma, como descrito acima, que requer dimerização para atividade de clivagem. Duas nucleases de dedo de zinco podem ser necessárias para a clivagem, quando cada nuclease compreende um monômero do dímero de enzima ativo. Alternativamente, uma nuclease de dedo de zinco única pode incluir dois monômeros para criar um dímero de enzima ativo. Como usado neste documento, um "dímero de enzima ativo" é um dímero de enzima capaz de realizar clivagem de uma molécula de ácido nucleico. Os dois monômeros de clivagem podem ser derivados da mesma endonuclease (ou fragmentos dos mesmos), ou cada monômero pode ser derivado de uma endonuclease diferente (ou fragmentos funcionais respectivos).
[00043] Quando dois monômeros de clivagem são usados para formar um dímero de enzima ativo, os sítios de reconhecimento para as duas nucleases de dedo de zinco de preferência são descartados de modo que a ligação de duas nucleases de dedo de zinco para seus respectivos sítios de reconhecimento coloque os monômeros de clivagem em uma orientação espacial entre si que permite que os monômeros de clivagem formem um dímero de enzima ativo, por exemplo, por dimerização. Como resultado, as extremidades perto dos sítios de reconhecimento podem ser separadas por cerca de 5 a cerca de 18 nucleotídeos. Por exemplo, as extremidades próximas podem ser separadas por cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 de nucleotídeos. No entanto, será entendido que qualquer número inteiro de pares de nucleotídeos ou nucleotídeos pode intervir entre os dois sítios de reconhecimento (por exemplo, de aproximadamente 2 a cerca de 50 pares de nucleotídeos ou mais). As extremidades perto dos sítios de reconhecimento de nucleases de dedo de zinco, como por exemplo, aquelas descritos em detalhes neste documento, podem ser separadas por 6 nucleotídeos. Em geral, o sítio de clivagem situa-se entre os sítios de reconhecimento.
[00044] As endonucleases de restrição (enzimas de restrição) estão presentes em muitas espécies e são capazes de ligar a sequência específica ao DNA (em um sítio de reconhecimento) e clivagem de DNA em ou perto do sítio da ligação. Determinadas enzimas de restrição (por exemplo, tipo IIS) clivam o DNA em sítios retirados do sítio de reconhecimento e tem domínios de ligação e clivagem separáveis. Por exemplo, a enzima do tipo IIS FokI catalisa a clivagem de fita dupla do DNA, em 9 nucleotídeos do seu sítio de reconhecimento em uma fita e 13 nucleotídeos de seu sítio de reconhecimento do outro. Vide, por exemplo, Patentes US 5.356.802; 5.436.150 e 5.487.994; assim como Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol Chem. 269:31, 978-31, 982. Desse modo, uma nuclease do dedo de zinco pode compreender o domínio de clivagem de pelo menos uma enzima de restrição do tipo IIS e um ou mais domínios de ligação de dedo de zinco, que podem ou não podem ser projetados. As enzimas de restrição do tipo IIS exemplares são descritas, por exemplo, na Publicação Internacional WO 07/014.275, cuja descrição é incorporada por referência neste documento em sua totalidade. As enzimas de restrição adicionais também contêm a ligação separável e domínios de clivagem, e estas também são contempladas pela presente descrição. Vide, por exemplo, os ácidos nucleicos de Roberts et al. (2003) Res. 31:418-420.
[00045] Uma enzima de restrição do tipo IIS exemplar, cujo domínio de clivagem é separável do domínio de ligação, é FokI. Esta enzima específica é ativa como um dímero (Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10, 570-10, 575). Desse modo, para efeitos da presente descrição, a porção da enzima FokI usada em uma nuclease de dedo de zinco é considerada um monômero de clivagem. Assim, para a clivagem de fita dupla-alvo usando um domínio de clivagem de FokI, duas nucleases de dedo de zinco, cada uma contendo um monômero de clivagem de FokI, podem ser usadas para reconstituir um dímero de enzima ativo. Alternativamente, uma molécula de polipeptídeo único que contém um domínio de ligação de dedo de zinco e dois monômeros de clivagem de FokI também pode ser utilizada.
[00046] Em determinadas modalidades, o domínio de clivagem pode compreender um ou mais monômeros de clivagem engenheirados que minimiza ou previne a homodimerização, conforme descrito, por exemplo, nas Publicações de Patentes US 20050064474, 20060188987, e 20080131962, cada um dos quais é incorporado por referência neste documento em sua totalidade. Por meio de exemplo não limitante, resíduos de aminoácidos nas posições 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 e 538 de FokI são todos os destinos para influenciar a dimerização de domínios de meia clivagem de FokI. Monômeros de clivagem engenheirados exemplares de FokI que formam heterodímeros obrigatórios incluem um par no qual um primeiro monômero de clivagem inclui as mutações nas posições de resíduo de aminoácido 490 e 538 de FokI e um segundo monômero de clivagem que inclui as mutações nas posições de resíduo do aminoácido 486 e 499.
[00047] Desse modo, em uma modalidade, uma mutação na posição do aminoácido 490 substitui Glu (E) por Lys (K); uma mutação no resíduo de aminoácido 538 substitui Iso (I) por Lys (K); uma mutação no resíduo de aminoácido 486 substitui Gln (Q) por Glu (E); e uma mutação na posição 499 substitui Iso (I) por Lys (K). Especificamente, os monômeros de clivagem engenheirados podem ser preparados por posições mutantes 490 de E a K e 538 de I a K em um monômero de clivagem para produzir um monômero de clivagem engenheirado designado "E490K:I538K" e por posições mutantes 486 de Q a E e 499 de I a L em outro monômero de clivagem para produzir um monômero de clivagem engenheirado designado "Q486E:I499L". Monômeros de clivagem engenheirados acima descritos são mutantes de heterodímero obrigatórios em que clivagem aberrante é minimizada ou abolida. Monômeros de clivagem engenheiros podem ser preparados utilizando um método apropriado, por exemplo, por mutagênese conduzida por sítio de monômeros de clivagem do tipo selvagem (FokI), conforme descrito na Publicação de Patente US 20050064474.
[00048] Em outra modalidade, a endonuclease-alvo pode ser uma meganuclease. Meganucleases são endodesoxirribonucleases, caracterizadas por um sítio de reconhecimento grande, isto é, o sítio de reconhecimento geralmente varia de aproximadamente 12 pares de bases a cerca de 40 pares de bases. Como uma consequência deste requisito, o sítio de reconhecimento geralmente ocorre apenas uma vez em qualquer genoma determinado. Entre meganucleases, a família LAGLIDADG de endonucleases homing tornou-se uma ferramenta valiosa para o estudo de genomas e engenharia do genoma. Meganucleases podem ser direcionadas para a sequência cromossômica específica, modificando sua sequência de reconhecimento usando técnicas conhecidas por aqueles versados na técnica.
[00049] Em outra modalidade, a endonuclease-alvo pode ser uma nuclease efetora tipo ativador de transcrição (TALE). TALEs são fatores de transcrição de patógeno vegetal Xanthomonas que podem ser facilmente projetados para ligar novos-alvos de DNA. TALEs ou versões truncadas das mesmas podem estar ligados ao domínio catalítico de endonucleases como FokI para criar a endonuclease-alvo denominada nucleases TALE ou TALENs.
[00050] Em outra modalidade, a endonuclease-alvo pode ser uma nuclease específica por sítio. Em particular, uma nuclease específica por sítio pode ser uma endonuclease "rara cortadora" cuja sequência de reconhecimento ocorre raramente em um genoma. De preferência, a sequência de reconhecimento, da nuclease específica por sítio ocorre somente uma vez em um genoma.
[00051] Em outra modalidade, a endonuclease-alvo pode ser uma ruptura de fita dupla-alvo artificial em DNA induzindo agente (também denominada cortante de DNA de restrição artificial). Por exemplo, a ruptura de fita dupla-alvo artificial em DNA induzindo agente pode incluir um complexo de metal/quelante complexo que cliva o DNA de pelo menos um oligonucleotídeo complementar para o sítio de clivagem-alvo. A ruptura de fita dupla-alvo artificial em DNA induzindo agente, portanto, não contém qualquer proteína, o metal do complexo de metal/quelante pode ser cério, cádmio, cobalto, cromo, cobre, ferro, magnésio, manganês, zinco e similares. O quelante do complexo de metal/quelante pode ser EDTA, EGTA, BAPTA e similares. Em uma modalidade preferida, o complexo de metal/quelante pode ser Ce(IV)/EGTA. Em outra modalidade preferida, a ruptura de fita dupla-alvo artificial em DNA induzindo agente pode incluir um complexo de Ce(IV)/EGTA e duas vertentes de ácidos nucleicos de peptídeo pseudo-complementar (PNAs) (Katada et al., Current Gene Therapy, 2011, 11(1): 38-45).
[00052] Em algumas modalidades, a endonuclease-alvo pode ser introduzida na célula como um ácido nucleico, em que a célula então exprime e produz a endonuclease-alvo. O ácido nucleico codificando a endonuclease-alvo pode ser DNA ou RNA. O RNA pode ser RNA mensageiro, e o mRNA pode ser 5' capeado, poliadenilado ou ambos. Em geral, o ácido nucleico codificando a endonuclease-alvo será operavelmente associado a uma região de controle do promotor. A região de controle pode ser constitutiva ou induzível. O ácido nucleico codificando a endonuclease-alvo (e sua região de controle ligada) pode ser introduzido na célula como um vetor tal como um plasmídeo ou similares. Alternativamente, o ácido nucleico codificando a endonuclease-alvo (e sua região de controle ligada) pode ser introduzido na célula como uma molécula linear.
[00053] O método adicionalmente compreende a introdução de pelo menos um ácido nucleico de fita simples compreendendo uma região tendo identidade de sequência substancial para a sequência cromossômica em pelo menos um lado do sítio de clivagem-alvo na célula. Em algumas modalidades, um ácido nucleico de cadeia dupla é introduzido na célula. Em outras modalidades, dois ácidos nucleicos de fita simples são introduzidos na célula. Em outras modalidades, três ou mais ácidos nucleicos de fita simples são introduzidos na célula.
[00054] A frase "identidade de sequência substancial" significa que o oligonucleotídeo tem pelo menos cerca de 75% de identidade de sequências-alvo para a sequência cromossômica. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo possa ter cerca de 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência-alvo cromossômica. Além disso, o ácido nucleico de fita simples geralmente tem identidade de sequência substancial de pelo menos cerca de 10 nucleotídeos em pelo menos um lado do sítio de clivagem-alvo. Em alguma modalidade, o ácido nucleico de fita simples pode ter identidade de sequência substancial de cerca de 15 nucleotídeos, cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 25 nucleotídeos, cerca de 30 nucleotídeos, cerca de 40 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos ou mais de 100 nucleotídeos em pelo menos um lado do sítio de clivagem-alvo.
[00055] O comprimento dos ácidos nucleicos de fita simples que são introduzidos na célula pode e irá variar. Por exemplo, os ácidos nucleicos de fita simples podem variar de cerca de 20 nucleotídeos de comprimento até cerca de 200.000 nucleotídeos de comprimento. Em diversas modalidades, o ácido nucleico de fita simples pode variar de cerca de 20 nucleotídeos a cerca de 100 nucleotídeos de comprimento, de cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 1000 nucleotídeos de comprimento, de cerca de 1000 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos de comprimento, de cerca de 10.000 nucleotídeos a cerca de 100.000 nucleotídeos de comprimento, ou de cerca de 100.000 nucleotídeos a cerca de 200.000 nucleotídeos de comprimento.
[00056] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos de fita simples podem ser lineares. Em outras modalidades, os ácidos nucleicos de fita simples podem ser circulares (por exemplo, preparados pelos métodos de fagos conhecidos por aqueles versados na técnica). O ácido nucleico de fita simples pode ser senso ou antissenso em relação à sequência cromossômica de interesse.
[00057] A composição dos ácidos nucleicos de fita simples pode e irá variar. Os nucleotídeos do ácido nucleico podem ser desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos ou combinações dos mesmos. Os nucleotídeos podem ser nucleotídeos padrão (ou seja, adenosina, guanosina citidina, timidina e uridina) ou análogos de nucleotídeo. Um análogo de nucleotídeo refere-se a um nucleotídeo tendo uma base de purina ou pirimidina ou uma porção de ribose modificada. Um análogo de nucleotídeo pode ser um nucleotídeo de ocorrência natural (por exemplo, inosina) ou um nucleotídeo de ocorrência não natural. Exemplos não limitantes de modificações nas porções de açúcar ou base de um nucleotídeo incluem a adição (ou remoção) de grupos acetila, grupos amino, grupos carboxila, grupos carboximetila, grupos hidroxila, grupos metila, grupos fosforila e grupos tiol, bem como a substituição dos átomos de carbono e nitrogênio dessas bases com outros átomos (por exemplo, deaza-7 purinas). Análogos de nucleotídeo também incluem dideóxi nucleotídeos, 2'-O- metil nucleotídeos, ácidos nucleicos travados (LNA), ácidos nucleicos de peptídeo (PNA), e morfolinos. Os nucleotídeos dos ácidos nucleicos de fita simples podem estar ligados por ligações de fosfodiéster, fosfotioato, fosforamidita, fosforodiamidato ou combinações das mesmas.
[00058] Em modalidades preferenciais, o ácido nucleico de fita simples compreende desoxirribonucleotídeos.
[00059] Em uma modalidade, o ácido nucleico de fita simples pode incluir uma primeira região com a identidade de sequência substancial para a sequência cromossômica no lado a montante do sítio de clivagem-alvo e uma segunda região com a identidade de sequência substancial para a sequência cromossômica no lado a jusante do sítio de clivagem-alvo (por exemplo, vide figura 1 e figura 4). Em diversas iterações desta modalidade, o ácido nucleico de fita simples adicionalmente pode compreender uma alteração de pelo menos um nucleotídeo em relação à sequência cromossômica. Por exemplo, o ácido nucleico de fita simples incluirá, geralmente, uma substituição de pelo menos um nucleotídeo, uma exclusão de pelo menos um nucleotídeo, uma inserção de pelo menos um nucleotídeo, ou combinações das mesmas. Em diversas iterações, o ácido nucleico de fita simples pode compreender uma, duas, três, quatro, cinco ou mais alterações de nucleotídeos. Como consequência dessas alterações de nucleotídeos, a sequência cromossômica editada pode compreender uma sequência alterada ou uma pequena mutação de modo que um produto do gene modificado seja produzido, nenhum produto de gene seja produzido, etc.
[00060] Em uma modalidade alternativa, o ácido nucleico de fita simples pode incluir uma sequência exógena que é flanqueada pelas primeira e segunda regiões que têm identidade de sequência substancial para o outro lado do sítio de clivagem-alvo (como detalhado acima). Consequentemente, a sequência cromossômica editada pode compreender uma sequência de ácido nucleico exógena integrada. Como usado neste documento, o termo "exógena" se refere a qualquer sequência que não é normalmente localizada na localização cromossômica. Por exemplo, a sequência exógena pode ser um "gene" de outro organismo, uma cópia adicional de um "gene" do mesmo organismo, uma sequência artificial, uma sequência de codificação de uma molécula repórter, e assim por diante.
[00061] Em outra modalidade, o ácido nucleico de fita simples pode incluir uma primeira região com identidade de sequência substancial para a sequência cromossômica em um lado do sítio de clivagem-alvo e uma segunda região com identidade de sequência substancial para uma sequência cromossômica que é distal ao sítio de clivagem-alvo (vide figura 12). A sequência cromossômica distal pode estar a montante ou a jusante do sítio de clivagem-alvo; e a sequência cromossômica distal pode ser localizada por cerca de 20 pares de bases, cerca de 1.000.000 de pares de bases fora do sítio de clivagem- alvo. Por exemplo, a sequência cromossômica distal pode ser de cerca de 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300 ou 1.000 pares quilobase (a montante ou a jusante) do sítio de clivagem-alvo. Consequentemente, a sequência cromossômica editada pode incluir uma exclusão de até cerca de 1.000.000 pares de bases. Em uma iteração desta modalidade, o ácido nucleico de fita simples pode incluir uma primeira região com identidade de sequência substancial para o lado de jusante do sítio de clivagem-alvo e uma segunda região com identidade de sequências substancial para uma sequência cromossômica distal que está localizada a montante do sítio de clivagem-alvo, em que editado maio cromossômico compõem uma exclusão a montante (ou 5') em relação ao sítio de clivagem-alvo. Em outra iteração desta modalidade, o ácido nucleico de fita simples pode incluir uma primeira região com identidade de sequência substancial para o lado a montante do sítio de clivagem- alvo e uma segunda região com substancial de sequências de identidade para uma sequência cromossômica distal que está localizada a jusante do sítio de clivagem-alvo, em que a sequência cromossômica editada pode compreender uma exclusão a jusante (ou 3') em relação ao sítio de clivagem-alvo.
[00062] Em outra modalidade, o ácido nucleico de fita simples pode incluir uma sequência exógena que é flanqueada por uma primeira região com identidade de sequência substancial para a sequência cromossômica em um lado do sítio de clivagem-alvo e uma segunda região com identidade de sequência substancial para uma sequência cromossômica que é distal ao sítio de clivagem-alvo (como detalhado acima). Na presente modalidade, a sequência cromossômica editada pode compreender uma exclusão, bem como a integração da sequência exógena no sítio de clivagem-alvo (vide figura 16). A identidade da sequência exógena pode e irá variar. Por exemplo, a sequência exógena pode ser um "gene" de outro organismo, uma cópia adicional de um "gene" do mesmo organismo, uma molécula repórter, e assim por diante.
[00063] Em determinadas modalidades, o método adicionalmente compreende a introdução de pelo menos um polinucleotídeo doador para a célula. O polinucleotídeo doador compreende uma sequência para a integração na sequência cromossômica no sítio de clivagem- alvo, onde a sequência para integração é flanqueada por uma primeira sequência e uma segunda sequência, cada um dos quais tem uma identidade de sequência substancial para uma porção de um ácido nucleico de fita simples. Desse modo, o polinucleotídeo dador é introduzido juntamente com um primeiro ácido nucleico de fita simples e um segundo ácido nucleico de fita simples (e pelo menos uma endonuclease-alvo). O primeiro ácido nucleico de fita simples compreende uma primeira porção tendo identidade de sequência substancial para o lado a montante do sítio de clivagem-alvo e uma segunda porção com identidade de sequência substancial para a primeira sequência no polinucleotídeo doador. O segundo ácido nucleico de fita simples compreende uma primeira porção tendo identidade de sequência substancial para o lado de jusante do sítio de clivagem-alvo e uma segunda porção com identidade de sequência substancial para a segunda sequência no polinucleotídeo doador.
[00064] O polinucleotídeo doador pode incluir desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos modificados, análogos de nucleotídeos, e similares. Além disso, o polinucleotídeo doador pode ser circular ou linear. Normalmente, o polinucleotídeo doador será o DNA. Por exemplo, o polinucleotídeo doador pode ser um plasmídeo de DNA, um cromossomo bacteriano artificial (BAC), um cromossomo de levedura artificial (YAC), um vetor viral, e assim por diante. O polinucleotídeo doador adicionalmente pode compreender uma origem de replicação, um marcador de seleção, um sítio de clonagem múltipla, e assim por diante. O tamanho do polinucleotídeo doador pode e irá variar. Por exemplo, o nucleotídeo doador pode variar de cerca de 1 quilobase (kb) a cerca de 200 kb. Em uma modalidade, o polinucleotídeo doador pode compreender cerca de 100 kb de sequências exônicas e intrônicas de uma sequência de DNA humana codificando uma proteína de interesse.
[00065] O método compreende a introdução de moléculas e ácidos nucleicos de endonuclease-alvo descritos acima em uma célula. Uma variedade de células é adequada para uso no método. Em geral, a célula será uma célula eucariótica ou um organismo de uma única célula eucariótica. Em alguns casos, a célula pode ser uma célula cultivada, uma célula primária ou uma célula imortal. Células adequadas incluem fungos ou leveduras tais como Pichia, Saccharomyces ou Schizosaccharomyces; células de insetos, tais como células SF9 de Spodoptera frugiperda ou células S2 de Drosophila melanogaster; e células animais, tais como camundongo, rato, hamster, primatas não humanos, ou células humanas. Células exemplares são de mamíferos. As células de mamíferos podem ser células primárias. Em geral, pode ser usada qualquer célula primária que é sensível a rupturas de fita dupla. As células podem ser de uma variedade de tipos de células, por exemplo, fibroblasto, mioblasto, células T ou B, macrófagos, células epiteliais, e assim por diante.
[00066] Quando linhagens de células de mamíferos são usadas, a linhagem de célula pode ser qualquer linhagem de célula estabelecida ou uma linhagem de células primárias ainda não descrita. A linhagem de célula pode estar aderente ou não aderente, ou a linhagem de célula pode ser cultivada sob condições que incentivam o crescimento aderente, não aderente ou organotípico usando técnicas padrão conhecidas para as pessoas versadas na técnica. Exemplos não limitantes de linhagens celulares de mamíferos adequadas incluem células do ovário de hamster chinês (CHO), linhagem de CVI de rim de macaco transformado pelo SV40 (COS7), linhagem de rim embrionário humano 293, células de rim de hamster bebê (BHK), células de sertoli de camundongo (TM4), células de rim de macaco (CVI-76), células de rim de macaco verde africano (VERO), células de carcinoma cervical humano (HeLa), células de rim canino (MDCK), células do fígado de rato búfalo (BRL 3A), células de pulmão humano (W138), células de fígado humanas (Hep G2), células de tumor mamário de rato (MMT), células de hepatoma de rato (HTC), células HIH/3T3, células humanas de osteossarcoma de U2-OS, células A549, células K562, células humanas HEK293, células humanas HEK293T, células humanas HCT116, células MCF-7 e células TRI. Para uma extensa lista de linhagens de células de mamíferos, os versados na técnica podem referir-se ao catálogo American Type Culture Collection (ATCC®, Mamassas, VA).
[00067] Em ainda outras modalidades, a célula pode ser uma célula- tronco. Células-tronco apropriadas incluem, sem limite, células-tronco embrionárias, células-tronco embrionárias tipo ES, células-tronco fetais, células-tronco adultas, células-tronco pluripotentes, células-tronco pluripotentes induzidas, células tronco multipotentes, células-tronco oligopotentes e células-tronco unipotentes.
[00068] Em outras modalidades, a célula pode ser um embrião de uma célula. O embrião pode ser um vertebrado ou um invertebrado. Vertebrados adequados incluem mamíferos, aves, répteis, anfíbios e peixes. Exemplos de mamíferos adequados, sem limite, roedores, animais domésticos, animais e não primatas. Exemplos não limitantes de roedores incluem camundongos, ratos, hamsters, gerbils e cobaias. Animais domésticos apropriados incluem, mas não estão limitados a gatos, cães, coelhos, ouriços e furões. Exemplos não limitantes de gado incluem cavalos, caprinos, ovinos, suínos, bovinos, lhamas e alpacas. Não primatas adequados incluem, mas não estão limitados aos macacos-prego, os chimpanzés, lêmures, macacos, saguis, micos, macacos-aranha, macacos-esquilo e macacos vervet. Exemplos não limitantes de aves de galinhas, perus, patos e gansos. Alternativamente, o animal pode ser um invertebrado como um inseto, um nematódeo, e similares. Exemplos não limitantes de insetos incluem Drosophila e mosquitos.
[00069] As moléculas e ácidos nucleicos de endonuclease-alvo descritos acima podem ser introduzidos na célula por diversos meios. A liberação adequada significa incluir a microinjeção, eletroporação, sonoporação, biobalística, transfecção mediada por fosfato de cálcio, transfecção catiônica, transfecção de lipossomas, transfecção de dendrímeros, transfecção de choque térmico, transfecção de nucleofecção, magnetofecção, lipofecção, impalefecção, transfecção óptica, absorção aprimorada pelo próprio agente de ácidos nucleicos e liberação através de lipossomas, imunolipossomas, virossomas ou vírions artificiais. Em uma modalidade, a endonuclease-alvo pode ser introduzida em uma célula, por nucleofecção, moléculas e ácidos nucleicos. Em outra modalidade, as moléculas e ácidos nucleicos de endonuclease-alvo podem ser introduzidos na célula (por exemplo, um embrião de uma célula) por microinjeção. As moléculas e ácidos nucleicos de endonuclease-alvo podem ser injetados no núcleo ou no citoplasma da célula.
[00070] Em modalidades em que mais do que uma molécula de endonuclease-alvo e mais um ácido nucleico de fita simples são introduzidos em uma célula, as moléculas podem ser introduzidas simultaneamente ou sequencialmente. Por exemplo, as moléculas de endonuclease-alvo, cada específico para um sítio de clivagem-alvo, bem como o ácido nucleico de fita simples correspondente, pode ser introduzido ao mesmo tempo. Alternativamente, cada molécula de endonuclease-alvo, assim como o ácido nucleico de fita simples correspondente, pode ser introduzida sequencialmente. Os polinucleotídeos doadores opcionais podem ser introduzidos da mesma forma.
[00071] A relação entre as moléculas de endonuclease-alvo para um ácido nucleico de fita simples pode e irá variar. Em geral, a razão das moléculas de endonuclease-alvo para ácidos nucleicos pode variar de cerca de 1:10 a cerca de 10:1. Em diversas modalidades, a razão entre as moléculas de endonuclease-alvo para ácidos nucleicos pode ser de aproximadamente 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 ou 10:1. Em uma modalidade, a razão pode ser de cerca de 1:1.
[00072] O método adicionalmente compreende manter a célula em condições adequadas, de modo que a ruptura de fita dupla introduzida por endonuclease-alvo possa ser reparada por um processo conduzido por homologia usando o ácido nucleico de fita simples, de modo que a sequência cromossômica seja editada. Em modalidades em que o ácido nucleico codificando endonuclease-alvo de codificação é introduzido na célula, o método compreende manter a célula em condições adequadas, de modo que a célula exprima a endonuclease-alvo.
[00073] Em geral, a célula será mantida em condições adequadas para a célula. Condições de cultivo de célula adequadas são bem conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, em Santiago et al. (2008) 105:5809-5814; Moehle et al. (2007) PNAS 104:3055-3060; Urnov et al. (2005) Nature 435:646-651; e Lombardo et al. (2007) Nat. Biotechnology 25:1298-1306. Os versados na técnica apreciam que os métodos de cultivo de células são conhecidos na técnica e podem e irão variar dependendo do tipo de célula. A otimização de rotina pode ser usada em todos os casos, para determinar as melhores técnicas para um tipo específico de célula.
[00074] As modalidades em que a célula é um embrião de uma célula, o embrião pode ser cultivado in vitro (por exemplo, em cultivo de células). Normalmente, o embrião é cultivado em uma temperatura adequada e nos meios de comunicação adequados com a razão necessária O2/CO2 para permitir o reparo da ruptura de fita dupla e permitir o desenvolvimento do embrião. Exemplos não limitantes adequados de meio incluem meio M2, M16, KSOM, BMOC e HTF. Um versado na técnica apreciará que condições de cultivo podem e irão variar dependendo da espécie do embrião. A otimização de rotina pode ser usada em todos os casos, para determinar as melhores condições de cultivo de uma determinada espécie de embrião. Em alguns casos, o embrião também pode ser cultivado in vivo através da transferência do embrião no útero de um hospedeiro feminino. De um modo geral o hospedeiro feminino é da mesma espécie ou similar tal como o embrião. De preferência, o hospedeiro feminino está com pseudogravidez. Métodos de preparação de hospedeiro feminino com pseudogravidez são conhecidos na técnica. Além disso, métodos de transferência de um embrião em um hospedeiro feminino são conhecidos. O cultivo de um embrião in vivo permite que o embrião se desenvolva e pode resultar em um nascimento de vida de um animal derivado do embrião.
[00075] Durante esta etapa do processo, a endonuclease-alvo (que, em alguns casos, é expressa a partir do ácido nucleico introduzido codificando a endonuclease-alvo) reconhece, liga e cria uma ruptura de fita dupla no sítio de clivagem-alvo na sequência cromossômica. A ruptura de fita dupla na sequência cromossômica é reparada, através de recombinação homóloga com o ácido nucleico de fita simples, tal que a sequência de ácido nucleico seja trocada para a sequência cromossômica. A sequência do ácido nucleico pode ser fisicamente integrada ou, alternativamente, a sequência do ácido nucleico pode ser usada como um modelo para o reparo da ruptura, resultando na edição da sequência cromossômica.
[00076] A frequência da edição-alvo da sequência cromossômica pode e irá variar dependendo de diversos fatores. Em algumas modalidades, a frequência de edição pode ser maior do que cerca de 0,01%, 0,03%, 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% ou 30%. Clones de célula única que incluem a sequência cromossômica editada podem ser isolados usando técnicas bem conhecidas na técnica. As pessoas versadas na técnica estão familiarizadas com métodos para gerar células de homozigotos para a sequência cromossômica editada. Em outras palavras, as células podem ser homozigotos ou heterozigotos para a sequência cromossômica editada.
[00077] A sequência cromossômica editada pode incluir uma ou mais mutações pontuais (ou seja, em que um nucleotídeo é substituído por outro nucleotídeo), deleções de um ou mais, e/ou inserções de um ou mais. As mutações de ponto podem ser mutações missense, mutações não senso ou mutações silenciosas. As exclusões podem variar de cerca de um par de base a cerca de 500 pares quilobase, e as inserções podem variar de cerca de um par de base a cerca de 200 pares quilobase.
[00078] A sequência cromossômica editada, portanto, pode dar origem a um produto de gene modificado (isto é, proteína ou RNA não- codificante). Por exemplo, nas modalidades em que a sequência cromossômica editada encontra-se dentro de uma região de codificação de proteína, a proteína resultante pode incluir pelo menos uma alteração de aminoácido. Em outras modalidades, a sequência cromossômica modificada pode dar origem a um RNA não-codificante modificado, ou a sequência cromossômica modificada pode ter uma alteração da função regulamentar.
[00079] Alternativamente, a sequência cromossômica editada pode ser inativada de tal modo que nenhum produto do gene funcional seja produzido (ou a função de uma região reguladora seja eliminada). Por exemplo, em modalidades em que a sequência cromossômica editada se encontra dentro de uma região de codificação de proteínas, as mutações, deleções, ou inserções de ponto podem estabelecer códons de batente pré-maturas, mutações de junção de sítio de encaixe e/ou mutação de deslocamento de estrutura tal que nenhuma proteína funcional seja produzida.
[00080] Em modalidades nas quais a sequência cromossômica editada compreende uma inserção, a sequência inserida pode codificar um peptídeo, uma proteína, um domínio da proteína, um fragmento de proteína, uma subunidade de proteína, uma marca de proteína e similares. Alternativamente, a sequência inserida pode fornecer um lado de reconhecimento da endonuclease de restrição, codificar um RNA não-codificante, compreender um sítio de ligação de microRNA ou funcionar como um elemento de controle transcricional.
[00081] Outro aspecto da descrição fornece células compreendendo editar pelo menos uma sequência cromossômica, em que a sequência cromossômica foi editada pelo método descrito acima no ponto (I). Células adequadas são detalhadas acima na seção (I)(d).
[00082] Um aspecto adicional engloba kits para a edição de sequências cromossômicas em uma célula. Um kit é composto por (a) pelo menos uma endonuclease-alvo ou ácido nucleico codificando uma endonuclease-alvo, em que a endonuclease-alvo é capaz de introduzir uma ruptura de fita dupla em um sítio de clivagem-alvo na sequência cromossômica, e (b) pelo menos um ácido nucleico de fita simples que compreende uma primeira porção tendo identidade de sequência substancial para a sequência cromossômica em pelo menos um lado do sítio de clivagem-alvo. Desse modo, o kit fornece meios para a edição de uma sequência cromossômica, usando o método detalhado acima na seção (I).
[00083] O kit adicionalmente pode incluir um ou mais reagentes adicionais úteis para praticar o método divulgado para edição de genoma utilizando a endonuclease-alvo e ácidos nucleicos de fita simples. Um kit inclui geralmente um pacote com um ou mais recipientes conservando os reagentes, como uma ou mais composições separadas ou, opcionalmente, como adição onde permitirá a compatibilidade dos reagentes. O kit também pode incluir outro(s) material(is), que podem ser desejáveis de um ponto de vista do usuário, tal como um tampão, um diluente, meio de cultura/meio, neste material, ou qualquer outro material útil para tratamento ou realização de qualquer etapa do método de edição de genoma.
[00084] Os kits fornecidos neste documento preferencialmente incluem instruções para a edição de sequências cromossômicas como detalhado acima no ponto (I). As instruções incluídas nos kits podem ser fixadas nos materiais de embalagem ou podem ser incluídas como um folheto informativo. Embora as instruções sejam normalmente escritas ou impressas, estas não estão limitadas a tal. Qualquer meio capaz de armazenar tais instruções e comunicar as mesmas a um usuário final é contemplado por esta descrição. Esses meios incluem, mas não são meios de armazenamento limitado a eletrônicos (por exemplo, discos magnéticos, fitas, cartuchos, chips), mídias ópticas (por exemplo, CD- ROM) e similares. Como usado neste documento, o termo "instruções" pode incluir o endereço de um local na internet que fornece as instruções.
[00085] O método de edição de sequências cromossômicas divulgados neste documento pode ter uma variedade de aplicações. Em algumas modalidades, o método pode ser utilizado para fins de pesquisa para introduzir mutações específicas em uma proteína de interesse, tal que a função da proteína modificada possa ser examinada. O método também pode ser usado para desativar uma proteína codificando a sequência de modo que nenhuma proteína seja produzida, em que o fenótipo da célula ou organismo que compreende as células pode ser examinado. Além disso, o método pode ser usado para modificar ou desativar a codificação de regiões ou para fins de pesquisa, as regiões de controle transcricional do RNA. Em ainda outras modalidades, o método pode ser usado para excluir grandes regiões de sequência cromossômica e/ou integrar sequências de ácido nucleico exógenas.
[00086] Em outras modalidades, o método divulgado neste documento pode ser utilizado para fins clínicos ou terapêuticos. Ou seja, o método pode ser usado para reparar ou corrigir genes causadores de doenças ou sequências cromossômicas. Por exemplo, a doença falciforme pode ser causada por uma alteração de nucleotídeo único (ou seja, uma alteração A para T nos resultados do gene da β-globina em uma mudança glutamato para valina na proteína β-globina). Nesse sentido, o método desta descrição pode ser usado para corrigir o SNP no gene da β-globina em células de um indivíduo tendo doença ou traço falciforme. De forma similar, o método pode ser usado para corrigir mutações, deleções, inserções e similares de junção de encaixe em outros genes ou sequências cromossômicas que desempenham um papel em um estado de doença ou doença específica.
[00087] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos neste documento têm o significado comumente entendido por uma pessoa versada na técnica a que pertence esta invenção. As seguintes referências fornecem uma das habilidades com uma definição geral de muitos dos termos utilizados nesta invenção: Singleton et al. Dictionary of Microbiology e Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary os Science and Technology (Walker Ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Como usado neste documento, os seguintes termos têm o significado atribuído a menos que especificado de outra forma.
[00088] Quando se apresentam elementos da presente descrição ou a(s) modalidade(s) preferida(s), os artigos "o", "um", "uma" e "referido" destinam-se a dizer que há um ou mais elementos. Os termos "compreendendo", "incluindo" e "tendo" se destinam a ser inclusivos e significam que pode haver elementos adicionais que não sejam os elementos listados.
[00089] Os termos "edição" ou "edição de genoma" referem-se a um processo pelo qual uma sequência cromossômica específica é alterada. A sequência cromossômica editada pode incluir uma inserção de pelo menos um nucleotídeo, uma exclusão de pelo menos um nucleotídeo, e/ou substituição de pelo menos um nucleotídeo. A sequência cromossômica modificada editada pode codificar um produto do gene modificado (por exemplo, uma proteína com uma sequência de aminoácido alterada, um RNA não-codificante com uma sequência de nucleotídeos alterada, etc.), fornece uma função modificada (por exemplo, função de promotor alterada, função de realçador alterada, etc.) pode deixar de dar origem a um produto do gene (ou seja, a sequência não é transcrita ou nenhum produto funcional produzido), deixar de fornecer uma função reguladora, codificar uma sequência exógena ou fornecer uma nova função (isto é, como um promotor regulável, promotor induzível, ligação de microRNA, sítio, etc.).
[00090] Neste documento, o termo "endógeno" se refere a uma sequência cromossômica que é nativa para a célula.
[00091] O termo "exógeno" como usado aqui se refere a uma sequência de ácido nucleico que não é normalmente localizado em uma determinada localização cromossômica. Uma sequência exógena pode ser de outro organismo, pode ser artificial ou pode ser uma cópia de uma sequência de ácido nucleico presente em outra localização cromossômica.
[00092] Um "gene", neste documento, refere-se a uma região de DNA (incluindo exóns e íntrons) codificando um produto de gene, bem como todas as regiões de DNA que regulam a produção do produto de gene, se são ou não tais sequências reguladoras adjacentes à codificação e/ou sequências transcritas. Desse modo, um gene inclui, mas não está necessariamente limitado a sequências de promotor, terminadores, sequências reguladoras de translação, tais como sítios de ligação de ribossomo e sítios de entrada de ribossoma interno, potenciadores, silenciadores, isoladores, elementos de contorno, origens de replicação, sítios de fixação de matriz e regiões de controle do lócus.
[00093] Os termos "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" se referem a um polímero de desoxirribonucleotídeo ou ribonucleótido de polímero, em conformação linear ou circular. Para efeitos da presente descrição, estes termos não estão sendo interpretados como limitação no que diz respeito ao comprimento de um polímero. Os termos podem englobar análogos de nucleotídeos naturais conhecidos, bem como nucleotídeos modificados nas porções de base, açúcar e/ou fosfato (por exemplo, estrutura principal de fosforotioato). Em geral, um análogo de nucleotídeo específico tem a mesma especificidade de emparelhamento de base; ou seja, um análogo de A será um par de base com T.
[00094] Os termos "polinucleotídeos" e "proteína" são usados indistintamente para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos.
[00095] Neste documento, os termos "sítio-alvo" ou "sequência-alvo" se referem a uma sequência de ácido nucleico que define uma porção de uma sequência cromossômica a ser editada e que uma nuclease do dedo de zinco é projetada para reconhecer e ligar-se, desde que existam condições suficientes para ligação.
[00096] Os termos "a montante" e "a jusante" referem-se à localização em uma sequência de ácido nucleico em relação a uma posição fixa. A montante refere-se à região que é 5' (ou seja, perto da extremidade 5' da fita) para a posição e a jusante, refere-se à região que é 3' (ou seja, perto da extremidade 3' da fita) para a posição.
[00097] As técnicas para a determinação de identidade de sequência de ácidos nucleicos e aminoácidos são conhecidas na técnica. Tais técnicas incluem, normalmente, determinando a sequência de nucleotídeos de mRNA de um gene e/ou determinação da sequência de ácido amino codificada assim e comparando estas sequências a uma segunda sequência de nucleotídeos ou aminoácidos. As sequências genômicas também podem ser determinadas e comparadas com essa moda. Em geral, a identidade remete a uma correspondência exata de nucleotídeo-para-nucleotídeo ou aminoácido-para-aminoácido de dois polinucleotídeos ou sequências de polipeptídeo, respectivamente. Duas ou mais sequências (de polinucleotídeos ou aminoácidos) podem ser comparadas determinando sua identidade por cento. A identidade de porcentagem de duas sequências, sequências de ácido nucleico ou aminoácidos, se o número de correspondências exatas entre duas sequências alinhadas divididas pelo comprimento das sequências mais curtas for multiplicado por 100. Um alinhamento aproximado para sequências de ácidos nucleicos é fornecido pelo algoritmo de homologia local de Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482489 (1981). Esse algoritmo pode ser aplicado a sequências de aminoácidos usando a matriz de pontuação desenvolvida por Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA, e normalizado por Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745- 6763 (1986). Uma implementação exemplar desse algoritmo para determinar a identidade por cento de uma sequência é fornecida por Genetics Computer Group (Madison, Wis) no Pedido de utilidade de "BestFit". Outros programas apropriados para calcular a identidade de porcentagem ou similaridade entre sequências geralmente são conhecidos na técnica, por exemplo, outro programa de alinhamento é BLAST, usado com parâmetros padrão. Por exemplo, BLASTN e BLASTP podem ser usados utilizando os seguintes parâmetros de padrão: código genético = padrão; filtro = nenhum; fita = ambos; corte = 60; espera = 10; Matriz = BLOSUM62; Descrições = 50 sequências; classificação por = HIGH SCORE; Bancos de dados = não-redundante, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank traduções CDS+proteína Swiss+Spupdate+PIR. Detalhes destes programas podem ser encontrados no website de GenBank. Com relação a sequências aqui descritas, o intervalo desejado com graus de identidade de sequência é aproximadamente 80% a 100% e qualquer valor inteiro dos mesmos. Normalmente as identidades por cento entre sequências são de pelo menos 70 a 75%, preferencialmente 80 a 82%, preferencialmente 85 a 90%, até mesmo preferencialmente 92%, preferencialmente 95% e preferencialmente 98% de identidade de sequência.
[00098] Alternativamente, o grau de similaridade da sequência entre polinucleotídeos pode ser determinado por hibridação de polinucleotídeos sob condições que permitem a formação de duplex estável entre regiões que compartilham certo grau de identidade de sequência, seguido por digestão com nucleases de fita simples específicas e determinação do tamanho dos fragmentos digeridos. Dois ácidos nucleicos ou duas sequências de polipeptídeo são substancialmente similares uns aos outros quando as sequências exibem pelo menos cerca de 70% a 75%, preferencialmente 80 a 82%, preferencialmente 85% a 90%, mesmo preferencialmente 92%, preferencialmente 95%, e preferencialmente 98% de identidade de sequência ao longo de um comprimento das moléculas, determinado usando os métodos acima. Como usado neste documento, substancialmente similar também se refere às sequências mostrando identidade completa para um DNA especificado ou sequência do polipeptídeo. Sequências de DNA que são substancialmente similares podem ser identificadas em um experimento de hibridação Southern sob, por exemplo, condições restritivas, conforme definido para esse determinado sistema. A definição de condições adequadas de hibridização está dentro da habilidade da técnica. Vide, por exemplo, Sambrook et al., supra; Nucleic Acids Hybridization: A Practical Method, editors B. D. Hames and S. J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, D.C.; IRL Press).
[00099] A hibridação seletiva de dois fragmentos de ácidos nucleicos pode ser determinada da seguinte forma. O grau de identidade de sequência entre duas moléculas de ácido nucleico afeta a eficiência e a força dos eventos de hibridação entre tais moléculas. Uma sequência de ácidos nucleicos parcialmente idêntica, pelo menos parcialmente inibe a hibridação de uma sequência completamente idêntica para uma molécula-alvo. A inibição da hibridação da sequência completamente idêntica pode ser avaliada utilizando ensaios de hibridização que são bem conhecidos na técnica (por exemplo, Southern (DNA) blot, Northern (RNA) blot, solution hybridization, or the like, see Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.). Tais ensaios podem ser realizados usando diversos graus de seletividade, por exemplo, usando condições variando de baixa a alta rigidez. Se as condições de baixa rigidez forem empregadas, a ausência de ligação não específica pode ser avaliada usando uma sonda secundária que não tem mesmo um grau parcial de identidade de sequência (por exemplo, uma sonda tendo menos do que cerca de 30% de identidade sequência com a molécula-alvo), tal que, na ausência de eventos de ligação não específica, a sonda secundária não hibridize o-alvo.
[000100] Quando utilizando um sistema de detecção baseado em hibridização, uma sonda de ácido nucleico é selecionada que é complementar a uma sequência do ácido nucleico de referência e depois por seleção de condições adequadas para a sonda e a sequência de referência seletivamente cruza, ou liga, uns aos outros para formar uma molécula de frente e verso. Uma molécula de ácido nucleico que é capaz de hibridizar seletivamente para uma sequência de referência sob circunstâncias de hibridação moderadamente severas normalmente cruza sob condições que permitem a detecção de uma sequência do ácido nucleico-alvo de pelo menos cerca de pelo menos 10 a 14 nucleotídeos de comprimento, tendo uma identidade de sequência de pelo menos cerca de 70% com a sequência da sonda de ácido nucleico selecionada. Condições rigorosas de hibridação normalmente permitem a detecção de sequências de ácidos nucleicos- alvo de pelo menos cerca de 10 a 14 nucleotídeos de comprimento, tendo uma identidade de sequência de mais de cerca de 90 a 95% com a sequência da sonda de ácido nucleico selecionada. Condições de hibridação úteis para hibridação de sequência de sonda/referência, onde a sequência de teste e de referência tem um grau específico de identidade de sequência, pode ser determinada como conhecido na técnica (vide, por exemplo, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, editors B. D. Hames and S. J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, D.C.; IRL Press). Condições para a hibridação são conhecidas pelos versados na técnica.
[000101] O rigor de hibridização refere-se ao grau no qual as condições de hibridização desqualificam a formação de híbridos contendo nucleotídeos incompatíveis, com maior rigor, correlacionado com uma menor tolerância para híbridos incompatíveis. Os fatores que afetam o rigor da hibridação são conhecidos pelos versados na técnica e incluem, mas não estão limitados a temperatura, pH, força iônica e concentração de solventes orgânicos, tais como, por exemplo, formamida e dimetilsulfóxido. Como é conhecido por aqueles versados na técnica, o rigor de hibridização é aumentado por temperaturas elevadas, baixa força iônica e baixa concentração de solvente. No que diz respeito a condições de rigor de hibridação, é bem conhecido na técnica que numerosas condições equivalentes podem ser empregadas para estabelecer um rigor particular variando, por exemplo, os seguintes fatores: o comprimento e a natureza das sequências, composição de diversas sequências, concentrações de sais e outros componentes da solução de hibridação, a presença ou ausência de agentes de bloqueio das soluções de hibridação de base (por exemplo, sulfato de dextrano e polietilenoglicol), temperatura de reação de hibridação, e parâmetros de tempo, bem como, condições variáveis de lavagem. Um conjunto específico de condições de hibridização pode ser escolhido seguindo métodos padrão na técnica (Vide, por exemplo, Sapeka, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.).
[000102] Os exemplos a seguir estão incluídos para ilustrar a invenção.
[000103] O exemplo a seguir detalha a modificação do lócus de quinase RSK2. Um oligonucleotídeo (125 nt) foi projetado para incorporar três mutações distintas na sequência cromossômica de quinase RSK2. O oligonucleotídeo compreendendo: (1) duas mutações pontuais em sítios de ligação de ZFN para prevenir subsequente junção de extremidade não homóloga (NHEJ), (2) uma alteração TGC para GTT para converter uma Cys em uma Val, e (3) uma alteração silenciosa C para A para criar um sítio BamHI único para triagem de clone (figura 1). O oligonucleotídeo foi produzido usando procedimentos de síntese padrão (por exemplo, nenhuma modificação química) e foi purificado por PAGE. Um par de nucleases de dedo de zinco (ZFNs) foi projetado para atingir o lócus de quinase RSK2. Um ZFN foi projetado para ligar a sequência 5'—GTATACATAAAGCTA-3' (SEQ ID NO: 6; sítio de ligação esquerdo, indicado na figura 1), e o outro ZFN foi projetado para ligar a sequência 5'-GGAGTTTGCAGTGAAGGTA-3' (SEQ ID NO: 7; sítio de ligação direito indicado na figura 1).
[000104] As células humanas K562 foram nucleofectadas com 8 μg de mRNA codificando ZFNs e 0,3 nmol de oligonucleotídeo. Após dois dias de incubação, pools de células foram analisados para a presença do sítio de BamH1. Como mostrado na figura 2, células expostas para o oligonucleotídeo e os ZFNs abrigaram o sítio de BamH1, ao passo que a introdução do oligonucleotídeo sozinho não teve efeito. A integração de frequência variou de cerca de 20 a 30%.
[000105] Clones de célula única foram isolados e exibidos usando um ensaio de qPCR para identificar aqueles abrigando o sítio de BamH1 (vide figura 3). Aproximadamente 750 clones foram selecionados e identificaram cerca de 40 clones positivos. Os clones positivos foram posteriormente amplificados por PCR em torno da localização cromossômica-alvo e digeridos com BamHI para confirmar a edição do lócus cromossômico de quinase RSK2. Os dados de sequenciamento revelaram que os clones positivos de BamHI também foram positivos para Cys desejado para mudança de códon Val.
[000106] O exemplo a seguir detalha o uso de oligonucleotídeos para introduzir o lócus de AAVS1 de um sítio de HindIII. A figura 4 apresenta a sequência do tipo selvagem do lócus de AAVS1 e sequências de oligonucleotídeos senso e antissenso (108 nt) que incluem o sítio de HindIII. Os oligonucleotídeos foram produzidos utilizando procedimentos padrão (por exemplo, com nenhuma modificação química) e foram purificados por PAGE.
[000107] Um par de ZFNs foi projetado para atingir o lócus de AAVS1. Um ZFN foi projetado para ligar a sequência 5'-ACCCCACAGTGG-3' (SEQ ID NO: 8; sítio de ligação esquerdo, indicado na figura 4), e o outro ZFN foi projetado para ligar a sequência 5'-TAGGGACAGGAT-3' (SEQ ID NO: 9; sítio de ligação direito indicado na figura 4). O mRNA poliadenilado, capeado codificando os ZFNs foi preparado usando procedimentos padrão. O mRNA de ZFN e o oligonucleotídeo compreendendo o sítio de HindIII foram nucleofectados em células K562, HCT116, U2OS, A549, HEK293, HepG2 ou MSF7. Após um período de incubação, pools de células foram analisados para a presença do sítio de HindIII. As células expostas ao oligonucleotídeo e aos ZFNs continham fragmentos de HindIII, em que aquelas tratadas com oligonucleotídeo sozinho não tinham fragmentos de HindIII (figura 5).
[000108] Clones de célula única A549 foram isolados e exibidos usando um ensaio de qPCR para identificar aqueles abrigando o sítio de HindIII (figura 6). Aproximadamente 933 clones foram selecionados, com 308 identificados como positivo. Desse modo, a frequência de liberação do sítio de HindIII foi de cerca de 33%. Os clones positivos foram posteriormente amplificados por PCR em torno da localização cromossômica-alvo e digeridos com HindIII para confirmar a inserção da sequência de oligonucleotídeo. Os clones mostrando bandas fracas na posição do produto de PCR parental foram sequenciados e confirmados conter o sítio de HindIII (vide figura 6). Os clones mostrando diversas bandas fortes em torno da posição do produto de PCR parental são hipóteses de conter pequenas inserções derivadas por NHEJ.
[000109] Para determinar se os oligonucleotídeos mais curtos podem ser usados para liberar o sítio de HindIII para o lócus de AAVS1, os oligonucleotídeos que variam em comprimento de 36 a 106 nt foram preparados. Por exemplo, um oligonucleotídeo de 106 nt tinha uma identidade de sequência para 50 nt em ambos os lados do sítio de clivagem ZFN (ou seja, tinham braços de homologia de 50 nt), com um - sítio de HindIII (6 nt) entre os braços de homologia. As sequências dos oligonucleotídeos são apresentadas na Tabela 1 abaixo.
[000110] As células K562 foram nucleofectadas com 2,5 μg do DNA de plasmídeo codificando cada um dos ZFNs conduzidos por AAVS1 (total de 5 μg) e 3 μL de 100 μM estoque de oligonucleotídeo (senso ou antissenso). As células foram colhidas 2 dias pós-nucleofecção. O DNA genômico foi amplificado por PCR e digerido com HindIII. A figura 7 apresenta a integração de oligonucleotídeos de AAVS1-HindIII de fita senso de diferentes comprimentos. A liberação de ZFNs e qualquer um dos oligonucleotídeos resultou na integração. No entanto, os oligonucleotídeos compreendendo 40 ou mais parecia resultar em melhor integração. A integração de oligonucleotídeos de AAVS1-HindIII de fita antissenso de diferentes comprimentos é mostrada na figura 8. Como acima, a exposição a qualquer um dos oligonucleotídeos e dos ZFNs resultou na integração. Estes dados revelam que os oligonucleotídeos senso ou antissenso podem ser usados, e oligonucleotídeos tão curtos quanto 30 nt são integrados.
[000111] Para determinar se o tipo de ácido nucleico codificando os ZFNs afetou a taxa de inserção, as células K562 foram nucleofectadas com 2,5 μg de DNA ou 2,0 μg de mRNA codificando cada ZFN (mensagens total de 5 μg ou 4 μg, respectivamente) e 3 μL de oligonucleotídeo AAVS1-HindIII de 100 μM (ou seja, 50, 60 ou 100 nt). As células foram colhidas 2 dias pós-nucleofecção. O DNA genômico foi amplificado por PCR e digerido com HindIII. Como mostrado na figura 9, a liberação de ZFNs como RNA resultou em melhor integração dos oligonucleotídeos tendo comprimentos diferentes.
[000112] Para detectar fragmentos de NHEJ putativos, as células tratadas por oligonucleotídeo/ZFN foram submetidas a um ensaio de Cel-1. O ensaio de Cel-1 detecta alelos do lócus-alvo que se desvie do tipo selvagem como resultado reparação imperfeita mediada por NHEJ de rupturas de fita dupla de DNA induzidas por ZFN e/ou inserção de nucleotídeos adicionais. A amplificação por PCR da região-alvo de um pool de células tratadas por ZFN gera uma mistura de aplicons WT e mutantes. A fusão e o recozimento dessa mistura resultam em incompatibilidades de formação entre heteroduplexes de alelos WT e mutantes. Uma "bolha" de DNA formada no sítio de incompatibilidade é clivada pela nuclease principal Cel-1, e os produtos de clivagem podem ser resolvidos por eletroforese em gel. A intensidade relativa dos produtos de clivagem, em comparação com a banda parental é uma medida do nível de clivagem de Cel-1 do heteroduplex. Para isso, pools de células tratadas por ZFN/oligonucleotídeo foram amplificados por PCR e divididos em duas amostras. Uma amostra foi deixada sem tratamento e a outra amostra foi tratada com enzima de Cel-1 de 1 μL e potenciador de 1 μL durante 30 minutos a 42°C. Os resultados são apresentados na figura 10. Os fragmentos de Cel-1 e fragmentos putativos derivados de NHEJ incompatíveis foram detectados nas células tratadas por Cel-1.
[000113] As células A549 foram nucleofectadas com 4 μg de mRNA codificando ZFNs-alvo de AAVS1 e um oligonucleotídeo de AAVS1- HindIII ou um oligonucleotídeo de CNR1-HindIII. Para cada tipo do oligonucleotídeo, testaram-se as seguintes formas: a) senso, de fita simples; b) antissenso de fita simples; c) senso e antissenso; d) senso de fita simples (2X); e) fita dupla (pré-anelada). Após dois dias de incubação, as células foram colhidas, o DNA genômico foi amplificado por PCR e, em seguida, digerido com HindIII. Como mostrado na figura 11, apenas células expostas para o oligonucleotídeo de AAVS1-HindIII homólogo tinham um sítio de HindIII no lócus de AAVS1.
[000114] Para determinar se os oligonucleotídeos de DNA de fita simples (ssODN, de oligodesoxinucleotídeo de fita simples) poderiam ser usados para excluir uma sequência genômica-alvo de 0,1 kb a 100 kb no lócus de AAVS1 nas células K562, foi preparada uma série de ssODNs. ssODNs projetados para excluir uma sequência genômica de AAVS1-alvo de 5 kb, 10 kb e 100 kb são apresentados na Tabela 2. Cada oligonucleotídeo continha uma região (designada I' na figura 12) com identidade de sequência para uma região genômica (ou seja, a fronteira de exclusão distal ou região de ponto de extremidade de exclusão) localizada a uma distância especificada a partir do sítio de corte de ZFN e uma região (designada II na figura 12) correspondente para o sítio de ligação apropriado ZFN perto do sítio de corte de ZFN. Os oligonucleotídeos foram produzidos através de procedimentos de síntese padrão (por exemplo, nenhuma modificação química) e foram purificados por PAGE.
[000115] As sequências de ssODN exemplares apresentadas na Tabela 2 acima, sublinhadas são ácidos nucleicos no lócus que inclui o sítio de ligação de ZFN (a região designada como II na figura 12A). Os ácidos nucleicos com ambos sublinhados e em negrito são os nucleotídeos de reconhecimento para o sítio de ligação direito de ZFNs de AAVS1. Os ácidos nucleicos em negrito-itálico, mas sem sublinhado são complementares para o ponto de extremidade de exclusão distante (a região designada como I na figura 12A). A figura 12A ilustra as exclusões 5' no sítio de corte de ZFN. A figura 12B ilustra a exclusão 3' para o sítio de corte de ZFN.
[000116] As células K562 foram nucleofectadas com 4 μg de mRNA codificando ZFNs conduzidos por AAVS1 (total de 8 μg) e 3 μL de doador de ssODN de 100 μM: AAVS1-0,1 kb, AAVS1-0,5 kb, AAVS1-1 kb, AAVS1-1,5 kb, AAVS1-2 kb, AAVS1-2,5 kb, AAVS1-3 kb, AAVS1- 3,5 kb, AAVS1-4 kb, AAVS1-4,5 kb, AAVS1-5 kb, AAVS1-10 kb, AAVS1- 10,2 kb, AAVS1-19,9 kb, AAVS1-20 kb, AAVS1-50 kb, AAVS1-100 kb. Células k562 nucleofectadas com apenas ssODN, ou com ZFN só foram utilizadas como controle. Células k562 foram colhidas 2 dias pós- nucleofecção. O DNA genômico foi amplificado por PCR por um iniciador frontal a montante da extremidade 5' do ponto de extremidade distante da exclusão e um iniciador reverso a jusante da extremidade 3' do sítio de ligação de ZFN direito, como mostrado na figura 12A. De forma similar, usando o sítio de corte de ZFN como ponto de referência, para o esquema de exclusão 3' fora do sítio de corte de ZFN 12B, o iniciador frontal está a montante da extremidade 5' do sítio de ligação de ZFN e o iniciador reverso está a jusante da extremidade 3' do ponto de extremidade de exclusão distante.
[000117] Na figura 13, as rotas rotuladas como "2" usaram células K562 expostas apenas ao oligonucleotídeo, mas sem ZFN como um modelo para amplificação por PCR. Portanto, os fragmentos de PCR foram esperados ter um indicativo de comprimento sendo derivado do alelo do tipo selvagem (sem exclusão). As rotas rotuladas como "3" usaram células K562 expostas a ZFN apenas, e assim os produtos de PCR foram esperados ter também o indicativo de comprimento sendo derivado do alelo do tipo selvagem (ou NHEJ). As rotas rotuladas como "1" usaram células K562 expostas a ZFN e oligonucleotídeo, e assim, os fragmentos de PCR foram esperados ser amplificados do alelo de exclusão e, portanto, menor em tamanho do que o alelo do tipo selvagem pelo número de pares de bases, projetado para ser excluído. Dependendo dos comprimentos de exclusão previstos na célula, a rota 1 também pode incluir fragmentos de PCR amplificados a partir do alelo do tipo selvagem. O tamanho esperado dos fragmentos de PCR do alelo tipo selvagem e dos fragmentos de PCR de alelo de exclusão é apresentado acima de cada grupo de pistas na figura 13. Os fragmentos de PCR eram todos do tamanho esperado, indicando que a exclusão de DNA genômico-alvo de cerca de 0,1 kb, 0,5 kb, 1,0 kb, 1,5 kb, 2 kb, 2,5 kb, 3,0 kb, 3,5 kb, 4,0 kb, 4,5 kb, 5,0 kb, 10,0 kb, 10,2 kb, 19,9 kb, 20 kb, 50 kb e 100 kb usando oligonucleotídeos de fita simples e ZFN foram realizados com sucesso.
[000118] Usando o sítio de corte de ZFN como ponto de referência, de acordo com a seleção do sítio de corte de ZFN a montante (para exclusão 3') ou jusante (exclusão 5') em relação à região de exclusão genômica-alvo, oligonucleotídeos de fita simples antissenso e/ou senso foram utilizados para mediar a exclusão genômica orientada, especificamente a montante do sítio de corte de ZFN. Na figura 13, entre os grupos de rotas, os grupos com um asterisco "*" indicaram exclusão 3' do sítio de corte de ZFN; grupos sem asterisco "*" indicaram exclusão 5' do sítio de corte de ZFN; o único grupo com asterisco duplo "**" indicou exclusões 3' e 5' do sítio de corte de ZFN. Como mostrado na figura 13, cada tipo dos grupos mostrou ter produtos de PCR com o tamanho esperado.
[000119] Para testar a exclusão de DNA genômico-alvo no lócus de AAVS1 em células diferentes, cada um dos pools de células K562, HCT116, U2OS, A549, HEK293, HepG2 e MCF7 foram nucleofectados com 4 μg de mRNA codificando os ZFNs conduzidos por AAVS1 (total de 8 μg) e 3 μL de doador de ssODN de 100 μM:AAVS1-5 kb. Cada um dos pools de célula nucleofectados com apenas ssODN, ou com ZFN apenas foi usado como controle. As células foram colhidas 2 dias pós- nucleofecção. DNAs genômicos foram amplificados por PCR pelo iniciador frontal a montante da extremidade 5' da exclusão-alvo e iniciador reverso a jusante da extremidade 3' da exclusão-alvo. As rotas rotuladas como "1" usaram o DNA das células expostas a oligonucleotídeo e ZFN como modelo de PCR, e os fragmentos de PCR foram esperados ser amplificados a partir do alelo da exclusão, com um tamanho menor de 5 kb do que o fragmento de PCR de alelo tipo selvagem (5303 bp). Como mostrado na figura 14, os fragmentos e PCR de alelo de exclusão em todas as amostras de célula tinham o tamanho esperado de 303 bp.
[000120] Para testar as exclusões de DNA genômico-alvo no lócus diferente nas células K562, as células K562 foram nucleofectadas com cada um (1) mRNA (total de 8 μg) codificando ZFNs conduzidos por IRAK4 e um doador de ssODN (3 μL de 100 μM) para exclusão de 6 kb; (2)) mRNA (total de 8 μg) codificando ZFNs conduzidos por RSK2 e um doador de ssODN (3 μL de 100 μM) para exclusão de 5,2 kb; e (3) mRNA (total de 8 μg) codificando ZFNs conduzidos por RSK4 e um doador de ssODN (3 μL de 100 μM) para exclusão de 5,0 kb. Cada um dos pools de célula nucleofectados de amostras com ssODN apenas, ou com ZFN apenas foi usado como controle. As células foram colhidas 2 dias pós-nucleofecção e isoladas do DNA genômico. Os DNAs genômicos foram amplificados por PCR pelo iniciador frontal a montante da extremidade 5' da exclusão-alvo e iniciador reverso a jusante da extremidade 3' da exclusão-alvo. As rotas rotuladas como "1" usaram o DNA de células expostas ao oligonucleotídeo e ao ZFN como modelo de PCR, e os fragmentos de PCR foram esperados ser amplificados a partir do alelo de exclusão. Como mostrado na figura 15, os fragmentos de PCR de alelo de exclusão em todas as amostras de célula tinham o tamanho esperado de 334 bp para o lócus de IRAK4, 281 bp para o lócus RSK2 e 190 bp para o lócus RSK4, respectivamente.
[000121] Análises de sequência de DNA de clones de pool de DNA genômico foram conduzidas para avaliar o nível de precisão da exclusão-alvo mediada por oligonucleotídeos de fita simples e ZFNs. O pool de DNA genômico foi isolado de células K562 expostas a ZFN e oligonucleotídeos de fita simples projetados para eliminar 100 bp-alvo fora de 5' do sítio de corte de ZFN no lócus de AAVS1. Um pouco mais de 40% dos clones tinham alelos com exclusão precisa de 100 bp-alvo; superficialmente mais de 55% dos clones tinham alelos do tipo selvagem (sem exclusão, interrupção ou reparação) ou alelos como um resultado de junção de extremidade não homóloga final (NHEJ); e os clones tendo alelos com exclusão imprecisa (ou seja, exclusão adicional de 81 bp fora do limite da exclusão pretendida 5') foram menos de 5% (dados não mostrados).
[000122] Em outro evento, os clones de pool DNA genômico que foi isolado após as células K562 serem expostas a ZFN e oligonucleotídeos de fita simples projetados para eliminar um 100 bp-alvo de 3' do sítio de corte de ZFN no lócus de AAVS1 foram submetidos à análise de sequenciamento de DNA. Um pouco mais de 50% dos clones tinham alelos com exclusão precisa de 100 bp-alvo; um pouco menos 50% dos clones tinham alelos do tipo selvagem (sem exclusão, interrupção ou reparação) ou alelos como resultado de junção de extremidade não homóloga final (NHEJ); e não havia nenhum clone tendo alelos com exclusão imprecisa (dados não mostrados).
[000123] Em um evento adicional, os clones do pool de DNA genômico que foi isolado após as células K562 serem expostas a um par de ZFNs em toda a região-alvo para exclusão e dois conjuntos de oligonucleotídeos de fita simples projetados para eliminar 100 bp-alvo fora de 5' e 3' do sítio de corte de ZFN no lócus de AAVS1 foram submetidos à análise de sequências de DNA. Mais de 20% dos clones tinham alelos com exclusão precisa de 100 bp-alvo fora de 5' do sítio de corte de ZFN; um pouco menos de 30% dos clones tinham alelos com exclusão precisa de 100 bp-alvo de 3' do sítio de corte de ZFN; um pouco menos 50% dos clones tinham alelos do tipo selvagem (sem exclusão, interrupção ou reparação) ou alelos como resultado de junção de extremidade não homóloga (NHEJ); e nenhum clone tinha alelos com exclusão imprecisa para exclusão 5' ou 3' fora dos sítios de corte de ZFN (dados não mostrados).
[000124] Clones de célula única isolados foram genotipados através de análise do gel para determinar a composição alélica no lócus onde se realizou a exclusão de DNA genômico-alvo. Os clones de célula única foram isolados depois que as células K562 foram expostas a ZFN e oligonucleotídeos de fita simples projetados para excluir sequência genômica de 5 kb, 10 kb e 100 kb, respectivamente. Os clones de exclusão de homozigotos foram esperados ter fragmentos de PCR de um tamanho que foram derivados dos dois alelos de exclusão no clone. Os clones de exclusão de heterozigotos foram esperados ter o alelo de exclusão e o alelo não exclusão do tipo selvagem. O alelo de não exclusão do tipo selvagem foi detectado pela junção de PCR com pares de iniciador flanqueando cada uma das duas extremidades de exclusão. A Tabela 3 resume os resultados da genotipagem de clone único.
[000125] A figura 16 ilustra um esquema exemplar para obter exclusões e inserções genômicas-alvo simultâneas em células com DNA de oligonucleotídeos de fita simples (ssODN) e ZFNs. As sequências de ssODN para exclusão e inserção-alvo tem três regiões: região I' compreendendo sequências de nucleotídeos complementares para o ponto de extremidade de exclusão distante (região designada como I na figura 16); região II compreendendo a sequência de nucleotídeo do sítio de ligação de ZFN (região designada como II na figura 16); e a região III compreendendo a sequência de nucleotídeos a ser inserida. Especificamente, o oligonucleotídeo de SM271 foi projetado para exclusão-alvo de 5 kb e inserção do sítio de IoxP simultâneas: 5' ATCCACAAAAGTATAAAATTGACTCTTCTGTCCTGTGTGtaacttcgta tagcatacattatacg aaqttatCTAGGGACAGGATTGGTGACAGAAAAGCCCCATCCTTA 3' (SEQ ID NO: 24), com sítio de IoxP representado pela sequência de nucleotídeos em letras minúsculas, sítio de ligação de ZFN sublinhado, nucleotídeos de reconhecimento para o sítio de ligação de ZFN direito sublinhado e em negrito e sequência complementar para o ponto de extremidade de exclusão distante em negrito-itálico mas sem sublinhado.
[000126] Como mostrado na figura 16, um iniciador de PCR frontal A e iniciador reverso B que flanqueiam as regiões I e II foram usados para verificar a exclusão-alvo; e o iniciador de PCR frontal A e iniciador reverso C foram utilizados para verificar a inserção-alvo, com o iniciador C compreendendo os nucleotídeos no sítio de junção para o braço de ligação de ZFN direito e o DNA genômico vizinho. A figura 17 mostra a verificação de PCR da exclusão-alvo da sequência de 5 kb, que gerou o fragmento de PCR de 303 bp esperado do alelo de exclusão (Rota 6: AAVS1-ZFN e AAVS1- 5 kb ssODN) utilizando os iniciadores A e B. A inserção-alvo do sítio de IoxP foi verificada pelo fragmento de PCR utilizando os iniciadores A e C (figura 17, vide rota 10).
[000127] O exemplo a seguir detalha o uso de oligonucleotídeos e ZFNs para introduzir uma sequência de interesse de um plasmídeo doador no lócus de AAVS1. Em geral, um ou dois ZFNs, dois doadores de oligonucleotídeos e um doador de plasmídeo estão envolvidos neste processo. Os ZFNs fazem rupturas de fita dupla (DSB). Os dois doadores de oligonucleotídeo então ligam as extremidades de DSB utilizando as seções que são complementares para o sítio de corte de ZFN. Cada extremidade 5' dos dois doadores do oligonucleotídeo é homóloga a regiões no plasmídeo de doador (universal ou não). A homologia na extremidade 5' dos doadores de oligonucleotídeo provoca a invasão do doador de plasmídeo. Quando DSB é resolvido usando o plasmídeo doador, a sequência desejada do plasmídeo doador é introduzida e inserida no sítio de corte de ZFN (figura 22).
[000128] Para confirmar o esquema, as células foram transfectadas com dois AAVS1 ZFNs (Z), dois doadores de oligonucleotídeo (O) e o doador de plasmídeo de camundongo Rosa26 (D) (Z + O + D). As células transfectadas com apenas ZFNs (Z), doadores de oligonucleotídeo apenas (O), doador de plasmídeo apenas (D), ZFNs e doadores de oligonucleotídeo apenas (Z + O), ZFNs e doador de plasmídeo apenas (Z + D), doadores de oligonucleotídeo e doador de plasmídeo apenas (O + D) foram utilizadas como controles. As células transfectadas, em seguida, foram cultivadas, colhidas e os clones de célula individuais foram analisados. A junção do PCR foi realizada para confirmar que o doador de DNA do doador de plasmídeo foi incorporado no lócus de AAVS1. Os iniciadores AAVS1 Cel-F2 (5' TTCGGGTCACCTCTCACTCC 3'; SEQ ID NO: 25) e SM373.Junc.R1 (5' ACCTCGAGACCGGTGGATCCGA 3'; SEQ ID NO: 26) flanqueando a junção de 5' foram utilizados para confirmação de junção 5'; e iniciadores SM373.Junc.F2 (5' GCGGTCTGAATTCGGATCCACCG 3'; SEQ ID NO: 27) e AAVS1 Cel-R2 (5' GGCTCCATCGTAAGCAAACC 3'; SEQ ID NO: 28) flanqueando a junção 3' foram utilizados para confirmação de junção 3'.
[000129] Análises de sequência na junção 5' e na junção 3' confirmaram que a sequência de doador do doador do plasmídeo foi incorporada no lócus de AAVS1 nas células. A integração confirmada na junção 5' mostra a sequência apresentada na figura 18 (SEQ ID NO: 29). A integração confirmada na junção 3' é mostrada pela sequência na figura 19 (SEQ ID NO: 30). A figura 20 mostra que os clones expostos a dois ZFNs, dois doadores de oligonucleotídeos e um doador de plasmídeo (Z + O + D) compreendiam o fragmento de PCR do sítio de junção 5' de tamanho 390 bp (figura 20A) e fragmento de PCR do sítio de junção 3' de tamanho 309 bp (figura 20B) indicativo da integração de sequência do doador.
[000130] Para investigar se a identidade de sequência do DNA no sítio homólogo da sequência genômica do oligonucleotídeo afetaria a eficiência da exclusão da sequência genômica-alvo, uma sequência do oligonucleotídeo foi alterada no segmento correspondente à extremidade de exclusão distal de 10 kb do sítio de corte de ZFN AAVS1, de modo que oligonucleotídeos com 100% de identidade, 98% de identidade de sequência, 90% de identidade de sequência, 50% de identidade de sequência estivessem preparados. A eficiência da exclusão de 10 kb, em seguida, foi medida por PCR em tempo real de SYBR Green (figura 21). O ΔCt entre 100% de identidade e 98% de identidade foi 0,4; o ΔCt entre 100% de identidade e 90% de identidade foi 5; e o ΔCt entre 100% de identidade e 50% de identidade foi 7. A eficiência de exclusão foi comparável entre os oligonucleotídeos tendo 100% de identidade e os oligonucleotídeos tendo 98% de identidade de sequência. A eficiência da exclusão diminuiu quando a identidade de sequência foi reduzida para 90%, e a eficiência foi significativamente inferior quando a identidade de sequência foi de 50% ou menos.
Claims (6)
1. Método para editar pelo menos uma sequência cromossômica endógena em uma célula pela inserção de uma sequência na sequência cromossômica, o método caracterizado pelo fato de que compreende: a) introduzir na célula (i) pelo menos uma endonuclease-alvo ou ácido nucleico que codifica uma endonuclease-alvo, a endonuclease-alvo sendo capaz de introduzir uma quebra de fita dupla em um sítio de clivagem-alvo na sequência cromossômica, (ii) pelo menos um primeiro ácido nucleico de fita simples compreendendo uma primeira porção tendo identidade de sequência substancial para a sequência cromossômica no lado a montante do sítio de clivagem-alvo; (iii) pelo menos um segundo ácido nucleico de fita simples compreendendo uma primeira porção tendo identidade de sequência substancial para o lado a jusante do sítio de clivagem alvo, e (iv) pelo menos um polinucleotídeo doador compreendendo uma primeira sequência tendo identidade de sequência substancial para uma segunda porção do primeiro ácido nucleico de fita simples e uma segunda sequência tendo identidade de sequência substancial para uma segunda porção do segundo ácido nucleico de fita simples, e em que as primeira e segunda sequências do polinucleotídeo doador flanqueiam uma sequência para inserção dentro da sequência cromossômica; e b) manter a célula em condições tais que a quebra de fita dupla introduzida pela endonuclease-alvo seja reparada por um processo de homologia dirigida de tal modo que a sequência para inserção é integrada dentro da sequência cromossômica, dessa forma editando a sequência cromossômica; em que o método não compreende um processo para modificação da identidade genética da linhagem germinal de um ser humano e, em que o método não compreende um método para tratamento de um corpo humano ou animal por cirurgia ou terapia.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada ácido nucleico de fita simples é linear ou circular, é senso ou antissenso e tem um comprimento de 20 nucleotídeos a 100.000 nucleotídeos.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que (i) cada ácido nucleico de fita simples compreende desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, miméticos de ribonucleotídeos, nucleotídeos modificados, nucleotídeos 2'-O-metila, ácidos nucleicos bloqueados, ácidos nucleicos de peptídeo ou combinações dos mesmos, ou (ii) em que cada ácido nucleico de fita simples compreende ligações fosfodiéster, ligações fosforotioato, ligações fosforamidita, ligações fosforodiamidato, ou combinações dos mesmos.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a endonuclease-alvo é uma nuclease de dedo de zinco, uma meganuclease, uma nuclease efetora tipo ativadora de transcrição (TALE), uma nuclease sítio-específica ou um agente indutor de quebra de fita dupla de DNA-alvo artificial.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula humana, uma célula de mamífero, uma célula de vertebrado, uma célula de invertebrado, uma célula-tronco, uma célula-tronco pluripotente induzida, uma célula única de embrião não-humano ou uma célula eucariota unicelular.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a endonuclease-alvo é uma nuclease de dedo de zinco e cada ácido nucleico de fita simples é um ácido desoxirribonucleico que é pelo menos 30 nucleotídeos de comprimento.
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