CN102234628A - Ccr5缺失型的造血干细胞及其制备方法与应用 - Google Patents

Ccr5缺失型的造血干细胞及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN102234628A
CN102234628A CN2011101156808A CN201110115680A CN102234628A CN 102234628 A CN102234628 A CN 102234628A CN 2011101156808 A CN2011101156808 A CN 2011101156808A CN 201110115680 A CN201110115680 A CN 201110115680A CN 102234628 A CN102234628 A CN 102234628A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ccr5
stem cell
hemopoietic stem
zinc finger
finger nuclease
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2011101156808A
Other languages
English (en)
Inventor
陈小平
姚永超
秦莉
那顺巴雅尔
赵思婷
覃丽梅
何正祥
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
STATE KEY LABORATORY OF RESPIRATORY DISEASE
Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Original Assignee
STATE KEY LABORATORY OF RESPIRATORY DISEASE
Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by STATE KEY LABORATORY OF RESPIRATORY DISEASE, Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS filed Critical STATE KEY LABORATORY OF RESPIRATORY DISEASE
Priority to CN2011101156808A priority Critical patent/CN102234628A/zh
Publication of CN102234628A publication Critical patent/CN102234628A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开一种制备自体CCR5缺失的造血干细胞的方法，将CCR5特异性锌指核酸酶表达质粒与绿色荧光蛋白和嘌呤霉素重组质粒共转染到人诱导多潜能干细胞，特异性地使人诱导多潜能干细胞的CCR5基因插入失活，再经过体外定向诱导分化，得到CCR5缺失型的造血干细胞。本发明的造血干细胞，可用于治疗艾滋病，为艾滋病的干细胞治疗提供一个新方法。

Description

CCR5缺失型的造血干细胞及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种自体CCR5缺失的造血干细胞及其制备方法与应用。
背景技术
艾滋病(AIDS)是威胁全人类的严重传染病。至今为止，人类尚未发明根治艾滋病的方法，也未发明有效的艾滋病预防性疫苗。高效抗逆转录病毒疗法(HARRT，俗称“鸡尾酒”疗法)可以抑制艾滋病病毒(HIV)的复制，有效缓解病情，显著降低病死率，但不能彻底清除体内的病毒，停药后病毒会迅速反弹，因此无法达到根治的目的。通过研究HIV感染细胞的过程知道，HIV通过与T细胞膜的受体CD4和辅助受体CCR5、CXCR4等细胞膜分子的相互作用而进入细胞并在细胞内复制。过去的研究已经阐明CCR5基因功能丧失(如CCR5Δ32纯合子)的人不感染HIV，但这种人可以正常生活，说明CCR5的功能并非不可或缺。最近报道一例患白血病的HIV感染者在接受CCR5Δ32纯合子供者的异体骨髓移植(治疗白血病)之后，其体内的HIV病毒载量持续在可测水平以下，在没有HAART治疗的情况下，HIV“消失”长达两年，并证明这是世界上首例通过干细胞移植获得治愈的艾滋病患者。
艾滋病的细胞移植治疗的成功为艾滋病患者带来新的希望，但这只是小概率事件，因为CCR5Δ32纯合子的人只有极少的一部分，在中国，比例更低，因此要为艾滋病患者找到相同配型的CCR5Δ32纯合子供体的机会很小。同时，尽管找到相同配型的CCR5Δ32纯合子供体，这种异体移植需要清除患者自身的骨髓细胞，因而导致大约三分之一的病人死亡，有幸存活的病人还要终生服用免疫抑制剂来对抗免疫排斥反应。而基因打靶技术，可以按要求改造目的基因，这就意味着可以将野生型CCR5变为突变失活型的CCR5。锌指核酸酶技术的出现，又极大地提高了目的基因敲除的效率。利用锌指核酸酶技术敲除CCR5基因已经在T细胞和造血干细胞中得以实现。并且，敲除CCR5基因的T细胞用于治疗艾滋病已经进入了临床试验阶段。
但传统的基于造血干细胞和T淋巴细胞的基因治疗无法逾越转染效率低和造血干细胞无法在体外有效扩增的瓶颈。诱导多潜能干细胞(iPS)技术自从2007年由日本科学家发明以来，受到了科学界的广泛重视。iPS技术可以以自体体细胞为来源，将细胞重编程为类似胚胎干细胞的多潜能干细胞，这种细胞有分化为多种组织细胞的潜能，可以在体外长期传代培养并保持未分化状态。由于iPS细胞来源于自身的体细胞，因而取材方便，同时可避免移植排斥反应。因此，将iPS细胞应用于治疗疾病，有着相当大的前景。
发明内容
本发明提供种一种制备自体CCR5缺失的造血干细胞的方法。
本发明的具体技术方案如下：
一种制备造血干细胞的方法，所述的制备方法包括如下步骤：
(1)构建CCR5特异性锌指核酸酶表达载体；
(2)构建同源重组供体质粒；
(3)对人多潜能干细胞中的CCR5基因进行敲除，并采用绿色荧光蛋白和嘌呤霉素进行筛选阳性细胞的筛选，得到CCR5基因敲除的人多潜能干细胞；
(4)诱导CCR5基因敲除的人诱导多潜能干细胞进行分化，得到CCR5基因敲除型造血干细胞。
优选的，所述的步骤(1)的CCR5特异性锌指核酸酶表达载体，其表达一对锌指核酸酶，并在该对锌指核酸酶之间通过2A序列连接。
优选的，所述的步骤(1)的CCR5特异性锌指核酸酶表达的载体具有控制CCR5特异性锌指核酸酶表达的启动子，包括CAG启动子或EF1-α启动子。
优选的，步骤(2)所述的同源重组供体质粒，其筛选标记的两端为CCR5的同源臂。
优选的，步骤(4)使用OP9小鼠骨髓基质细胞共培养诱导分化步骤(3)获得的CCR5基因敲除的人多潜能干细胞。
本发明通过在人iPS细胞中表达CCR5特异性的锌指核酸酶，特异性地切断iPS细胞的CCR5基因，随后与同源重组载体发生重组，导致CCR5基因处插入了筛选标记。将筛选标记筛选得到的iPS细胞与OP9小鼠骨髓基质细胞体外共培养，从而将iPS细胞定向分化成CCR5缺失的造血干细胞。
采用本发明上述制备方法获得的造血干细胞，所述的造血干细胞其自体CCR5缺失，并具有绿色荧光蛋白和嘌呤霉素抗性。
上述CCR5缺失的造血干细胞可应用于治疗艾滋病。
本发明将具有如下有益效果：
本发明提供的一种制备自体CCR5缺失的造血干细胞的方法，可用于大量制备艾滋病患者的自体造血干细胞。因为这种造血干细胞来源于iPS细胞，所以可以通过大量培养iPS细胞分化得到大量的造血干细胞。此造血干细胞的CCR5基因已经被插入失活，因此将CCR5基因插入失活的造血干细胞移植到艾滋病患者体内后，由其分化而来的免疫细胞不再表达CCR5基因，不再被HIV感染，达到治疗艾滋病的目的。
下面将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
附图说明
图1是锌指核酸酶联合同源重组特异性敲出CCR5基因的示意图；其中：ZFNs expressionvector：锌指核酸酶表达载体；Donor vector：同源重组供体质粒；CAG Promoter：CAG启动子；ZFN-L和ZFN-R：锌指核酸酶1和锌指核酸酶2；polyA：终止子；2A：2A序列；EF1alpha：EF1-α启动子；EGFP：绿色荧光蛋白基因；Puro：嘌呤霉素抗性基因；5’arm和3’arm：5’端和3’端同源臂；Fok I：锌指核酸酶中的Fok I核酸酶部分；CCR5locus：CCR5等位基因；EX1，EX2和EX3：CCR5基因的外显子1，外显子2和外显子3。
图2是不同比例的同源重组载体与锌指核酸酶表达载体共转染iPS细胞后嘌呤霉素抗性克隆数量图；其中：PuroR colonies/106cells：一百万个细胞中嘌呤霉素抗性克隆数；Donor∶ZFNs：同源重组质粒与锌指核酸酶表达质粒的比例。
图3是CCR5敲除后的iPS克隆荧光图。
图4是CCR5敲除后的iPS克隆碱性磷酸酶染色图；
图5A是CCR5敲除后的iPS克隆SSEA-1染色图；
图5B是CCR5敲除后的iPS克隆SSEA-4染色图；
图5C是CCR5敲除后的iPS克隆TRA-1-60染色图；
图5D是CCR5敲除后的iPS克隆TRA-1-810染色图；
图6A是CCR5敲除后的iPS克隆体外定向造血分化2天图；
图6B是CCR5敲除后的iPS克隆体外定向造血分化4天图；
图6C是CCR5敲除后的iPS克隆体外定向造血分化6天图；
图6D是CCR5敲除后的iPS克隆体外定向造血分化8天图；
图7A是CCR5敲除后的iPS克隆体外定向造血分化2天检测CD34的流式细胞分析图；
图7B是CCR5敲除后的iPS克隆体外定向造血分化4天检测CD34的流式细胞分析图；
图7C是CCR5敲除后的iPS克隆体外定向造血分化6天检测CD34的流式细胞分析图；
图7D是CCR5敲除后的iPS克隆体外定向造血分化8天检测CD34的流式细胞分析图；
图7E是CCR5敲除后的iPS克隆体外定向造血分化10天检测CD34的流式细胞分析图；
图7F是CCR5敲除后的iPS克隆体外定向造血分化12天检测CD34的流式细胞分析图；
图8是几种多潜能干细胞体外定向造血分化比较图；其中：CD34+cells in coculture(％)：共培养体系中，CD34+造血干细胞的百分比；H9：H9胚胎干细胞；Δ5H9：敲除CCR5基因的H9胚胎干细胞；hiPS：诱导多潜能干细胞；Δ5hiPS敲除CCR5基因的诱导多潜能干细胞。
图9A是CCR5缺失型造血干细胞集落分析CFC-M集落图；
图9B是CCR5缺失型造血干细胞集落分析CFC-G集落图；
图9C是CCR5缺失型造血干细胞集落分析CFC-GM集落图；
图9D是CCR5缺失型造血干细胞集落分析CFC-GEMM集落图；
图9E是CCR5缺失型造血干细胞集落分析CFC-E集落图。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：
将iPS细胞中的CCR5基因敲除，体外诱导分化成CCR5缺失型的造血干细胞。
CCR5基因敲除相关载体的构建(图1)：
1、CCR5特异性锌指核酸酶表达载体的构建。以pXL-Bac II(Malcolm J.Fraser，Universityof Notre Dame赠送)载体为基础，首先将CAG启动子(参考文献：Alexopoulou A，CouchmanJ，Whiteford J.The CMV early enhancer/chicken βactin(CAG)promoter can be used to drivetransgene expression during the differentiation of murine embryonic stem cells into vascularprogenitors.BMC Cell Biology.2008；9：2)用Sal I和BamH I双酶切克隆到载体上，得到pXG载体。再将合成的一对CCR5特异性锌指核酸酶基因(锌指核酸酶1基因：ATGGACTACAAGGACCACGATGGCGATTACAAGGACCACGACATTGATTACAAGGACGATGATGACAAGATGGCACCAAAAAAGAAACGAAAAGTGGGCATCCACGGGGTCCCAGCCGCTATGGCAGAACGACCCTTTCAGTGCCGCATCTGTATGCGAAACTTCAGCGACAGATCCAACCTGTCTAGGCACATTCGCACTCATACCGGCGAGAAACCATTTGCTTGCGATATCTGTGGCAGAAAGTTCGCAATTAGCTCCAACCTGAATAGCCACACTAAAATCCATACCGGGTCCCAGAAGCCTTTTCAGTGCCGGATTTGTATGAGAAACTTCTCAAGGAGCGACAACCTGGCCCGACACATCAGAACCCATACTGGAGAGAAACCATTTGCCTGCGATATTTGTGGTCGGAAGTTCGCTACCAGCGGCAACCTGACCAGACACACAAAAATCCATCTGAGGGGCAGTCAGCTCGTCAAGTCAGAACTGGAGGAAAAGAAATCCGAGCTGAGACATAAGCTGAAATACGTGCCCCACGAGTATATCGAACTCATCGAGATTGCACGAAATTCTACACAGGACCGGATTCTGGAAATGAAAGTGATGGAGTTCTTTATGAAGGTCTACGGATATCGCGGCAAGCATCTGGGCGGGTCTCGAAAGCCAGATGGCGCTATCTATACTGTGGGGAGTCCCATCGACTACGGAGTGATTGTCGATACCAAGGCCTACAGCGGCGGTTATAACCTGCCTATCGGCCAGGCTGACGAGATGCAGAGATATGTGGAGGAAAACCAGACAAGGAACAAGCACATTAACCCCAATGAATGGTGGAAGGTGTACCCTTCTAGTGTCACTGAGTTCAAGTTTCTGTTCGTCTCTGGACATTTTAAGGGCAACTATAAGGCACAGCTGACCCGGCTGAACCACATCACAAACTGCAATGGCGCCGTGCTGAGCGTCGAGGAACTGCTCATCGGCGGGGAAATGATTAAGGCCGGAACCCTGACACTGGAGGAAGTGCGGAGAAAGTTTAACAATGGCGAGATTAACTTC
锌指核酸酶2基因：
ATGGATTACAAAGACCATGATGGCGACTATAAGGATCACGACATCGACTACAAAGACGATGACGATAAGATGGCTCCCAAGAAAAAGAGGAAGGTCGGCATCCACGGCGTGCCCGCCGCAATGGCAGAACGACCATTTCAGTGCCGCATTTGTATGCGAAACTTCTCCCGGTCTGACAATCTGAGCGTGCATATCAGAACCCATACCGGGGAGAAGCCCTTTGCATGCGATATTTGTGGAAGAAAATTCGCCCAGAAGATCAACCTCCAAGTCCATACAAAAATTCATACTGGGGAAAAGCCTTTTCAGTGCAGAATCTGTATGAGGAATTTCAGTCGCTCAGACGTGCTGTCCGAACACATCAGGACACATACTGGCGAAAAGCCATTTGCTTGCGATATTTGTGGGCGCAAGTTCGCACAGAGAAACCACAGGACCACACATACCAAGATTCACCTGCGGGGATCTCAGCTCGTCAAGTCAGAACTGGAGGAAAAGAAATCCGAGCTGAGACATAAGCTGAAATACGTGCCCCACGAGTATATCGAACTCATCGAGATTGCACGAAATTCTACACAGGACCGGATTCTGGAAATGAAAGTGATGGAGTTCTTTATGAAGGTCTACGGATATCGCGGCAAGCATCTGGGCGGGTCTCGAAAGCCAGATGGCGCTATCTATACTGTGGGGAGTCCCATCGACTACGGAGTGATTGTCGATACCAAGGCCTACAGCGGCGGTTATAACCTGCCTATCGGCCAGGCTGACGAGATGCAGAGATATGTGGAGGAAAACCAGACAAGGAACAAGCACATTAACCCCAATGAATGGTGGAAGGTGTACCCTTCTAGTGTCACTGAGTTCAAGTTTCTGTTCGTCTCTGGACATTTTAAGGGCAACTATAAGGCACAGCTGACCCGGCTGAACCACATCACAAACTGCAATGGCGCCGTGCTGAGCGTCGAGGAACTGCTCATCGGCGGGGAAATGATTAAGGCCGGAACCCTGACACTGGAGGAAGTGCGGAGAAAGTTTAACAATGGCGAGATTAACTTC)，中间用2A序列(GTCAAACAGACCCTGAACTTCGACCTGCTGAAGCTGGCTGGGGATGTGGAGAGCAATCCCGGACCT)连接后，用BamHI和BglII双酶切后一起克隆到pXG载体上，在其后面加上polyA终止子(CGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATG)，最后得到CCR5特异性锌指核酸酶表达载体pXG-ZFNs。
2、同源重组供体质粒的构建。提取iPS细胞基因组为模板，PCR方法分别扩增CCR5基因5’(引物：AAACCTTCAGACCAGAGATCTATTC和ATAGGATCCAACCAAAGATGAACACCAG)和3’(ATAGGATCCAAGAGCATGACTGACATCTACC和ATAGTCGACACTACTAGGTAATCAATCCTCACC)端的同源臂，然后将扩增到的PCR产物分别构建到pUC19载体(Invitrogen)上得到pUC19-53R。然后分别用PCR方法扩增EF1-α启动子(参考文献Serafini M，Bonamino M，Golay J，Introna M.Elongation factor 1(EF1alpha)promoter in a lentiviral backbone improves expression of the CD20suicide gene in primary Tlymphocytes allowing efficient rituximab-mediated lysis.Haematologica.2004；89：86-95.)引物：TAGATTAATAAGAGCATGCGTGAGGCTCC和AATGCTAGCTTTTCACGACACCTGAAATGG)，EGFP基因(序列为ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG)，引物：TTAAGATCTTAGCGCTACCGGTCGCCAC和TATGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC，2A序列(引物：TTAAGATCTGGCGTCAAACAGACCCTGAAC和TATTCTAGAAGGTCCGGGATTGCTCTCC)，嘌呤霉素抗性基因(序列为ATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGTGCCCGAAGGACCGCGCGACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCC)(引物：TTATCTAGAATGACCGAGTACAAGCCCACGG  和ATAGTCGACTCAGGCACCGGGCTTGCG)，polyA终止子(引物：ATAGTCGACCGACTGTGCCTTCTAGTTGCC和ACTAAGCTTAGAAGCCATAGAGCCCACCG)。将扩增的PCR产物按先后顺序克隆到pUC19-53R质粒的CCR5两同源臂中间，得到CCR5的同源重组供体质粒。
人iPS细胞中的CCR5基因敲除：
用mTesR1培养基(Stem Cell公司)培养iPS细胞，使细胞保持未分化状态。将CCR5的同源重组供体质粒与CCR5特异性锌指核酸酶表达载体按不同比例用转染试剂共转染到未分化的iPS细胞中，两天后在培养基中加入嘌呤霉素到终浓度为1μg/mL。再经过4天的培养，得到不同数量的具有嘌呤霉素抗性的iPS克隆团(图2)。经过多次传代培养后，嘌呤霉素抗性的克隆团稳定表达绿色荧光蛋白，表明CCR5的同源重组供体质粒已经稳定地整合到iPS细胞的基因组(图3)。CCR5的敲除应不影响到iPS细胞的未分化状态，采用两种方法验证其全能性。一是碱性磷酸酶染色，阳性的着色深，表明该细胞还保持着未分化状态(图4)。二是免疫荧光染色，未分化的iPS细胞是SSEA-1阴性(图5A)，SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81阳性的细胞(图5B、5C、5D)。
体外定向分化得到CCR5缺失型的造血干细胞：
将鼠OP9骨髓基质细胞接种于0.1％明胶处理过的六孔细胞培养板上，用OP9细胞培养基培养。OP9细胞培养基组成为：α-MEM液体培养基+20％Defined FBS。OP9细胞在培养板上连续培养8天，其中第4天将培养基换一半。将未分化的CCR5缺失型iPS细胞用dispase酶处理7分钟后，轻轻吹打成小块，300g离心后用分化培养基重悬，接种于已经培养8天后的OP9细胞上。分化培养基组成：α-MEM液体培养基+10％Defined FBS+100μMmonothioglycerol。OP9共培养造血分化体系从第4天起每两天半换培养基一次。每两天进行一次显微镜观察(图6A、6B、6C、6D)。同时，进行流式细胞分析，检测分化出的造血干细胞的状况(图7A、7B、7C、7D、7E、7F)。结果表明，CD34+造血干细胞在第6天开始出现，每10天达到最大值。CCR5缺失型的iPS细胞的分化模式与未敲除CCR5的iPS细胞及胚胎干细胞的分化模式基本相同(图8)。用Stem Cell公司的克隆形成集落分析试剂盒对CCR5缺失型的造血干细胞进行分析，经过14-21天的培养，造血干细胞形成了各种血液系统中的细胞集落(图9A、9B、9C、9D、9E)。结果表明通过本发明方法得到的CCR5缺失型的造血干细胞具有分化成血液系统中各种细胞的能力。因此，通过本发明方法得到的CCR5缺失型的造血干细胞具有移植并治疗艾滋病的潜能。
Figure IDA0000086228910000021
Figure IDA0000086228910000031
Figure IDA0000086228910000041
Figure IDA0000086228910000051

Claims (7)

1.一种制备造血干细胞的方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：
(1)构建CCR5特异性锌指核酸酶表达载体；
(2)构建同源重组供体质粒；
(3)对人多潜能干细胞中的CCR5基因进行敲除，并采用绿色荧光蛋白和嘌呤霉素进行筛选阳性细胞的筛选，得到CCR5基因敲除的人多潜能干细胞；
(4)诱导CCR5基因敲除的人诱导多潜能干细胞进行分化，得到CCR5基因敲除型造血干细胞。
2.根据权利要求1所述的制备自体CCR5缺失的造血干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤(1)的CCR5特异性锌指核酸酶表达载体，其表达一对锌指核酸酶，并在该对锌指核酸酶之间通过2A序列连接。
3.根据权利要求1所述的制备自体CCR5缺失的造血干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤(1)的CCR5特异性锌指核酸酶表达的载体具有控制CCR5特异性锌指核酸酶表达的启动子，包括CAG启动子或EF1-α启动子。
4.根据权利要求1所述的制备自体CCR5缺失的造血干细胞的方法，其特征在于，步骤(2)所述的同源重组供体质粒，其筛选标记的两端为CCR5的同源臂。
5.根据权利要求1所述的制备自体CCR5缺失的造血干细胞的方法，其特征在于，步骤(4)使用OP9小鼠骨髓基质细胞共培养诱导分化步骤(3)获得的CCR5基因敲除的人多潜能干细胞。
6.根据权利要求1所述的制备方法获得的造血干细胞，其特征在于，所述的造血干细胞其自体CCR5缺失，并具有绿色荧光蛋白和嘌呤霉素抗性。
7.根据权利要求6所述的造血干细胞在治疗艾滋病的应用。
CN2011101156808A 2011-05-06 2011-05-06 Ccr5缺失型的造血干细胞及其制备方法与应用 Pending CN102234628A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2011101156808A CN102234628A (zh) 2011-05-06 2011-05-06 Ccr5缺失型的造血干细胞及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2011101156808A CN102234628A (zh) 2011-05-06 2011-05-06 Ccr5缺失型的造血干细胞及其制备方法与应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102234628A true CN102234628A (zh) 2011-11-09

Family

ID=44885756

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2011101156808A Pending CN102234628A (zh) 2011-05-06 2011-05-06 Ccr5缺失型的造血干细胞及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102234628A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102586324A (zh) * 2012-01-17 2012-07-18 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种用于基因治疗的细胞的构建方法及制得的细胞

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060275371A1 (en) * 2005-05-10 2006-12-07 Hongjie Dai Hydrophobic nanotubes and nanoparticles as transporters for the delivery of drugs into cells
WO2007014181A2 (en) * 2005-07-25 2007-02-01 Johns Hopkins University Site-specific modification of the human genome using custom-designed zinc finger nucleases
EP2206782A1 (en) * 2006-05-25 2010-07-14 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for gene inactivation
WO2010107493A2 (en) * 2009-03-20 2010-09-23 Sangamo Biosciences, Inc. Modification of cxcr4 using engineered zinc finger proteins
WO2011005849A1 (en) * 2009-07-08 2011-01-13 Cellular Dynamics International, Inc. Modified ips cells having a mutant form of human immunodeficiency virus (hiv) cellular entry gene

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060275371A1 (en) * 2005-05-10 2006-12-07 Hongjie Dai Hydrophobic nanotubes and nanoparticles as transporters for the delivery of drugs into cells
WO2007014181A2 (en) * 2005-07-25 2007-02-01 Johns Hopkins University Site-specific modification of the human genome using custom-designed zinc finger nucleases
EP2206782A1 (en) * 2006-05-25 2010-07-14 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for gene inactivation
WO2010107493A2 (en) * 2009-03-20 2010-09-23 Sangamo Biosciences, Inc. Modification of cxcr4 using engineered zinc finger proteins
WO2011005849A1 (en) * 2009-07-08 2011-01-13 Cellular Dynamics International, Inc. Modified ips cells having a mutant form of human immunodeficiency virus (hiv) cellular entry gene

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HYE JOO KIM, 等: "Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly", 《GENOME RESEARCH》 *
NATHALIA HOLT, 等: "Zinc finger nuclease-mediated CCR5 knockout hematopoietic stem cell transplantation controls HIV-1 in vivo", 《NATURE BIOTECHNOLOGY》 *
PEREZ EE, 等: "Establishment of HIV-1 resistance inCD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases", 《NATURE BIOTECHNOLOGY》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102586324A (zh) * 2012-01-17 2012-07-18 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种用于基因治疗的细胞的构建方法及制得的细胞

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109715171A (zh) 基因组编辑增强子
CN105518134A (zh) CRISPR-Cas9特异性敲除猪SLA-2基因的方法及用于特异性靶向SLA-2基因的sgRNA
CN106755091A (zh) 基因敲除载体，mh7a细胞nlrp1基因敲除方法
JP2019520844A5 (zh)
JP2017513477A5 (zh)
CN105492609A (zh) CRISPR-Cas9特异性敲除猪GGTA1基因的方法及用于特异性靶向GGTA1基因的sgRNA
CN105518135A (zh) CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法及用于特异性靶向CMAH基因的sgRNA
CN105518138A (zh) CRISPR-Cas9特异性敲除猪GFRA1基因的方法及用于特异性靶向GFRA1基因的sgRNA
CN105518137A (zh) CRISPR-Cas9特异性敲除猪SALL1基因的方法及用于特异性靶向SALL1基因的sgRNA
CN105492608A (zh) CRISPR-Cas9特异性敲除猪PDX1基因的方法及用于特异性靶向PDX1基因的sgRNA
CN110234762A (zh) 用于治疗肌强直性营养不良的组合物和方法
CN104046593A (zh) 一种低免疫原性的人细胞及其制备方法
CN110106201A (zh) 一种可控永生化的逆转录病毒载体和人脐带间充质干细胞及其构建方法
CN102965341A (zh) 永生化人脐带间充质干细胞系及其建立方法和应用
Léon et al. The EB66® cell line as a valuable cell substrate for MVA-based vaccines production
CN104450620A (zh) 一种携带双自杀基因的可回复永生化肝细胞株及其构建方法
CN104099371A (zh) Kap26.1基因作为引入绒山羊细胞改善绒毛细度的外源基因的应用
CN108220243B (zh) 一种多能干细胞及其分化的t细胞和应用
WO2020125576A1 (zh) 一种在细胞中递送基因的方法
CN102234628A (zh) Ccr5缺失型的造血干细胞及其制备方法与应用
CN107217071A (zh) 一种重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒、构建方法及其应用
CN111057719B (zh) 一种高效的小鼠骨髓来源巨噬细胞的转染方法及其应用
CN103146755A (zh) 体外慢病毒介导bmp-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法
JP5006312B2 (ja) バキュロウイルスベクターを使用して核酸分子を胚性幹細胞に送達する方法
CN101074428B (zh) 一种促进胚胎干细胞向心肌细胞分化的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20111109

RJ01 Rejection of invention patent application after publication