JP5006312B2 - バキュロウイルスベクターを使用して核酸分子を胚性幹細胞に送達する方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2005年5月27日に出願の米国仮特許出願第60/684,958号からの優先権の利益を主張し、この内容は、参照により本明細書に援用される。
本発明は、一般に幹細胞への核酸分子の送達に、および特に胚性幹細胞へのウイルスのベクターによる核酸分子の送達に関する。
一過性または長期発現のいずれかを媒介することができる多用途遺伝子導入ベクターは、再生医療および基礎生物学的研究の両方の目的のための胚性幹(ES)細胞の遺伝子工学に必要である。さらに、細胞ゲノムへの組み込みのために遺伝子が幹細胞に送達されるときに、定義された遺伝子座での染色体組み込みは、安定な導入遺伝子発現のためのランダムな組み込みと比較して、一般的に好ましい。
実施例1
本明細書において、本発明者らは、バキュロウイルス感染したヒトおよびマウス胚性幹細胞における導入遺伝子の高レベル発現を記述する。本発明者らは、無血清培地において懸濁された幹細胞に感染させるために、ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子(immediately early gene)エンハンサー/プロモーターを内包するバキュロウイルスを使用し、ヒト胚性幹細胞において高い形質導入効率を得た。感染した幹細胞は、増殖し続け、形態学的に明らかな変化を示さず、神経細胞に分化することができた。
バキュロウイルスベクターの調製:リポーター遺伝子を有するバキュロウイルスベクターを作製するために、ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーターおよびエンハンサーの制御下にある増強緑色蛍光タンパク質(eGFP)cDNAを導入プラスミドpFastBac1(Gibco BRL、Life Technologies、Gaithersburg、MD、USA)に挿入した。プロモーターは、Not1とXba1との間に挿入し、eGFP cDNAはプロモーターの下流にXho1とHindIIIの間に挿入した。
図1。フィーダー上で培養したES-D3細胞における、バキュロウイルスを媒介した導入遺伝子の発現。mES細胞を500のMOIにて、CMVプロモーターの制御下でeGFP遺伝子を含む組み換えバキュロウイルスに感染させた。感染後3日目のmES細胞の蛍光顕微鏡(上段)および位相差(下段)像を示した。
ES-D3細胞をマウス胚性線維芽細胞上で培養し、200および500のMOIにて、無血清培地中で37℃にて1時間、eGFPリポーター遺伝子を含むバキュロウイルスを形質導入した。導入遺伝子の発現は、感染後24時間に、1日インキュベーション後のマウスES細胞において1〜2%の効率で観察された。ウイルス粒子の吸収のため、フィーダー層における強い導入遺伝子の発現が観察された。インキュベーション後3日目まででは、eGFP発現の増大は見られなかった(図1)。
ここでは、本発明者らは、ヒト胚性幹(hES)細胞の遺伝子改変のための、バキュロウイルスベクターを使用した効率的な遺伝子導入方法であって、35%までのhES細胞において一過性の導入遺伝子発現をもたらす方法を記述する。ヒト19番染色体における部位特異的組み込みを媒介するために、アデノ随伴ウイルス(AAV)エレメントを使用したハイブリッドバキュロウイルスベクターを使用して、本発明者らは、長期の未分化増殖期間にて安定な導入遺伝子の発現を観察した。遺伝子発現は、それらの分化後でさえ、hES細胞によく保持された。
バキュロウイルスベクター調製:レポーター遺伝子、すなわちヒトEF-1αプロモーターの制御下における増強緑色蛍光タンパク質(eGFP)遺伝子を有するバキュロウイルスベクターを作製するために、ベクターpEGFP-C1(Clontech)由来のeGFP遺伝子をPCR増幅し、pFastBac1(Invitrogen)のEcoRIとSpeIとの間に挿入した。次いで、pEF1V5-HisA(Invitrogen)由来のEF-1αプロモーターをeGFP遺伝子の上流のBamHIとEcoRIとの間で発現カセットに挿入した。
図6。バキュロウイルスベクターによって媒介されるhES細胞における一過性導入遺伝子の発現。(A〜F)時間経過観察は、EF1αプロモーターの制御下にeGFP遺伝子を有する組み換えバキュロウイルスで形質導入後1日目(A、B)、3日目(C,D)、および7日目(E、F)のhES細胞コロニーを示す。位相差(A、C、E)および蛍光像(B、D、F)を示してある。(G)形質導入後2日目のeGFP陽性hES細胞の割合のフローサイトメトリー解析。
本発明者らは、機械的スライシングによりHES-1系統のhES細胞凝集塊を単離し、無血清のhES細胞培養培地にこれらを懸濁し、フィーダー上に再び播種する前に1時間、100プラーク形成単位(pfu)の感染効率(MOI)にて増強緑色蛍光タンパク質(eGFP)遺伝子を含むバキュロウイルスベクターを凝集塊に感染させた。ヒトEF1αプロモーターによって駆動されて、eGFP発現は、形質導入後の6時間という早い時期に観察され、24時間で高度に強くなり、明るい緑の蛍光が凝集塊全体を覆った(図6A及びB)。形質導入されたhES細胞は、凝集塊から成長し続け、新たに生成されたeGFP陰性hES細胞によって囲まれた中心に「緑」の領域を有するコロニーを生じた(図6CおよびD)。中心領域のeGFPシグナルは、時間とともに減少して、7日目で非常に弱くなった(図6EおよびF)。フローサイトメトリー解析により、2日目の凝集塊におけるeGFP陽性のhES細胞が約35%であることが証明された(図6G)。ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーターおよびエンハンサー(CMVプロモーター)を有するバキュロウイルスベクターを使用したときに、同様の結果が観察された(図7)。これらの知見は、バキュロウイルスベクターがhES細胞における一過性遺伝子発現を媒介する際に形質転換受容性であることを示唆する。
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Claims (17)
- 核酸分子を胚性幹細胞に送達する方法であって、支持細胞が除かれた条件下で、前記胚性幹細胞を、前記核酸分子を含むバキュロウイルスベクターに感染させることを含む方法。
- 前記胚性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項1に記載の方法。
- 請求項1または請求項2に記載の方法であって、前記核酸分子は、コード領域および作動可能に連結されたプロモーターを含む導入遺伝子を含む方法。
- 前記導入遺伝子は、リポーター遺伝子、選択可能なマーカー遺伝子、胚性幹細胞の分化に関与する遺伝子または治療的導入遺伝子である、請求項3に記載の方法。
- 前記プロモーターが胚性幹細胞に特異的なプロモーター、分化細胞型に特異的なプロモーター、発生特異的プロモーター、ウイルスプロモーターまたは哺乳動物プロモーターとウイルスプロモーターおよび/またはエンハンサーとの融合プロモーターである、請求項3または請求項4に記載の方法。
- 前記プロモーターがヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター/エンハンサーである、請求項5に記載の方法。
- 前記バキュロウイルスベクターが核酸分子に隣接する逆方向末端反復配列(ITR)配列およびrep遺伝子をさらに含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ITR配列およびrep遺伝子がアデノ随伴ウイルスITR配列およびrep遺伝子である、請求項7に記載の方法。
- 前記バキュロウイルスベクターがオートグラファ・カリフォルニカ(Autographa. californica)核多角体ウイルスベクターである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 胚性幹細胞に分化を誘導することをさらに含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 被験体の障害を治療するための組み換えバキュロウイルス核酸を含む胚性幹細胞を含む医薬組成物であって、前記障害は、前記被験体における前記特定の細胞型の早発性死または機能不全によって特徴づけられる医薬組成物。
- 前記胚性幹細胞が分化した、請求項11に記載の医薬組成物。
- 前記バキュロウイルスベクターが治療的導入遺伝子を含む、請求項11または12に記載の医薬組成物。
- 前記障害が、癌、白血病、パーキンソン病、アルツハイマー病、ALS、CNS損傷、脊椎損傷、多発性硬化症、心臓損傷、肝障害、腎臓損傷、膵臓の損傷、レチナール損傷、腸管の損傷、骨格筋損傷、筋ジストロフィー、肺損傷または糖尿病である請求項11〜13のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記胚性幹細胞が外科的移植または注射のために適応される、請求項11〜14のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記胚性幹細胞がさらなる成長因子で処理されている、請求項11〜15のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記さらなる成長因子が線維芽細胞成長因子またはニューロトロフィンである、請求項16に記載の医薬組成物。
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