ES2378333T3 - Métodos y composiciones para la inactivación de genes - Google Patents

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Abstract

Proteína que comprende un dominio de unión al ADN con dedos de zinc modificada genéticamente, en la que el dominio de unión al ADN comprende cuatro regiones de reconocimiento de dedo de zinc como sigue:

Description

Métodos y composiciones para la inactivación de genes.
�?MBITO TÉCNICO
La presente descripción pertenece a los ámbitos de la ingeniería polipeptídica y genómica y de la recombinación homóloga.
ANTECEDENTES
Se han descrito varios métodos y composiciones para la escisión dirigida del ADN genómico. Tales escisiones dirigidas se pueden utilizar, por ejemplo, para inducir la mutagénesis dirigida, inducir deleciones dirigidas de las secuencias del ADN celular y facilitar la recombinación dirigida de un locus cromosómico predeterminado. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de los Estados Unidos 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; y la publicación de patente internacional WO 07/014275.
CCR5, un receptor de quimiocinas con 7 dominios transmembranarios, es el correceptor principal para la entrada del VIH-1 en los linfocitos T CD4 (Samson et al. (1996) Nature 382: 722-725; Deng et al (1996) Nature 381: 661-666; Alkhatib (1996) Science 272: 1955-1958). Desde el descubrimiento de que la deleción �32 en el gen del CCR5 confiere resistencia al VIH-1, se ha estudiado intensamente el CCR5 a modo de diana principal para el tratamiento del VIH. Aunque se ha demostrado que algunas moléculas pequeñas inducen la internalización del receptor o bloquean la interacción entre el CCR5 y el VIH (Fatkenheuer et al. (2005) Nat. Med. 11: 1170-1172), estas estrategias con moléculas pequeñas han dado lugar al desarrollo de la resistencia a través de la selección de mutantes de escape que, interesantemente, continúan utilizando el CCR5 para la entrada del virus (Kuhmann et al. [2004] J. Virol. 78: 2790-2807). De igual forma, dentro del organismo, las estrategias a base de ARNi y antisentidos sólo han bloqueado parcialmente la expresión del CCR5 hasta la fecha.
Así pues, se siguen necesitando composiciones que supriman completamente el gen de CCR5 para la penetración fenotípica y la resistencia a largo plazo a la infección del VIH.
Mani et al (Biochemical and Biophysical Research Communications, Academic Press Inc. Orlando, FL, US, vol. 335, n.º 2, 23 de septiembre de 2005, páginas 447-457), Urnov et al. (Nature, Nature Publishing Group, Londres, GB, vol. 435, n.º 7042, 2 de junio de 2005, páginas 646-651) y Liu Qiang et al (Journal of Biological Chemistry, vol. 277, n. 6, 8 de febrero de 2002, páginas 3850-3856) describen nucleasas con dedos de zinc que inducen roturas bicatenarias en los sitios elegidos de los genes deseados.
Durai et al. (Nucleic Acids Research, Oxford University Press, Surrey, GB, vol. 33, n.º 18, 26 de octubre de 2005, páginas 5678-5990) y Kandavelou Karthikeyan et al. (Nature Biotechnology, Nature Publishing Group, Nueva York, NY, US, vol. 23, n.º 6, junio de 2005, páginas 686-687) describen el concepto de utilizar dominios de unión al ADN de tipo dedo de zinc de síntesis artificial para crear nucleasas que se unan a determinadas secuencias diana y las escindan.
COMPENDIO
La presente invención se define mediante el conjunto de reivindicaciones adjuntas.
En la presente memoria se describen composiciones y métodos para la inactivación parcial o completa de un gen diana. También se describen métodos que utilizan estas composiciones (reactivos), por ejemplo para inactivar un gen en una célula con propósitos terapéuticos y/o para producir líneas celulares en las cuales está inactivado un gen diana.
En un aspecto, en la presente memoria se dan a conocer nucleasas con dedos de zinc (ZFN, por su nombre en inglés) que tienen sitios diana en el gen del CCR-5 humano. En algunas realizaciones, la escisión dentro del gen de CCR-5 con estas nucleasas da lugar a la disrupción permanente (p. ej., mutación) del gen de CCR5. En algunas realizaciones, el o los dominios de dedo de zinc se modifican genéticamente para que se unan a un sitio diana cadena arriba de la mutación �32 del CCR5 que se produce de forma natural. Las proteínas con dedos de zinc pueden incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más dedos de zinc, teniendo cada dedo de zinc una hélice de reconocimiento que se une a un subsitio diana en el gen diana. En algunas realizaciones, el gen diana es CCR-5 y las proteínas con dedos de zinc comprenden 4 dedos (designados F1, F2, F3 y F4 y ordenados de F1 a F4 desde el extremo amino al extremo carboxilo) y comprenden la secuencia de aminoácidos de las regiones de reconocimiento mostradas en la tabla 1.
Así pues, en algunos aspectos, en la presente memoria se da a conocer una proteína que comprende un dominio de unión al ADN de tipo dedo de zinc modificado genéticamente, en donde el dominio de unión al ADN comprende cuatro regiones de reconocimiento de tipo dedo de zinc ordenadas de F1 a F4 desde el extremo amino al extremo carboxilo, y en donde F1, F3 y F4 comprenden las siguientes secuencias de aminoácidos: F1: DRSNLSR (SEQ ID n.º 2); F3: RSDNLAR (SEQ ID n.º 4), y F4: TSGNLTR (SEQ ID n.º 8). En algunas realizaciones, F2 comprende la secuencia de aminoácidos ISSNLNS (SEQ ID n.º 5). Alternativamente, F2 comprende la secuencia de aminoácidos VSSNLTS (SEQ ID n.º 6).
Cualquiera de las proteínas descritas en la presente memoria pueden además comprender un dominio de escisión y/o un semidominio de escisión (p. ej., un semidominio de escisión de FokI de tipo silvestre o modificado genéticamente). Así pues, en cualquiera de las ZFN descritas en la presente memoria, el dominio nucleasa puede comprender un dominio nucleasa o un semidominio nucleasa de tipo silvestre (p. ej., un semidominio de escisión de FokI). En otras realizaciones, las ZFN comprenden dominios o semidominios nucleasa modificados genéticamente, por ejemplo, semidominios de escisión de FokI modificados genéticamente que forman heterodímeros estrictos. Véase, p. ej., la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos n.º 60/808 486, registrada el 25 de mayo de 2006.
En otro aspecto, la descripción da a conocer un polinucleótido que codifica cualquiera de las proteínas descritas en la presente memoria. Cualquiera de los polinucleótidos descritos en la presente memoria también puede comprender secuencias (secuencias donadoras o parches) para la inserción dirigida en el gen diana (p. ej., CCR-5).
En otro aspecto más, se da a conocer un vector para introducir el gen que comprende cualquiera de los polinucleótidos descritos en la presente memoria. En determinadas realizaciones, el vector es un vector adenovírico
(p. ej., un vector Ad5/35). Así pues, en la presente memoria también se dan a conocer vectores de adenovirus (Ad) que comprenden un secuencia que codifica al menos una nucleasa con dedos de zinc (ZFN) y/o una secuencia donadora para la integración dirigida en un gen diana. En algunas realizaciones, el vector Ad es un vector de Ad quimérico, por ejemplo, un vector Ad5/35. En otras realizaciones, el gen diana es el gen del CCR-5 humano. Los vectores descritos en la presente memoria pueden comprender secuencias donadoras. En algunas realizaciones, un único vector comprende secuencias que codifican una o más ZFN y la o las secuencias donadoras. En otras realizaciones, la o las secuencias donadoras están contenidas en un primer vector y las secuencias que codifican la ZFN están presentes en un segundo vector.
Las secuencias de ZFN de los vectores (p. ej., vectores Ad) descritas en la presente memoria típicamente codificarán una fusión de una proteína con dedo de zinc (ZFP, por su nombre en inglés) y un dominio de escisión o semidominio de escisión (a saber, un dominio de nucleasa). La porción de la proteína ZFN con dedos de zinc se modifica genéticamente para que se una a un sitio diana en el gen diana. Las proteínas con dedos de zinc pueden incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más dedos de zinc, teniendo cada dedo de zinc una hélice de reconocimiento que se une a un subsitio diana en el gen diana. En algunas realizaciones, el gen diana es CCR-5 y las proteínas con dedos de zinc comprenden 4 dedos (designados F1, F2, F3 y F4) y comprenden la secuencia de aminoácidos de las regiones de reconocimiento mostradas en la tabla 1.
En cualquiera de los polinucleótidos o proteínas descritos en la presente memoria, el dominio de escisión puede comprender al menos un dominio de escisión o al menos un semidominio de escisión. En algunas realizaciones, el dominio es escisión o el semidominio de escisión es un dominio de escisión de tipo silvestre (p. ej., un semidominio de escisión de tipo silvestre de FokI). En otras realizaciones, el dominio de escisión o el semidominio de escisión está modificado genéticamente.
Aún en otro aspecto, la descripción da a conocer una célula aislada que comprende alguna de las proteínas, polinucleótidos y/o vectores descritos en la presente memoria. En determinadas realizaciones, la célula se selecciona entre el grupo que consiste en una célula troncal hematopoyética, un linfocito T (p, ej., linfocito T CD4+), un macrófago, una célula dendrítica y una célula presentadora de antígenos. En otro aspecto, también se describen las células que comprenden uno o más vectores Ad como los descritos en la presente memoria (vectores Ad-ZFN, Ad-ZFN-donador y/o Ad-donador). Las células incluyen, por ejemplo, células mononucleares de la sangre periférica (CMSP), macrófagos, células troncales mesenquimatosas, células madre embrionarias humanas (células hES), células troncales hematopoyéticas (p. ej., linfocitos CD34+), linfocitos T (p. ej., linfocitos CD4+), células dendríticas o células presentadoras de antígenos; o una línea celular tal como K562 (de leucemia mielogénea crónica), HEK293 (de riñón embrionario), PM-1 (de linfocitos T CD4+), THP-1 (de leucemia monocítica) o GHOST (de osteosarcoma).
En otro aspecto, en la presente memoria se encuentran descritos los métodos para inactivar un gen diana en una célula aislada mediante la introducción de una o más proteínas, polinucleótidos y/o vectores en la célula tal y como se describe en la presente memoria. En cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria, las ZFN pueden inducir la mutagénesis dirigida, deleciones dirigidas de secuencias de ADN celular, y/o facilitar la recombinación dirigida en un locus cromosómico predeterminado. Así pues, en algunas realizaciones, las ZFN eliminan uno o más nucleótidos del gen diana. En otras realizaciones se reemplaza una secuencia genómica del gen diana, por ejemplo mediante un Ad-ZFN como el descrito en la presente memoria y una secuencia «donadora» que se inserta en el gen después de la escisión dirigida con la ZFN. La secuencia donadora puede estar presente en el vector Ad-ZFN, presente en un vector Ad distinto o, alternativamente, se puede introducir en la célula aislada mediante un mecanismo de introducción del ácido nucleico diferente. En determinadas realizaciones, el gen diana es un gen de CCR-5.
Se dan a conocer los métodos para utilizar las proteínas con dedos de zinc y fusiones de las mismas para mutar el gen CCR-5 y/o inactivar el funcionamiento del CCR-5 en una célula aislada o línea celular. Por lo tanto, se da a conocer un método para inactivar un gen de CCR-5 en una célula humana aislada, en donde el método comprende la introducción en la célula de cualquiera de las proteínas o polinucleótidos descritos en la presente memoria.
En otro aspecto más, la descripción da a conocer el uso de un polinucleótido de la invención para tratar o prevenir la infección del VIH en un sujeto de acuerdo con la reivindicación 19.
El ácido nucleico puede comprender cualquiera de los polinucleótidos descritos en la presente memoria. En cualquiera de los usos, el primer ácido nucleico puede codificar además un segundo polipéptido, en donde el segundo polipéptido comprende: (i) un dominio de unión al ADN de tipo dedo de zinc que está modificado genéticamente para que se una a un segundo sitio diana en el gen de CCR5; y (ii) un dominio de escisión. De igual forma, cualquiera de estos usos pueden comprender además un segundo ácido nucleico, en donde el segundo ácido nucleico contiene dos regiones de homología con el gen de CCR-5, flanqueando una secuencia que no es homóloga al gen de CCR-5.
En cualquiera de los métodos y composiciones descritos en la presente memoria la célula puede ser, por ejemplo, una célula troncal hematopoyética (p. ej., un linfocito CD34+), un linfocito T (p. ej., un linfocito CD4+), un macrófago, una célula dendrítica o una célula presentadora de antígeno; o una línea celular tal como K562 (de leucemia mielogénea crónica), HEK293 (de riñón embrionario), PM-1 (de linfocito T CD4+), THP-1 (de leucemia monocítica) o GHOST (de osteosarcoma).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
En la figura 1 se muestran los diagramas esquemáticos de los vectores de Ad5/35 en los que se ha eliminado la secuencia que codifica E1 o se ha reemplazado con un casete de expresión del transgén (p. ej., que codifica GFP, las ZFN y/o secuencias donadoras).
En la figura 2 se muestra la secuencia de aminoácidos del semidominio de escisión de FokI de tipo silvestre (SEQ ID n.º 33). Las posiciones en las que la secuencia se puede alterar (486, 490, 499 y 538) para formar semidominios de escisión modificados genéticamente están en negrita y subrayados.
En la figura 3 se muestra la secuencia de aminoácidos de un semidominio de escisión modificado genéticamente de ejemplo (SEQ ID n.º 34) que forma un heterodímero con el semidominio de escisión modificado genéticamente que se muestra en la figura 4. Las posiciones en las cuales se alteró la secuencia en comparación con el tipo silvestre (que corresponde a los restos de aminoácidos 486 y 499) están subrayadas.
En la figura 4 se muestra la secuencia de aminoácidos de otro semidominio de escisión modificado genéticamente de ejemplo (SEQ ID n.º 35) que se puede utilizar en las ZFN descritas en la presente memoria. Las posiciones en las cuales se alteró la secuencia en comparación con el tipo silvestre (que corresponde a los restos aminoacídicos 490 y 538) están subrayados.
En la figura 5 se muestra la secuencia nucleotídica de una porción de un gen de CCR-5 (SEQ ID n.º 36) utilizada para construir una secuencia donadora (parche) que tiene brazos homólogos a CCR-5. Véase también el ejemplo 1.
En la figura 6 se muestra la secuencia nucleotídica de una secuencia «parche» de 47 pb (SEQ ID n.º 37) que se usó para insertarla en el gen de CCR-5. Véase también el ejemplo 1.
En la figura 7 se muestra la secuencia nucleotídica de la secuencia donadora (SEQ ID n.º 38) utilizada para la inserción dirigida en el gen de CCR-5. El brazo homólogo a CCR-5 en 5' corresponde a los nucleótidos 1-471; la secuencia «parche» para la inserción dirigida en CCR-5 está subrayada y corresponde a los nucleótidos 472-518; y el brazo homólogo a CCR-5 en 3' corresponde a los nucleótidos 519-1928. Véase también el ejemplo 1.
En la figura 8 se representan secuencias de una porción del gen de CCR-5 en células transducidas con Ad5/35-ZFN. El tipo celular se muestra en la columna 3. Las bases que faltan en comparación con la secuencia de CCR-5 de tipo silvestre están señaladas con un punto.
En la figura 9 se representa el análisis de las secuencias de una porción del gen de CCR-5 en las células transducidas con un Ad5/35-ZFN. El tipo celular está indicado en la columna 3. Los genomas modificados que se muestran en esta figura tenían varias inserciones pequeñas (bases subrayadas) en el gen de CCR-5 y, en un caso, una deleción, que se señala mediante un punto.
En la figura 10 se representa el análisis de las secuencias de una porción del gen de CCR-5 en las células transducidas con un Ad5/35-ZFN. Los genomas modificados que se muestran en esta figura tenían distintas inserciones más largas (bases subrayadas) en el gen de CCR-5.
En la figura 11, paneles A y B, se representa la evolución en el tiempo del porcentaje de linfocitos T con el CCR-5 modificado en los linfocitos T transducidos con Ad5/35 ZFN215 (panel A) y con Ad5/35 ZFN224 (panel B), tras la exposición al VIH de tipo silvestre o a una infección falsa.
En la figura 12 hay un esquema que describe los sitios diana del gen de CCR5 para las parejas de CCR5-ZFN 215 y
224.
En la figura 13 se muestra el grado de disrupción del gen diana en las células GHOST-CCR5 transducidas con un vector Ad5/35 que codifica las ZFN indicadas que actúan selectivamente sobre el CCR5 o la IL2-Ry. Véase el ejemplo 14. Los productos que migran más abajo (indicados con flechas) son una medición directa de la disrupción del gen mediada por ZFN. «CNT» indica células no transducidas.
En la figura 14, los paneles A y B son gráficos que describen mediciones de citometría de flujo de la expresión de CCR5 en la superficie (figura 14A) o de la expresión de la GFP (figura 14B) de las células GHOST-CCR5 transducidas con un vector Ad5/35 que codifica ZFN 215 o ZFN 224. En la figura 14A se representa la disminución de la expresión de CCR5 en la superficie según se mide mediante citometría de flujo en las células GHOST-CCR5 transducidas con el vector indicado. CNT se refiere a células no transducidas; IL2R se refiere a las células que contienen las ZFN dirigidas específicamente a IL2Ry; 215 y 224 se refieren a las células que contienen la pareja ZFN 215 o la pareja ZFN 224, respectivamente. «IFM» indica intensidad de fluorescencia media. En la figura 14B se muestra la protección de la exposición al VIH-1BAL tal y como se midió mediante citometría de flujo 48 horas después de la exposición al VIH sobre las células modificadas CCR5-ZFN215 y CCR5-ZFN224 en comparación con IL-2Ry-ZFN y las células GHOST-CCR de control. La fluorescencia de GFP indica la entrada del VIH y está representada como un porcentaje medio de infectado respecto al control positivo. Las barras de los gráficos representan la media de un triplicado.
En la figura 15 se muestra el nivel de alelos de CCR que han sido alterados mediante ZFN, determinado mediante el ensayo Cel-1, los días 3, 10, 21, 31, 42 y 52 después de la exposición al VIH-1 con el VIH-1BAL R5-tropo o después de la infección simulada del VIH. Las células con alelos CCR5 interrumpidos permanecieron en una cantidad estable en los cultivos de infección simulada, pero se enriquecieron en presencia del VIH-1.
En la figura 16 se muestran las secuencias de los alelos de CCR-5 en las células PM1 tratadas con ZFN el día 52 después de la exposicón al VIH.
En la figura 17 se muestran los niveles de alelos de CCR5 interrumpidos mediante ZFN en los linfocitos T CD4 primarios de un donante sano anónimo transducidos con un vector Ad5/35 que expresa CCR5-ZFN215, CCR5-ZFN224 o GFP, a una MDI de 30 o 100, que se determinó mediante el ensayo nucleasa Surveyor™. Las bandas que corresponden a los alelos de CCR5 interrumpidos están indicadas mediante flechas. El porcentaje de alelos de CCR5 interrumpidos está indicado debajo de cada carril.
En la figura 18 se describe el tiempo de generación de los linfocitos T CD4 transducidos con vectores Ad5/35 cuyos genomas codificaban o bien las CCR5-ZFN o bien GFP (células de control). Las células se transdujeron con los vectores Ad5/35 el día 0. La línea que conecta los puntos mostrados mediante triángulos representa el tiempo de generación de las células no transducidas; la línea que conecta los puntos mostrados mediante cuadrados describe los tiempos de generación de las células transducidas con CCR5-ZFN 224 en Ad5/35; y la línea que conecta los puntos mostrados mediante rombos describe los tiempos de generación de las células transducidas con GFP en Ad5/35.
En la figura 19 se describe el enriquecimiento de alelos de CCR5 interrumpidos por la ZFN en los linfocitos T CD4+ transducidos con ZFN 215 a lo largo del tiempo después de la exposición in vitro al VIH-1US1 CCR5-tropo, en comparación con cultivos de infección simulada. La disrupción de CCR5 se midió con el ensayo nucleasa (Cel-1) Surveyor®. La línea que conecta los cuadrados representa las células infectadas con el VIH y la línea que conecta los triángulos representa las células de infección simulada. Se obtuvo un nivel inicial de aproximadamente el 10% de alelos de CCR5 interrumpidos mediante ZFN al mezclar los linfocitos T CD4 transducidos con Ad5/35 con linfocitos T CD4 sin modificar (1:3).
En la figura 20 hay un gráfico que representa los focos intranucleares medios de inmunotinción de P53BP1 en los linfocitos T CD4+ primarios, determinados 24 horas después de la transducción con los vectores Ad5/35 que expresan las parejas CCR5-ZFN 215 o 224. Se contaron los focos intranucleares desde un mínimo de 100 núcleos por condición utilizando el programa informático Velocity™. También se muestran los resultados obtenidos de las células de control positivo tratadas con etopósido y de las células de control negativo (no transducidas).
En la figura 21 hay un gráfico que representa la frecuencia de disrupción de CCR5 in vivo, medida con el ensayo nucleasa (Cel-1) Surveyor®, en los linfocitos CD4 aislados el día 40 a partir de los bazos de control (infección simulada) o de ratones infectados con el VIH. Los resultados de cada grupo se promediaron y se analizaron mediante la prueba de t unilateral.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Se describen en la presente memoria nucleasas con dedos de zinc (ZFN) que actúan selectivamente sobre el gen de CCR5 humano (CCR5-ZFN). Estas ZFN generan de forma eficaz una rotura bicatenaria (RBI), por ejemplo, en un sitio determinado en la región codificante de CCR5. El sitio puede estar, por ejemplo, cadena arriba de la mutación L32 de CCR5. La expresión transitoria de las ZFN descritas en la presente memoria favorece la disrupción permanente y muy eficaz del gen CCR5 en las células humanas, que incluyen los linfocitos T CD4 humanos primarios, confiere una protección robusta contra la infección del VIH-1 y proporciona una ventaja selectiva poderosa para estas células in vitro e in vivo.
En particular, la administración transitoria de las CCR5-ZFN da lugar a la disrupción permanente del gen de CCR5 humano con una eficacia que sobrepasa el 50% en los linfocitos T CD4 humanos primarios. La acción de la CCR5-ZFN es muy específica y se tolera bien, como se reveló mediante (i) el examen de las características de estabilidad, crecimiento e injerto de la subpoblación modificada por ZFN incluso en ausencia de selección, (ii) la tinción directa de los focos 53BP1 inducidos por las RBI intranucleares, y (iii) las pruebas de escisión en otros sitios genómicos que, sin ser la diana, guardan mucha similitud con la misma. Además, en presencia de presión selectiva en forma de una infección activa del VIH-1, la modificación por la ZFN confiere una ventaja abismal de supervivencia durante los ensayos de exposición in vitro al VIH-1 CCR5-tropo (pero no con el CXCR4-tropo) a niveles comparables a los obtenidos con células CCR5L32 homocigóticas.
La modificación del genoma mediada por CCR5-ZFN como la descrita en la presente memoria se puede emplear para generar un genotipo sin CCR5 en las células humanas primarias. Además, como cabría espera para cualquier rasgo determinado genéticamente, las células modificadas por ZFN mostraron una resistencia estable y heredable in vitro e in vivo a la infección del VIH-1.
Las estrategias basadas en moléculas pequeñas, intracuerpos. ARNi o antisentidos para el tratamiento del VIH a través de la disrupción de CCR5 reprimen o bloquean de forma incompleta el CCR5 a nivel del ARNm o de la proteína. Véase, Levine et al. (2006) Proc. Natl Acad. Sci. USA 103: 17372-17377; Trkola et al. (2002) Proc. Natl Acad. Sci. USA 99: 395-400). Por consiguiente, a diferencia de otras estrategias, las CCR5-ZFN descritas en la presente memoria generan una verdadera célula sin CCR5 que, al igual que la CCR5L32 seleccionada de forma natural, da negativo para CCR5 de forma permanente y completa, sobrevive preferiblemente a la infección del VIH-1 y da lugar a células hija que son igualmente resistentes a la infección del VIH-1. La modificación genética permanente mediante CCR5-ZFN bloquea la entrada del virus sin que se requiera la integración de ningún ADN foráneo en el genoma, ya que la administración y expresión transitorias del gen de ZFN es suficiente para eliminar la expresión de CCR5.
También se describen en la presente memoria vectores de adenovirus (Ad) que comprenden las ZFN y/o secuencias donadoras y células que comprenden estos vectores Ad. Estos vectores Ad son útiles en los métodos de escisión dirigida de cromatina celular y para la alteración dirigida de una secuencia nucleotídica celular, p. ej., mediante la escisión dirigida seguida por la unión de extremos no homólogos o mediante la escisión dirigida seguida por la recombinación homóloga entre un polinucleótido exógeno (que comprende una o más regiones de homología con la secuencia nucleotídica celular) y una secuencia genómica.
General
La práctica de los métodos, así como la preparación y el uso de las composiciones descritas en la presente memoria emplean, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de biología molecular, bioquímica, estructura y análisis de la cromatina, química computacional, cultivo celular, ADN recombinante y campos relacionados que se encuentran dentro de los conocimientos de la técnica. Estas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 y tercera edición, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Nueva York, 1987 y actualizaciones periódicas; la serie METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, tercera edición, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 304, «Chromatin» (P. M. Wassarman y A. P. Wolffe, eds), Academic Press, San Diego, 1999; y METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, vol. 119, «Chromatin protocols» (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.
Definiciones
Los términos «ácido nucleico», «polinucleótido» y «oligonucleótido» se utilizan indistintamente y se refieren a un polímero de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, en conformación lineal o circular, y tanto en forma monocatenaria como bicatenaria. Para los propósitos de la presente descripción, estos términos no se deben considerar como limitantes respecto a la longitud de un polímero. Los términos pueden abarcar análogos conocidos de nucleótidos naturales, así como nucleótidos que están modificados en la base, el azúcar y/o los fosfatos (p, ej., esqueletos de fosforotioato). En general, un análogo de un nucleótido determinado tiene la misma especificidad de apareamiento de bases; a saber, un análogo de A se emparejará con la base T.
Los términos «polipéptido», «péptido» y «proteína» se utilizan intercambiablemente para referirse a un polímero de restos aminoacídicos. El término también se aplica a polímeros de aminoácidos en los que uno o más aminoácidos son análogos químicos o derivados modificados de los correspondientes aminoácidos que se producen de forma natural.
«Unión» se refiere a una interacción no covalente específica de la secuencia entre macromoléculas (p. ej., entre una proteína y un ácido nucleico). No todos los componentes de una interacción de unión necesitan ser específicos de la secuencia (p. ej., contactos con restos de fosfato en un esqueleto de ADN), siempre y cuando la interacción en conjunto sea específica de la secuencia. Tales interacciones se caracterizan por lo general mediante una constante de disociación (Kd) de 10-6 M-1 o más baja. «Afinidad» se refiere a la fuerza de la unión: una mayor afinidad de unión se que correlaciona con una Kd más baja.
Una «proteína de unión» es una proteína que es capaz de unirse de forma no covalente a otra molécula. Una proteína de unión se puede unir a, por ejemplo, una molécula de ADN (una proteína de unión al ADN), una molécula de ARN (una proteína de unión al ARN) y/o una molécula de proteína (una proteína de unión a proteínas). En el caso de una proteína de unión proteínas, puede unirse a sí misma (para formar homodímeros, homotrímeros, etc.) y/o se puede unir a una o más moléculas de una o más proteínas diferentes. Una proteína de unión puede tener más de un tipo de actividad de unión. Por ejemplo, las proteínas con dedos de zinc tienen actividad de unión al ADN, de unión al ARN y de unión a las proteínas.
Una «proteína de unión al ADN con dedos de zinc» (o dominio de unión) es una proteína, o un dominio dentro de una proteína mayor, que se une al ADN de un modo específico de la secuencia a través de uno o más dedos de zinc, que son regiones de la secuencia de aminoácidos dentro del dominio de unión cuya estructura se estabiliza a través de la coordinación de un ion de zinc. El término proteína de unión al ADN con dedos de zinc se abrevia a menudo como proteína con dedos de zinc o ZFP.
Los dominios de unión de tipo dedo de zinc se pueden «modificar genéticamente» para que se unan a una secuencia nucleotídica determinada. Ejemplos no limitantes de los métodos para modificar genéticamente las proteínas con dedos de zinc son el diseño y la selección. Una proteína con dedo de zinc diseñada es una proteína que no se produce en la naturaleza cuyo diseño/composición es resultado principalmente de criterios racionales. Los criterios racionales para el diseño incluyen la aplicación de reglas de sustitución y de algoritmos computerizados para procesar información en una base de datos que almacena información de los diseños de ZFP y de los datos de unión existentes. Véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos 6 140 181; 6 453 242; y 6 534 261; véase también las patentes internacionales WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060, WO 02/016536 y WO 03/016496.
Una proteína con dedos de zinc «seleccionada» es una proteína que no se encuentra en la naturaleza cuya producción es resultado principalmente de un proceso empírico, tal como la presentación en fagos, la trampa de la interacción o la selección híbrida. Véase, p. ej., las patentes US 5 789 538; US 5 925 523; US 6 007 988; US 6 013 453; US 6 200 759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197 y WO 02/099084.
La terminología «secuencia» se refiere a una secuencia nucleotídica de cualquier longitud, que puede ser ADN o ARN; puede ser lineal, circular o ramificada y puede ser monocatenaria o bicatenaria. La terminología «secuencia donadora» se refiere a una secuencia nucleotídica que se inserta en un genoma. Una secuencia donadora puede tener cualquier longitud, por ejemplo, entre 2 y 10 000 nucleótidos de longitud (o cualquier valor entero entre ellos o por encima), preferentemente entre unos 100 y 1000 nucleótidos de longitud (o cualquier entero entre ellos), más preferentemente entre unos 200 y 500 nucleótidos de longitud.
Una «secuencia no idéntica homóloga» se refiere a una primera secuencia que comparte un grado de identidad de secuencia con una segunda secuencia, pero cuya secuencia no es idéntica a la de la segunda secuencia. Por ejemplo, un polinucleótido que comprende la secuencia de tipo silvestre de un gen mutante es homólogo y no idéntico a la secuencia del gen mutante. En algunas realizaciones, el grado de homología entre las dos secuencias es suficiente para permitir la recombinación homóloga entre ellas, utilizando los mecanismos celulares normales. Dos secuencias no idénticas homólogas pueden tener cualquier longitud y el grado de falta de homología puede ser tan pequeño como un único nucleótido (p. ej., para la corrección de una mutación puntual del genoma mediante la recombinación homóloga dirigida) o tan larga como 10 o más kilobases (p. ej., para la inserción de un gen en un sitio ectópico predeterminado en un cromosoma). Dos polinucleótidos que comprenden las secuencias no idénticas homólogas no necesitan tener la misma longitud. Por ejemplo, se puede utilizar un polinucleótido exógeno (a saber, polinucleótido donador) de entre 20 y 10 000 nucleótidos o pares de nucleótidos.
Las técnicas para determinar la identidad de secuencias de ácido nucleico y de secuencias de aminoácidos se conocen en la técnica. Típicamente, tales técnicas incluyen determinar la secuencia nucleotídica del ARNm de un gen y/o determinar la secuencia de aminoácidos codificada por éste, y comparar estas secuencias a una segunda secuencia de aminoácidos o nucleotídica. De este modo, también se pueden determinar las secuencias genómicas y compararlas. En general, la identidad se refiere a una correspondencia exacta nucleótido a nucleótido entre dos polinucleótidos, o aminoácido a aminoácido entre dos polipéptidos. Se pueden comparar dos o más secuencias (polinucleotídicas o aminoacídicas) mediante la determinación de su porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad de dos secuencias, bien sean secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos, es el número de coincidencias exactas entre dos secuencias alineadas dividido por la longitud de la secuencia más corta y multiplicado por 100. Un alineamiento aproximado para las secuencias de ácido nucleico se obtiene mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981). Este algoritmo se puede aplicar a las secuencias de aminoácidos utilizando la matriz de ponderación desarrollada por Dayhoff, Atlas of protein sequences and structure, M. O. Dayhoff, ed, supl. 5, 3: 353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D. C., EE.UU., y normalizada por Gribskov, Nucl. Acids. Res. 14 (6): 6745-6763 (1986). Una aplicación ejemplar de este algoritmo para determinar el porcentaje de identidad de una secuencia la proporciona la aplicación «BestFit» del paquete de programas del Genetics Computer Group (Madison, WI). Los parámetros por defecto para este método se describen en Wisconsin sequence analysis package program manual, versión 8 (1995) (disponible en el Genetics Computer Group, Madison, WI). Un método preferente para establecer el porcentaje de identidad en el contexto de la presente descripción es utilizar el paquete MPSRCH de programas con el copyright de la Universidad de Edinburgo, desarrollado por John F. Collins y Shane S. Sturrok, y distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). A partir de estas suites de paquetes se puede emplear el algoritmo de Smith-Waterman, en los que se utilizan los parámetros de defecto para la tabla de ponderación (por ejemplo, penalización de 12 por abrir un hueco, penalización de uno por extensión de hueco, y un hueco de seis). A partir de los datos generados, el valor de «coincidencia» refleja la identidad de secuencia. Otros programas adecuados para calcular el porcentaje de identidad o similitud entre secuencias se conocen por lo general en la técnica, por ejemplo, otro programa de alineamiento es BLAST, utilizado con los parámetros de defecto. Por ejemplo, se pueden utilizar BASTN y BLASTP con los siguientes parámetros de defecto: código genético = estándar; filtro = ninguno; hebra = ambas; valor de corte = 60; esperado = 10; matriz = BLOSUM62; descripciones = 50 secuencias; clasificado mediante = PUNTUACIÓN M�?S ALTA; bases de datos = no redundantes, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + traducciones de CDS de Genbank + SwissProt + Spupdate + PIR. Los detalles de estos programas se pueden encontrar en la siguiente dirección de internet: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST. Respecto a las secuencias descritas en la presente memoria, el intervalo de grados deseados de identidad de secuencia es aproximadamente del 80 al 100% y cualquier valor entero entre ellos. Típicamente, el porcentaje de identidad entre las secuencias es una identidad de secuencia de al menos el 70 al 75%, preferentemente del 80 al 82%, más preferentemente del 85 al 90%, incluso más preferentemente del 92%, aún más preferentemente del 95% y lo más preferentemente del 98%.
Alternativamente, el grado de similitud entre polinucleótidos se puede determinar mediante hibridación de polinucleótidos en condiciones que permiten la formación de dúplex estables entre regiones homólogas, seguido de la digestión con nucleasa(s) específicas de cadena sencilla, y la determinación del tamaño de los fragmentos digeridos. Dos ácidos nucleicos, o dos secuencias polipeptídicas, son sustancialmente homólogas una a otra cuando las secuencias muestran una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 70 al 75%, preferentemente del 80 al 82%, más preferentemente del 85 al 90%, incluso más preferentemente del 92%, aún más preferentemente del 95% y lo más preferentemente del 98%, sobre una longitud definida de las moléculas, lo que se determinó mediante los métodos anteriores. Tal y como se utiliza en la presente memoria, sustancialmente homólogo se refiere también a las secuencias que muestran una identidad completa con una secuencia de ADN o polipeptídica específica. Las secuencias de ADN que son sustancialmente homólogas se pueden identificar en un experimento de hibridación de tipo Southern en, por ejemplo, condiciones rigurosas, tal y como se definen para este sistema particular. Definir condiciones de hibridación apropiadas se encuentra dentro de los conocimientos del experto en la técnica. Véase, p. ej., Sambrook et al., supra; Nucleic acid hybridization: a practical approach, editores B. D. Hames y S. J. Higgins, (1985) Oxford; Washington DC; IRL Press).
La hibridación selectiva de dos fragmentos de ácido nucleico se puede determinar como sigue. El grado de identidad de secuencia entre dos moléculas de ácido nucleico afecta a la eficacia y a la fuerza de las hibridaciones entre tales moléculas. Una secuencia de ácido nucleico parcialmente idéntica inhibirá al menos parcialmente la hibridación de una secuencia completamente idéntica a una molécula diana. La inhibición de la hibridación de la secuencia completamente idéntica se puede evaluar mediante ensayos de hibridación que se conocen bien en la técnica (p. ej., transferencia (de ADN) de tipo Southern, transferencia (de ARN) de tipo Northern, hibridación en solución o similares, véase Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, segunda edición, (1989) Cold Spring Harbor, N. Y.). Tales ensayos se pueden llevar a cabo con distintos grados de selectividad, por ejemplo, con condiciones que varían de un rigor bajo a uno alto. Si se emplean condiciones poco rigurosas, se puede evaluar la ausencia de una unión inespecífica mediante una sonda secundaria que carece incluso de un grado parcial de identidad de secuencia (por ejemplo, una sonda que tiene una identidad de secuencia de menos de aproximadamente el 30% con la molécula diana) de tal forma que, en la ausencia de uniones inespecíficas, la sonda secundaria no se hibridará a la diana.
Al utilizar un sistema de detección basado en la hibridación se elige una sonda de ácido nucleico que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico de referencia y, luego, mediante la selección de las condiciones apropiadas, la sonda y la secuencia de referencia se hibridan, o se unen, selectivamente una a la otra para formar una molécula bicatenaria. Una molécula de ácido nucleico que es capaz de hibridarse selectivamente a una secuencia de referencia en condiciones de hibridación moderadamente rigurosas se hibrida típicamente en condiciones que permiten la detección de una secuencia de ácido nucleico diana de al menos aproximadamente 10 a 14 nucleótidos de longitud que tiene una identidad de secuencia de aproximadamente el 70% con la secuencia de la sonda del ácido nucleico seleccionado. Las condiciones de hibridación rigurosas típicamente permiten la detección de secuencias de ácido nucleico diana de al menos aproximadamente 10 a 14 nucleótidos de longitud que tiene una identidad de secuencia de más de aproximadamente el 90 al 95% con la secuencia de la sonda de ácido nucleico seleccionada. Las condiciones de hibridación útiles para la hibridación de la secuencia de la sonda/referencia, en donde la sonda y la secuencia de referencia tienen un grado específico de identidad de secuencia, se pueden determinar como se conoce en la técnica (véase, por ejemplo, Nucleic acid hybridization: a practical approach, editores B. D. Hames y S. J. Higgins, (1985) Oxford; Washington DC; IRL Press).
Las condiciones para la hibridación las conocen bien los expertos en la técnica. El rigor de la hibridación se refiere al grado al que las condiciones de hibridación no favorecen la formación de híbridos que contiene nucleótidos mal apareados, correlacionándose un rigor elevado con una menor tolerancia para los híbridos con apareamientos erróneos. Los factores que afectan al rigor de la hibridación los conocen bien los expertos en la técnica e incluyen, pero sin limitarse a ellos, la temperatura, el pH, la fuerza iónica y la concentración de disolventes orgánicos tales como, por ejemplo, formamida y dimetilsulfóxido. Como saben los expertos en la técnica, el rigor de la hibridación se incrementa a temperaturas más altas, a una fuerza iónica más baja y a unas concentraciones de disolvente más bajas.
Respecto a las condiciones rigurosas para la hibridación, se conoce bien en la técnica que se pueden emplear numerosas condiciones equivalentes para establecer un rigor particular variando, por ejemplo, los factores siguientes: la longitud y la naturaleza de las secuencias, la composición de las bases de las diferentes secuencias, la concentración de las sales y de otros componentes de la solución de hibridación, la presencia o la ausencia de los agentes bloqueantes en las soluciones de hibridación (p. ej., sulfato de dextrano y polietilenglicol), la temperatura de la reacción de hibridación y los parámetros del tiempo, así como diferentes condiciones de lavado. La selección de un conjunto particular de condiciones de hibridación se selecciona siguiendo los métodos estándares en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, segunda edición, (1989) Cold Spring Harbor, N. Y.).
La «recombinación» se refieren a un proceso de intercambio de información genética entre dos polinucleótidos. Para los propósitos de esta descripción, «recombinación homóloga (RH)» se refiere a la forma especializada de tal intercambio que tiene lugar, por ejemplo, durante la reparación de roturas bicatenarias en las células. Este proceso requiere homología entre las secuencias nucleotídicas, utiliza una molécula «donadora» para reparar la plantilla de una molécula «diana» (a saber, la que sufrió la rotura bicatenaria), y se conoce con nombres tales como «conversión génica sin retrocruzamiento» o «conversión génica de un segmento corto», porque conduce a la transferencia de información genética del donador a la diana. Sin desear comprometerse con ninguna teoría en particular, tal transferencia puede implicar la corrección de los apareamientos erróneos del ADN heterodúplex que se forman entre la diana rota y el donador, y/o la «hibridación de la hebra dependiente de la síntesis», en la que se utiliza el donador para volver a sintetizar la información genética que formará parte de la diana, y/o los procesos relacionados. Tal RH especializada a menudo da lugar a una alteración de la secuencia de la molécula diana de tal forma que parte o toda la secuencia del polinucleótido donador se incorpora en el polinucleótido diana.
«Escisión» se refiere a la rotura del esqueleto covalente de una molécula de ADN. La escisión se puede iniciar mediante una serie de métodos que incluyen, pero sin limitarse a ellos, la hidrólisis enzimática o química de un enlace fosfodiéster. Se pueden escindir tanto una sola hebra como las dos hebras, y la escisión de las dos hebras se puede producir como resultado de dos escisiones monocatenarias diferentes. La escisión del ADN da lugar a la producción de extremos romos o de extremos cohesivos. En algunas realizaciones se utilizan polipéptidos de fusión para la escisión del ADN bicatenario diana.
Un «semidominio de escisión» es una secuencia polipeptídica que, junto con un segundo polipéptido (idéntico o diferente) forma un complejo que tiene actividad de escisión (preferentemente actividad de escisión bicatenaria). Las terminologías «primer y segundo semidominio de escisión», «semidominios de escisión + y –» y «semidominios de escisión derecha e izquierda» se utilizan indistintamente para referirse a las parejas de semidominios de escisión que se dimerizan.
Un «semidominio de escisión modificado genéticamente» es un semidominio de escisión que se ha modificado para formar heterodímeros estrictos con otro semidominio de escisión (p. ej., otro semidominio de escisión modificado genéticamente). Véanse también las publicaciones de patente de los EE.UU. n.º 20050064474 y 20060188987 y la solicitud provisional de patente de los EE.UU. n.º 60/808 486 (registrada el 25 de mayo de 2006).
«Cromatina» es la estructura nucleoproteica que comprende el genoma celular. La cromatina celular comprende el ácido nucleico, principalmente el ADN, y las proteínas, que incluyen las proteínas cromosómicas histónicas y no histónicas. La mayor parte de la cromatina celular eucariótica existe en forma de nucleosomas, en la que un núcleo del nucleosoma comprende aproximadamente 150 pares de bases de ADN asociados a un octámero que comprende dos de cada una de las histonas H2A, H2B, H3 y H4; y el ADN conector (de longitud variable según el organismo) se extiende entre los núcleos del nucleosoma. Una molécula de histona H1 se asocia por lo general al ADN conector. Para los propósitos de la presente descripción, la terminología «cromatina» se quiere que abarque todos los tipos de nucleoproteínas celulares, tanto procariotas como eucariotas. La cromatina celular incluye la cromatina cromosómica y la episómica.
Un «cromosoma» es un complejo de cromatina que comprende todo o una porción del genoma de una célula. El genoma de una célula se caracteriza a menudo por su cariotipo, que es el conjunto de los cromosomas que comprenden el genoma de la célula. El genoma de una célula puede comprender uno o más cromosomas.
Un «episoma» es un ácido nucleico, un complejo nucleoproteico u otra estructura, todos con capacidad de replicación, que comprende un ácido nucleico que no forma parte del cariotipo cromosómico de una célula. Ejemplos de episomas incluyen los plásmidos y determinados genomas víricos.
Una «región accesible» es un sitio en la cromatina celular en la cual un sitio diana presente en el ácido nucleico puede estar unido por una molécula exógena que reconoce el sitio diana. Sin desear comprometerse con ninguna teoría en particular, se cree que una región accesible es una que no está empaquetada en una estructura nucleosómica. La estructura diferente de una región accesible se puede detectar a menudo por su sensibilidad a las sondas químicas y enzimáticas, por ejemplo, a las nucleasas.
Un «sitio diana» o «secuencia diana» es una secuencia de ácido nucleico que define una porción de un ácido nucleico al que se unirá una molécula de unión, siempre y cuando se den las condiciones suficientes para la unión. Por ejemplo, la secuencia 5'-GAATTC3' es un sitio diana para la endonucleasa de restricción EcoRI.
Una molécula «exógena» es una molécula que normalmente no está presente en una célula, pero que se puede introducir en una célula mediante uno o más métodos genéticos, bioquímicos o de otro tipo. La «presencia normal en la célula» se determina respecto a la etapa de desarrollo particular y a las condiciones del entorno de la célula. Así, por ejemplo, una molécula que está presente sólo durante el desarrollo embrionario del músculo es una molécula exógena respecto a una célula del músculo adulto. De igual forma, una molécula inducida por choque térmico es una molécula exógena respecto a una célula sin someter a choque térmico. Una molécula exógena puede comprender, por ejemplo, una versión funcional de una molécula endógena que funciona mal o una versión que funciona mal de una molécula endógena que funciona con normalidad.
Una molécula exógena puede ser, entre otras cosas, una molécula pequeña, que se genera mediante un procedimiento de química combinatoria, o una macromolécula tal como una proteína, ácido nucleico, glúcido, lípido, glucoproteína, lipoproteína, polisacárido, cualquier derivado modificado de las moléculas anteriores, o cualquier complejo que comprende una o más de las moléculas anteriores. Los ácidos nucleicos incluyen ADN y ARN, pueden ser mono- o bicatenarios; pueden ser lineales, ramificados o circulares; y pueden tener cualquier longitud. Los ácidos nucleicos incluyen los que son capaces de formar estructuras bicatenarias así como los ácidos nucleicos que forman estructuras tricatenarias. Véanse, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. n.º 5 176 996 y 5 422 251. Las proteínas incluyen, pero sin limitarse a ellas, proteínas de unión al ADN, factores de transcripción, factores de remodelación de la cromatina, proteínas de unión al ADN metilado, polimerasas, metilasas, desmetilasas, acetilasas, desacetilasas, cinasas, fosfatasas, integrasas, recombinasas, ligasas, topoisomerasas, girasas y helicasas.
Una molécula exógena puede ser el mismo tipo de molécula que una molécula endógena, p. ej., una proteína o ácido nucleico exógenos. Por ejemplo, un ácido nucleico exógeno puede comprender un genoma vírico infectivo, un plásmido o episoma introducido en una célula, o un cromosoma que normalmente no está presente en la célula. Los métodos para la introducción de las moléculas exógenas en las células los conocen los expertos en la técnica e incluyen, pero sin limitarse a ellos, la transferencia mediante lípidos (a saber, liposomas, que incluyen lípidos neutros y catiónicos), electroporación, inyección directa, fusión celular, bombardeo de partículas, coprecipitación con fosfato de calcio, transferencia mediante dextrano-DEAE y transferencia mediante vectores víricos.
Por el contrario, una molécula «endógena» es una que normalmente está presente en una célula determinada en una etapa particular del desarrollo en condiciones medioambientales concretas. Por ejemplo, un ácido nucleico endógeno puede comprender un cromosoma, el genoma de una mitocondria, de un cloroplasto o de otro orgánulo, o un ácido nucleico episómico que se produce de forma natural. Otras moléculas endógenas pueden incluir proteínas, por ejemplo, factores de transcripción y enzimas.
Una molécula de «fusión» es una molécula en la que dos o más subunidades moleculares están conectadas, preferentemente mediante enlace covalente. Las moléculas de las subunidades pueden ser del mismo tipo químico de molécula, o pueden ser de diferentes tipos químicos de moléculas. Ejemplos del primer tipo de molécula de fusión incluyen, pero sin limitarse a ellas, proteínas de fusión (por ejemplo, una fusión entre un dominio de unión al ADN de ZFP y un dominio de escisión) y ácidos nucleicos de fusión (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión descrita más arriba). Ejemplos del segundo tipo de molécula de fusión incluyen, pero sin limitarse a ellas, una fusión entre un ácido nucleico que forma una estructura triple y un polipéptido, y una fusión entre una molécula que se une por el surco menor y un ácido nucleico.
La expresión de una proteína de fusión en una célula puede ser resultado de la introducción de la proteína de fusión en la célula o mediante la introducción de un polinucleótido que codifica la proteína de fusión a una célula, en donde se transcribe el polinucleótido, y se traduce el transcrito, para generar la proteína de fusión. El transayuste, la escisión de polipéptidos y la ligación de polipéptidos también pueden estar implicados en la expresión de una proteína en una célula. Los métodos para la introducción del polinucleótido y del polipéptido en las células se presentan en otra parte de esta descripción.
Un «gen», para los propósitos de la presente descripción, incluye una región de ADN que codifica un producto génico (véase más abajo) así como todas las regiones de ADN que regulan la producción del producto génico, tanto si tales secuencias reguladoras están adyacentes a secuencias codificantes y/o transcritas, como si no lo están. Por consiguiente, un gen incluye, pero no se limita necesariamente a ellos, secuencias promotoras, terminadores, secuencias reguladoras de la traducción tales como sitios de unión del ribosoma y sitios internos de entrada del ribosoma, potenciadores, silenciadores, aisladores, elementos delimitadores, orígenes de replicación, sitios de adhesión a la matriz y regiones de control del locus.
La «expresión génica» se refiere a la conversión de la información, contenida en un gen, en un producto génico. Un producto génico puede ser el producto transcripcional directo de un gen (p. ej., ARNm, ARNt, ARNr, ARN antisentido, ribozima, ARN estructural o cualquier otro tipo de ARN) o una proteína producida por la traducción de un ARNm. Los productos génicos también incluyen ARN que se modifican mediante procesos tales como formación de la caperuza, poliadenilación, metilación y riboedición, y proteínas modificadas mediante, por ejemplo, metilación, acetilación, fosforilación, ubicuitinación, ADP-ribosilación, miristoilación y glucosilación.
La «modulación» de la expresión génica se refiere a un cambio en la actividad de un gen. La modulación de la expresión puede incluir, pero sin limitarse a ellas, la activación génica y la represión génica.
Las células «eucariotas» incluyen, pero sin limitarse a ellas, células de hongos (tales como levadura), células vegetales, células animales, células de mamíferos y células de humanos (p. ej., linfocitos T).
Una «región de interés» es cualquier región de cromatina celular, tal como, por ejemplo, un gen o una secuencia no codificante dentro de un gen o adyacente a él, en la que es deseable que se una una molécula exógena. La unión puede ser para los propósitos de la escisión dirigida del ADN y/o de la recombinación dirigida. Una región de interés puede estar presente en un cromosoma, un episoma, un genoma organular (p. ej., mitocondrial, cloroplástico) o un genoma vírico infectivo, por ejemplo. Una región de interés puede estar dentro de la región codificante de un gen, dentro de las regiones no codificantes transcritas tales como, por ejemplo, secuencias líder, secuencias remolque o intrones, o dentro de las regiones no transcritas, tanto secuencia arriba como secuencia abajo de la región codificante. Una región de interés puede ser tan pequeña como un único par de nucleótidos o de hasta 2000 pares de nucleótidos de longitud, o cualquier valor entero de pares de nucleótidos.
Las terminologías «unión operativa» y «operativamente unido» (o «unido operativamente») se utilizan indistintamente con referencia a una yuxtaposición de dos o más componentes (tales como elementos de secuencia), en la que los componentes se ordenan de tal forma que ambos componentes funcionan con normalidad y permiten la posibilidad de que al menos uno de los componentes pueda intervenir en una función que se ejerce sobre al menos uno de los otros componentes. A modo de ilustración, una secuencia reguladora transcripcional, tal como un promotor, está unido operativamente a una secuencia codificante si la secuencia reguladora de la transcripción controla el nivel de transcripción de la secuencia codificante en respuesta a la presencia o ausencia de uno o más factores de regulación transcripcional. Una secuencia de regulación transcripcional está generalmente unida operativamente en cis a una secuencia codificante, pero necesita estar directamente adyacente a ella. Por ejemplo, un potenciador es una secuencia reguladora de la transcripción que está unida operativamente a una secuencia codificante, incluso aunque no sean contiguas.
Respecto a los polipéptidos de fusión, la terminología «operativamente unido» se puede referir al hecho de que cada uno de los componentes desempeña la misma función en unión a otro componente, que si no estuviesen así unidos. Por ejemplo, respecto a un polipéptido de fusión en el que el dominio de unión al ADN de ZFP está fusionado a un dominio de escisión, el dominio de unión al ADN de ZFP y el dominio de escisión se encuentran operativamente unidos si, en el polipéptido de fusión, la porción del dominio de unión al ADN de ZFP es capaz de unirse a su sitio diana y/o su sitio de unión, mientras que el dominio de escisión es capaz de escindir el ADN en la vecindad del sitio diana.
Un «fragmento funcional» de una proteína, polipéptido o ácido nucleico es una proteína, polipéptido o ácido nucleico cuya secuencia no es idéntica a la proteína, polipéptido o ácido nucleico de longitud completa, mientras que conserva la misma función que la proteína, polipéptido o ácido nucleico de longitud completa. Un fragmento funcional puede poseer más, menos, o el mismo número de restos que la correspondiente molécula nativa, y/o puede contener una o más sustituciones de aminoácidos o nucleótidos. Los métodos para determinar la función de un ácido nucleico (p. ej., función codificante, capacidad para hibridarse a otro ácido nucleico) se conocen bien en la técnica. De igual forma, se conocen bien los métodos para determinar la función de la proteína. Por ejemplo, la función de unión al ADN de un polipéptido se puede determinar, por ejemplo, mediante unión a filtro, cambio de la movilidad electroforética o ensayos de inmunoprecipitación. La escisión del ADN se puede ensayar mediante electroforesis en gel. Véase Ausubel et al., más arriba. La capacidad de una proteína para interaccionar con otra proteína se puede determinar, por ejemplo, mediante coinmunoprecipitación, ensayos de doble híbrido o de complementación, tanto genéticos como bioquímicos. Véase, por ejemplo, Fields et al. (1989) Nature 340: 245-246; patente de los EE.UU. n.º 5 585 245 y patente internacional PCT WO 98/44350.
Nucleasas con dedos de zinc
Se describen en la presente memoria nucleasas con dedos de zinc (ZFN) que se pueden usar para la inactivación génica, por ejemplo, la inactivación del gen de CCR5. Las ZFN comprenden una proteína con dedos de zinc (ZFP) y un dominio nucleasa (de escisión).
A. Proteínas con dedos de zinc
Los dominios de unión de tipo dedo de zinc se pueden modificar genéticamente para que se unan a una secuencia de elección. Véase, por ejemplo, Beerli et al., (2002) Nature Biotechnol.. 20: 135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70: 313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19: 656-660; Segal et al., (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12: 632-637; Choo et al., (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10: 411-416. Un dominio de unión de tipo dedo de zinc modificado genéticamente puede tener una nueva especificidad de unión, en comparación con una proteína con dedos de zinc que se produce de forma natural. Los métodos de modificación genética incluyen, pero sin limitarse a ellos, el diseño racional y diversos tipos de selección. El diseño racional incluye, por ejemplo, utilizar bases de datos que comprenden secuencias de nucleótidos de tripletes (o cuadrupletes) y secuencias de aminoácidos individuales de dedos de zinc, en las que cada secuencia de nucleótidos de triplete o cuadruplete está asociada a una o más secuencias de aminoácidos de dedos de zinc que se unen a la secuencia triplete o cuadruplete particular. Véase, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. en copropiedad 6 453 242 y 6 534 261, incorporadas por referencia en la presente memoria en su totalidad.
Los métodos de selección de ejemplo, incluidos los sistemas de exposición en fagos y los sistemas de doble híbrido, se describen en las patentes de los EE.UU. 5 789 538; 5 925 523; 6 007 988; 6 013 453; 6 410 248; 6 140 466; 6 200 759; y 6 242 568; así como las patentes internacionales WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 y la patente de Gran Bretaña GB 2 338 237.
La mejora de la especificidad de unión para los dominios de unión de tipo dedo de zinc se ha descrito, por ejemplo, en la patente internacional en copropiedad WO 02/077227.
La selección de los sitios diana, las ZFP y los métodos para el diseño y la construcción de proteínas de fusión (y los polinucleótidos que las codifican) los conocen los expertos en la técnica y se describen en detalle sobre la base de los números de publicación de los EE.UU. 20030232410; 20050208489; 2005064474; 20050026157; 20060188987; la publicación de patente internacional WO 07/014275; las solicitudes de patente de los Estados Unidos 10/587 723 (registrada el 27 de julio de 2006); 11/493 423 (registrada el 26 de julio de 2006).
En algunas realizaciones, las nucleasas con dedos de zinc de los vectores Ad-ZFN descritas en la presente memoria se unen a un gen de CCR-5. La tabla 1 describe una serie de dominios de unión de tipo dedo de zinc que se han modificado genéticamente para que se unan a secuencias nucleotídicas en el gen del CCR-5 humano. Cada fila describe un dominio particular de unión al ADN de tipo dedo de zinc. La secuencia diana del ADN para cada dominio se muestra en la primera columna (los sitios diana del ADN están indicados con letras mayúsculas; los nucleótidos no contactados están indicados en minúsculas), y desde la segunda hasta la quinta columnas se muestran la secuencia de aminoácidos de la región de reconocimiento (aminoácidos –1 a +6, con respecto al comienzo de la hélice) de cada uno de los dedos de zinc (F1 a F4) en la proteína. También se proporciona en la primera columna un número de identificación para cada proteína.
Tabla 1: nucleasas con dedos de zinc dirigidas al gen del CCR-5 humano
Diseños r162
Secuencia diana
F1 F2 F3 F4
5 Diseños 168
Secuencia diana
F1 F2 F3 F4
Diseños r627
Secuencia diana
F1 F2 F3 F4
Diseños 633
Secuencia diana
F1 F2 F3 F4
5 Como se describe más abajo, en algunas realizaciones, un dominio de unión con cuatro dedos como se muestra en la tabla 1 se fusiona a un semidominio de escisión, de tal forma que, por ejemplo, el dominio de escisión de una endonucleasa de restricción de tipo IIs tal como FokI. Para la escisión dirigida se utiliza una pareja de tales fusiones de semidominio nucleasa con dedos de zinc, como se describe, por ejemplo, en la publicación de patente de los EE.UU. n.º 20050064474 (n.º de serie de solicitud 10/912 932). Por ejemplo, ZFN-215 representa la pareja de
10 proteínas de fusión que contiene los dominios de unión de tipo dedo de zinc designados 8267 (que reconoce la secuencia diana mostrada en la SEQ ID n.º 1 y que comprende las 4 hélices de reconocimiento descritas en las SEQ ID n.º 2, 6, 4 y 8) y 8196z (que reconoce la secuencia diana mostrada en la SEQ ID n.º 9 y que comprende las 4 hélices de reconocimiento descritas en las SEQ ID n.º 10, 17, 12 y 13). ZFN-201 representa la pareja de proteínas de fusión que contiene los dominios de unión de tipo dedo de zinc denominados 8266 (que reconoce la secuencia
15 diana mostrada en la SEQ ID n.º 1 y comprende las 4 hélices de reconocimiento descritas en las SEQ ID n.º 2, 2, 4 y 8) y 8196z (que reconoce la secuencia diana mostrada en la SEQ ID n.º 9 y comprende las 4 hélices de reconocimiento descritas en las SEQ ID n.º 10, 17, 12 y 13).
Para la escisión dirigida, los extremos cercanos a los sitios de unión pueden estar separados por 5 o más pares de nucleótidos, y cada una de las proteínas de fusión puede unirse a una hebra opuesta del ADN diana. Por 20 consiguiente, cualquiera de las proteínas identificadas como un «diseño r162» en la tabla 1 (lo que indica que se une a la hebra inversa y que el extremo secuencia abajo de su sitio de unión está en el nucleótido 162) se pueden emparejar con cualquiera de las proteínas identificadas como un «diseño 168» (lo que indica que se une a la hebra opuesta a la que se unen los diseños r162 u que el extremo secuencia arriba de su sitio de unión se encuentra en el nucleótido 168). Por ejemplo, la proteína 8267 se puede emparejar con la proteína 8196 o con la proteína 8196z o
25 con cualquier otro de los diseños 168; y la proteína 8266 se puede emparejar con cualquiera de las proteínas 8196 o 8196z o con cualquier otro de los diseños 168. Todas las combinaciones de dos en dos de los diseños r162 y 168 se pueden utilizar para la escisión dirigida y para la mutagénesis de un gen de CCR-5. De igual forma, la proteína 7524 (o cualquier otro diseño r627) se puede utilizar junto con la proteína 8040 (o cualquier otro diseño 633) para obtener la escisión dirigida y la mutagénesis de un gen de CCR-5.
30 Las CCR5-ZFN descritas en la presente memoria son capaces de actuar selectivamente sobre cualquier secuencia de CCR5 en el genoma. Por ejemplo, las secuencias genómicas de CCR5 (incluidas las variantes alélicas tales como CCR5-L32) se conocen bien en la técnica y los individuos homocigotos para CCR5-L32 (véase. p. ej., Liu et al (1996) Cell 367-377) son resistentes a la infección del VIH-1.
B. Dominios de escisión
35 Las ZFN también comprenden una nucleasa (dominio de escisión, semidominio de escisión). La porción del dominio de escisión de las proteínas de fusión descritas en la presente memoria se pueden obtener de cualquier endonucleasa o exonucleasa. Las endonucleasas de ejemplo de las cuales se puede obtener un dominio de escisión incluyen, pero sin limitarse a ellas, endonucleasas de restricción y endonucleasas de asentamiento. Véase, por ejemplo, el catálogo 2002-2003 de New England Biolabs, Beverly, MA; y Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:
40 3379-3388. Se conocen otras enzimas que escinden el ADN (p. ej., nucleasa S1; nucleasa de la soja verde; ADNasa I pancreática; nucleasa microcócica; endonucleasa HO de levadura; véase también Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Una o más de estas enzimas (o fragmentos funcionales de las mismas) se pueden usar como fuente de dominios de escisión y semidominios de escisión.
De igual forma, un semidominio de escisión puede proceder de cualquier nucleasa o porción de la misma, como se
45 mencionó más arriba, que requiera la dimerización para la actividad de escisión. En general, se requieren dos proteínas de fusión para la escisión si las proteínas de fusión comprenden semidominios de escisión.
Alternativamente, se puede utilizar una única proteína que comprende dos semidominios de escisión. Los dos semidominios de escisión pueden proceder de la misma endonucleasa (o de fragmentos funcionales de la misma), o cada semidominio de escisión puede proceder de una endonucleasa diferente (o fragmentos funcionales de la misma). Además, los sitios diana para las dos proteínas de fusión están preferentemente dispuestos, uno con respecto al otro, de tal forma que la unión de las dos proteínas de fusión a sus respectivos sitios diana coloca los semidominios de escisión en una orientación espacial de uno respecto al otro que permite que los semidominios de escisión formen un dominio de escisión funcional, p. ej., mediante dimerización. Por consiguiente, en algunas realizaciones, los extremos cercanos de los sitios diana están separados por 5 a 8 nucleótidos o por 15 a 18 nucleótidos. Sin embargo, cualquier número entero de nucleótidos o pares de nucleótidos puede intercalarse entre dos sitios diana (p. ej., de 2 a 50 pares de nucleótidos o más). En general, el sitio de escisión se localiza entre los sitios diana.
Las endonucleasas de restricción (enzimas de restricción) están presentes en muchas especies y son capaces de unirse a secuencias específicas del ADN (en un sitio de reconocimiento), y escindir el ADN en el sitio de unión o cerca de él. Determinadas enzimas de restricción (p. ej., de tipo IIS) escinden el ADN en los sitios retirados del sitio de reconocimiento y tienen unos dominios de escisión y unión separables. Por ejemplo, la enzima de tipo IIS FokI cataliza la escisión bicatenaria del ADN a 9 nucleótidos de su sitio de reconocimiento en una hebra y a 13 nucleótidos de su sitio de reconocimiento en la otra. Véase, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. n.º 5 356 802; 5 436 150 y 5 487 994; así como Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci USA 89: 4275-4279; Li et al (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2764-2768; Kim et al., (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269: 31978-31982. Por lo tanto, en una realización, las proteínas de fusión comprenden el dominio de escisión (o semidominio de escisión) de al menos una enzima de restricción de tipo IIS y uno o más dominios de unión de tipo dedo de zinc, que pueden o no estar modificados genéticamente.
Una enzima de restricción de tipo IIS de ejemplo, cuyo dominio de escisión es separable del dominio de unión, es Fok I. Esta enzima en particular es activa en forma de dímero. Bitinaite et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10570-10575. Por consiguiente, para los propósitos de la presente descripción, la porción de la enzima FokI utilizada en las proteínas de fusión descritas se considera un semidominio de escisión. Por lo tanto, para la escisión bicatenaria dirigida y/o el reemplazo dirigido de secuencias celulares mediante fusiones de dedos de zinc con FokI, se pueden utilizar dos proteínas de fusión, cada una comprendiendo un semidominio de escisión de FokI, para reconstruir un dominio de escisión catalíticamente activo. Alternativamente, también se puede utilizar una molécula polipeptídica única que contiene un dominio de unión de tipo dedos de zinc y dos semidominios de escisión de FokI. En otra parte de esta descripción se dan a conocer los parámetros para la escisión dirigida y la alteración dirigida de la secuencia mediante fusiones de dedos de zinc con FokI.
Un dominio de escisión o semidominio de escisión puede ser cualquier porción de una proteína que conserva la actividad de escisión, o que conserva la capacidad para multimerizarse (p. ej., dimerizarse) para formar un dominio de escisión funcional.
En la publicación de patente internacional WO 07/014275 se describen enzimas de restricción de tipo IIS de ejemplo. Otras enzimas de restricción también contienen dominios de unión y escisión separables, y se contemplan en la presente descripción. Véase, por ejemplo, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids. Res. 31: 418-420.
En algunas realizaciones, el dominio de escisión comprende uno o más semidominios de escisión modificados genéticamente (también denominados mutantes del dominio de dimerización) que disminuyen al mínimo o impiden la homodimerización, como se describe, por ejemplo, en las publicaciones de patente de los EE.UU. n.º 20050064474 y 20060188987 (n.º de serie de solicitud 10/912 932 y 11/304 981, respectivamente) y en la solicitud de patente provisional de los EE.UU. n.º 60/808 486 (registrada el 25 de mayo de 2006). Los restos de aminoácidos en las posiciones 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 y 538 de FokI son todos dianas que influyen en la dimerización de los semidominios de escisión de FokI.
Semidominios de escisión de FokI de ejemplo modificados genéticamente que forman heterodímeros estrictos incluyen una pareja en la que un primer semidominio de escisión incluye mutaciones en los restos de aminoácidos de las posiciones 490 y 538 de FokI y un segundo semidominio de escisión incluye mutaciones en los restos de aminoácidos 486 y 499. Véanse las figuras 2, 3 y 4.
Así pues, en una realización, tal y como se muestra en las figuras 3 y 4, la mutación en 490 reemplaza Glu (E) por Lys (K); la mutación en 538 reemplaza Ile (I) por Lys (K); la mutación en 486 reemplaza Gln (Q) por Glu (E); y la mutación en la posición 499 reemplaza Ile (I) por Lys (K). Específicamente, los semidominios de escisión modificados genéticamente descritos en la presente memoria se prepararon mutando las posiciones 490 (E�K) Y 538 (I�K) en un semidominio de escisión para producir un semidominio de escisión modificado genéticamente denominado «E490K:I538K» y mutando las posiciones 486 (Q�E) y 499 (I�L) en otro semidominio de escisión para producir un semidominio de escisión modificado genéticamente denominado «Q486E:I499L». Los semidominios de escisión modificados genéticamente descritos en la presente memoria son mutantes heterodiméricos estrictos en los que la escisión aberrante se disminuye al mínimo o suprime. Véase, p. ej., el ejemplo 1 de la solicitud provisional de patente de los EE.UU. n.º 60/808 486 (registrada el 25 de mayo de 2006).
Los semidominios de escisión modificados genéticamente descritos en la presente memoria se pueden preparar mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, mediante mutagénesis específica de sitio de semidominios de escisión de tipo silvestre (FokI) como se describe en la publicación de patente de los EE.UU. n.º 20050064474 (n.º de serie 10/912 932, ejemplo 5) y la solicitud provisional de patente de los EE.UU. de n.º de serie 60/721 054 (ejemplo 38).
C. Otros métodos para la escisión específica de CCR5
Se puede utilizar cualquier nucleasa que tenga un sitio diana en un gen de CCR5 en los métodos y los usos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, las endonucleasas de asentamiento y las meganucleasas tienen secuencias de reconocimiento muy largas, algunas de las cuales es probable que estén presentes, mediante cálculos estadísticos, una vez en un genoma de tamaño humano. Cualquier nucleasa que tenga un único sitio diana en un gen CCR5 se puede utilizar en vez de, o además de, una nucleasa con dedos de zinc, para la escisión dirigida en un gen de CCR5.
Las endonucleasas de asentamiento de ejemplo incluyen I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII y I-TevIII. Se conocen sus secuencias de reconocimiento. Véanse también la patente de los EE.UU. n.º 5 420 032; la patente de los EE.UU. n.º 6 833 252; Belfort et al., (1997) Nucleic Acids. Res. 25: 3379-3388; Dujon et al., (1989) Gene 82: 115-118; Perler et al. (1994) Nucleic. Acids. Res. 22, 11251127; Jasin (1996) Trends Genet. 12: 224-228; Gimble et al., (1996) J. Mol. Biol. 263: 163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol., 280: 345-353 y el catálogo de New England Biolabs.
Aunque la especificidad de escisión de la mayoría de endonucleasas de asentamiento no es absoluta respecto a su sitios de reconocimiento, los sitios tienen una longitud suficiente de modo que se puede obtener una única escisión por genoma de tamaño de mamífero al expresar una endonucleasa de asentamiento en una célula que contiene una única copia de su sitio de reconocimiento. También se ha descrito que la especificidad de las endonucleasas de asentamiento y de las meganucleasas se puede modificar genéticamente para unirse a sitios diana no naturales. Véase, por ejemplo, Chevalier et al., (2002) Molec. Cell 10: 895-905; Epinat et al., (2003) Nucleic Acids. Res. 31: 2952-2962; Ashworh et al., (2006) Nature 441: 656-659; Paques et al., (2007) Current Gene Therapy 7: 49-66.
Envío al interior celular
Las ZFN descritas en la presente memoria se pueden introducir en una célula diana mediante cualquier medio adecuado. Los métodos para introducir proteínas que comprenden dedos de zinc se describen, por ejemplo, en las patentes de los EE.UU. n.º 6 453 242; 6 503 717; 6 534 261; 6 599 692; 6 607 882; 6 689 558; 6 824 978; 6 933 113; 6 979 539; 7 013 219; y 7 163 824.
Las ZFN como las descritas en la presente memoria también se pueden introducir mediante vectores que contienen secuencias que codifican una o más ZFN. Se puede utilizar cualesquiera sistemas de vector que incluyen, pero sin limitarse a ellos, vectores plasmídicos, vectores retrovíricos, vectores lentivíricos, vectores adenovíricos, vectores del virus de la viruela; vectores del virus del herpes y vectores de virus adenoasociados, etc. Véanse también las patentes de los EE.UU. n.º 6 534 261; 6 607 882; 6 824 978; 6 933 113; 6 979 539; 7 013 219; y 7 163 824.
En determinadas realizaciones, el vector es un vector de adenovirus. Así pues, en la presente memoria se describen vectores de adenovirus (Ad) para introducir secuencias heterólogas (p. ej., nucleasas con dedos de zinc [ZFN]) en las células.
Los ejemplos no limitantes de vectores Ad que se pueden utilizar en la presente solicitud incluyen vectores Ad recombinantes (tal como los que carecen de E1), vectores Ad capaces de replicarse condicionalmente (tal como oncolíticos) y/o capaces de replicarse procedentes de serotipos humanos o no humanos (p. ej., Ad5, Ad11, Ad35 o adenovirus 3 porcino); y/o vectores Ad quiméricos (tal como Ad5/35) o vectores Ad con tropismo alterado con proteínas de la fibra (p. ej., botón o fuste) modificadas genéticamente (tales como inserción peptídica dentro del bucle H1 de la proteína del botón). También son útiles los vectores Ad «cobardes», p. ej., un vector Ad del que se han retirado todos los genes de adenovirus para reducir la inmunogenia e incrementar el tamaño del ADN que pueden portar. Esto permite, por ejemplo, la introducción simultánea de secuencias que codifican las ZFN y una secuencia donadora. Tales vectores cobardes son especialmente útiles cuando las secuencias donadoras incluyen transgenes grandes que se tienen que integrar mediante integración dirigida.
Los vectores adenovíricos (Ad) recombinantes incapaces de replicarse se pueden producir con una titulación elevada, y pueden infectar fácilmente numerosos tipos diferentes de células. La mayor parte de los vectores de adenovirus se modifican genéticamente de tal forma que un transgén reemplaza los genes AdE1a, E1b y/o E3; posteriormente, el vector de replicación defectuosa se propaga en las células que proporcionan en trans una o más de las funciones de los genes eliminados. Por ejemplo, las células 293 humanas aportan la función de E1. Los vectores Ad son capaces de transducir varios tipos de tejidos in vivo, incluidas las células diferenciadas que no se dividen, como las que se hallan en el hígado, riñón y músculo. Los vectores Ad convencionales tienen una gran capacidad de transporte. Un ejemplo del uso de un vector Ad en un ensayo clínico implicó el tratamiento con polinucleótidos para la inmunización antitumoral con inyección intramuscular (Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7: 1083-1089 [1998]).
Otros ejemplos del uso de vectores adenovíricos para la transferencia génica en los ensayos clínicos incluyen Rosenecker et al., Infection 24: 15-10 (1996); Welsh et al., Hum. Gene. Ther. 2: 205-18 (1995); Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5: 597-613 (1997): Topf et al., Gene Ther. 5: 507-513 (1998).
En algunas realizaciones, el vector Ad es un vector adenovírico quimérico, que contiene secuencias de dos o más genomas de adenovirus diferentes. Por ejemplo, el vector Ad puede ser un vector Ad5/35. El Ad5/35 se crea reemplazando uno o más de los genes de las proteínas de la fibra (botón fust, cola, pentón) del Ad5 con el correspondiente gen de la proteína de la fibra de un adenovirus del grupo B tal como, por ejemplo, Ad35. El vector Ad5/35 y las características de este vector se describen, por ejemplo, en Ni et al. (2005) «Evaluation of biodistribution and safety of adenovirus vectors containing group B fibers after intravenous injection into baboons», Hum. Gene. Ther. 16: 664-677; Nilsson et al., (2004) «Functionally distinct subpopulations of cord blood CD34+ cells are transduced by adenoviral vectors with serotype 5 or 35 tropism», Mol. Ther. 9: 377-388; Nilsson et al., (2004) «Development of an adenoviral vector system with adenovirus serotype 35 tropism; efficient transient gene transfer into primary malignant hematopoietic cells» J. Gene Med. 6: 631-641; Schroers et al (2004) «Gene transfer into human T lymphocytes and natural killer cells by Ad5/F35 chimeric adenoviral vectors», Exp. Hematol. 32: 536-546; Seshidhar et al., (2003) «Development of adenovirus serotype 35 as a gene transfer vector», Virology 311: 384-393; Shayakhmetov et al (2000) «Efficient gene transfer into human CD34(+) cells by a retargeted adenovirus vector», J. Virol. 74: 2567-2583; y Sova et al. (2004), «A tumor-targeted and conditionally replicating oncolytic adenovirus vector expressing TRAIL for treatment of liver metastases», Mol. Ther. 9: 496-509.
Como se observó anteriormente, las ZFN y los polinucleótidos que codifican estas ZFN se pueden introducir en cualquier célula diana. Generalmente, para inactivar un gen CCR-5, la célula es una célula inmunitaria, por ejemplo, un linfocito (linfocitos B, linfocitos T tales como los linfocitos T cooperadores [TH] y los linfocitos T citotóxicos [TC], linfocitos nulos tales como los linfocitos citolíticos naturales [NK]); una célula mononuclear (monocitos, macrófagos); una célula granular (granulocitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos); un mastocito; y/o una célula dendrítica (células de Langerhans, células dendríticas intersticiales, células dendríticas interdigitales, células dendríticas en circulación). Los macrófagos, los linfocitos B y las células dendríticas son células presentadoras de antígeno ejemplares que intervienen en la activación de los linfocitos TH. En algunas realizaciones, la célula diana es un linfocito TH, que se caracteriza por expresar CD4 en la superficie. La célula diana también puede ser una célula troncal hematopoyética, que puede dar lugar a cualquier célula inmunitaria.
Aplicaciones
Los métodos y composiciones descritos se pueden utilizar para escindir el ADN en una región de interés de la cromatina celular (p. ej., en un sitio deseado o predeterminado en un genoma, por ejemplo, en un gen, mutante o de tipo silvestre); para reemplazar una secuencia genómica (p. ej., una región de interés en la cromatina celular, véase también el ejemplo 5 que viene a continuación) con una secuencia no idéntica homóloga (a saber, recombinación dirigida); para eliminar una secuencia genómica al escindir el ADN en uno o más sitios en el genoma, cuyos sitios de escisión entonces se reúnen mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ, por su nombre en inglés); para detectar los factores celulares que facilitan la recombinación homóloga; para reemplazar una secuencia de tipo silvestre con una secuencia mutante; y/o para convertir un alelo en un alelo diferente. Tales métodos y usos, respectivamente, también permiten la generación y/o modificación de estirpes celulares (para usos terapéuticos y no terapéuticos), el tratamiento de infecciones (víricas o bacterianas) en un huésped (p. ej., bloqueando la expresión de los receptores del virus o de la bacteria, con lo que se previene la infección y/o diseminación en un organismo hospedador); para tratar enfermedades genéticas.
Así pues, las composiciones y los métodos descritos en la presente memoria se pueden utilizar para la modificación génica, la corrección génica y la disrupción génica. Los ejemplos no limitantes de modificación génica incluyen la integración dirigida basada en la reparación directa por homología (RDH), la corrección génica basada en la RDH; la modificación génica basada en la RDH; la disrupción génica basada en la RDH; la disrupción génica basada en la NHEJ y/o combinaciones de RDH, NHEJ y/o alineamiento de cadenas sencillas (SSA, por su nombre en inglés). El alineamiento de cadenas sencillas (SSA) se refiere que una rotura bicatenaria que ocurra entre dos secuencias repetidas en la misma orientación se repara mediante la retirada de la RBI mediante exonucleasas 5'-3' para exponer las 2 regiones complementarias. Las hebras monocatenarias que codifican las 2 repeticiones directas luego se alinean una con la otra, y el intermediario alineado se puede procesar de tal forma que se digieren las colas monocatenarias (la porción del ADN monocatenario que no está alineado a ninguna secuencia), se rellenan los huecos mediante la ADN polimerasa y se reúnen los extremos del ADN. Esto da lugar a la deleción de las secuencias localizadas entre las repeticiones directas.
Las composiciones (p. ej., vectores Ad-ZFN) y los métodos descritos en la presente memoria se pueden utilizar para el tratamiento de distintas enfermedades genéticas y/o enfermedades infecciosas.
Las composiciones y los métodos también se pueden aplicar en tratamientos a base de células troncales, que incluyen, pero sin limitarse a ellas:
(a)
Corrección de mutaciones de células somáticas mediante la conversión génica en parches pequeños o la integración dirigida para genoterapia monogénica.
(b)
Disrupción de alelos negativos dominantes.
(c)
Disrupción de genes necesarios para la entrada o la infección productiva de patógenos al interior de las células.
(d)
Mejora de la ingeniería tisular, por ejemplo, mediante:
(i)
Modificación de la actividad génica para promocionar la diferenciación o la formación de tejidos funcionales; y/o
(ii)
Disrupción de la actividad génica para promocionar la diferenciación o la formación de tejidos funcionales.
(e)
Bloqueo o inducción de la diferenciación, por ejemplo, mediante:
(i)
Disrupción de genes que bloquean la diferenciación para favorecer que las células troncales se diferencien hacia un linaje específico.
(ii)
Inserción dirigida de una casete de expresión de gen o de ARNpi que puede estimular la diferenciación de las células troncales.
(iii) Inserción dirigida de una casete de expresión de gen o de ARNpi que puede bloquear la diferenciación de las células troncales y permitir la mejor expansión y mantenimiento de la pluripotencia.
(iv) Inserción dirigida de un gen indicador en fase con un gen endógeno que es un marcador de la pluripotencia
o del estado de diferenciación que proporcionaría una marcación fácil para puntuar el estado de diferenciación de las células troncales y cómo alteran este estado los cambios en medios, citocinas, condiciones de crecimiento, expresión de genes, expresión de las moléculas de ARNpi, exposición de los anticuerpos a los marcadores de la superficie celular, o fármacos.
(f)
La transferencia de núcleos de células somáticas, por ejemplo, se pueden aislar las células somáticas propias del paciente, modificar el gen diana deseado de una manera apropiada, generar los clones celulares (y controlar la calidad para asegurarse de la seguridad del genoma) y aislar los núcleos de estas células y transferirlos a óvulos sin fertilizar para generar células hES específicas del paciente que se podrían inyectar directamente o que se podrían diferenciar antes de injertarlas en el paciente, lo que reduce o elimina el rechazo del tejido.
(g)
Células troncales universales mediante genosupresión de receptores del CMH: Esta estrategia se utilizaría para generar células de identidad inmunitaria disminuida o suprimida. Los tipos celulares para este procedimiento incluyen, pero sin limitarse a ellos, linfocitos T, linfocitos B, células troncales hematopoyéticas y células troncales embrionarias. Por consiguiente, estas células troncales o sus derivados (tipos celulares o tejidos diferenciados) se podrían potencialmente injertar en cualquier persona con independencia de su origen o histocompatibilidad.
Las composiciones también se pueden utilizar para el tratamiento de células somáticas (p. ej., tratamiento con células autólogas y/o linfocitos T universales por genosupresión de receptores del CMH, véase el apartado (g) más arriba), por lo que se permite la producción de reservas de linfocitos T que se han modificado para mejorar sus propiedades biológicas. Tales células se pueden infundir en numerosos tipos de pacientes independientemente de la fuente donante de los linfocitos T y de su histocompatibilidad con el receptor.
Además, el uso de los vectores Ad como los descritos en la presente memoria para introducir las ZFN potencia la tasa de NHEJ. Sin que signifique decantarse por una teoría, parece que este efecto se debe al efecto inhibidor que las proteínas E4 (E4 ORF6 (E4 34K), E4 ORF3) pueden tener sobre la reparación de las RBI.
Ejemplos
Ejemplo 1: Construcción de los vectores
A. Construcción de los vectores Ad5/35-GFP y Ad5/35-ZFN
Se construyeron los vectores quiméricos Ad/35 (Nilsson et al., (2004) Mol. Ther. 9: 377-388; Nilsson et al., (2004) J. Gene Med. 6: 631-641) tal y como se muestra esquemáticamente en la figura 1. Brevemente, en el lugar de los genes E1 se introdujo una secuencia que codifica un casete de expresión para GFP (línea superior), un casete de expresión para un par de ZFN modificadas genéticamente (ZFN1 y ZFN2) que actúan selectivamente sobre el locus del CCR5 endógeno (línea central), o una secuencia donadora homóloga para destinar una secuencia parche de 47 pb al locus de CCR5 (línea inferior) utilizando el sistema de recombinación bacteriana AdEasy (Stratagene).
Las construcciones en los vectores Ad-215 y Ad-201 comprenden cada una secuencias que codifican dos ZFN que escinden el gen del CCR5 endógeno en las secuencias que codifican la Leu55. Ambas ZFN se expresan bajo el control de un único promotor mediante una fusión con 2A. Tal y como se muestra en la tabla 1 de más arriba, la pareja ZFN215 codificada por la construcción Ad-215 comprende dominios de unión de dedos de zinc 8267 y 8196z de los diseños r162 y 168, respectivamente; mientras que la pareja ZFN201 codificada por el vector Ad-201 comprende los dominios de unión de dedos de zinc 8266 y 8196z de los diseños r162 y 168, respectivamente. Las
5 ZFN codificadas por los vectores Ad-215 y Ad-201 están fusionadas a un semidominio de escisión de FokI de tipo silvestre. Véase la figura 2.
La pareja ZFN224 codificada por la construcción Ad-224 comprende los dominios de unión de dedos de zinc 8267 y 8196z de los diseños r162 y 168, respectivamente. Por lo tanto, la construcción Ad-224 tiene las mismas proteínas con dedos de zinc que Ad-215. Sin embargo, las ZFN codificadas por la construcción Ad-224 contienen el
10 semidominio de escisión de FokI mutante que se describe en la solicitud provisional de patente de los EE.UU. n.º 60/808 486 (registrada el 25 de mayo de 2006), y que se incorpora en la presente memoria por referencia en su totalidad. En particular, el dominio con dedos de zinc 8267 está fusionado a un semidominio de escisión de FokI que contiene las mutaciones Q486E e I499L (figura 3), y el dominio con dedos de zinc 8196z está fusionado a un semidominio de escisión de FokI que contiene las mutaciones E490K e I538K (figura 4).
15 B. Vector donador para la inserción dirigida
Para fabricar un vector donador (Ad5/35 P ori, línea inferior de la figura 1), un fragmento de 1881 pb del genoma humano que corresponde al locus de CCR5 se amplificó por PCR y se clonó en el vector PCR4-TOPO (Invitrogen). La secuencia del fragmento se muestra en la figura 5 (SEQ ID n.º 36).
Para generar un sitio de clonación en el cual insertar una secuencia «parche», se cambiaron 2 nucleótidos de la
20 secuencia mostrada en la figura 5 para generar un sitio de reconocimiento XbaI. En concreto, la secuencia nucleotídica «atcctgataa» (SEQ ID n.º 39) (nucleótidos 470-479 en el fragmento donador) se cambió a «atctagataa » (SEQ ID n.º 40) (las 2 bases cambiadas están subrayadas) mediante el kit de mutagénesis específica de sitio QuickChange (Stratagene).
A continuación, la secuencia de ADN resultante se dirigió con XbaI, y una secuencia «parche» de 47 pb, mostrada 25 en la figura 6 (SEQ ID n.º 37), se introdujo en el sitio XbaI.
La secuencia resultante, mostrada en la figura 7 (SEQ ID n.º 38) se introdujo en el vector Ad5/35 como se describe más arriba para los casetes de expresión de GFP y ZFN. Respecto a la secuencia mostrada en la figura 7, el brazo de homología en 5' corresponde a los nucleótidos 1-471; la secuencia «parche» para la inserción dirigida a CCR-5 está subrayada y corresponde a los nucleótidos 472-518; y el brazo de homología en 3' corresponde a los
30 nucleótidos 519-1928.
Ejemplo 2: transducción de las células hES con los vectores Ad5/35-GFP
Los vectores quiméricos Ad5/35-GFP que se describen en el ejemplo 1 se introdujeron en las células troncales embrionarias humanas (hES) como sigue.
Se realizaron infecciones de células hES en volúmenes de 500 μl utilizando 400 000 células y 25 μl, 5 μl o 0,5 μl del
35 vector Ad5/35-GFP (MDI de 8200, 1640 y 164, respectivamente). Después de 4 horas se lavaron las células y se sembraron en células alimenticias de fibroblastos embrionarios murinos (FEM) nuevas. La microscopia de fluorescencia de las células vivas, obtenidas unas 20 horas después de la infección, mostraron fluorescencia en las colonias de células troncales que se habían infectado con 5 y 25 μl del virus, y ninguna fluorescencia en las células alimenticias. Se realizó el análisis FACS para la fluorescencia de GFP unas 22 horas después de la infección. Los
40 resultados se muestran en la tabla 2.
Tabla 2
Infección
% de linfocitos T fluorescentes
Infección simulada
0,74%
0,5 μl de Ad5/35-GFP
39,4%
5 μl de Ad5/35-GFP
91%
25 μl de Ad5/35-GFP
95%
Estos resultados indican que los vectores Ad5/35 son capaces de infectar células troncales embrionarias humanas con gran eficiencia.
Ejemplo 3: modificación del gen CCR-5 mediante los Ad5/35-ZFN
Se obtuvieron los linfocitos T CD4+ y las CMSP de AllCells. Se cultivaron las células en RPMI + SBF al 10% + L5 glutamina al 1% (30 mg/ml) + IL-2 (1 ng/ml, Sigma) y se activaron con perlas anti-CD3-CD28 según el protocolo del fabricante (Dynal). Las células se inocularon a 3 x 105 células/ml en un volumen de 1 ml en una placa de 24 pocillos.
Los vectores adenovíricos que se describen en el ejemplo 1 (Ad5/35 GFP, Ad5/35 215 o Ad5/35 224) se añadieron dos días después a una MDI de 10, 30 o 100 (MDI calculada según la titulación infectiva).
Las células se recogieron 2 días después de la exposición al virus y se determinó la eficacia de la modificación del
10 gen mediante un ensayo Cel-1, realizado como se describe en la publicación de patente internacional WO 07/014275. Véanse también Oleykowski et al. (1998) Nucleic Acids Res. 26: 4597-4602; Qui et al. (2004) BioTechniques 36: 702-707; Yeung et al (2005) BioTechniques 38: 749-758.
Los resultados se muestran en la tabla 3.
Tabla 3
% de alelos de CCR-5 modificados
CMSP
Linfocitos T CD4+
Control
No detectable No detectable
Ad5/35-ZFN215 a MDI 10
6,1 6,7
Ad5/35-ZFN215 a MDI 30
14,0 16,5
Ad5/35-ZFN215 a MDI 100
31,2 32,3
Ad5/35-ZFN224 a MDI 10
3,6 1,8
Ad5/35-ZFN224 a MDI 30
7,4 9,0
Ad5/35-ZFN224 a MDI 100
15,0 14,9
Ad5/35-GFP a MDI 10
No detectable No detectable
Ad5/35-GFP a MDI 30
No detectable No detectable
Estos resultados indican que la modificación génica se observó después de la infección de las células con los vectores Ad5/35 que codifican tanto la pareja nucleásica ZFN215 (que comprende los semidominios de escisión de FokI de tipo silvestre) y la pareja nucleásica ZFN 224 (que comprende los semidominios de escisión de FokI mutantes descritos en el ejemplo 1A). Además, los resultados muestran que los niveles de modificación génica se
20 incrementaron de una manera dependiente de la dosis.
Para determinar la persistencia de la modificación génica inducida por ZFN, se mantuvieron las células infectadas en cultivo durante otros 8 días (mismo medio de cultivo que antes). Las células se contaron y se diluyeron con un medio nuevo cada 2 días. A continuación se recogieron las células (10 días después de la transducción vírica) y se repitió el ensayo de Cel-1. Además, una fracción de la población de linfocitos T CD4+ se reactivó el día 7 con perlas anti
25 CD3/CD28 (Dynal). Los resultados se muestran en la tabla 4.
Tabla 4
% de células infectadas
CD4 reactivado
CD4 no activado
Control
No detectable No detectable
Ad5/35-ZFN215 a MDI 30
10,1 10,9
Ad5/35-ZFN215 a MDI 100
29,0 28,2
Ad5/35-ZFN224 a MDI 30
6,7 6,4
Ad5/35-ZFN224 a MDI 100
16,1 16,6
Ad5/35-GFP a MDI 100
No detectable No detectable
Estos resultados muestran que el grado de modificación génica se mantuvo a medida que proliferaban los linfocitos T CD4+. Además, la reactivación no tuvo ningún efecto evidente sobre el crecimiento de las células modificadas en 5 comparación con las células sin modificar.
Ejemplo 4: modificación del gen de CCR-5 mediante Ad5/35-ZFN en las células CD34+
Los linfocitos T CD4+ y las células CD34+ se obtuvieron de AllCells. El día 0 se cultivaron los linfocitos T CD4+ en RPMI + SBF al 10% + L-glutamina al 1% (30 mg/ml) + IL-2 (1 ng/ml, Sigma) y se activaron con perlas anti-CD3-CD28 según el protocolo del fabricante (Dynal). Se cultivaron las células CD34+ en medio sin suero (Stemspan
10 H3000, Stem Cell Technologies) y se complementaron con citocinas (Stemspan CC100, Stem Cell Technologies). Las células se inocularon a 6 x 105 células/ml en un volumen de 1 ml en placas de 24 pocillos. Se añadieron vectores adenovíricos (Ad5/35 GFP o Ad5/35 224) al día siguiente (día 1) a diferentes MDI (MDI calculada según la titulación infectiva).
Las células se recogieron el día 4 y se determinó la eficacia de modificación génica mediante un ensayo Cel-1.
15 Para los linfocitos T CD4+, Ad5/35 224 indujo la modificación del gen de CCR-5 con una eficacia del 18,0%, 34,5% y 48,4% a las MDI de 25, 50 y 100, respectivamente.
De igual forma, para las células CD34+, el Ad5/35 224 indujo la modificación del gen de CCR5 con una eficacia del 10,9% y del 11,1%, a las MDI de 10 y 50, respectivamente.
Ejemplo 5: inserción dirigida de una secuencia exógena en el gen de CCR-5 mediante Ad5/35-ZFN
20 El día 0 se cultivaron los linfocitos T CD4+ en RPMI + SBF al 10% + L-glutamina al 1% (30 mg/ml) + IL-2 (1 ng/ml, Sigma) y se activaron con perlas anti-CD3-CD28 de acuerdo con el protocolo del fabricante (Dynal). Las células se inocularon a 3 x 105 células/ml en un volumen de 1 ml en una placa de 24 pocillos. Dos días después (día 2), las células se cotransdujeron con diferentes combinaciones de Ad5/35 224 y Ad5/35 P ori donador (figuras 1 y 7). Se añadió el Ad5/35 224 a MDI de 0, 25, 50 y 100 y el Ad5/35 P ori donador se añadió a MDI de 0, 100 y 300 (la MDI se
25 calculó basándose en la titulación infectiva). Las células se recogieron 2 días después de la infección (día 4) y se determinó la eficacia de la integración dirigida mediante ensayo de RFLP, como se describe a continuación.
Se aisló el ADN genómico de las células transducidas y se amplificó por PCR con cebadores localizados fuera de la región donadora que contiene la homología. A continuación, el fragmento amplificado se incubó con la enzima de restricción BglI, cuyo sitio de reconocimiento está contenido dentro de la secuencia donadora (parche) P ori. Se
30 calculó la frecuencia de la integración dirigida de la secuencia parche determinando la proporción de productos escindidos y sin escindir. La frecuencia de la integración dirigida de la secuencia parche fue del 3,1% cuando las células se cotransdujeron con Ad5/35 224 a una MDI de 50 y Ad 5/35 P ori a una MDI de 300.
Ejemplo 6: inducción de la unión de extremos no homólogos mediante los Ad5/35-ZFP
Para determinar los tipos de mutaciones generadas por ZFN mediante la escisión dirigida seguida de la unión de
35 extremos no homólogos (NHEJ), se secuenció y analizó la secuencia genómica de CCR-5 de las células modificadas. Brevemente, las CMSP y los linfocitos T CD4+, ambos transducidos con Ad5/35 ZFN 215 del mismo modo que se describe en el ejemplo 3, se recogieron y se extrajo el ADN genómico de estas células. A continuación se amplificó el locus del CCR5 por PCR, se clonó con Topo en el vector PCR4-TOPO (Invitrogen), y se analizó la secuencia de los clones bacterianos y se compararon con el locus del CCR5 de tipo silvestre.
Las mutaciones inducidas por la escisión dirigida de ZFN incluyeron deleciones e inserciones, y el tamaño de tales cambios varió a lo largo de un amplio margen. Se observaron tanto deleciones como inserciones de tan solo un par 5 de bases, y también se observaron inserciones de hasta casi 100 pares de nucleótidos. Las secuencias de algunas mutaciones de ejemplo inducidas mediante la escisión dirigida mediada por ZFN se muestran en las figuras 8-10.
La figura 8 muestra las secuencias de una serie de deleciones identificadas durante el análisis. Los pares de bases que faltan están señalados con puntos.
Se produjo con mucha frecuencia una inserción de 5 pares de bases en las células tratadas con ZFN. Esta inserción 10 convierte la secuencia (SEQ ID n.º 41) en (SEQ ID n.º 42), donde la secuencia insertada está subrayada.
Otra mutación observada con frecuencia era una inserción de cuatro pares de bases entre los dos sitios de unión de ZFN, lo que convierte la secuencia (SEQ ID n.º 41) en 15 (SEQ ID n.º 43), donde la secuencia insertada está subrayada.
La figura 9 muestra las secuencias nucleotídicas de otras mutaciones. En un caso, se observó una combinación de una deleción de un nucleótido y una inserción de cinco nucleótidos.
La figura 10 muestra las secuencias de un número de inserciones más largas que son resultado de la escisión dirigida de ZFN.
20 Un resumen de las modificaciones de secuencia del locus de CCR-5 se muestra a continuación en la tabla 5.
Tabla 5
TIPO DE MUTACIÓN
NÚMERO EN CADA TIPO DE CÉLULA TOTALES
CMSP
Linfocitos T CD4+
Deleción
10 8 18
Inserciones
5 pb 11 14 25
4 pb
8 2 10
Otro
3 3 6
Larga
1 3 4
De tipo silvestre
10 14 24
Totales
43 44 87
Ejemplo 7: viabilidad celular después de la transducción de Ad5/35-ZFN
También se evaluó la viabilidad celular después de la transducción con las construcciones de Ad5/35-ZFN.
25 Brevemente, se adquirieron los linfocitos T CD4+ y las CMSP a AllCells. El día 0 se cultivaron las células en RPMI + SBF al 10% + L-glutamina al 1% (30 mg/ml) + IL-2 (1 ng/ml, Sigma) y se activaron con perlas anti-CD3-CD28 según el protocolo del fabricante (Dynal). Las células se inocularon a 3 x 105 células/ml en un volumen de 1 ml en placas de 24 pocillos. Se añadieron los vectores adenovíricos (Ad5/35 GFP, Ad5/35 215 o Ad5/35 224) dos días después (día 2) a MDI de 10, 30 y 100 (la MDI se calculó basándose en la titulación infectiva). Se midieron el número de
30 células y la viabilidad celular los días 4, 6, 8, 10 y 12 mediante el protocolo VIACOUNT que acompaña al citómetro de flujo analítico GUAVA, siguiendo las instrucciones del fabricante (Guava Technologies).
Las Ad5/35 ZFN generalmente se toleraban bien, y al menos el 75% de las células (hasta el 90% a la MDI más baja) eran viables en todos los puntos temporales. Así, se observó una toxicidad mínima.
Ejemplo 8: crecimiento celular tras a la transducción de Ad5/35-ZFN
También se evaluó el crecimiento celular (duplicación) después de la transducción con construcciones Ad5/35-ZFN.
El día 0 se cultivaron linfocitos T CD4+ y CMSP en RPMI + SBF al 10% + L-glutamina al 1% (30 mg/ml) + IL-2 (1 ng/ml, Sigma). Se activaron las células los días 0 y 6 con perlas anti-CD3-CD28 según el protocolo del fabricante (Dynal). Inicialmente, las células se inocularon a 3 x 105 células/ml en un volumen a 1 ml en placas de 24 pocillos. Se añadieron los vectores adenovíricos (Ad5/35 GFP, Ad5/35 215 o Ad5/35 224) el día 2 a MDI de 10, 30 o 100 (la MDI calculada se basó en la titulación infectiva). Se midieron el número de células y la viabilidad celular mediante el protocolo VIACOUNT que compaña al citómetro de flujo analítico GUAVA tal y como se describe en el ejemplo 7.
El crecimiento celular o el tiempo de generación se vieron mínimamente afectados por el adenovirus (excepto para Ad5/35 215 a una MDI de 100). En total, se consiguieron al menos 8 duplicaciones (a saber, una expansión > 100 veces) a lo largo de un intervalo de 14 días en los linfocitos T CD4+ y en las CMSP.
Ejemplo 9: medición de la persistencia del genoma del adenovirus en los linfocitos T CD4+
Se cultivaron linfocitos T CD4+ en RPMI + SBF al 10% + L-glutamina al 1% (30 mg/ml) + IL-2 (1 ng/ml, Sigma) y se activaron con perlas anti-CD3-CD28 según el protocolo del fabricante (Dynal). Se sembraron las células a 6 x 105 células/ml en un volumen de 1 ml en una placa de 24 pocillos. Se añadieron vectores adenovíricos (Ad5/35 215 o Ad5/35 224) al día siguiente a MDI de 10, 30 y 100 (la MDI calculada se basó en la titulación infectiva). Se recogieron las células los días 4 y 14. Se extrajo el ADN con un kit Masterpure (Epicenter Biotechnologies). Se calculó la persistencia de los genomas adenovíricos mediante la presencia de ADN genómico de Ad según se midió mediante PCR con TaqMan® (Applied Biosystem). Se diseñaron cebadores/sondas para que se hibridaran selectivamente y detectaran la región E4 del genoma adenovírico. El límite de detección del protocolo de PCR con TaqMan® es aproximadamente de ~10-4 genomas adenovíricos por célula.
En total, entre 2 días y 12 días después de la transducción, el nivel de genomas adenovíricos por célula disminuyó de 100 a 1000 veces. Se detectaron menos del 10-2 genomas por célula con la MDI más alta (100) el día 12 después de la transducción.
Ejemplo 10: medición de la persistencia de la expresión de la proteína en los linfocitos T CD4+
El día 0 los linfocitos T CD4+ se cultivaron y se activaron como se describe en el ejemplo 9. Se añadieron vectores adenovíricos (Ad5/35 GFP) el día después de la activación (día 1) a una MDI de 50, 100, 250 y 500 (la MDI se calculó basándose en la titulación infectiva). El porcentaje de células positivas para GFP y la intensidad fluorescente media (IFM) se determinaron mediante la citometría de flujo analítica GUAVA cada 2-3 días.
Se observó una expresión significativa de GFP al inicio (día 3) a todas las MDI. La fluorescencia de GFP persistió hasta el día 13, del 80 al 100% de células positivas para GFP el día 3 hasta del 30 al 60% de células positivas para GFP el día 13. Sin embargo, la IFM disminuyó significativamente durante ese mismo tiempo (en casi 100 veces), lo que sugiere que, aunque las células del día 13 se valoraron como positivas para GFP mediante el citómetro de flujo, contenían una cantidad significativamente menor de proteína GFP. Además, es bien sabido que la GFP tiene una semivida relativamente larga (> 24 horas).
Ejemplo 11: medición del ARNm de ZFN en los linfocitos T CD4+ transducidos con los vectores Ad5/35-ZFN
El día 0 los linfocitos T CD4+ se cultivaron y se activaron como se describe en el ejemplo 9. Los vectores adenovíricos (Ad5/35 215 o Ad5/35 224) se añadieron al día siguiente (día 1) a MDI de 30 y 100 (la MDI se calculó basándose en la titulación infectiva). Se recogieron las células los días 3 y 9 (a saber, 2 y 8 días después de la transducción), y se extrajo el ARN con un kit de aislamiento de ARN High Pure® (Roche). Se cuantificó el ARNm de ZFN mediante RT-PCR con TaqMan® (Applied Biosystems). El conjunto cebador/sonda se diseñó y se optimizó para que se hibridaran a secuencias que codifican el semidominio de escisión de FokI.
Se detectaron cantidades significativas del ARNm de ZFN (1 x 105 a 1 x 106 copias por célula según la MDI) 2 días después de la transducción. No obstante, transcurridos 8 días después de la transducción, el nivel del ARNm de ZFN en todas las muestras excepto una (Ad5/35 215 a MDI de 100) estaban por debajo del límite de detección del ensayo. Se detectaron aproximadamente 100 copias/célula en la muestra de Ad5/35 215 a MDI 100, lo que representa una disminución de miles de veces de la cantidad del ARNm entre 2 y 8 días después de la transducción.
Ejemplo 12: disrupción del gen de CCR-5 en los linfocitos T CD4+ humanos primarios utilizando los vectores Ad5/35-ZFN
Los linfocitos T CD4+ humanos primarios (obtenidos de donadores en la Universidad de Pensilvania) se transdujeron en falso o se transdujeron con Ad5/35 GFP, o con Ad5/35 215, o con Ad5/35 224.
El día 1, los linfocitos T se sedimentaron y se resuspendieron a una concentración de 1 x 106/ml en Xvivo 15 (BioWhittaker, Walkersville, MD) complementado con suero de ternera fetal al 10% y L-glutamina al 1%. Se expuso 1 ml de células a perlas anti-CD3/CD28 (preparadas como se describe en Levine et al. (1997) J. Immunol. 159: 59215930). Al día siguiente (día 2), se transdujeron 1 x 106 células con los vectores Ad5/35 GFP, Ad5/35 215 o Ad5/35 5 224 a una MDI de 30 o 100. Al día siguiente se duplicó el volumen del medio con Xvivo15 que contiene suero de ternera fetal al 10%, L-glutamina al 1%, N-acetilcisteína al 0,9% y 300 UI/ml de la IL-2 recombinante humana. Para cada condición, se contaron las células cada 2 días en un contador Coulter, se sedimentó una muestra problema para el análisis y el cultivo restante se inoculó y se alimentó a 1 x 106 células/ml. El día 6 se retiraron las perlas con un imán, y se cultivaron las células con el medio Xvivo15/SBF/L-glutamina/NAC/IL-2 descrito más arriba. El día 8,
10 una fracción de las células de cada muestra se sedimentó para el análisis mediante Cel-1 y el resto de las células de cada muestra (a una concentración de 1 x 106 células/ml) se infectaron con la cepa US1 del VIH-1 CCR5-tropo a una MDI de 0,1 (véase el ejemplo 13).
Cada dos días, las células se contaron, se sedimentaron, se recogió una pequeña cantidad para el análisis mediante Cel-1, y el resto de células se inocularon y se alimentaron con el mismo medio que contiene Xvivo15/SBF/L
15 glut/NAC/IL-2.
El día 13 se realizó la reestimulación de los cultivos de linfocitos T CD4+ con una mezcla de CMSP alógenas irradiadas (3000 rad) y células K562 irradiadas (10 000 rad) que expresan CD32 más OKT3 (anti-CD3) y anti-CD28.
Se recogió el ADN genómico 13 días después de la transducción y se midió la eficacia de la disrupción del CCR5 mediante el ensayo Cel-1. Los resultados se muestran en la tabla 6.
20 Tabla 6
MDI
Control GFP Ad/ZFN 215 Ad/ZFN 224
30
100 30 100 30 100
Porcentaje de alelos modificados
0 0 0 54 44 44 30

Ejemplo 13: Exposición al VIH
Además, los linfocitos T CD4+ humanos primarios transducidos con los vectores Ad5/35 tal y como se describe en el ejemplo 12 se diluyeron 1:3 con células sin transducir y o bien infectadas en falso o bien infectadas (MDI de 0,1) con
25 una cepa del VIH capaz de replicarse, la US1. A continuación se hicieron pases de estas células para permitir varias rondas de infección y replicación del VIH. Se aisló una pequeña cantidad de células en cada uno de los días 0, 5, 11 y 17 después de la infección de cultivos infectados en falso y con VIH para monitorizar el porcentaje de células que contienen los genes CCR5 alterados. Se aisló el ADN genómico de cada muestra de células y se determinó la presencia de los alelos mutantes de CCR5 mediante el ensayo Cel-1.
30 Los resultados se muestran en los paneles A (células transducidas con Ad5/35 215) y B (células transducidas con Ad5/35 224) de la figura 11 e indican que, en las células que se habían transfectado con los vectores Ad ZFN, el número de células que contienen alteraciones de secuencia en su gen de CCR-5 se incrementó después de la infección con VIH (ZFN VIH), pero no se incrementó en las células que no se habían infectado con el VIH (ZFN falso).
35 Ejemplo 14: disrupción de CCR5 mediante ZFN en las células GHOST-CCR5.
A. Determinación de mutaciones inducidas por la ZFN en las células GHOST-CCR5
Células GHOST-CCR5, una línea celular indicadora de la infección del VIH-1 que contiene varias copias (unas 4) de un casete autólogo de expresión de CCR5 y un gen marcador inducible de GFP bajo el control de la LTR del VIH-2 (Morner et al., (1999) J. Virol. 73: 2343-2349) se obtuvieron del AIDS Research and Reference Reagent Program del
40 NIH y se transdujeron con un vector adenovírico (Ad5/35) (Schroers et al. 82004) Experimental Hematology 32: 536546) que codifica las parejas CCR5-ZFN 215 (véase más arriba el texto relacionado con la tabla 1) y 224 (que contiene las ZFN señaladas en la tabla 1 como 8196z y 8266). Los sitios de unión para ambas parejas de ZFN son los mismos y se muestran en la figura 12.
Se determinó la inducción de mutaciones mediadas por ZFN en el sitio diana utilizando un ensayo basado en la
45 nucleasa Surveyor™ (Transgenomic), también conocida como Cel-1, una enzima que detecta los apareamientos erróneos y escinde el ADN en el sitio de las mutaciones inducidas por la ZFN. Brevemente, se extrajo el ADN genómico de células modificadas y de control mediante el kit de purificación de ADN MasturePure™ (Epicentre Biotechnologies) y se complementó con 5 μCi de a-32P-dATP y 5 μCi de a-32P-dCTP para la PCR radioactiva.
Se realizó la PCR (reacciones de 50 1l) radioactiva (kit de PCR AccuPrime™ [Invitrogen]) sobre 100 ng del ADN genómico extraído de células modificadas y de control. Brevemente, un fragmento de 292 pb del locus de CCR5 que abarca el sitio diana de CCR5-ZFN se amplificó durante 30 ciclos (30 s a 95 ºC, 30 s a 60 ºC, y 30 s a 68 ºC) (SEQ ID n.º 29) y C5_Cel_160_R1:
(SEQ ID n.º 30).
Se centrifugó el producto de la PCR a través de una columna G-50 (GE Healthcare) y 1 1l del producto purificado se mezcló con 1 1l de un tampón de hibridación a 10X (tampón de hibridación a 1X: Tris a 10 mM, NaCl a 100 mM) y agua hasta un volumen final de 10 1l. Se desnaturalizó el ADN y rehibridó en un bloque de PCR utilizando un programa que permite formar heterodúplex (10 min a 95 ºC; de 95 ºC a 85 ºC a –2 ºC/s; y de 85 ºC a 25 ºC a –0,1 ºC/s). Después de la rehibridación, se añadieron 1 1l de la nucleasa SurveyorTM (Transgenomics), 1 μl del tampón II de PCR de AccuPrimeTM a 10X, y agua hasta un volumen total de 20 1l. Se incubó la reacción a 42 ºC durante 20 min para digerir los heterodúplex, y los productos escindidos se resolvieron en un gel de poliacrilamida en TBE al 10% no desnaturalizante (Bio-Rad). Se secó el gel y se analizó con un Phosphorimager®. Se determinó el nivel de la disrupción del gen diana inducido por ZFN obteniendo la proporción entre el fragmento parental sin escindir dividido por los dos productos escindidos de migración más rápida. La proporción de alelos de CCR5 con disrupción por ZFNen la muestra original se calculó utilizando la fórmula: (1->(fracción parental)) x 100. El ensayo es sensible a cambios de un único nucleótido y tiene un límite de detección en aproximadamente un 1% de alelos modificados por ZFN.
Los resultados, mostrados en la figura 13, demostraron que las CCR5-ZFN como las descritas en la presente memoria son muy eficientes (50 al 80%) a la hora de mutar el CCR5 en las células GHOST-CCR5 (carriles 3 y 4). Las células de control no transducidas (carril 1) y las células transducidas con un vector Ad5/35 que codifica las ZFN específicas de IL-2Ry (Urnov et al (2005) Nature 435: 646-651; carril 2) no presentaban ninguna modificación de CCR5 detectable, lo que indica que los resultados eran específicos de CCR5-ZFN.
B. Exposición al VIH
Además, las poblaciones de células transducidas se mantuvieron en cultivo y, una semana después, se infectaron con VIH-1BAL, un aislado del VIH-1 CCR5-tropo prototípico. Los virus para la exposición se obtuvieron del AIDS Research and Reference Reagent Program del NIH y se propagaron en CMSP desprovistas de CD8 para generar cultivos de reserva para el trabajo.
Inmediatamente antes de la infección con el VIH-1, se analizó la expresión del CCR5 en la superficie y se demostró que estaba reducida en > 10 veces en los conjuntos de células transducidas con CCR5-ZFN en comparación con las células de control tratadas con las IL2Ry-ZFN (fig. 14A).
Los resultados de la exposición al VIH-1BAL mostraron una disminución considerable en la infección por VIH-1 en las muestras tratadas con CCR5-ZFN después de una semana, lo que se midió mediante la pérdida de la inducción de GFP promovida por la LTR del VIH 48 horas después de la infección (figura 14B). La modificación genética en el sitio diana pretendido dentro de CCR5 se confirmó por secuenciación del ADN genómico de células GHOST-CCR5 tratadas con CCR5-ZFN.
Además, los clones procedentes de una sola célula aislados de las células GHOST-CCR5 transducidas con CCR5-ZFN se expandieron durante varias semanas. Se genotipó el transgén de CCR5 y se ensayó un clon que posee sólo alelos de CCR5 con disrupción y se demostró que era resistente a la infección por VIH mediante VIH-1BAL. La introducción de un transgén de CCR-5 en estas células restauró la infectibilidad por el VIH, lo que demuestra que la resistencia a la infección por VIH-1 estaba mediada exclusivamente por un defecto en la entrada del virus a través de la disrupción de CCR5 mediada por ZFN.
Estos resultados muestran que las CCR5-ZFN escinden con eficacia su sitio diana del ADN del gen CCR5, y confirman que una proporción elevada de mutaciones inducidas por ZFN impiden la expresión de CCR5 en la superficie celular, lo que da lugar a una resistencia completa a la infección por el VIH-1 CCR5-tropo.
Ejemplo 15: la modificación por CCR5-ZFN confiere una ventaja de supervivencia.
Los experimentos siguientes se realizaron para evaluar si la disrupción de CCR5 mediada por ZFN conferiría la resistencia a largo plazo al VIH-1 esperada de un cambio genético permanente.
A. Disrupción de CCR-5 después del cultivo a largo plazo
Las células PM1, una línea de linfocitos T CD4+ con niveles de expresión de CCR5 similares a los linfocitos T CD4+ primarios, se electroporaron con el plásmido de expresión CCR5-ZFN que codifica la pareja ZFN201 para producir un nivel de disrupción del CCR5 endógeno del 2,4% de los alelos.
A continuación, esta población celular tratada con ZFN se infectó con el VIH-1BAL o en falso el día 7, se hicieron proliferar las células en un cultivo continuo durante 70 días, y la proporción de alelos modificados con ZFN se midió mediante el análisis del ADN antes de la infección y los días 3, 10, 21, 31, 42 y 52 después de la infección.
Como se muestra en la figura 15, hacia el día 52 de infección, el cultivo de PM1 infectado con VIH-1 se sometió a un enriquecimiento de aproximadamente 30 veces para los alelos de CCR5 modificados con ZFN (aproximadamente el 73%). Por el contrario, la población con infección simulada mostró una persistencia estable de los alelos de CCR5 alterados por ZFN (aproximadamente el 2,3%), lo que indica que no hay ninguna consecuencia adversa para la tasa de crecimiento de las células que llevan un alelo modificado por ZFN en ausencia de presión selectiva. Las células PM1 electroporadas con los plásmidos de expresión de ZFN de control (no dirigidas a CCR5) eran sensibles a la infección del VIH-1 y no mostraron ningún indicio de disrupción del CCR5.
Estos resultados demuestran que la infección del VIH-1 proporciona una ventaja selectiva poderosa para las células modificadas con CCR5-ZFN y que la ventaja selectiva se mantiene a largo plazo en el cultivo.
B. Mutaciones mediadas por ZFN
La identidad molecular de las mutaciones mediadas por ZFN en el gen de CCR5 en las células PM1 también se determinó mediante amplificación por PCR y secuenciación de la región diana de CCR5 el día 52 después de la infección.
Se observaron numerosas deleciones e inserciones cortas distintas desde el punto de vista molecular en el 78% de las lecturas de secuencia (63 de las 81 secuencias) (figura 16), lo que indica que la persistencia de los alelos de CCR5 modificados en presencia del VIH no fue resultado de un único acontecimiento infrecuente.
Todas las mutaciones se mapearon en los sitios de reconocimiento de ZFN o cerca de ellos, lo que sugiere que las modificaciones permanentes de la secuencia del gen de CCR5 fueron resultado de la escisión de ZFN y la posterior reparación mediante la NHEJ. Aunque se observó un abanico amplio de mutaciones diferentes de deleción e inserción, una inserción específica de 5 pb (una duplicación de la secuencia entre los sitios de unión de ZFN que da lugar a la introducción de dos codones de parada inmediatamente detrás secuencia abajo del codón de isoleucina en la posición 56) representó > 30% de las secuencias modificadas (figura 16).
C. Superinfección
También se llevaron a cabo experimentos de superinfección para confirmar que las células PM1 modificadas por CCR5-ZFN permanecieron sensibles al VIH-1 CXCR4-tropo y mantuvieron una ventaja selectiva cuando se reinfectaron con el virus CCR5-tropo.
Brevemente, se simuló la transfección de las células PM1, o se transfectaron con plásmidos que codifican la pareja CCR5-ZFN 201 o una pareja de control ZFN (GR) como se describe más arriba. Estas poblaciones celulares se expusieron al VIH-1BAL y el día 59 después de la infección se mezcló una porción de cada muestra con células PM1 no transfectadas parentales y se reinfectó con el VIH-1BK132 CXCR4-tropo o con el VIH-1BAL CCR5-tropo. Estos cultivos reinfectados se siguieron durante un tiempo y se les analizó la frecuencia de la disrupción génica el día 21 después de la reinfección (día 80 después de la infección inicial). Las células infectadas con VIH-1BAL se volvieron a enriquecer con células modificadas por ZFN (64%) tras la dilución con las células PM1, mientras que en las poblaciones celulares que se infectaron en falso o que se infectaron con el VIH-1BK132 CXCR4-tropo se observó poca
o ninguna ventaja selectiva para las células con disrupción en el CCR5.
Las células GHOST-CXCR4 también se expusieron a sobrenadantes (5 1l) de cultivos de células PM1 transfectadas con CCR5-ZFN expuestas al VIH-1 que se retiraron al comienzo (día 3) y al final (día 56). Estos cultivos no demostraron que la infección fuera dependiente de CXCR4. Los mismos sobrenadantes aplicados a las células GHOST-CCR5 permanecieron infectivos, aunque a un menor grado, con la excepción de la muestra transfectada con CCR5-ZFN, lo que sugiere que el enriquecimiento de > 30 veces para las células PM1 sin CCR5 había dado lugar a una reducción enorme de la infectividad vírica el día 56 del cultivo. Por lo tanto, la evolución vírica hacia el uso del correceptor CXCR4 no se detectó en sobrenadantes recogidos en los momentos temprano y tardío de cultivos tratados con CCR5-ZFN e infectados con VIH-1.
Además, se obtuvieron secuencias de bucle V3 de sobrenadantes de células PM-1 expuestas al VIH-1 que se transfectaron con plásmidos que expresaban o bien CCR5-ZFN o bien una GFP de control para determinar los efectos del enriquecimiento de células sin CCR5 generadas con ZFN sobre el tropismo vírico en el tiempo. Se aislaron 150 secuencias províricas del ADN del VIH del cultivo longitudinal de células PM-1 tratadas con CCR5-ZFN infectadas con VIH-1BAL; de éstas, 88 se aislaron el día 3 después de la infección y 62 se aislaron el día 52. Como control se aislaron 78 secuencias de ADN del VIH de las células PM-1 tratadas con GFP infectadas con VIH; 45 el día 3 y 33 el día 52. Se evaluaron las secuencias en busca de cambios en el tropismo emparejando las secuencias del bucle V3 de consenso R5, R5X4 o X4 descritas por Hung et al. (1999) J. Virol. 73: 8216-8226. Todas las secuencias del bucle V3 de las muestras del día 3 y del día 52 tratadas con GFP y CCR5-ZFN se emparejaban muy estrechamente con la secuencia de consenso de CCR5, lo que sugiere que no se produjo ninguna evolución rápida para cambiar al uso del correceptor; esto es coherente con los datos de más arriba que muestran que la infectividad se da sólo en la línea de células indicadoras CCR5-GHOST.
Estos resultados demuestran que la expresión transitoria de las CCR5-ZFN establece una resistencia estable y selectiva al VIH-1 CCR5-tropo, similar a la observada en los individuos que llevan la mutación CCR5L32 que se produce de forma natural.
Ejemplo 16: selección in vitro de linfocitos T CD4 primarios modificados por CCR5-ZFN
A. Disrupción de CCR5 con las ZFN
Para determinar la eficacia de CCR5-ZFN en las células humanas primarias, los linfocitos T CD4+ de donantes sanos con el gen de CCR5 de tipo silvestre se transdujeron con vectores Ad5/35 que codifican tanto CCR5-ZFN 215 como CCR5-ZFN 224 para la introducción transitoria de ZFN con una gran eficacia. Los niveles de disrupción de CCR5 mediada por ZFN (que alcanza el 40 al 60% de los alelos de CCR5) dependientes de la multiplicidad de infección (MDI) se observaron en muchos experimentos utilizando células aisladas de diferentes donantes. Un ejemplo se muestra en la figura 17.
Tal y como se muestra en la figura 18, la tasa de duplicación de la población de linfocitos T CD4 primarios modificados no se diferenciaba de la de las células no transducidas, permaneciendo estable la proporción de alelos de CCR5 modificados durante al menos un mes durante el cultivo in vitro.
B. Exposición al VIH
También se evaluó la resistencia de los linfocitos T CD4 modificados con ZFN en masa a la infección del VIH in vitro.
Los individuos que llevan la mutación CCR5L32 que se produce de forma natural se ha demostrado que están protegidos de la infección y de la progresión del VIH. Véase, por ejemplo, Samson et al., (1996) Nature 382: 722-725 (1996); Huang (1996) Nat. Med. 2:1240-1243 (1996); Berger et al., (1999) Annu. Rev. Immunol. 17: 657-700. En un experimento de control, los linfocitos T CD4+ de un donante homocigoto para el alelo CCR5L32 se mezclaron con los linfocitos T CD4+ de un donante con el CCR5 de tipo silvestre en las proporciones indicadas, y se expusieron al VIH-1BAL. Después de la provocación, se observó que los linfocitos T CD4 CCR5L32 se enriquecían unas 2 veces más que las muestras de infección simulada en paralelo.
La infección con VIH-1US1 CCR5-tropo sobre una población de linfocitos T CD4+ transducidos con CCR5-ZFN en masa también dio lugar a que aparecieran el doble de células con el gen editado que contenían alelos de CCR5 con disrupción por ZFN (medido con el ensayo de la nucleasa Surveyor® (Cel-1) como se describe más arriba) durante 17 días de cultivo, mientras que las poblaciones de control con infección simulada mantuvieron un nivel estable de alelos de CCR5 con disrupción por ZFN (figura 19). En los experimentos en paralelo, las células transducidas con CCR5-ZFN expuestas al VIH-1US1 produjeron una cantidad de p24 soluble significativamente más baja que los controles, en congruencia con la frecuencia de la disrupción de CCR5 en la población. Los linfocitos T CD4 transducidos con un vector de control Ad5/35 GFP no mostraron ninguna disrupción detectable del gen CCR5.
Así pues, los linfocitos T CD4+ convertidos en CCR5 nulos mediante la transducción de ZFN se seleccionaron con una eficacia similar a los linfocitos T CD4 homocigotos para el alelo CCR5L32 que se produce de forma natural durante la infección del VIH-1.
Ejemplo 17: especificidad de las CCR5-ZFN en los linfocitos T CD4 primarios
A. Roturas bicatenarias
Para cuantificar el número de roturas bicatenarias (RBI) generadas tras la expresión de ZFN, realizamos la tinción intranuclear de las RBI de todo el genoma para la inmunodetección de los focos de P53BP1 como una medición no sesgada de la acción de ZFN por todo el núcleo. La P53BP1 se lleva a los sitios de las RBI al comienzo de la respuesta de reparación y es necesaria para la NHEJ (Schultz et al. (2000) J. Cell Biol. 151: 1381-1390). Brevemente, 24 horas después de la transducción de los linfocitos T CD4+ con los vectores Ad5/35 que expresan las ZFN dirigidas a CCR5, se determinó el número de focos inmunorreactivos de P53BP1 por núcleo de los linfocitos T CD4.
Se realizó la tinción intranuclear de P53BP1 mediante fijación con metanol o paraformaldehído seguida de la permeabilización nuclear con Triton al 0,5%. Los anticuerpos anti-P53BP1 de conejo purificados por afinidad (Bethel Laboratories) y el anticuerpo secundario F(ab')2 Alexa Fluor™ 488 de cabra anti-IgG (H+L) de conejo eran de Invitrogen. Los anticuerpos se utilizaron a una concentración final a 2 a 5 1g/ml. Se realizó la microscopia de epifluorescencia utilizando un Zeiss Axioplan-II (Thornwood NY) con un objetivo 63x Plan Apo de Zeiss que tiene una apertura numérica de 1,4.
Las imágenes se adquirieron y analizaron utilizando los módulos de adquisición y clasificación del paquete de programas informáticos Velocity™ (Lexington MA). Se realizó el análisis de las regiones independientes de fluorescencia de P53BP1 ajustando el tiempo de exposición y los umbrales para disminuir al mínimo la autofluorescencia y mediante la sincronización de la intensidad para incluir el 40% superior de fluorescencia. A continuación se enumeró y se midió cada región identificada. Sólo las regiones con fluorescencia verde que se colocalizaron con la fluorescencia del DAPI se incluyeron en los análisis finales.
Los resultados se muestran en la figura 20. No hubo ninguna diferencia significativa en el número medio de focos de P53BP1 intranucleares cuando se compararon linfocitos T CD4 transducidos con ZFN 224 y los no transducidos. Por el contrario, las células de control positivo tratadas con etopósido (p = 0,004) o las células transducidas con un vector Ad5/35 que expresa la ZFN 215 (p = 0,003) mostraron una elevación estadísticamente significativa en los focos intranucleares de P53BP1 cuando se compararon con las células no transducidas. Además, no se observó ninguna diferencia significativa en el perímetro medio de los focos de P53BP1 entre todas las condiciones. El análisis del ADN confirmó que ZFN 215 y ZFN 224 escindían de forma equivalente el sitio diana pretendido en el gen de CCR5.
B. Determinación del sitio de unión de ZFN de consenso
Para confirmar la especificidad de la acción de ZFN 224, se determinaron los sitios de unión de ZFN de consenso y se encontró que coincidían con la única secuencia diana pretendida en CCR5. Las preferencias del sitio de unión para cada una de las 2 proteínas con dedos de zinc que comprenden ZFN-224 se analizaron mediante el siguiente método de selección del sitio: (1) primero, una versión de la ZFP de interés etiquetada con el epítopo HA se expresó mediante el sistema de traducción-transcripción acoplada rápida TnT (Promega), y se incubó con un conjunto de secuencias de ADN parcialmente aleatorizadas en presencia de fragmentos Fab biotinilados anti-HA (Roche) y ADN competidor poli-dIdC (Sigma); (2) la proteína (junto con cualquier secuencia de ADN unida productivamente) se capturó en perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina (Dynal); (3) las perlas magnéticas se colocaron en una mezcla máster de PCR de Roche que contiene los cebadores apropiados y entonces el ADN unido se liberó y se amplificó por PCR. A continuación, este conjunto amplificado del ADN se utilizó como el conjunto de ADN de inicio para los ciclos posteriores de unión de ZFP, enriquecimiento y amplificación. Se repitieron los ciclos que comprendes las etapas (1) a (3) hasta un total de cuatro rondas de selección. Por último, se clonaron y se secuenciaron los fragmentos de ADN amplificados tras la ronda final. La región aleatorizada de cada secuencia de ADN se alineó para determinar la secuencia del sitio de unión de consenso para el dominio de unión al ADN de tipo dedo de zinc. Los sitios de unión de consenso determinados mediante este método concordaban con los sitios de unión especificados en la tabla 1.
Las preferencias de secuencia diana de las dos CCR5 ZFN de la pareja ZFN 224 (8196z y 8266, tabla 1), determinadas como se describe más arriba, se utilizaron para guiar una predicción bioinformática pangenómica de los posibles 15 mejores sitios no diana en el genoma humano. Este análisis bioinformático buscó y clasificó los posibles sitios no diana como sigue:
Todos los posibles sitios de unión del ADN para los dos miembros de la pareja ZFN 224 (8196z y 8266, tabla 1) se identificaron en el genoma humano, permitiendo hasta dos bases diferentes con las secuencias de consenso de cada sitio diana determinado como se describe más arriba.
Se identificaron todos los posibles sitios de escisión utilizando la lista completa de sitios de unión (identificados como se describió en el párrafo anterior) que permitieron que cualquiera de las dos ZFN (entre ellas, las homodimerizaciones y las heterodimerizaciones) se unieran en la configuración apropiada para presentar actividad nucleasa (a saber, la unión de las ZFN en los lados opuestos del ADN con un espaciado de 5 ó 6 pb entre ellos).
Entonces, la lista resultante de los posibles sitios de escisión se clasificó para dar prioridad a los sitios con la mayor similitud al consenso para cada ZFN, como se definió mediante el método de selección de sitio descrito más arriba. Brevemente, los datos de selección del sitio se utilizaron para crear una probabilidad para el reconocimiento de los cuatro nucleótidos (A, C, G o T) en cada una de las 12 posiciones del sitio de unión de cada ZFN. Cada posible sitio de unión a ZFN se puntuó como el producto de estas doce (12) probabilidades (obsérvese que para eliminar una puntuación o probabilidad de cero, a cada posición se le sumó 1 para cada nucleótido (A, C, G o T) antes de la normalización para asegurar que ninguna entrada en la tabla de probabilidad fuera cero). De igual forma, la puntuación para un sitio de escisión no diana dado (que requiere que dos de tales sitios de ZFN estén ocupados) se calculó como el producto de las dos puntuaciones dadas a cada uno de los dos sitios de unión de ZFN que comprenden el posible sitio de escisión. De los 15 sitios identificados, 7 caían dentro de los genes anotados y 2 de éstos cayeron dentro de la secuencia exónica. Estos siete genes comparten las características siguientes; (i) su mutación o disrupción no se ha conectado con ninguna enfermedad conocida; y (ii) con la excepción de CCR2, no tienen una función descrita en los linfocitos T CD4.
Los ensayos con la nucleasa Surveyor™ no revelaron ninguna actividad de ZFN detectable (límite de detección del 1%) en ninguno de estos sitios con la excepción de CCR2 (el familiar más cercano del gen CCR5 en el genoma humano). Observamos una modificación del 4,1% de los alelos de CCR2 en la población en las condiciones que revelaron un 35,6% de alelos de CCR5 modificados con ZFN. Sin embargo, la pérdida de CCR2 en los linfocitos T CD4 debería tolerarse bien ya que los ratones CCR2-/- muestran numerosos fenotipos leves asociados predominantemente con un retraso del tráfico y captación de macrófagos (Peters et al., (2000) J. Immunol. 165: 7072-7077). Los alelos mutantes de CCR2 se han correlacionado con un retraso del desarrollo del SIDA en las personas infectadas con el VIH, aunque no se observó ninguna influencia sobre la incidencia de la infección del VIH1 (Smith et al., (1997) Nat. Med. 3: 1052-1053). Por lo tanto, es poco probable que la mutación paralela de CCR2 sea perjudicial ni que pueda incrementar la protección de los linfocitos T CD4 modificados ante la infección del VIH.
La combinación del análisis específico de los sitios de unión consenso de ZFP respecto a los sitios no diana más parecidos en el genoma empleando la tinción intranuclear no sesgada para la generación de RBI pangenómicos indica que ZFN 224 es una nucleasa modificada genéticamente muy específica, cuya actividad sólo es medible sobre el gen de CCR5 y, a con unas 10 veces menos intensidad, en CCR2 (el homólogo de CCR5).
Ejemplo 18: selección in vivo de los linfocitos T CD4 primarios modificados por CCR5-ZFN
Un modelo de ratón NOG/SCID de infección del VIH se utilizó para comproba la transferencia adoptiva y la protección de la infección del VIH de los linfocitos T CD4 modificados con ZFN in vivo. Véase Schultz et al. (2007) Nat. Rev. Immunol. 7: 118.
Los linfocitos T CD4 primarios se transdujeron con los vectores Ad5/35 y se expandieron en cultivo utilizando perlas magnéticas recubiertas con anti-CD3/anti-CD28 en presencia de IL-2. Los ratones NOG/SCID (de 7 a 9 semanas de edad) se asignaron aleatoriamente a 2 grupos de tratamiento (n = 8 ratones por grupo) con una mezcla igual de machos y hembras en cada grupo. Se mantuvieron estos ratones en una instalación de animales con flora intestinal definida. Ambos grupos recibieron una inyección i.p. de 100 1l de PBS que contenía 7,5 millones de linfocitos T CD4 humanos primarios expandidos ex vivo con CCR5-ZFN y 1 millón de CMSP autólogas en reposo para favorecer el injerto en combinación. Además, los animales con tratamiento simulado recibieron 1 millón de CMSP autólogas activadas con PHA sin infectar, mientras que el grupo de animales infectados recibió 1 millón de CMSP activadas con PHA infectadas con el VIH-1US1 CCR5-tropo.
Para valorar el injerto, se realizó la toma de muestras de sangre periférica 3 o 4 semanas después de la transferencia adoptiva y se analizó el injerto mediante citometría de flujo para los CD45, CD4 y CD8 humanos. Después de 4,5 semanas se sacrificaron los ratones y los linfocitos T CD4 esplénicos se purificaron utilizando el kit de separación Miltenyi MACS. Sólo se utilizaron para el análisis final las muestras con una pureza de más del 75%. Para determinar la frecuencia de la disrupción de CCR5, se empleó un ensayo con la nucleasa Surveyor™ modificado mediante una estrategia de PCR anidada para retirar totalmente el ADN genómico contaminante de ratón. El ADN de los linfocitos CD4 esplénicos purificados se amplificó utilizando primero con 50 pmol de cebadores externos (R5-det-out-F1: (SEQ ID n.º 31); C5_HDR_R:
(SEQ ID n.º 32)) durante 25 ciclos (30 s a 95 ºC; 30 s a 58 ºC, y 3 min a 68 ºC), el material resultante se purificó en gel, y se realizó el ensayo de la nucleasa Surveyor™ sobre el producto purificado según las recomendaciones de los fabricantes.
Transcurrido un mes desde infección del VIH in vivo, se sacrificaron los ratones y el ADN genómico de los linfocitos T CD4 humanos purificados del bazo se utilizó para el análisis de la disrupción de CCR5 mediada por ZFN, utilizando el ensayo con la nucleasa Surveyor™ descrito más arriba. Se descartaron del análisis las muestras de dos ratones (uno infectado con el VIH y otro con la infección simulada) debido a la purificación inadecuada de los linfocitos CD4.
Todos los grupos mostraron un injerto igual, aunque los grupos infectados con el VIH mostraron una proporción reducida de linfocitos CD4 por CD8, coherente con el agotamiento de los linfocitos T CD4 inducido por el VIH.
Además, la figura 21 muestra que se observó un enriquecimiento de unas 3 veces para los alelos de CCR5 con disrupción por ZFN en el grupo infectado con el VIH (disrupción media de CCR5 del 27,5%), en comparación con los animales que recibieron una población de comienzo idéntica de linfocitos T CD4 tratados con ZFN en ausencia de infección del VIH (grupo de simulación, disrupción media de CCR5 del 8,5%, p = 0,008).
Estos datos demuestran (i) una ventaja selectiva para los linfocitos T CD4+ humanos primarios transducidos con ZFN en presencia del VIH-1 in vivo, y (ii) un injerto y crecimiento normales de estas mismas células transducidas con ZFN en ausencia de esta presión selectiva. Estos datos indican que la introducción transitoria de las ZFN modificadas genéticamente tuvo éxito a la hora de reproducir el genotipo nulo de CCR5L32 (y los fenotipos resultantes).
Por lo tanto, las ZFN que se describen en la presente memoria escinden específicamente en el gen de CCR5 y provocan la disrupción permanente de más del 50% de los alelos de CCR5 en la mayor parte de una población de linfocitos T CD4+ primarios. Además, la disrupción genética de CCR5 por las ZFN proporciona una protección robusta, estable y heredable contra la infección del VIH-1 in vitro e in vivo. Los linfocitos T CD4 modificados por ZFN se injertan y proliferan con normalidad cuando se estimulan.

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Proteína que comprende un dominio de unión al ADN con dedos de zinc modificada genéticamente, en la que el dominio de unión al ADN comprende cuatro regiones de reconocimiento de dedo de zinc como sigue:
    5 2. Proteína que comprende un dominio de unión al ADN con dedos de zinc modificada genéticamente, en la que el dominio de unión al ADN comprende cuatro regiones de reconocimiento de dedo de zinc como sigue:
  2. 3.
    Proteína que comprende un dominio de unión al ADN con dedos de zinc modificada genéticamente, en la que el dominio de unión al ADN comprende cuatro hélices de reconocimiento de dedo de zinc como sigue:
  3. 4.
    Proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que además comprende un dominio de escisión.
  4. 5.
    Proteína de acuerdo con la reivindicación 4, en la que el dominio de escisión es un semidominio de escisión.
  5. 6.
    Proteína de acuerdo con la reivindicación 5, en la que el semidominio de escisión es un semidominio de escisión 15 de FokI de tipo silvestre.
  6. 7.
    Proteína de acuerdo con la reivindicación 5, en la que el semidominio de escisión es un semidominio de escisión de FokI modificado genéticamente.
  7. 8.
    Polinucleótido que codifica la proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
  8. 9.
    Vector para transferencia génica, que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 8. 20 10. Vector para transferencia génica de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el vector es un vector adenovírico.
  9. 11.
    Vector para transferencia génica de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el vector adenovírico es un vector Ad5/35.
  10. 12.
    Célula aislada que comprende la proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 8.
    25 13. Célula de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la célula se selecciona entre el grupo que consiste en una célula troncal hematopoyética, un linfocito T, un macrófago, una célula dendrítica y una célula presentadora de antígeno.
  11. 14. Célula de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el linfocito T es un linfocito CD4+.
  12. 15. Célula de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la célula se selecciona entre el grupo que consiste en una 30 célula K562, una célula HEK293, una PM-1, una célula THP-1 y una línea celular GHOST.
  13. 16. Método para inactivar el gen de CCR-5 en una célula humana aislada, comprendiendo el método la introducción de una proteína en la célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7; un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 8 o un vector para transferencia génica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.
    35 17. Método de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la célula aislada se selecciona entre el grupo que consiste en una célula troncal hematopoyética, un linfocito T, un macrófago, una célula dendrítica y una célula presentadora de antígeno.
  14. 18.
    Método de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el linfocito T es un linfocito CD4+ aislado.
  15. 19.
    Método de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la célula aislada se selecciona entre el grupo que consiste en una célula K562, una célula HEK293, una PM-1, una célula THP-1 y una línea celular GHOST.
  16. 20. Utilización de un primer ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 8 que codifica un primer polipéptido, en 5 donde el primer polipéptido comprende
    (i) un dominio de unión al ADN con dedos de zinc que está modificado genéticamente para que se una a un primer sitio diana en el gen de CCR5; y
    (ii) un dominio de escisión; para preparar un medicamento para tratar o prevenir la infección del VIH en un sujeto.
    10 21. Utilización de acuerdo con la reivindicación 20, en la que el primer ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7 codifica además un segundo polipéptido, en la que el segundo polipéptido comprende:
    (i)
    un dominio de unión al ADN con dedos de zinc que está modificado genéticamente para que se una a un segundo sitio diana en el gen de CCR5; y
    (ii)
    un dominio de escisión.
    15 22. Utilización de acuerdo con la reivindicación 20, que comprende además un segundo ácido nucleico que contiene dos regiones de homología con el gen de CCR-5 que flanquean una secuencia que no es homóloga a la del gen de CCR-5.
    CNT
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