JP7432621B2 - 選択的遺伝子調節のための組成物および方法 - Google Patents

選択的遺伝子調節のための組成物および方法 Download PDF

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Description

相互参照
本出願は、２０１９年５月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／８５４，２３８号、２０１９年６月５日に出願された米国仮特許出願第６２／８５７，７２７号、および２０２０年４月１０日に出願された米国仮特許出願第６３／００８，５６９号の利益を主張し、これらのそれぞれは、その全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は配列表を含み、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２０年５月２８日に作成され、４６４８２－７２４＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、４１８，４８３バイトのサイズである。
広範囲のヒト疾患が、遺伝子の異常な発現に関連する。一部の場合では、遺伝子中の遺伝的変異は、それを、調節不全にするか、下方調節するか、または全く発現させず、ハプロ不全をもたらす。一部の場合では、遺伝子中の遺伝的変異は、それを上方調節させ、遺伝子の過剰発現をもたらす。遺伝性の障害または疾患を処置するには、多くの課題が存在する。１つのアプローチは、遺伝子治療であり、これは、患者の細胞への核酸の治療的送達を含む。しかしながら、遺伝子治療によって誘発される望ましくない免疫応答、オフターゲット効果、遺伝子治療ビヒクル（例えば、ウイルス）のクローニング能力に対する制限、より長い期間にわたり治療効果を持続させることなどの、遺伝子治療に関連するさまざまな課題は、未解決のままである。中枢神経系（ＣＮＳ）は、遺伝子および／またはタンパク質発現における根本的な機能障害に対処する治療の開発に対する多くの独自の課題を提起する。ＣＮＳ疾患／障害の症状を管理するのを助ける薬物は存在するが、多くのＣＮＳ疾患／障害、例えば、ドラベ症候群は、特異的な処置も治癒も欠いている。そのため、疾患または障害の影響を逆転させるのを助けるための任意の内在性遺伝子の発現をモジュレートすることができる新規な組成物および方法、特に、低減された免疫原性、低減されたオフターゲット効果、標的遺伝子に対する増加した特異性、および／または増加した治療有効性を有する治療に対する必要性が存在している。
一態様では、本出願は、細胞におけるＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させる天然に存在しない転写因子をコードする配列を含む発現カセットであって、天然に存在しない転写因子が、少なくとも２つの転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）に、以下の様式：ＴＡＤ１－ＴＡＤ２－ＤＢＤ、ＤＢＤ－ＴＡＤ３－ＴＡＤ４またはＴＡＤ１－ＴＡＤ２－ＤＢＤ－ＴＡＤ３－ＴＡＤ４で作動可能に連結されたＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を含む、発現カセットを提供する。ある特定の実施形態では、ＴＡＤ１、ＴＡＤ２、ＴＡＤ３およびＴＡＤ４は、独立して、以下：ＶＰ１６、ＶＰ６４、Ｖｉｐｅｒ、ＣＩＴＥＤ２、ＣＩＴＥＤ４、ＣＲＥＢ３、またはそれらの機能的断片から選択される。ある特定の実施形態では、ＴＡＤ１およびＴＡＤ２は、同じＴＡＤである。ある特定の実施形態では、ＴＡＤ１およびＴＡＤ２は、ＣＩＴＥＤ２またはその機能的断片である。ある特定の実施形態では、ＴＡＤ１およびＴＡＤ２は、ＣＩＴＥＤ４またはその機能的断片である。ある特定の実施形態では、ＴＡＤ３およびＴＡＤ４は、同じＴＡＤである。ある特定の実施形態では、ＴＡＤ３およびＴＡＤ４は、ＣＩＴＥＤ２またはその機能的断片である。ある特定の実施形態では、ＴＡＤ３およびＴＡＤ４は、ＣＩＴＥＤ４またはその機能的断片である。ある特定の実施形態では、ＴＡＤ１、ＴＡＤ２、ＴＡＤ３およびＴＡＤ４は、同じＴＡＤである。ある特定の実施形態では、ＴＡＤ１、ＴＡＤ２、ＴＡＤ３およびＴＡＤ４は、ＣＩＴＥＤ２またはその機能的断片である。ある特定の実施形態では、ＴＡＤ１、ＴＡＤ２、ＴＡＤ３およびＴＡＤ４は、ＣＩＴＥＤ４またはその機能的断片である。
ある特定の実施形態では、少なくとも２つのＴＡＤドメインの間にリンカーが存在しない。
ある特定の実施形態では、少なくとも２つのＴＡＤドメインの間にリンカーが存在する。ある特定の実施形態では、リンカーは、ＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号１７７）もしくはＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号１７８）を含むか、またはこれらからなる。
ある特定の実施形態では、ＤＢＤは、１８～２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する。
ある特定の実施形態では、ＤＢＤは、その最も近いヒト対応物と少なくとも８０％の配列同一性を含む。ある特定の実施形態では、ＤＢＤは、その最も近いヒト対応物と少なくとも９０％の配列同一性を含む。ある特定の実施形態では、ＤＢＤおよび少なくとも２つのＴＡＤは、それらの最も近いヒト対応物と少なくとも８０％の配列同一性をそれぞれ含む。ある特定の実施形態では、ＤＢＤおよび少なくとも２つのＴＡＤは、それらの最も近いヒト対応物と少なくとも９０％の配列同一性をそれぞれ含む。
ある特定の実施形態では、ＤＢＤは、ガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９である。
ある特定の実施形態では、ＤＢＤは、ジンクフィンガードメインを含む。ある特定の実施形態では、ＤＢＤは、６～９個のジンクフィンガードメインを含む。ある特定の実施形態では、ＤＢＤは、６個のジンクフィンガーを含む。ある特定の実施形態では、ＤＢＤは、１８ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する。ある特定の実施形態では、ＤＢＤは、９個のジンクフィンガーを含む。ある特定の実施形態では、ＤＢＤは、２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する。
ある特定の実施形態では、ＤＢＤは、配列番号１４８～１５１のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、ＤＢＤは、配列番号１４８～１５１のいずれか１つを有する配列を含む。
ある特定の実施形態では、ＤＢＤは、ヒトＥＧＲ１またはヒトＥＧＲ３に由来する。
ある特定の実施形態では、ＤＢＤは、配列番号７７～９８のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、ＤＢＤは、配列番号７７～９８を含む。
ある特定の実施形態では、ＤＢＤは、配列番号９２と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、ＤＢＤは、配列番号９２を含む。
ある特定の実施形態では、天然に存在しない転写因子は、配列番号１３０または１３１と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、天然に存在しない転写因子は、配列番号１３０または１３１を含む。
ある特定の実施形態では、発現カセットは、配列番号７２または７３のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、発現カセットは、配列番号７２または７３のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、発現カセットは、他の細胞型におけるよりもＰＶニューロンにおいてより高いレベルで転写因子の発現を駆動する調節エレメントをさらに含む。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、配列番号１～４のいずれか１つを含む。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、配列番号２または３を含む。
ある特定の実施形態では、発現カセットは、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位をさらに含む。ある特定の実施形態では、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号７、１４または１５のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を含む。ある特定の実施形態では、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号７、１４または１５のいずれか１つを含む。
ある特定の実施形態では、発現カセットは、ウイルスベクターの一部である。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶウイルスである。ある特定の実施形態では、ＡＡＶウイルスは、ＡＡＶ９ウイルスまたはｓｃＡＡＶ９ウイルスである。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスである。
別の態様では、本出願は、細胞におけるＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させる天然に存在しない転写因子をコードする配列を含む発現カセットであって、天然に存在しない転写因子が、転写活性化ドメインに作動可能に連結されたＤＮＡ結合ドメインを含み、ＤＮＡ結合ドメインが、配列ＬＥＰＧＥＫＰ－［ＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳ Ｘ ＨＱＲＴＨ ＴＧＥＫＰ］ｎ－ＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳ Ｘ ＨＱＲＴＨ－ＴＧＫＫＴＳ（配列番号１４７）を含むジンクフィンガータンパク質であり、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインの間にＨＡタグ（配列番号３０３）が存在しない、発現カセットを提供する。ある特定の実施形態では、転写活性化ドメインは、ＶＰ１６、ＶＰＲもしくはＶＰ６４配列、またはそれらの機能的断片を含む。ある特定の実施形態では、転写活性化ドメインは、ＶＰ６４を含む。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、１８～２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ｎ＝６～９である、配列番号１４７を含むジンクフィンガードメインである。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ｎ＝６である、配列番号１４７を含むジンクフィンガードメインである。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、１８ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ｎ＝９である、配列番号１４７を含むジンクフィンガードメインである。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１４８～１５１のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１４８～１５１のいずれか１つを有する配列を含む。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号７７～９１のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号７７～９１のいずれか１つを含む。
ある特定の実施形態では、発現カセットは、他の細胞型におけるよりもＰＶニューロンにおいてより高いレベルで転写因子の発現を駆動する調節エレメントをさらに含む。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、配列番号１～４のいずれか１つを含む。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、配列番号２または３を含む。
ある特定の実施形態では、天然に存在しない転写因子は、配列番号１２７と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、天然に存在しない転写因子は、配列番号１２７を含む。
ある特定の実施形態では、発現カセットは、配列番号９３または７１のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、発現カセットは、配列番号９３または７１のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、発現カセットは、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位をさらに含む。ある特定の実施形態では、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号７、１４または１５のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を含む。ある特定の実施形態では、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号７、１４または１５のいずれか１つを含む。
ある特定の実施形態では、発現カセットは、ウイルスベクターの一部である。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶウイルスである。ある特定の実施形態では、ＡＡＶウイルスは、ＡＡＶ９ウイルスまたはｓｃＡＡＶ９ウイルスである。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスである。
別の態様では、本出願は、配列番号１４または１５と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドであって、マイクロＲＮＡ結合部位が、興奮性ニューロンにおける導入遺伝子の発現を低減させる、ポリヌクレオチドを提供する。ある特定の実施形態では、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号１４を含む。ある特定の実施形態では、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号１５を含む。別の態様では、本出願は、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位、ならびにプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む発現カセットを提供する。ある特定の実施形態では、プロモーターおよび／またはエンハンサーは、他の細胞型におけるよりもパルブアルブミン（ＰＶ）ニューロンにおいてより高いレベルで導入遺伝子の発現を駆動するＰＶ選択的調節エレメントである。ある特定の実施形態では、ＰＶ選択的調節エレメントは、導入遺伝子に作動可能に連結されている。
別の態様では、本出願は、導入遺伝子および少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位に作動可能に連結された調節エレメントを含む発現カセットであって、調節エレメントが、他の細胞型におけるよりもパルブアルブミン（ＰＶ）ニューロンにおいてより高いレベルで導入遺伝子の発現を駆動し、マイクロＲＮＡ結合部位が、興奮性ニューロンにおける導入遺伝子の発現を低減させる、発現カセットを提供する。ある特定の実施形態では、発現カセットは、配列番号６７を含まない。ある特定の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ＭＩＲ１２８（配列番号９）に対する少なくとも１つの結合部位を含む。ある特定の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ＭＩＲ２２１（配列番号１１）に対する少なくとも１つの結合部位を含む。ある特定の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ＭＩＲ２２２（配列番号１３）に対する少なくとも１つの結合部位を含む。ある特定の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ＭＩＲ１２８（配列番号９）に対する少なくとも１つの結合部位、およびＭＩＲ２２１（配列番号１１）に対する少なくとも１つの結合部位を含む。ある特定の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ＭＩＲ１２８（配列番号９）に対する少なくとも１つの結合部位、ＭＩＲ２２１（配列番号１１）に対する少なくとも１つの結合部位、およびＭＩＲ２２２（配列番号１３）に対する少なくとも１つの結合部位を含む。ある特定の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号７、１４または１５のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号７、１４または１５を含む。
ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、細胞におけるＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させる天然に存在しない転写因子を含むポリペプチドをコードする。ある特定の実施形態では、転写因子は、１８～２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する。ある特定の実施形態では、転写因子は、ＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、転写因子は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含む。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、その最も近いヒト対応物と少なくとも８０％の配列同一性を含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、その最も近いヒト対応物と少なくとも９０％の配列同一性を含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインの両方は、それらの最も近いヒト対応物と少なくとも８０％の配列同一性を含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインの両方は、それらの最も近いヒト対応物と少なくとも９０％の配列同一性を含む。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９である。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガードメインを含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、６～９個のジンクフィンガードメインを含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、６個のジンクフィンガーを含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、１８ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、９個のジンクフィンガーを含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１４８～１５１のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１４８～１５１のいずれか１つを有する配列を含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９２～９８のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９２～９８のいずれか１つを含む。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列ＬＥＰＧＥＫＰ－［ＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳ Ｘ ＨＱＲＴＨ ＴＧＥＫＰ］ｎ－ＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳ Ｘ ＨＱＲＴＨ－ＴＧＫＫＴＳ（配列番号１４７）を含むジンクフィンガータンパク質である。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号７７～９１のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号７７～９１のいずれか１つを含む。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ヒトＥＧＲ１またはヒトＥＧＲ３に由来する。
ある特定の実施形態では、転写活性化ドメインは、ＶＰ１６、ＶＰＲ、ＶＰ６４、ＣＩＴＥＤ２、ＣＩＴＥＤ４もしくはＣＲＥＢ３配列、またはそれらの機能的断片を含む。ある特定の実施形態では、転写活性化ドメインは、ヒトＣＩＴＥＤ２、ＣＩＴＥＤ４もしくはＣＲＥＢ３配列、またはそれらの機能的断片を含む。
ある特定の実施形態では、調節エレメントは、配列番号１～４のいずれか１つを有する配列を含む。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、配列番号２または３を有する配列を含む。
ある特定の実施形態では、天然に存在しない転写因子は、配列番号１０５、１０６および１２７～１２９のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、天然に存在しない転写因子は、配列番号１０５、１０６および１２７～１２９のいずれか１つを含む。
ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号７１、７４、７５、７６または１８４のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号７１、７４、７５、７６または１８４のいずれか１つを含む。
ある特定の実施形態では、発現カセットは、ウイルスベクターの一部である。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶウイルスである。ある特定の実施形態では、ＡＡＶウイルスは、ＡＡＶ９ウイルスまたはｓｃＡＡＶ９ウイルスである。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスである。
別の態様では、本出願は、霊長類のパルブアルブミン（ＰＶ）ニューロンにおける導入遺伝子の選択的発現のための方法であって、霊長類に、導入遺伝子および少なくとも１つのマクロＲＮＡ結合部位を含むウイルスベクターを投与するステップを含み、マイクロＲＮＡ結合部位が、興奮性ニューロンにおける導入遺伝子の発現を低減させる、方法を提供する。
ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、導入遺伝子に作動可能に連結された調節エレメントをさらに含み、調節エレメントは、他の細胞型におけるよりもパルブアルブミン（ＰＶ）ニューロンにおいてより高いレベルで導入遺伝子の発現を駆動する。
ある特定の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ＭＩＲ１２８（配列番号９）に対する少なくとも１つの結合部位を含む。ある特定の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ＭＩＲ２２１（配列番号１１）に対する少なくとも１つの結合部位を含む。ある特定の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ＭＩＲ２２２（配列番号１３）に対する少なくとも１つの結合部位を含む。ある特定の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ＭＩＲ１２８（配列番号９）に対する少なくとも１つの結合部位、およびＭＩＲ２２１（配列番号１１）に対する少なくとも１つの結合部位を含む。ある特定の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ＭＩＲ１２８（配列番号９）に対する少なくとも１つの結合部位、ＭＩＲ２２１（配列番号１１）に対する少なくとも１つの結合部位、およびＭＩＲ２２２（配列番号１３）に対する少なくとも１つの結合部位を含む。ある特定の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号７、１４または１５のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号７、１４または１５を含む。
ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、細胞におけるＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させる天然に存在しない転写因子をコードする配列を含む。
ある特定の実施形態では、転写因子は、１８～２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する。
ある特定の実施形態では、転写因子は、ＤＮＡ結合ドメインを含む。
ある特定の実施形態では、転写因子は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含む。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、その最も近いヒト対応物と少なくとも８０％の配列同一性を含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、その最も近いヒト対応物と少なくとも９０％の配列同一性を含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインの両方は、それらの最も近いヒト対応物と少なくとも８０％の配列同一性を含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインの両方は、それらの最も近いヒト対応物と少なくとも９０％の配列同一性を含む。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９である。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガードメインを含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、６～９個のジンクフィンガードメインを含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、６個のジンクフィンガーを含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、１８ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、９個のジンクフィンガーを含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１４８～１５１のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１４８～１５１のいずれか１つを有する配列を含む。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ヒトＥＧＲ１またはヒトＥＧＲ３に由来する。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９２～９８のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９２～９８のいずれか１つを含む。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列ＬＥＰＧＥＫＰ－［ＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳ Ｘ ＨＱＲＴＨ ＴＧＥＫＰ］ｎ－ＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳ Ｘ ＨＱＲＴＨ－ＴＧＫＫＴＳ（配列番号１４７）を含むジンクフィンガータンパク質である。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号７７～９１のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号７７～９１のいずれか１つを含む。
ある特定の実施形態では、転写活性化ドメインは、ＶＰ１６、ＶＰＲ、ＶＰ６４、ＣＩＴＥＤ２、ＣＩＴＥＤ４もしくはＣＲＥＢ３配列、またはそれらの機能的断片を含む。ある特定の実施形態では、転写活性化ドメインは、ヒトＣＩＴＥＤ２、ＣＩＴＥＤ４もしくはＣＲＥＢ３配列、またはそれらの機能的断片を含む。
ある特定の実施形態では、調節エレメントは、配列番号１～４のいずれか１つを有する配列を含む。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、配列番号２または３を有する配列を含む。
ある特定の実施形態では、天然に存在しない転写因子は、配列番号１０５、１０６および１２７～１２９のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、天然に存在しない転写因子は、配列番号１０５、１０６および１２７～１２９のいずれか１つを含む。
ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号７１、７４、７５、７６または１８４のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号７１、７４、７５、７６または１８４のいずれか１つを含む。
ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶウイルスである。ある特定の実施形態では、ＡＡＶウイルスは、ＡＡＶ９ウイルスまたはｓｃＡＡＶ９ウイルスである。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスである。
ある特定の実施形態では、霊長類は、ヒトである。ある特定の実施形態では、霊長類は、非ヒト霊長類である。ある特定の実施形態では、非ヒト霊長類は、旧世界ザル、オランウータン、ゴリラ、チンパンジー、マーモセット、カニクイザル、アカゲザルまたはブタオザルである。
別の態様では、本出願は、細胞におけるＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させる天然に存在しない転写因子をコードする配列を含む発現カセットであって、天然に存在しない転写因子が、配列番号１２８または１２９と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、発現カセットを提供する。ある特定の実施形態では、天然に存在しない転写因子は、配列番号１２８または１２９を含む。
別の態様では、本出願は、本明細書において提供される発現カセットのいずれかを投与することによる、細胞におけるＳＣＮ１Ａの発現を増加させる方法を提供する。ある特定の実施形態では、細胞は、ニューロン細胞である。ある特定の実施形態では、ニューロン細胞は、単極ニューロン、双極ニューロン、多極ニューロンまたは偽単極ニューロンからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、細胞は、ＧＡＢＡ作動性ニューロンである。ある特定の実施形態では、細胞は、ＰＶニューロンである。ある特定の実施形態では、細胞は、非ニューロン細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、グリア細胞である。ある特定の実施形態では、グリア細胞は、星状膠細胞、乏突起膠細胞、上衣細胞、シュワン細胞および衛星細胞からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、細胞は、対象内にある。ある特定の実施形態では、対象は、哺乳動物である。ある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａの発現を増加させることは、疾患、障害または症状を処置する。ある特定の実施形態では、障害は、中枢神経系障害である。ある特定の実施形態では、障害は、ＳＣＮ１Ａハプロ不全に関連するてんかんである。ある特定の実施形態では、ハプロ不全は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の機能欠失変異についてヘテロ接合性である対象の結果である。ある特定の実施形態では、障害は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子における、挿入、欠失または置換に関連するてんかんである。ある特定の実施形態では、障害は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子における点変異に関連するてんかんである。ある特定の実施形態では、障害は、ドラベ症候群である。ある特定の実施形態では、中枢神経系障害の症状は、ニューロン活動亢進である。ある特定の実施形態では、中枢神経系障害を処置することは、ニューロン活動亢進を低減させることを含む。ある特定の実施形態では、中枢神経系障害の症状は、発作である。ある特定の実施形態では、中枢神経系障害を処置することは、発作の頻度を低減させることを含む。ある特定の実施形態では、中枢神経系障害を処置することは、発作の重症度を低減させることを含む。
別の態様では、本出願は、本明細書において提供される発現カセットのいずれか１つを投与することによる、ＣＮＳにおけるＳＣＮ１Ａの発現を増加させる方法を提供する。ある特定の実施形態では、発現カセットは、片側脳室内（ＩＣＶ）投与を介して投与される。ある特定の実施形態では、発現カセットは、両側脳室内（ＩＣＶ）投与を介して投与される。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａの増加した発現は、脳において起こる。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａの増加した発現は、前頭皮質、頭頂皮質、側頭皮質、海馬、髄質および／または後頭皮質において起こる。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａの増加した発現は、脊椎において起こる。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａの増加した発現は、脊髄および／または後根神経節において起こる。
参照による組み込み
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、あたかもそれぞれの個々の刊行物、特許または特許出願が、具体的かつ個々に、参照によって組み込まれるのを示したのと同じ程度で、参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明の新規の特徴を、特に、添付の特許請求の範囲に記述する。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が用いられる例示的な場合について記述している以下の詳細な説明および添付の図面への参照によって得られる。
図１は、第２染色体（ＧＲＣｈ３８．ｐ１２に関連する）のさまざまな領域に結合する操作された転写因子を使用する内因性ＳＣＮ１Ａの上方調節を図示する。データは、対照（ＥＧＦＰ－ＫＡＳＨ）条件に関するＳＣＮ１Ａ発現における倍数変化として表す。
図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｃは、ＳＣＮ１Ａ特異的転写活性化因子を使用するＨＥＫ２９３細胞における内因性ＳＣＮ１Ａの相対発現を図示する（表１を参照されたい）。データは、対照条件に対する倍数変化として表し、Ｌｏｇ１０スケールで示す。 同上。
図３Ａは、ＳＣＮ１Ａ特異的転写活性化因子（構築物３０）を使用するＧＡＢＡニューロンにおける内因性ＳＣＮ１Ａの相対発現を図示する。データは、対照条件（ＣＢＡ－ＥＧＦＰ）に対する倍数変化として表す。
図３Ｂは、ＳＣＮ１Ａ特異的転写活性化因子（構築物２５および１６）を使用するＧＡＢＡニューロンにおける内因性ＳＣＮ１Ａの相対発現を図示する。データは、Ｌｏｇ１０で、対照条件（ＣＢＡ－ＥＧＦＰ）に対する倍数変化として表す。
図４は、ＳＣＮ１Ａ特異的転写因子（構築物３０）によって駆動される、内因性ＳＣＮ１Ａおよび４０個の最も近い隣接する遺伝子の相対発現を図示する。データは、Ｌｏｇ１０で、対照条件（ＣＢＡ－ＥＧＦＰ－ＫＡＳＨ）に対する倍数変化として表す。
図５Ａおよび図５Ｂは、ｅＧＦＰを発現した対照発現カセットと比較した、ｉｎ ｖｉｖｏでのＳＣＮ１Ａ特異的転写活性化因子の発現を図示する。図５Ａは、対照のｅＧＦＰ、またはＳＣＮ１Ａ転写活性化因子を含む構築物４のいずれかを注射されたマウスにおけるＳＣＮ１Ａ遺伝子の相対発現を図示する。図５Ｂは、平均ｅＧＦＰのパーセンテージについての、ＳＣＮ１Ａ発現における変化を図示する。これらの実験は、構築物４による転写活性化が約２０～３０％のＳＣＮ１Ａ発現の上方調節をもたらしたことを示す。
図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ、図６Ｆおよび図６Ｇは、対照と比較した、さまざまなＳＣＮ１Ａ特異的転写因子を使用するドラベ症候群のＳｃｎ１ａｔｍ１Ｋｅａノックアウトマウスモデルにおける高体温発作に対する効果を図示する。Ｐ１のＳｃｎ１ａ＋／－マウス（ヘテロ接合性；ＨＥＴ）に、ＡＡＶ９－ＥＧＦＰ、またはＳＣＮ１Ａ特異的転写因子（構築物３１～３４、４２および４３の１つ）を発現するＡＡＶ９ベクターのいずれかを注入した。Ｐ２６～Ｐ２８で、注入マウスに、高体温誘発発作アッセイを実行し、それらが強直間代発作を経験した内部温度を記録した。図６Ｄは、ＤＢＤおよびＴＡＤの間に位置するＨＡタグを含有する構築物３２、ならびにＨＡタグを含有しない構築物３４の間の直接比較を示す。図６Ｅは、コード領域およびポリＡテイルの間に位置するｍ１マイクロＲＮＡ結合部位を含有する構築物３１、ならびにｍ１マイクロＲＮＡ結合部位を含有しない構築物３２の間の直接比較を示す。図６Ｈは、構築物３１を使用するドラベ症候群のＳｃｎ１ａＲＸ変異体マウスモデルにおける高体温発作に対する効果を図示する（ＰＢＳを注射された対照と比較）。 同上。 同上。 同上。
図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃおよび図７Ｄは、さまざまな条件下でのドラベ症候群のＳｃｎ１ａｔｍ１Ｋｅａノックアウトマウスモデルにおける生存率を図示する。図７Ａは、生存アッセイにおける野生型（ＰＢＳ ＷＴ）およびＳｃｎ１ａ＋／－マウス（ＰＢＳ ＨＥＴ）の間の比較を図示する。Ｐ１のＳｃｎ１ａ＋／－（Ｎ＝５３）およびＳｃｎ１ａ＋／＋（Ｎ＝５４）マウスに、ＰＢＳを注入した。マウスを、それらのホームケージにおいて毎日観察し、いかなる死亡している状態の場合にも、その日付を記録した。Ｓｃｎ１ａ＋／－およびＳｃｎ１ａ＋／＋動物の間の生存率に有意差があった（Ｐ＜０．０００１）。図７Ｂ～Ｄは、対照と比較した、さまざまなＳＣＮ１Ａ特異的転写因子で処置されたマウスについてのドラベ症候群のマウスモデルにおける生存に対する効果を図示する。Ｐ１のＳｃｎ１ａ＋／－マウスに、ＰＢＳ、またはＳＣＮ１Ａ特異的転写因子（構築物３１または３３）を発現するＡＡＶ９ベクターのいずれかを注入した。マウスを、それらのホームケージにおいて毎日観察し、いかなる死亡している状態の場合にも、その日付を記録した。図７Ｄは、コード領域およびポリＡテイルの間に位置するｍ１マイクロＲＮＡ結合部位を含有する構築物３１、ならびにｍ１マイクロＲＮＡ結合部位を含有しない構築物３３の間の直接比較を示す。図７Ｅは、構築物３１を使用するドラベ症候群のＳｃｎ１ａＲＸ変異体マウスモデルにおける生存率を図示する（ＰＢＳを注射された対照と比較）。 同上。 同上。
図８は、２頭の未処置対照動物に対して正規化された、１．２×１０１２ｇｃ／動物で２頭のカニクイザルに投与されたＳＣＮ１Ａ特異的転写因子をコードするＡＡＶ９ベクター（構築物３３）の実質内送達後の異なる脳組織中の相対Ｓｃｎ１Ａ ｍＲＮＡ発現を図示する。すべての動物を、注入２８日後に屠殺し、Ｓｃｎ１Ａ ｍＲＮＡを、Ｔａｑｍａｎ ＰＣＲによって、組織試料において定量した。データを、脳由来の異なる組織切片における標的ｍＲＮＡの正規化された発現として報告する。類似の結果を、同様に、Ｓｃｎ１ａ遺伝子由来プライマー／プローブの異なるセットを用いて記録した。
図９Ａ～Ｆは、ＥＦ１ａプロモーター、ＲＥ２プロモーター（配列番号２）、またはＥＧＦＰコード領域およびポリＡ部位の間に位置するｍ１マイクロＲＮＡ結合部位（配列番号７）を有するＲＥ２プロモーター（配列番号２）の制御下のＥＧＦＰ導入遺伝子を含むＡＡＶ９ベクターによる処置後のマーモセットの海馬の歯状回領域におけるＥＧＦＰの発現のパターンを示す。海馬の歯状回領域の代表的な領域を、それぞれのベクター処置について示す。上列は、ＤＡＰＩで染色された細胞核を示し、下列は、抗ＧＦＰ抗体で染色されたＧＦＰ陽性領域を示す。図９Ａにおいて（ＥＦ１ａ処置）、海馬のＣＡ４門領域（hylus region）は、黄色で外形が描かれ、矢印は、歯状細胞顆粒細胞体層（dentate cell granule cellbody layer）（ＤＧ）を指し示す。図９Ｂおよび図９Ｃは、同じ領域を中心とする。興奮性および抑制性介在ニューロンの混合であるＣＡ４領域は、それがＲＥ２＋ｍ１条件における有意な発現の唯一の領域であったので、強調される。ＥＦ１ａおよびＲＥ２は、導入遺伝子発現を駆動し、ＧＦＰ発現は、より広がっており、海馬の他の領域を含んでいた。ＤＧ細胞層は、一次興奮性ニューロンを含有すると考えられる。ＥＦ１ａおよびＲＥ２によって駆動されるＧＦＰ発現は、ＲＥ２＋ｍ１処置動物（図９Ｆ）においてまだ存在しないＤＧ細胞層（図９Ｄおよび図９Ｅ）において可視化される（白色矢頭）。
図１０Ａ～Ｌは、ＥＦ１ａプロモーター、ＲＥ２プロモーター（配列番号２）、またはＥＧＦＰコード領域およびポリＡ部位の間に位置するｍ１マイクロＲＮＡ結合部位（配列番号７）を有するＲＥ２プロモーター（配列番号２）の制御下のＥＧＦＰ導入遺伝子を含むＡＡＶ９ベクターによる処置後のマーモセットの海馬の歯状回領域におけるＥＧＦＰの発現のパターンが、ＲＥ２およびＲＥ２＋ｍ１処置動物におけるパルブアルブミン（ＰＶ）陽性細胞に主に局在化していることを示す。海馬の歯状回領域の代表的な領域を、それぞれのベクター処置について示す。上列は、ＧＦＰ陽性領域を示し、次の下列は、ＰＶに対する抑制性介在ニューロンマーカーで染色された同じ領域を示す。図１０Ａ～Ｆにおけるボックス内領域は、図１０Ｇ～Ｌにおいて、より高倍率で示す。ＲＥ２およびＲＥ２＋ｍ１によって駆動されるＧＦＰ発現は、主に、抑制性介在ニューロンマーカーＰＶと共局在化するが（図１０Ｈおよび１０Ｋ、１０Ｉおよび１０Ｌ、白色矢頭）、ＥＧ－ＥＦ１ａにおいて、ＧＦＰ発現は、ＰＶ陽性細胞に簡単に局在化されない（図１０Ｇおよび１０Ｊ、白色矢頭）。加えて、ＧＦＰ陽性細胞は、ＥＦ１ａ処置動物におけるあまり区別されない細胞体の形態（図１０Ｇ、黄色矢頭）と比較して、ＲＥ２およびＲＥ２＋ｍ１処置動物における錐体細胞体を有する非常に分岐した細胞の明らかな介在ニューロンの形態（図１０Ｈおよび１０Ｉ、黄色矢頭）を有する。
図１１は、片側脳室内（ＩＣＶ）投与を介して４．８Ｅ＋１３または８Ｅ＋１３ ｖｇ／動物で投与されるＡＡＶ９－ＲＥＧＡＢＡ－ｅＴＦＳＣＮ１Ａで処置された動物についての、前頭皮質（ＦＣ）、吻側頭頂皮質（吻側ＰＣ）、側頭皮質（ＴＣ）、尾側頭頂皮質（尾側ＰＣ）、海馬（Ｈｉｐ）、髄質（Ｍｅｄ）および後頭皮質（ＯＣ）の組織試料におけるＶＧ／二倍体ゲノムを示す（実施例１０および実施例１１）。それぞれのデータポイントは、組織試料についてのＶＧ／二倍体ゲノムを表し、水平のバーは、それぞれの動物に対するすべての組織試料についての平均ＶＧ／二倍体ゲノムを表す。
図１２は、片側脳室内（ＩＣＶ）投与を介して４．８Ｅ＋１３または８Ｅ＋１３ ｖｇ／動物で投与されるＡＡＶ９－ＲＥＧＡＢＡ－ｅＴＦＳＣＮ１Ａで処置された動物についての、前頭皮質（ＦＣ）、吻側頭頂皮質（吻側ＰＣ）、側頭皮質（ＴＣ）、尾側頭頂皮質（尾側ＰＣ）、海馬（Ｈｉｐ）、髄質（Ｍｅｄ）および後頭皮質（ＯＣ）の組織試料における転写物／μｇ ＲＮＡを示す（実施例１０および実施例１１）。それぞれのデータポイントは、組織試料についてのＶＧ／二倍体ゲノムを表し、水平のバーは、それぞれの動物に対するすべての組織試料についての平均ＶＧ／二倍体ゲノムを表す。ＡＲＦＧＡＰ２についての平均転写物は、１．８５Ｅ＋６／μｇ ＲＮＡであり、上側境界の破線によって示す。検出限界を、下側境界の破線によって示す。
図１３は、脳の外側の末梢組織試料におけるベクター生体内分布（ＶＧ／二倍体ゲノム）および導入遺伝子発現（転写物／μｇ ＲＮＡ）を示す。示される末梢組織試料は、脊髄Ｃ２／Ｌ４（ＳＣ Ｃ２／Ｌ４）、後根神経節Ｃ２／Ｌ４（ＤＲＧ Ｃ２／Ｌ４）、肝臓、脾臓、心臓、腎臓、肺、膵臓および精巣／卵巣である。霊長類の脳における平均ＶＣＮ（ベクター生体内分布）および転写物（導入遺伝子発現）を、破線によって示す。
本明細書において、天然に存在せず、ゲノム標的部位に結合し、かつ目的の内因性遺伝子の発現をモジュレートするように設計された、操作された転写因子またはｅＴＦが提供される。そのようなｅＴＦは、目的の遺伝子の発現（ＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現）を上方調節または下方調節するように設計されていてもよい。本明細書において、ウイルスベクターに組み入れられ得、パルブアルブミン（ＰＶ）ニューロンにおいて導入遺伝子の選択的な発現を提供し得る、マイクロＲＮＡ結合部位も提供される。
一態様では、本出願は、ナトリウム電位依存性チャネルアルファサブユニット１（ＳＣＮ１Ａ）遺伝子の発現を上方調節することができ、その対応するタンパク質産物のＮａｖ１．１の発現を増加させることができる、ｅＴＦ、および例えば、ドラベ症候群などのＮａｖ１．１における欠損に関連する疾患または障害を処置するためのそれらの使用の方法を提供する。
別の態様では、本出願は、興奮性ニューロンにおけるマイクロＲＮＡ結合部位を含有するｍＲＮＡの発現を低減し、それによってＧＡＢＡ作動性ニューロンまたはパルブアルブミン（ＰＶ）ニューロンにおける遺伝子の選択的発現をもたらすマイクロＲＮＡ結合部位、およびＰＶニューロンにおける目的の遺伝子の選択的発現のためのそれらの使用の方法を提供する。
定義
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数形も同様に含むことを意図する。さらにまた、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」という用語またはそれらの変形が、詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかにおいて使用される限りにおいて、そのような用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同様の様式で包括的であることを意図する。
「約」または「およそ」という用語は、その値が測定または決定される方法、すなわち、測定系の限界に一部において依存する、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差範囲内を意味する。例えば、「約」は、当技術分野における実施毎に、１標準偏差以内または１よりも大きい標準偏差以内であることを意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大で２０％、最大で１５％、最大で１０％、最大で５％または最大で１％の範囲を意味し得る。
「決定する」、「測定する」、「評価する（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」、「評価する（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」、「アッセイする」、「分析する」という用語およびそれらの文法的等価物は、任意の形態の測定を指すために本明細書において互換可能に使用することができ、要素が存在するか、または存在しないかを決定すること（例えば、検出）を含む。これらの用語は、定量的決定および／または定性的決定の両方を含み得る。評価することは、相対的または絶対的であり得る。
「発現」という用語は、核酸配列もしくはポリヌクレオチドが、ＤＮＡ鋳型から（例えば、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物に）転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが、その後、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされたポリペプチドは、集合的に「遺伝子産物」と称する場合がある。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結した」、「作動可能な連結」、「動作可能に連結した」またはそれらの文法的等価物は、遺伝エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列などの並置を指し、ここで、エレメントは、予測された様式でそれらを作動させる関係にある。例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー配列を含み得る調節エレメントは、調節エレメントがコード配列の転写を開始するのを助ける場合、コード領域に動作可能に連結されている。この機能的関係が維持される限り、調節エレメントおよびコード領域の間に介在する残基が存在していてもよい。
「ベクター」は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドを含むか、またはポリヌクレオチドに関連し、細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介するために使用され得る、高分子または高分子の会合を指す。ベクターの例としては、プラスミド、ウイルスベクター、リポソーム、および他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。ベクターは、一般に、標的における遺伝子の発現を促進するために遺伝子に動作可能に連結された遺伝エレメント、例えば、調節エレメントを含む。
本明細書で使用される場合、「発現カセット」および「核酸カセット」は、一緒に発現されるか、もしくは発現のために作動可能に連結される、核酸配列またはエレメントの組合せを指すために、互換可能に使用される。一部の場合では、発現カセットは、調節エレメント、およびそれらが発現のために作動可能に連結される１つまたは複数の遺伝子の組合せを指す。
「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスの略称であり、ウイルスそれ自体またはその誘導体を指すために使用され得る。この用語は、他のものが必要とされる場合を除き、すべての血清型、サブタイプ、ならびに天然に存在する形態および組換え形態の両方に及ぶ。「ｒＡＡＶ」という略称は、組換えＡＡＶベクター（または「ｒＡＡＶベクター」）とも称される組換えアデノ随伴ウイルスを指す。「ＡＡＶ」という用語は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、およびそれらのハイブリッド、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、ならびにヒツジＡＡＶを含む。さまざまな血清型のＡＡＶのゲノム配列、ならびにネイティブの末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質およびキャプシドサブユニットの配列は、当技術分野において公知である。そのような配列は、文献中、またはＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベース中で見出され得る。「ｒＡＡＶベクター」は、本明細書で使用される場合、ＡＡＶ起源のものではないポリヌクレオチド配列（すなわち、ＡＡＶに対して異種のポリヌクレオチド）、典型的には、細胞の遺伝子形質転換のための目的の配列を含むＡＡＶベクターを指す。一般に、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの、一般には２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に挟まれている。ｒＡＡＶベクターは、一本鎖（ｓｓＡＡＶ）または自己相補的（ｓｃＡＡＶ）のいずれかであり得る。「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質、およびキャプシド封入された（encapsidated）ポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターで構成されるウイルス粒子を指す。粒子が、異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などの野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、これは、典型的には、「ｒＡＡＶベクター粒子」または単に「ｒＡＡＶ粒子」と称される。そのため、そのようなベクターがｒＡＡＶ粒子内に含有されるので、ｒＡＡＶ粒子の産生は、ｒＡＡＶベクターの産生を必然的に含む。
本明細書で使用される場合、「処置する」、「処置」、「治療」などの用語は、疾患もしくは障害の進行を緩和、遅延または遅らせること、疾患もしくは障害の予防、疾患もしくは障害の減弱、疾患もしくは障害の影響または症状を低減すること、疾患もしくは障害の発生を予防すること、疾患もしくは障害を阻害すること、あるいは疾患もしくは障害の発症を軽減させることを指す。本開示の方法は、任意の哺乳動物で使用され得る。例示的な哺乳動物としては、限定されるものではないが、ラット、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、およびより好ましくは、ヒトが挙げられる。治療利益には、処置される根本的な障害の根絶または軽減を含む。また、治療利益は、対象が根本的な障害に依然として苦しめられている場合があるにもかかわらず、対象において改善が観察されるように、根本的な障害に関連する生理学的症状の１つまたは複数の根絶または軽減により達成される。一部の場合では、予防的利益のために、治療薬は、特定の疾患を発生する危険性がある対象、または疾患の生理学的症状の１つもしくは複数を報告する対象に、この疾患の診断が行われていない場合であっても、投与されてもよい。本開示の方法は、任意の哺乳動物で使用され得る。一部の場合では、処置は、症状の減少または休止（例えば、発作の頻度、持続時間および／または重症度の低減）をもたらし得る。予防効果としては、疾患もしくは状態の出現を遅延もしくは排除すること、疾患もしくは状態の症状の発症を遅延または排除すること、疾患もしくは状態の進行を遅くすること、停止させることまたは逆転させること、あるいはそれらの任意の組合せが挙げられる。
「有効量」または「治療有効量」という用語は、限定されるものではないが、下記に定義される疾患処置を含む、意図される適用に影響を与えるのに十分な本明細書に記載の組成物の量を指す。治療有効量は、当業者によって容易に決定することができる、意図される処置適用（ｉｎ ｖｉｖｏ）、または処置される対象および疾患状態、例えば、対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与の様式などに応じて変わり得る。この用語は、標的細胞において特定の応答を誘導する用量にも適用される。具体的な用量は、選択された特定の組成物、従う投与レジメン、他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、それが投与される組織、およびそれが運ばれる物理的送達システムに応じて変わる。
ヌクレオチドまたはペプチド配列の「断片」は、参照配列または「全長」配列よりも短い配列を指す。
分子の「バリアント」は、そのような配列の対立遺伝子バリエーション、すなわち、分子全体またはその断片のいずれかと構造および生物活性において実質的に類似の配列を指す。
ＤＮＡまたはタンパク質配列の「機能的断片」は、全長ＤＮＡまたはタンパク質配列の生物活性と実質的に類似する生物活性（機能的または構造的のいずれか）を保持する断片を指す。ＤＮＡ配列の生物活性は、全長配列に起因することが公知の様式で発現に影響を及ぼすその能力であり得る。
「対象」および「個体」という用語は、脊椎動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒトを指すために、本明細書において互換可能に使用される。本明細書に記載の方法は、ヒトの治療、獣医学適用、および／または疾患もしくは状態の動物モデルにおける前臨床研究において有用であり得る。
「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語は、対象の身体において起こる事象を指す。
「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という用語は、対象の身体の外側で起こる事象を指す。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、対象の外側で実行される任意のアッセイを包含する。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、生きている細胞または死んだ細胞が用いられる細胞に基づくアッセイを包含する。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、インタクトな細胞が用いられない無細胞アッセイも包含する。
一般に、互換可能に使用され得る「配列同一性」または「配列相同性」は、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のヌクレオチドとヌクレオチドまたはアミノ酸とアミノ酸の正確な対応を指す。典型的には、配列同一性を決定するための技法は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列を比較すること、およびそれらの同一性パーセントを決定することを含む。例えば、同一性を評価する目的のための配列比較は、限定されるものではないが、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／において利用可能なＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅアライナーを参照されたい、必要に応じてデフォルト設定を用いる）、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（例えば、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉにおいて利用可能なＢＬＡＳＴアラインメントツールを参照されたい、必要に応じてデフォルト設定を用いる）、およびＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｗａｔｅｒ／において利用可能なＥＭＢＯＳＳ Ｗａｔｅｒアライナーを参照されたい、必要に応じてデフォルト設定を用いる）を含む、任意の適切な整列化アルゴリズムによって行われ得る。最適な整列は、デフォルトパラメーターを含む、選択されたアルゴリズムの任意の適切なパラメーターを使用して評価され得る。２つの配列間の「相同性パーセント」とも称される「同一性パーセント」は、２つの最適に整列された配列の間の正確なマッチの数を参照配列の長さで割り、１００を掛けたものとして計算することができる。同一性パーセントはまた、例えば、国立衛生研究所から利用可能なバージョン２．２．９を含むａｄｖａｎｃｅｄ ＢＬＡＳＴコンピュータープログラムを使用して、配列情報を比較することによって決定されてもよい。ＢＬＡＳＴプログラムは、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990)の整列方法に基づいており、Altschul,et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)；Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 90:5873-5877 (1993)；およびAltschul et al., Nucleic Acids Res.25:3389-3402 (1997)で議論される通りである。簡潔には、ＢＬＡＳＴプログラムは、同一の整列された記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を、２つの配列のより短い配列中の記号の総数で割ったものとして、同一性を定義する。プログラムは、比較される配列の長さ全体にわたって同一性パーセントを決定するために使用されてもよい。デフォルトパラメーターは、例えば、ｂｌａｓｔｐプログラムを用いる短いクエリー配列による検索を最適化するために提供される。プログラムはまた、Woottonand Federhen, Computers and Chemistry 17: 149-163 (1993)のＳＥＧプログラムによって決定されるクエリー配列のセグメントをマスクオフするためのＳＥＧフィルターの使用を可能にする。高い配列同一性は、一般に、およそ８０％～１００％の配列同一性の範囲、およびそれらの間の整数値を含む。
本明細書で使用される場合、タンパク質に関連する「操作された」とは、限定されるものではないが、天然に存在するタンパク質に由来するタンパク質、または天然に存在するタンパク質がある特定の性質を有するように改変もしくはリプログラミングされた場合を含む、天然に存在しないタンパク質を指す。
本明細書で使用される場合、「合成」および「人工」とは、天然に存在するヒトタンパク質と低い配列同一性（例えば、５０％未満の配列同一性）を有するタンパク質またはそのドメインを指すために、互換可能に使用される。例えば、ＶＰＲおよびＶＰ６４ドメインは、合成トランス活性化ドメインである。
本明細書で使用される場合、「操作された転写因子」または「ｅＴＦ」は、特異的標的結合部位に結合するように、および／または改変もしくは置き換えられた転写エフェクタードメインを含むように、改変またはリプログラミングされた、天然に存在しないＤＮＡ結合タンパク質または天然に存在しない転写モジュレーターを指す。
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ結合ドメイン」は、個々にまたは集合的にＤＮＡ結合タンパク質の一部としての、１つまたは複数のＤＮＡ結合モチーフ、例えば、ジンクフィンガーまたは塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックス（ｂＨＬＨ）モチーフを指すために使用され得る。
「転写活性化（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）ドメイン」、「転写活性化（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）ドメイン」、「トランス活性化（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）ドメイン」、「トランス活性化（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）ドメイン」および「ＴＡＤ」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、ＤＮＡ結合ドメインと併せて、直接、または共活性化因子として公知の他のタンパク質を介してのいずれかで、転写機構（例えば、一般的な転写因子および／またはＲＮＡポリメラーゼ）を接触させることによって、プロモーターからの転写を活性化することができる、タンパク質のドメインを指す。
「転写リプレッサー（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）ドメイン」、「転写リプレッサー（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）ドメイン」および「ＴＲＤ」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、ＤＮＡ結合ドメインと併せて、直接、または共リプレッサーとして公知の他のタンパク質を介してのいずれかで、転写機構（例えば、一般的な転写因子および／またはＲＮＡポリメラーゼ）を接触させることによって、プロモーターからの転写を抑制することができる、タンパク質のドメインを指す。
「ＧＲＣｈ３８．ｐ１２」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｓｓｅｍｂｌｙ受託番号ＧＣＡ＿０００００１４０５．２７および２０１７／１２／２１の日付を有する、ゲノムリファレンスコンソーシアムヒトビルド３８パッチリリース１２（ＧＲＣｈ３８．ｐ１２）を指す。
他に指示されない限り、本明細書で使用されるすべての用語は、それらが当業者にとって有するのと同じ意味を有し、本発明の実施は、当業者の知識内である、分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の技法を用いる。
ＳＣＮ１Ａを上方調節する操作された転写因子（ｅＴＦ）
一態様では、本出願は、ナトリウム電位依存性チャネルアルファサブユニット１（ＳＣＮ１Ａ）遺伝子の発現を上方調節することができ、その対応するタンパク質産物のＮａｖ１．１の発現を増加させることができる、ｅＴＦを提供する。ＳＣＮ１Ａ遺伝子は、ナトリウムチャネルをアセンブルするために使用されるサブユニットをコードする遺伝子のファミリーに属する。正に荷電したナトリウムイオンを細胞に輸送するこれらのチャネルは、電気信号を発生および伝達する細胞の能力において重要な役割を果たす。ＳＣＮ１Ａ遺伝子は、Ｎａｖ１．１と呼ばれるナトリウムチャンネルの一部（アルファサブユニット）をコードする。これらのチャネルは、主に、脳で見出され、そこで、それらはナトリウムイオンの細胞への流入を制御する。Ｎａｖ１．１チャネルは、ある神経細胞（またはニューロン）から別のものへのシグナルの伝達に関与する。ＳＣＮ１Ａ遺伝子におけるいくつかの変異は、異なる重症度の様々な発作性障害である熱性けいれんプラスを伴う遺伝性てんかん（ＧＥＦＳ＋）を引き起こすことが見出されている。これらの状態は、乳児期に始まり、通常は５歳までに止まる単純熱性（発熱関連）けいれん、および熱性けいれんプラス（ＦＳ＋）を含む。ＦＳ＋は、熱性けいれん、および発熱に関連しないもの（無熱性けいれん）を含む他の種類の発作を含み、これは、小児期を超えて続く。ＧＥＦＳ＋スペクトルは、長く続き、制御が困難であり得る、より深刻な発作を引き起こすドラベ症候群（乳児重症ミオクロニーてんかんまたはＳＭＥＩとしても公知）などの他の状態も含む。これらの反復性発作（てんかん）は、経時的に悪化し得、多くの場合、脳機能の低下を伴う。多くの他の変異は、家族において発生する片頭痛の形態である家族性片麻痺性片頭痛に関連しており、少なくとも１つの変異は、ある特定の抗てんかん薬の有効性に関連している。したがって、ＳＣＮ１Ａの発現を増加させる本明細書において提供されるｅＴＦは、Ｎａｖ１．１チャネルにおける変異に関連する種々の疾患または障害を処置するために使用することができる。
転写因子（ＴＦ）は、ゲノム中の特異的配列に結合し、遺伝子の発現を制御するタンパク質である。ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において提供される操作された転写因子またはｅＴＦは、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、および転写モジュレーターである少なくとも１つのドメイン、例えば、転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）または転写リプレッサードメイン（ＴＲＤ）のいずれかを含む、天然に存在しないタンパク質である。一実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦは、１つのＤＢＤおよび１つのＴＡＤを含んでいてもよく（例えば、ＴＡＤ－ＤＢＤまたはＤＢＤ－ＴＡＤ）、ここで、ＤＢＤおよびＴＡＤは、同じタンパク質に由来していてもよく、または異なるタンパク質に由来していてもよい。別の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦは、１つのＤＢＤおよび２つのＴＡＤを含んでいてもよく、ここで、ＤＢＤおよびＴＡＤは、同じタンパク質に由来するか、ＤＢＤは、第１のタンパク質に由来し、両方のＴＡＤは、第２のタンパク質に由来するか、ＤＢＤおよび１つのＴＡＤは、第１のタンパク質に由来し、第２のＴＡＤは、第２のタンパク質に由来するか、またはＤＢＤは、第１のタンパク質に由来し、１つのＴＡＤは、第２のタンパク質に由来し、第２のＴＡＤは、第３のタンパク質に由来する（例えば、ＴＡＤ１－ＤＢＤ－ＴＡＤ１、ＴＡＤ１－ＤＢＤ－ＴＡＤ２、ＴＡＤ１－ＴＡＤ１－ＤＢＤ、ＴＡＤ１－ＴＡＤ２－ＤＢＤ、ＤＢＤ－ＴＡＤ１－ＴＡＤ１またはＤＢＤ－ＴＡＤ１－ＴＡＤ２）。別の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦは、１つのＤＢＤおよび３つのＴＡＤを含んでいてもよく、ここで、ＤＢＤおよびＴＡＤは、同じタンパク質に由来するか、ＤＢＤは、第１のタンパク質に由来し、ＴＡＤは、１つもしくは複数の異なるタンパク質に由来するか、またはＤＢＤおよびすべてのＴＡＤは、すべて異なるタンパク質に由来する、例えば、ＴＡＤＸ－ＴＡＤＸ－ＴＡＤＸ－ＤＢＤ、ＴＡＤＸ－ＴＡＤＸ－ＤＢＤ－ＴＡＤＸ、ＴＡＤＸ－ＤＢＤ－ＴＡＤＸ－ＴＡＤＸまたはＤＢＤ－ＴＡＤＸ－ＴＡＤＸ－ＴＡＤＸ（式中、それぞれのＸは、独立して選択され、１つまたはすべての他のＴＡＤと同じまたは異なっていてもよい）である。例としては、例えば、ＴＡＤ１－ＴＡＤ１－ＤＢＤ－ＴＡＤ１、ＴＡＤ１－ＴＡＤ１－ＤＢＤ－ＴＡＤ２、ＴＡＤ１－ＴＡＤ２－ＤＢＤ－ＴＡＤ１、ＴＡＤ１－ＴＡＤ２－ＤＢＤ－ＴＡＤ２、ＴＡＤ１－ＴＡＤ２－ＤＢＤ－ＴＡＤ３、ＴＡＤ１－ＤＢＤ－ＴＡＤ１－ＴＡＤ１、ＴＡＤ１－ＤＢＤ－ＴＡＤ２－ＴＡＤ２、ＴＡＤ１－ＤＢＤ－ＴＡＤ１－ＴＡＤ２、ＴＡＤ２－ＤＢＤ－ＴＡＤ１－ＴＡＤ２、ＴＡＤ１－ＤＢＤ－ＴＡＤ２－ＴＡＤ３、ＴＡＤ１－ＴＡＤ１－ＴＡＤ１－ＤＢＤ、ＴＡＤ１－ＴＡＤ２－ＴＡＤ２－ＤＢＤ、ＴＡＤ１－ＴＡＤ２－ＴＡＤ２－ＤＢＤ、ＴＡＤ１－ＴＡＤ２－ＴＡＤ３－ＤＢＤ、ＤＢＤ－ＴＡＤ１－ＴＡＤ１－ＴＡＤ１、ＤＢＤ－ＴＡＤ１－ＴＡＤ１－ＴＡＤ２、ＤＢＤ－ＴＡＤ１－ＴＡＤ２－ＴＡＤ２またはＤＢＤ－ＴＡＤ１－ＴＡＤ２－ＴＡＤ３などが挙げられる。別の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦは、１つのＤＢＤおよび４つのＴＡＤを含んでいてもよく、ここで、ＤＢＤおよびＴＡＤは、同じタンパク質に由来するか、ＤＢＤは、第１のタンパク質に由来し、ＴＡＤは、１つもしくは複数の異なるタンパク質に由来するか、またはＤＢＤおよびすべてのＴＡＤは、すべて異なるタンパク質に由来する、例えば、ＴＡＤＸ－ＴＡＤＸ－ＴＡＤＸ－ＴＡＤＸ－ＤＢＤ、ＴＡＤＸ－ＴＡＤＸ－ＴＡＤＸ－ＤＢＤ－ＴＡＤＸ、ＴＡＤＸ－ＴＡＤＸ－ＤＢＤ－ＴＡＤＸ－ＴＡＤＸ、ＴＡＤＸ－ＤＢＤ－ＴＡＤＸ－ＴＡＤＸ－ＴＡＤＸまたはＤＢＤ－ＴＡＤＸ－ＴＡＤＸ－ＴＡＤＸ－ＴＡＤＸ（式中、それぞれのＸは、独立して選択され、１つまたはすべての他のＴＡＤと同じまたは異なっていてもよい）である。例としては、例えば、ＴＡＤ１－ＴＡＤ１－ＤＢＤ－ＴＡＤ１－ＴＡＤ１、ＴＡＤ１－ＴＡＤ１－ＤＢＤ－ＴＡＤ２－ＴＡＤ２、ＴＡＤ１－ＴＡＤ２－ＤＢＤ－ＴＡＤ１－ＴＡＤ２、ＴＡＤ１－ＴＡＤ２－ＤＢＤ－ＴＡＤ２－ＴＡＤ１、ＴＡＤ１－ＴＡＤ２－ＤＢＤ－ＴＡＤ１－ＴＡＤ３、ＴＡＤ１－ＴＡＤ３－ＤＢＤ－ＴＡＤ１－ＴＡＤ２、ＴＡＤ１－ＴＡＤ２－ＤＢＤ－ＴＡＤ３－ＴＡＤ４、ＴＡＤ１－ＴＡＤ１－ＴＡＤ１－ＤＢＤ－ＴＡＤ２、ＴＡＤ１－ＴＡＤ２－ＴＡＤ３－ＤＢＤ－ＴＡＤ４、ＴＡＤ１－ＤＢＤ－ＴＡＤ１－ＴＡＤ１－ＴＡＤ２、ＴＡＤ１－ＤＢＤ－ＴＡＤ２－ＴＡＤ３－ＴＡＤ４、ＴＡＤ１－ＤＢＤ－ＴＡＤ１－ＴＡＤ２－ＴＡＤ３、ＴＡＤ２－ＤＢＤ－ＴＡＤ１－ＴＡＤ２－ＴＡＤ３、ＴＡＤ１－ＤＢＤ－ＴＡＤ２－ＴＡＤ３－ＴＡＤ４、ＴＡＤ１－ＴＡＤ１－ＴＡＤ１－ＴＡＤ１－ＤＢＤ、ＴＡＤ１－ＴＡＤ２－ＴＡＤ２－ＴＡＤ３－ＤＢＤ、ＴＡＤ１－ＴＡＤ２－ＴＡＤ３－ＴＡＤ４－ＤＢＤ、ＤＢＤ－ＴＡＤ１－ＴＡＤ１－ＴＡＤ１－ＴＡＤ１、ＤＢＤ－ＴＡＤ１－ＴＡＤ１－ＴＡＤ２－ＴＡＤ２、ＤＢＤ－ＴＡＤ１－ＴＡＤ２－ＴＡＤ３－ＴＡＤ４またはＤＢＤ－ＴＡＤ１－ＴＡＤ２－ＴＡＤ３－ＴＡＤ３などが挙げられる。一実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦは、ＤＢＤの同じ末端（例えば、Ｎ末端またはＣ末端）に位置する１つのＤＢＤおよび２つのＴＡＤを含み、ここで、ＤＢＤは、第１のタンパク質に由来し、両方のＴＡＤは、第２のタンパク質に由来するか、またはＤＢＤは、第１のタンパク質に由来し、１つのＴＡＤは、第２のタンパク質に由来し、第２のＴＡＤは、第３のタンパク質に由来する（例えば、ＴＡＤ１－ＴＡＤ１－ＤＢＤ、ＴＡＤ１－ＴＡＤ２－ＤＢＤ、ＤＢＤ－ＴＡＤ１－ＴＡＤ１またはＤＢＤ－ＴＡＤ１－ＴＡＤ２）。ある特定の実施形態では、ＤＢＤは、複数のタンパク質由来のドメインを含有する合成構築物であってもよい。
ある特定の実施形態では、１つのＤＢＤならびに１つのＴＡＤおよび／または２つのＴＡＤは、直接、例えば、介在するアミノ酸配列なしで、コンジュゲートされていてもよく、１つのＤＢＤならびに１つのＴＡＤおよび／または２つのＴＡＤは、ペプチドリンカーまたはその組合せを使用してコンジュゲートされていてもよい。ある特定の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０もしくは１００アミノ酸、または１～５、１～１０、１～２０、１～３０、１～４０、１～５０、１～７５、１～１００、５～１０、５～２０、５～３０、５～４０、５～５０、５～７５、５～１００、１０～２０、１０～３０、１０～４０、１０～５０、１０～７５、１０～１００、２０～３０、２０～４０、２０～５０、２０～７５もしくは２０～１００アミノ酸を有するリンカーを介して、１つのＤＢＤは、１つのＴＡＤにコンジュゲートされ、および／または１つのＴＡＤは、第２のＴＡＤにコンジュゲートされる。一部の場合では、そのＤＢＤならびにそのＴＡＤおよび／または２つのＴＡＤは、そのドメインが由来する天然に存在するタンパク質中で見出される天然に存在する介在する残基を介してコンジュゲートされる。他の実施形態では、そのＤＢＤならびにＴＡＤおよび／または２つのＴＡＤは、合成または外因性リンカー配列を介してコンジュゲートされる。適切なリンカーは、柔軟性、切断性、非切断性、親水性および／または疎水性であり得る。ある特定の実施形態では、１つのＤＢＤならびに１つのＴＡＤおよび／または２つのＴＡＤは、複数のグリシンおよび／またはセリン残基を含むリンカーを介して一緒に融合されていてもよい。グリシン／セリンペプチドリンカーの例としては、［ＧＳ］ｎ、［ＧＧＧＳ］ｎ（配列番号１７９）、［ＧＧＧＧＳ］ｎ（配列番号１８０）、［ＧＧＳＧ］ｎ（配列番号１８１）が挙げられ、式中、ｎは、１と等しいか、または１よりも大きい整数である。ある特定の実施形態では、１つのＤＢＤならびに１つのＴＡＤおよび／または２つのＴＡＤをコンジュゲートするために有用なリンカーは、ＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号１７７）である。ある特定の実施形態では、１つのＤＢＤならびに１つのＴＡＤおよび／または２つのＴＡＤをコンジュゲートするために有用なリンカーは、ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号１７８）である。ある特定の実施形態では、１つのＤＢＤが２つのＴＡＤにコンジュゲートされる場合、第１および第２のＴＡＤは、同じもしくは異なるリンカーを用いてＤＢＤにコンジュゲートされてもよく、または一方のＴＡＤは、リンカーを用いてＤＢＤにコンジュゲートされてもよく、他方のＴＡＤは、ＤＢＤと直接（例えば、介在するリンカー配列なしで）コンジュゲートされ、または両方のＴＡＤは、ＤＢＤと直接（例えば、介在するリンカー配列なしで）コンジュゲートされてもよい。ある特定の実施形態では、ＤＢＤが同じ末端（例えば、Ｎ末端またはＣ末端）において２つのＴＡＤにコンジュゲートされる場合、２つのＴＡＤを接続するリンカーは、ＴＡＤをＤＢＤに接続するリンカーと同じもしくは異なっていてもよく、またはＴＡＤは、リンカーを用いて互いにコンジュゲートされてもよいが、ＴＡＤは、ＤＢＤと直接（例えば、介在するリンカー配列なしで）コンジュゲートされ、またはＴＡＤは、互いと直接（例えば、介在するリンカー配列なしで）コンジュゲートされてもよいが、ＴＡＤは、リンカーを用いてＤＢＤにコンジュゲートされる。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において提供されるｅＴＦは、ＤＢＤおよび１つまたは複数のＴＡＤの間に位置する１つまたは複数のＨＡタグ（例えば、配列番号１７１）を含まない。
ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において提供されるｅＴＦは、天然に存在する転写因子とは異なる性質を有する。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦは、ＤＢＤが、それが由来する天然に存在するタンパク質と比較して異なる標的部位に結合するように、ならびにそのような改変されたＤＢＤを含むｅＴＦが、そのＤＢＤ（例えば、ＳＣＮ１Ａ以外の遺伝子）が由来する天然に存在するタンパク質と比較して異なる遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａ）からの発現をモジュレートするように改変された、天然に存在するタンパク質に由来するＤＢＤを含む。他の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において提供されるｅＴＦは、そのように改変されたＴＡＤを含むｅＴＦが、そのＴＡＤ（例えば、ＳＣＮ１Ａ以外の遺伝子）が由来する天然に存在するタンパク質と比較して異なる遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａ）からの発現をモジュレートするように、および／またはそのように改変されたＴＡＤを含むｅＴＦが、そのＴＡＤが由来する天然に存在するタンパク質と比較してＳＣＮ１Ａの発現を異なってモジュレートする（例えば、上方調節する、対、下方調節する）ように改変された、天然に存在するタンパク質に由来するＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において提供されるｅＴＦは、天然に存在するタンパク質に由来するＤＢＤ、および天然に存在するタンパク質（同じタンパク質または異なるタンパク質のいずれか）に由来するＴＡＤを含み、ここで、ＤＢＤおよびＴＡＤは両方とも、改変されている。そのような実施形態では、ＤＢＤは、それが由来する天然に存在するタンパク質と比較して異なる標的部位に結合してもよく、そのように改変されたＤＢＤおよびＴＡＤを含むｅＴＦは、それらのドメイン（例えば、ＳＣＮ１Ａ以外の遺伝子）が由来する天然に存在するタンパク質と比較して異なる遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａ）からの発現をモジュレートし、および／またはそのように改変されたＤＢＤおよびＴＡＤを含むｅＴＦは、ＤＢＤおよびＴＡＤドメインが由来する天然に存在するタンパク質と比較してＳＣＮ１Ａの発現を異なってモジュレートする（例えば、上方調節する、対、下方調節する）。
ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）
ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において提供されるｅＴＦは、目的の標的部位（例えば、本明細書において提供されるｅＴＦが結合する場合に、ＳＣＮ１Ａの上方調節をもたらす標的部位）に結合する任意の適切なＤＢＤを含み得る。ある特定の実施形態では、ＤＢＤは、合成的に設計されたＤＢＤであってもよい。他の実施形態では、ＤＢＤは、天然に存在するタンパク質に由来していてもよい。ＤＢＤファミリーとしては、塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックス（ｂＨＬＨ）（例えば、ｃ－Ｍｙｃ）、塩基性－ロイシンジッパー（例えば、Ｃ／ＥＢＰ）、ヘリックス－ターン－ヘリックス（例えば、Ｏｃｔ－１）およびジンクフィンガー（例えば、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３）が挙げられる。これらのファミリーは、広範囲のＤＮＡ結合特異性および遺伝子標的を示す。本明細書において企図されるように、公知のヒト転写因子タンパク質のいずれか１つは、特異的標的部位を認識するようにＤＢＤを操作および／またはリプログラミングして、内因性ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現のモジュレーションをもたらすためのタンパク質プラットフォームとして機能し得る。例示的な実施形態では、本明細書において提供されるＤＢＤは、ジンクフィンガードメイン、ＴＡＬＥＮ結合ドメインまたはｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体を含む。
本明細書において提供されるＤＢＤは、ＳＣＮ１Ａの上方調節をもたらす任意の標的部位を認識するように設計され得る。例示的な実施形態では、ＤＢＤは、ｅＴＦが結合した場合に、内因性ＳＣＮ１Ａ遺伝子のゲノム位置を認識し、その発現を上方調節するように設計される。本明細書において提供されるｅＴＦが結合した場合に、内因性ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現をモジュレートすることができる結合部位は、ＳＣＮ１Ａの遺伝子発現のモジュレーションをもたらすゲノム中のどこにでも位置していてよい。さまざまな実施形態では、結合部位は、ＳＣＮ１Ａと異なる染色体上に、ＳＣＮ１Ａと同じ染色体上に、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）の上流に、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のＴＳＳの下流に、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のＴＳＳの近位に、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の遠位に、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のコード領域内に、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のイントロン内に、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のポリＡテイルの下流に、ＳＣＮ１Ａ遺伝子を調節するプロモーター配列内に、またはＳＣＮ１Ａ遺伝子を調節するエンハンサー配列内に、位置していてもよい。
ＤＢＤは、それが、例えば、最小のオフターゲット結合を伴って、またはオフターゲット結合を伴わずに、ＤＢＤによる標的結合部位配列の特異的認識を提供する限り、任意の長さの標的結合部位に結合するように設計され得る。ある特定の実施形態では、標的結合部位は、すべての他の遺伝子と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、５００倍、またはそれよりも高いレベルで、ｅＴＦが結合した場合にＳＣＮ１Ａの発現をモジュレートし得る。ある特定の実施形態では、標的結合部位は、４０個の最も近い隣接する遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａのコード配列の上流または下流のいずれかの染色体上の最も近くに位置する４０個の遺伝子）と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、５００倍、またはそれよりも高いレベルで、ｅＴＦが結合した場合にＳＣＮ１Ａの発現をモジュレートし得る。ある特定の実施形態では、標的結合部位は、少なくとも５ｂｐ、１０ｂｐ、１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、３０ｂｐ、３５ｂｐ、４０ｂｐ、４５ｂｐもしくは５０ｂｐ、またはそれよりも大きくてもよい。結合部位の具体的な長さは、ｅＴＦ中のＤＢＤの種類によって情報が提供される。一般に、結合部位の長さが長くなると、結合の特異性および遺伝子発現のモジュレーションは大きくなる（例えば、より長い結合部位は、より小さなオフターゲット効果を有する）。ある特定の実施形態では、より長い標的結合部位を認識するＤＢＤを有するｅＴＦは、より短い標的部位に結合するＤＢＤを有するｅＴＦで観察されるオフターゲット効果と比べて、非特異的結合に関連するより小さなオフターゲット効果（例えば、オフターゲット遺伝子、またはＳＣＮ１Ａ以外の遺伝子の発現のモジュレーションなど）を有する。一部の場合では、オフターゲット結合の低減は、より短い標的結合部位を認識するＤＢＤを有する同等のｅＴＦと比較して、少なくとも１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍低い。
ある特定の実施形態では、本明細書において提供されるＤＢＤは、ＤＢＤにコンジュゲートされたＴＡＤが、内因性ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現レベルに対してより高い効果を示すために、より多くの転写因子を動員すること、および／またはより長い期間にわたってそのような転写因子を動員することが可能であるように、より長い期間、標的結合部位に結合するように、増加した結合親和性を有するように改変することができる。ある特定の実施形態では、ＤＢＤは、所望の標的部位へのその特異的結合（またはオンターゲット結合）を増加させるように改変されてもよく、および／またはその非特異的結合もしくはオフターゲット結合を減少させるように改変されてもよい。
さまざまな実施形態では、ＤＢＤまたはｅＴＦおよび標的結合部位の間の結合は、さまざまな方法を使用して決定され得る。ある特定の実施形態では、ＤＢＤまたはｅＴＦおよび標的結合部位の間の特異的結合は、移動度シフトアッセイ、ＤＮａｓｅ保護アッセイ、またはタンパク質－ＤＮＡ結合をアッセイするための当技術分野において公知の任意の他のｉｎ ｖｉｔｒｏ法を使用して、決定してもよい。他の実施形態では、ｅＴＦおよび標的結合部位の間の特異的結合は、例えば、標的結合部位がｅＴＦと結合する場合の遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａ）の発現（ＲＮＡまたはタンパク質）を測定することによる、機能的アッセイを使用して決定してもよい。例えば、標的結合部位は、細胞に含有されるか、または細胞のゲノムに組み込まれるベクター上のレポーター遺伝子（例えば、ｅＧＦＰなど）またはＳＣＮ１Ａ遺伝子の上流に配置されてもよく、ここで、細胞は、ｅＴＦを発現する。あるいは、ｅＴＦを発現するベクターは、天然にＳＣＮ１Ａ遺伝子を含有する細胞型に導入されてもよい。対照（例えば、ｅＴＦなし、または異なる標的部位を認識するｅＴＦ）と比較した、ｅＴＦの存在下でのレポーター遺伝子（または、ＳＣＮ１Ａ）の発現のより高いレベルは、ｅＴＦのＤＢＤが標的部位に結合することを示す。適切なｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、細胞に基づかない）転写系および翻訳系も、同様の様式で使用してもよい。ある特定の実施形態では、標的部位に結合するｅＴＦは、対照（例えば、ｅＴＦなし、または異なる標的部位を認識するｅＴＦ）と比較して、レポーター遺伝子またはＳＣＮ１Ａの、少なくとも２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍またはそれよりも高い発現を有していてもよい。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、少なくとも９ｂｐ、１２ｂｐ、１５ｂｐ、１８ｂｐ、２１ｂｐ、２４ｂｐ、２７ｂｐ、３０ｂｐ、３３ｂｐもしくは３６ｂｐのサイズ；９ｂｐ、１２ｂｐ、１５ｂｐ、１８ｂｐ、２１ｂｐ、２４ｂｐ、２７ｂｐもしくは３０ｂｐよりも大きい；または９～３３ｂｐ、９～３０ｂｐ、９～２７ｂｐ、９～２４ｂｐ、９～２１ｂｐ、９～１８ｂｐ、９～１５ｂｐ、９～１２ｂｐ、１２～３３ｂｐ、１２～３０ｂｐ、１２～２７ｂｐ、１２～２４ｂｐ、１２～２１ｂｐ、１２～１８ｂｐ、１２～１５ｂｐ、１５～３３ｂｐ、１５～３０ｂｐ、１５～２７ｂｐ、１５～２４ｂｐ、１５～２１ｂｐ、１５～１８ｂｐ、１８～３３ｂｐ、１８～３０ｂｐ、１８～２７ｂｐ、１８～２４ｂｐ、１８～２１ｂｐ、２１～３３ｂｐ、２１～３０ｂｐ、２１～２７ｂｐ、２１～２４ｂｐ、２４～３３ｂｐ、２４～３０ｂｐ、２４～２７ｂｐ、２７～３３ｂｐ、２７～３０ｂｐもしくは３０～３３ｂｐである標的結合部位を認識する。例示的な実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、１８～２７ｂｐ、１８ｂｐまたは２７ｂｐである標的結合部位を認識する。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、第２染色体上に位置する標的結合部位を認識する。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、ＳＣＮ１ＡのＴＳＳの上流または下流の、１１０ｋｂ、１００ｋｂ、９０ｋｂ、８０ｋｂ、７０ｋｂ、６０ｋｂ、５０ｋｂ、４０ｋｂ、３０ｋｂ、２０ｋｂ、１０ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂまたは１ｋｂ以内の第２染色体上に位置する標的結合部位を認識する。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、ＳＣＮ１ＡのＴＳＳの上流の１１０ｋｂ以内の第２染色体上に位置する標的結合部位を認識する。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、ＳＣＮ１ＡのＴＳＳの下流の１１０ｋｂ以内の第２染色体上に位置する標的結合部位を認識する。例示的な実施形態では、そのような標的結合部位は、１８～２７ｂｐ、１８ｂｐまたは２７ｂｐである。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、１６６１７９６５２～１６５９８９５７１位の範囲内、１６６１２８０５０～１６６１２７９５８位の範囲内、１６６１５５４１４～１６６１４０５９０位の範囲内、１６６１７９６５２～１６６１７７７２７２位の範囲内または１６５９９９０２４６～１６５９８９５９２位の範囲内（すべて、ＧＲＣｈ３８．ｐ１２を参照）の第２染色体上に位置する標的結合部位を認識する。例示的な実施形態では、そのような標的結合部位は、１８～２７ｂｐ、１８ｂｐまたは２７ｂｐである。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、（ｉ）１８～２７ｂｐ、１８ｂｐまたは２７ｂｐである、（ｉｉ）１６６１７８８８０、１６６１７７３６９、１６６１７７３６２、１６６１７７２９９、１６６１７７２９９、１６６１５５３９３、１６６１５５２６４、１６６１４９３７３、１６６１４９１７６、１６６１４９１６５、１６６１４９１１８、１６６１４８９５３、１６６１４８５６５、１６６１４２３９６、１６６１４２３９１、１６６１４２３４４、１６６１４２２３９、１６６１４１１６２、１６６１４０９２８、１６６１４０５９０、１６５９９００７６、１６５９８９６８４、１６５９８９５７１、１６６１５５２５５、１６６１５５０９９、１６６１４８８４３、１６６１４８３６１、１６６１４２２１９、１６６１４１０９０、１６５９９０２４６、１６５９９０１９３、１６６１４９１６８、１６６１２７９９１、１６６１２８００２、１６６１２８０３７または１６６１２８０２５から選択される第２染色体上の位置と重複する（すべて、ＧＲＣｈ３８．ｐ１２を参照）、および（ｉｉｉ）本明細書において開示されるｅＴＦが結合する場合にＳＣＮ１Ａの発現の少なくとも１．２倍の増加を生じさせることができる、標的結合部位を認識する。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、（ｉ）配列番号１８、２５、３０、３１もしくは３５～６６のいずれかを含むか、またはそれからなる標的部位に結合する、および（ｉｉ）本明細書において開示されるｅＴＦが結合する場合にＳＣＮ１Ａの発現の少なくとも１．２倍の増加を生じさせることができる。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、（ｉ）１８～２７ｂｐ、１８ｂｐまたは２７ｂｐである、（ｉｉ）１６６１５５２５５、１６６１５５０９９、１６６１４８８４３、１６６１４８３６１、１６６１４２２１９、１６６１４１０９０、１６５９９０２４６、１６５９９０１９３、１６６１４９１６８、１６６１２７９９１、１６６１２８００２、１６６１２８０３７または１６６１２８０２５から選択される第２染色体上の位置と重複する（すべて、ＧＲＣｈ３８．ｐ１２を参照）、および（ｉｉｉ）本明細書において開示されるｅＴＦが結合する場合にＳＣＮ１Ａの発現の少なくとも２倍の増加を生じさせることができる、標的結合部位を認識する。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、（ｉ）配列番号１８、３０、３１、３７、３８、４５、４７、４８、４９、５５、６１、６２もしくは６４のいずれかを含むか、またはそれからなる標的部位に結合する、および（ｉｉ）本明細書において開示されるｅＴＦが結合する場合にＳＣＮ１Ａの発現の少なくとも２倍の増加を生じさせることができる。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、（ｉ）１８～２７ｂｐ、１８ｂｐまたは２７ｂｐである、および（ｉｉ）１６６１４９１６８、１６６１２７９９１、１６６１２８００２、１６６１２８０３７または１６６１２８０２５から選択される第２染色体上の位置と重複する（すべて、ＧＲＣｈ３８．ｐ１２を参照）、および（ｉｉｉ）本明細書において開示されるｅＴＦが結合する場合にＳＣＮ１Ａの発現の少なくとも５倍の増加を生じさせることができる、標的結合部位を認識する。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、（ｉ）配列番号１８、３０、３１、３７もしくは３８のいずれかを含むか、またはそれからなる標的部位に結合する、および（ｉｉ）本明細書において開示されるｅＴＦが結合する場合にＳＣＮ１Ａの発現の少なくとも５倍の増加を生じさせることができる。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、（ｉ）１８～２７ｂｐ、１８ｂｐまたは２７ｂｐである、（ｉｉ）１６６１２８００２、１６６１２８０３７または１６６１２８０２５から選択される第２染色体上の位置と重複する（すべて、ＧＲＣｈ３８．ｐ１２を参照）、および（ｉｉｉ）本明細書において開示されるｅＴＦが結合する場合にＳＣＮ１Ａの発現の少なくとも１５倍の増加を生じさせることができる、標的結合部位を認識する。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、（ｉ）配列番号３０、３７もしくは３８のいずれかを含むか、またはそれからなる標的部位に結合する、および（ｉｉ）本明細書において開示されるｅＴＦが結合する場合にＳＣＮ１Ａの発現の少なくとも１５倍の増加を生じさせることができる。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、（ｉ）１８～２７ｂｐ、１８ｂｐまたは２７ｂｐである、（ｉｉ）１６６１２８０３７または１６６１２８０２５から選択される第２染色体上の位置と重複する（すべて、ＧＲＣｈ３８．ｐ１２を参照）、および（ｉｉｉ）本明細書において開示されるｅＴＦが結合する場合にＳＣＮ１Ａの発現の少なくとも２０倍の増加を生じさせることができる、標的結合部位を認識する。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、（ｉ）配列番号３０もしくは３８のいずれかを含むか、またはそれからなる標的部位に結合する、および（ｉｉ）本明細書において開示されるｅＴＦが結合する場合にＳＣＮ１Ａの発現の少なくとも２０倍の増加を生じさせることができる。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、（ｉ）１８～２７ｂｐ、１８ｂｐまたは２７ｂｐである、（ｉｉ）１６６１２８０２５位において第２染色体上の位置と重複する、および（ｉｉｉ）本明細書において開示されるｅＴＦが結合する場合にＳＣＮ１Ａの発現の少なくとも２５倍の増加を生じさせることができる、標的結合部位を認識する。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、（ｉ）配列番号３０を含むか、またはそれからなる標的部位に結合する、および（ｉｉ）本明細書において開示されるｅＴＦが結合する場合にＳＣＮ１Ａの発現の少なくとも２５倍の増加を生じさせることができる。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、（ｉ）１８～２７ｂｐ、１８ｂｐまたは２７ｂｐである、および（ｉｉ）配列番号１８、２５、３０、３１または３５～３６のいずれか１つの配列を有するゲノム位置の少なくとも１ｋｂ、７５０ｂｐ、５００ｂｐ、４００ｂｐ、３００ｂｐ、２００ｂｐ、１００ｂｐまたは５０ｂｐ以内であるゲノム領域に結合する、標的結合部位を認識する。ある特定の実施形態では、標的結合部位は、本明細書において開示されるｅＴＦが結合する場合にＳＣＮ１Ａの発現の少なくとも１．２倍、２倍、５倍、１５倍、２０倍または２５倍の増加を生じさせることができる。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、（ｉ）１８～２７ｂｐ、１８ｂｐまたは２７ｂｐである、および（ｉｉ）配列番号１８、２５、３０、３１または３５～６６のいずれか１つの配列を有するゲノム位置と少なくとも部分的に重複するゲノム領域に結合する、標的結合部位を認識する。ある特定の実施形態では、標的結合部位は、本明細書において開示されるｅＴＦが結合する場合にＳＣＮ１Ａの発現の少なくとも１．２倍、２倍、５倍、１５倍、２０倍または２５倍の増加を生じさせることができる。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、以下の配列：配列番号１８、２５、３０、３１または３５～６６のいずれか１つを有する標的結合部位を認識する。ある特定の実施形態では、標的結合部位は、本明細書において開示されるｅＴＦが結合する場合にＳＣＮ１Ａの発現の少なくとも１．２倍、２倍、５倍、１５倍、２０倍または２５倍の増加を生じさせることができる。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、対照（例えば、ｅＴＦなし、または標的部位を認識しないｅＴＦ）と比較して、細胞において、またはｉｎ ｖｉｖｏで、ＳＣＮ１Ａ発現（ＳＣＮ１Ａ ＲＮＡおよび／またはＮａｖ１．１タンパク質）の、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍、１００倍、またはそれよりも高い上方調節、あるいは少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％、またはそれよりも高い上方調節をもたらす。さまざまな実施形態では、ＳＣＮ１Ａ発現の上方調節は、ＰＣＲ法、ウエスタンブロットまたはイムノアッセイを使用して、検出することができる。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、転写活性化アッセイにおいて、対照と比べて、少なくとも１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、８倍、１０倍、１２倍、１５倍、１８倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、１００倍、またはそれより高くまで、あるいは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％、またはそれよりも高くまで、ＳＣＮ１Ａ発現を増加させることができる標的部位に結合する。例示的なＳＣＮ１Ａ転写活性化アッセイは、本明細書において、実施例３に提供される。簡潔には、ＨＥＫ２９３を、ｅＴＦを有するプラスミド、または対照ｅＧＦＰレポーター構築物でトランスフェクトする。トランスフェクションの４８時間後、細胞を収集し、ＲＮＡを単離し、逆転写し、得られたｃＤＮＡ試料を、ｑＰＣＲ（例えば、配列番号１８５および１８６を有するプライマーを使用する）によって分析して、内因性ＳＣＮ１Ａ転写物のレベルを定量する。ＧＡＰＤＨは、ＳＣＮ１Ａ発現の相対レベルを決定するための参照遺伝子として使用してもよい。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、最小のオフターゲット効果、例えば、オフターゲット遺伝子またはＳＣＮ１Ａ以外の遺伝子の発現のモジュレーションなどの非特異的結合に関連するオフターゲット効果を有する。一実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、対照と比較して、１つまたは複数のオフターゲット遺伝子についてｅＴＦによって生じる発現よりも少なくとも５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍または５０倍高く、対照と比較してＳＣＮ１Ａを特異的に上方調節する。例示的な実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、対照と比べて、ｅＴＦによって生じる４０個の最も近い隣接する遺伝子（例えば、第２染色体上のＳＣＮ１Ａのコード配列に位置する４０個の最も近い遺伝子）、例えば、ＰＬＡ２Ｒ１、ＩＴＧＢ６、ＲＢＭＳ１、ＴＡＮＫ、ＰＳＭＤ１４、ＴＢＲ１、ＳＬＣ４Ａ１０、ＤＰＰ４、ＦＡＰ、ＩＦＩＨ１、ＧＣＡ、ＦＩＧＮ、ＧＲＢ１４、ＣＯＢＬＬ１、ＳＬＣ３８Ａ１１、ＳＣＮ３Ａ、ＳＣＮ２Ａ、ＣＳＲＮＰ３、ＧＡＬＮＴ３、ＴＴＣ２１Ｂ、ＳＣＮ９Ａ、ＳＣＮ７Ａ、Ｂ３ＧＡＬＴ１、ＳＴＫ３９、ＣＥＲＳ６、ＮＯＳＴＲＩＮ、ＳＰＣ２５、ＡＢＣＢ１１、ＤＨＲＳ９、ＢＢＳ５、ＫＬＨＬ４１、ＦＡＳＴＫＤ１、ＰＰＩＧ、ＣＣＤＣ１７３、ＰＨＯＳＰＨＯ２、ＫＬＨＬ２３、ＳＳＢ、ＭＥＴＴＬ５、ＵＢＲ３およびＭＹＯ３Ｂの転写よりも少なくとも１５倍高く、対象と比較してＳＣＮ１Ａ遺伝子からの転写を特異的に上方調節する（表１４を参照されたい）。さまざまな実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子からの転写の上方調節は、ＰＣＲ法を使用して検出することができる。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、ドラベ症候群のＳｃｎ１ａｔｍ１ｋｅａマウスモデルにおける高体温発作（ＨＴＳ）アッセイにおいて発作の頻度を低減することができる。ある特定の実施形態では、本明細書において開示されるｅＴＦは、ＨＴＳアッセイにおいて、４２．６℃での発作の頻度を、対照（例えば、ＰＢＳ処置、またはｅＧＦＰをコードする配列を含むＡＡＶベクターによる処置）と比較して、少なくとも１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、もしくはそれよりも大きく、または少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、もしくはそれよりも大きく、低減することが可能である。ある特定の実施形態では、本明細書において開示されるｅＴＦは、アッセイにおいて実行されたマウスの少なくとも６０％、６２％、６５％、７０％、７５％、７６％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が、４２．６℃で発作なしであるように、ＨＴＳアッセイにおける４２．６℃での発作の頻度を低減することが可能である。例示的なＨＴＳアッセイは、本明細書において、実施例６に記載する。簡潔には、雄Ｓｃｎ１ａ＋／－マウスと雌Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスを交配して生まれた同腹仔の仔に、Ｐ１において、両側ＩＣＶを介して、本明細書において提供されるＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦをコードするＡＡＶ９ベクター、またはｅＧＦＰをコードする対照ベクターを投与し得る。マウスは、約１．０Ｅ１０～５．０Ｅ１２ｇｃ／マウスで投与され得る。ＨＴＳアッセイは、姿勢の喪失を伴う最初の強直間代発作の発症まで、または４３℃の体温に達するまで、マウスの体温を（制御された条件下、および体温モニタリングにより）２分ごとに約０．５℃ずつ増加させることによって、混合１２９Ｓｔａｃ Ｘ Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドにおける、Ｐ２６～Ｐ２８のＳＣＮ１Ａヘテロ接合性マウスおよびＳＣＮ１Ａ野生型マウスにおいて行う。姿勢の喪失を伴う発作が、実験の全過程にわたって検出されない場合、マウスは発作なしとみなされる。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａについてヘテロ接合性であるマウス、例えば、Ｓｃｎ１ａｔｍ１ｋｅａマウス系統の生存を増加させることができる。ある特定の実施形態では、本明細書において開示されるｅＴＦは、Ｐ１００におけるＳＣＮ１Ａヘテロ接合性マウスの生存率を、対照（例えば、ＰＢＳ処置、またはｅＧＦＰをコードする配列を含むＡＡＶベクターによる処置）と比較して、少なくとも１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、もしくはそれよりも高く、または少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、もしくはそれよりも高く、増加させることが可能である。ある特定の実施形態では、本明細書において開示されるｅＴＦは、アッセイにおいて実行されるマウスの少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が、Ｐ１００において依然として生存しているように、Ｐ１００におけるＳＣＮ１Ａヘテロ接合性マウスの生存率を増加させることが可能である。例示的な生存アッセイは、本明細書において、実施例７に記載する。簡潔には、雄Ｓｃｎ１ａ＋／－マウスと雌Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスを交配して生まれた同腹仔の仔に、Ｐ１において、両側ＩＣＶを介して、ＡＡＶ９ベクターを投与し得る。マウスは、約１．０Ｅ１０～５．０Ｅ１２ｇｃ／マウスで投与され得る。Ｐ１００まで生存したマウスの数が決定される。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において提供されるｅＴＦは、ジンクフィンガータンパク質からであるか、ジンクフィンガータンパク質に由来するか、またはヌクレアーゼが不活性化ジンクフィンガータンパク質である、ＤＢＤを含んでいてもよい。ジンクフィンガーは、折り畳みを安定化するための、１つまたは複数の亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）の配位によって特徴付けられる、小さなタンパク質構造モチーフである。ジンクフィンガー（Ｚｎｆ）ドメインは、ＤＮＡ標的部位とタンデムに接触する複数のフィンガー様突出部を含有する、比較的小さなタンパク質モチーフである。ジンクフィンガーモチーフのモジュール性は、ＤＮＡ配列の多数の組合せが、高い程度の親和性および特異性で結合するのを可能にし、したがって、理想的に、特異的ＤＮＡ配列に標的化され得、それに結合し得る、タンパク質を操作するのに適している。多くの操作されたジンクフィンガーアレイは、マウス転写因子Ｚｉｆ２６８のジンクフィンガードメインに基づく。Ｚｉｆ２６８は、高い親和性で、９ｂｐの配列に集合的に結合する３個の個々のジンクフィンガーモチーフを有する。広範なジンクフィンガータンパク質が同定されており、本明細書においてさらに記載されるように、構造に基づいて異なる種類に特徴付けられる。任意のそのようなジンクフィンガータンパク質は、本明細書に記載のＤＢＤと関連して、有用である。
ジンクフィンガータンパク質を設計するためのさまざまな方法が利用可能である。例えば、目的の標的ＤＮＡ配列に結合するジンクフィンガータンパク質を設計するための方法は記載されており、例えば、Liu Q, et al., Design of polydactyl zinc-finger proteins for uniqueaddressing within complex genomes, Proc Natl Acad Sci USA. 94 (11): 5525-30(1997)；Wright DA et al., Standardized reagents and protocols for engineeringzinc finger nucleases by modular assembly, Nat Protoc . Nat Protoc.2006;1(3):1637-52；およびCA Gersbach and T Gaj, Synthetic Zinc Finger Proteins: TheAdvent of Targeted Gene Regulation and Genome Modification Technologies, AmChem Soc 47: 2309-2318 (2014)を参照されたい。加えて、目的のＤＮＡ標的配列に結合するジンクフィンガータンパク質を設計するためのさまざまなウェブに基づくツールが公に利用可能であり、例えば、ｏｍｉｃｔｏｏｌｓ．ｃｏｍ／ｚｆｎｓ－ｃａｔｅｇｏｒｙにおいてワールドワイドウェブ上で利用可能なＯｍｉｃＸからのＺｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＴｏｏｌｓおよびＧｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓウェブサイト；ならびにｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｂａｒｂａｓ／ｚｆｄｅｓｉｇｎ／ｚｆｄｅｓｉｇｎｈｏｍｅ．ｐｈｐにおいてワールドワイドウェブ上で利用可能なＳｃｒｉｐｐｓからのＺｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｔｏｏｌｓ設計ウェブサイトを参照されたい。加えて、目的のＤＮＡ標的配列に結合するジンクフィンガータンパク質を設計するためのさまざまな市販のサービスを利用可能であり、例えば、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓによって提供される市販のサービスまたはキット（ｃｒｅａｔｉｖｅ－ｂｉｏｌａｂｓ．ｃｏｍ／Ｄｅｓｉｇｎ－ａｎｄ－Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ－ｏｆ－Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ－Ｚｉｎｃ－Ｆｉｎｇｅｒ－Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ｈｔｍｌにおけるワールドワイドウェブ）、Ａｄｄｇｅｎｅから利用可能なＺｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｍｏｄｕｌａｒ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔ（ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｋｉｔｓ／ｚｆｃ－ｍｏｄｕｌａｒ－ａｓｓｅｍｂｌｙ／におけるワールドワイドウェブ）、またはＳｉｇｍａ ＡｌｄｒｉｃｈからのＣｏｍｐｏＺｒ Ｃｕｓｔｏｍ ＺＦＮ Ｓｅｒｖｉｃｅ（ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ－ｓｃｉｅｎｃｅ／ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ－ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／ｃｕｓｔｏｍ－ｚｆｎ．ｈｔｍｌにおけるワールドワイドウェブ）を参照されたい。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において提供されるｅＴＦは、１つもしくは複数のジンクフィンガーを含むＤＢＤを含むか、またはジンクフィンガータンパク質のＤＢＤに由来する。一部の場合では、ＤＢＤは、複数のジンクフィンガーを含み、それぞれのジンクフィンガーは、そのＮ末端もしくはＣ末端、または両方のいずれかにおいて、アミノ酸リンカーを介して、別のジンクフィンガーまたは別のドメインに連結されている。一部の場合では、本明細書において提供されるＤＢＤは、表９に記載の１つまたは複数のジンクフィンガーの種類由来の１つまたは複数のジンクフィンガーを含む。一部の場合では、本明細書において提供されるＤＢＤは、複数のジンクフィンガー構造またはモチーフ、あるいは配列番号１５２～１６７の１つもしくは複数、またはそれらの任意の組合せを有する複数のジンクフィンガーを含む。ある特定の実施形態では、ＤＢＤは、Ｘ－［ＺＦ－Ｘ］ｎおよび／または［Ｘ－ＺＦ］ｎ－Ｘ（式中、ＺＦは、表９に列挙されるモチーフのいずれか１つ（例えば、配列番号１３６～１４６のいずれか１つ）を有するジンクフィンガードメインであり、Ｘは、１～５０アミノ酸を含むアミノ酸リンカーであり、ｎは、１～１５の整数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５であり、それぞれのＺＦは、独立して、ＤＢＤ中の他のＺＦ配列と同じ配列または異なる配列を独立して有することができ、それぞれのリンカーＸは、独立して、ＤＢＤ中の他のＸ配列と同じ配列または異なる配列を有することができる）を含む。それぞれのジンクフィンガーは、そのＣ末端、Ｎ末端、または両方において、別の配列、ジンクフィンガーまたはドメインに連結され得る。ＤＢＤ中で、それぞれのリンカーＸは、配列、長さおよび／もしくは性質（例えば、柔軟性または電荷）が同一であり得るか、または配列、長さおよび／もしくは性質が異なり得る。一部の場合では、２つまたはそれよりも多くのリンカーが同一であってもよいが、他のリンカーは異なる。例示的な実施形態では、リンカーは、表９に提供される１つまたは複数の天然に存在するジンクフィンガータンパク質中に見出されるジンクフィンガーを接続する配列から得てもよく、またはそれに由来していてもよい。他の実施形態では、適切なリンカー配列としては、例えば、５またはそれよりも長いアミノ酸長のリンカーが挙げられる。６またはそれよりも長いアミノ酸長の例示的なリンカー配列については、そのそれぞれが、それらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書において提供されるＤＢＤタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間に適切なリンカーの任意の組合せを含んでいてもよい。本明細書に記載のＤＢＤタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間に適切なリンカーの任意の組合せを含んでいてもよい。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において提供されるｅＴＦは、１つまたは複数の古典的ジンクフィンガーを含むＤＢＤを含む。古典的Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガーは、亜鉛イオンが配位した、１つの鎖中の２つのシステイン、および別の鎖中の２つのヒスチジン残基を有する。古典的ジンクフィンガードメインは、２つのβ－シートおよび１つのα－ヘリックスを有し、α－ヘリックスは、ＤＮＡ分子と相互作用し、標的部位へのＤＢＤ結合の基礎を形成し、「認識ヘリックス」と称される場合がある。例示的な実施形態では、ジンクフィンガーの認識ヘリックスは、－１位、２位、３位または６位において少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、それによって、ジンクフィンガードメインの結合特異性を変化させる。他の実施形態では、本明細書において提供されるＤＢＤは、１つまたは複数の非古典的ジンクフィンガー、例えば、Ｃ２－Ｈ２、Ｃ２－ＣＨおよびＣ２－Ｃ２を含む。
別の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において提供されるｅＴＦは、以下の構造：ＬＥＰＧＥＫＰ－［ＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳ Ｘ ＨＱＲＴＨ ＴＧＥＫＰ］ｎ－ＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳ Ｘ ＨＱＲＴＨ－ＴＧＫＫＴＳ（配列番号１４７）（式中、ｎは、１～１５の整数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５であり、それぞれのＸは、独立して、３ｂｐの標的配列に結合することができる認識配列（例えば、認識ヘリックス）である）を有するジンクフィンガーモチーフを含むＤＢＤを含む。例示的な実施形態では、ｎは、３、６または９である。特に好ましい実施形態では、ｎは、６である。さまざまな実施形態では、それぞれのＸは、独立して、ＤＢＤ中の他のＸ配列と比較して、同じアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を有していてもよい。例示的な実施形態では、それぞれのＸは、ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｂａｒｂａｓ／ｚｆｄｅｓｉｇｎ／ｚｆｄｅｓｉｇｎｈｏｍｅ．ｐｈｐにおいてワールドワイドウェブ上にあるＳｃｒｉｐｐｓからのＺｉｎｇｅｒ Ｆｉｎｇｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌを使用して、３ｂｐの目的の標的結合部位と相互作用するように設計された７アミノ酸を含む配列である。
ＤＢＤ内のそれぞれのジンクフィンガーは、３ｂｐを認識するので、ＤＢＤ中に含まれるジンクフィンガーの数は、ＤＢＤによって認識される結合部位の長さの情報を与え、例えば、１個のジンクフィンガーを有するＤＢＤは、３ｂｐを有する標的結合部位を認識し、２個のジンクフィンガーを有するＤＢＤは、６ｂｐを有する標的結合部位を認識し、３個のジンクフィンガーを有するＤＢＤは、９ｂｐを有する標的結合部位を認識し、４個のジンクフィンガーを有するＤＢＤは、１２ｂｐを有する標的結合部位を認識し、５個のジンクフィンガーを有するＤＢＤは、１５ｂｐを有する標的結合部位を認識し、６個のジンクフィンガーを有するＤＢＤは、１８ｂｐを有する標的結合部位を認識し、９個のジンクフィンガーを有するＤＢＤは、２７ｂｐを有する標的結合部位を認識するなどである。一般に、より長い標的結合部位を認識するＤＢＤは、より高い結合特異性（例えば、より少ないオフターゲット結合または非特異的結合）を示す。
他の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において提供されるｅＴＦは、ＤＢＤの結合特異性を変化させる（例えば、ＤＢＤによって認識される標的部位を変化させる）ために、ジンクフィンガードメインの認識ヘリックスの１つまたは複数において１つまたは複数のアミノ酸置換を行うことによって、天然に存在するジンクフィンガータンパク質から誘導されるＤＢＤを含む。本明細書において提供されるＤＢＤは、任意の天然に存在するジンクフィンガータンパク質に由来していてもよい。さまざまな実施形態では、そのようなＤＢＤは、任意の種、例えば、マウス、ラット、ヒトなどのジンクフィンガータンパク質に由来していてもよい。例示的な実施形態では、本明細書において提供されるＤＢＤは、ヒトジンクフィンガータンパク質に由来する。ある特定の実施形態では、本明細書において提供されるＤＢＤは、表９に列挙される天然に存在するタンパク質に由来する。例示的な実施形態では、本明細書において提供されるＤＢＤタンパク質は、ヒトＥＧＲジンクフィンガータンパク質、例えば、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３またはＥＧＲ４に由来する。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において提供されるｅＴＦは、天然に存在するタンパク質のＤＢＤ内の１つまたは複数のジンクフィンガーを反復させることにより、ＤＢＤタンパク質中のジンクフィンガードメインの数を増加させるようにＤＢＤを改変することによって、天然に存在するタンパク質から誘導されるＤＢＤを含む。ある特定の実施形態では、そのような改変は、天然に存在するタンパク質のＤＢＤ内でのジンクフィンガーの、２倍化、３倍化、４倍化、またはさらなる増加（multiplication）を含む。一部の場合では、ヒトタンパク質のＤＢＤ由来の１つのジンクフィンガーを増やす、例えば、同じジンクフィンガーモチーフの、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれよりも多くコピーが、ｅＴＦのＤＢＤ中で反復される。一部の場合では、天然に存在するタンパク質のＤＢＤ由来のジンクフィンガーのセットを増やす、例えば、天然に存在するタンパク質のＤＢＤ由来の３個のジンクフィンガーのセットを、６個のジンクフィンガーを有するＤＢＤを有するｅＴＦを得るために２倍にする、９個のジンクフィンガーを有するｅＴＦのＤＢＤを得るために３倍にする、または１２個のジンクフィンガーを有するｅＴＦのＤＢＤを得るために４倍にするなどである。一部の場合では、天然に存在するタンパク質のＤＢＤ由来のジンクフィンガーのセットを、部分的に複製して、より多くの数のジンクフィンガーを有するｅＴＦのＤＢＤを形成し、例えば、ｅＴＦのＤＢＤは、４個のジンクフィンガーを含み、ここで、そのジンクフィンガーは、ｅＴＦのＤＢＤ中の合計で４個のジンクフィンガーについて、天然に存在するタンパク質由来の、第１のジンクフィンガーの１コピー、第２のジンクフィンガーの１コピー、および第３のジンクフィンガーの２コピーを表す。その結果、そのようなＤＢＤは、ＤＢＤの結合特異性を変化させる（例えば、ＤＢＤによって認識される標的部位を変化させる）ために、ジンクフィンガードメインの認識ヘリックスの１つまたは複数において１つまたは複数のアミノ酸置換を行うことによって、さらに改変される。例示的な実施形態では、ＤＢＤは、天然に存在するヒトタンパク質、例えば、ヒトＥＧＲジンクフィンガータンパク質、例えば、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３またはＥＧＲ４に由来する。
ヒトＥＧＲ１およびＥＧＲ３は、３－フィンガーＣ２Ｈ２ジンクフィンガーＤＢＤによって特徴付けられる。ジンクフィンガーについての一般的な結合規則は、３個すべてのフィンガーが、それぞれのジンクフィンガーのアルファヘリックス中の同じアミノ酸を使用して、類似の形状を有するその同族ＤＮＡ配列と相互作用して、標的結合部位配列の特異性または認識を決定することを提供する。そのような結合規則は、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３のＤＢＤを改変して、所望の標的結合部位を認識するＤＢＤを操作することを可能にする。一部の場合では、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３のジンクフィンガーモチーフ中の７－アミノ酸ＤＮＡ認識ヘリックスは、公開されたジンクフィンガー設計規則にしたがって改変される。ある特定の実施形態では、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３の３－フィンガーＤＢＤ中のそれぞれのジンクフィンガーは、例えば、１つもしくは複数の認識ヘリックスの配列を変えることによって、および／またはＤＢＤ中のジンクフィンガーの数を増加させることによって、改変される。ある特定の実施形態では、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３は、所望の標的部位における少なくとも９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６個、またはそれよりも多くの塩基対の標的結合部位を認識するようにリプログラミングされる。ある特定の実施形態では、ＥＲＧ１またはＥＧＲ３に由来するそのようなＤＢＤは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、またはそれよりも多くのジンクフィンガーを含む。例示的な実施形態では、ＤＢＤ中のジンクフィンガーの１つまたは複数は、認識ヘリックスの－１位、２位、３位または６位において少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
さまざまな実施形態では、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３に由来するＤＢＤを含むＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦは、天然に存在するＥＧＲ１またはＥＧＲ３の結合特異性とは異なるＤＮＡ結合特異性を有し、例えば、ＤＢＤは、未改変のＥＧＲ１またはＥＧＲ３によって認識される結合部位の配列：（ＧＣＧ（Ｔ／Ｇ）ＧＧＧＣＧ）（配列番号１８２）とは異なる配列を有する標的結合部位を認識する。
他の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において提供されるｅＴＦは、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体であるＤＢＤを含む。ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）／Ｃａｓ９は、部位特異的ゲノム標的化を可能にするゲノム編集ツールである。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、部位特異的ＤＮＡ切断を誘導するようにＣａｓ９ヌクレアーゼをガイドする非コードＲＮＡを使用する原核生物適応免疫応答系である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、哺乳動物細胞におけるゲノム編集を媒介するための単純なＲＮＡプログラム可能な方法を作出するために利用されている。シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体が次いで結合する特異的ゲノム位置に方向付けるように作製されてもよい。ｇＲＮＡは、さまざまな方法およびツールを使用して、目的の標的部位に結合するように設計され得る。例えば、目的の標的ＤＮＡ配列に結合するようにｇＲＮＡを設計するための方法は、Aach, et al. Flexible algorithm for identifying specific Cas9targets in genomes. BioRxiv, Cold Spring Harbor Labs. doi:http://dx.doi.org/10.1101/005074 (2014)；Bae, et al. Cas-OFFinder: a fast andversatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30(10):1473-1475 (2014)；Doench, J. G.et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-targeteffects of CRISPR-Cas9. Nat Biotech 34, 184-191 (2016)；Gratz, et al. Highlyspecific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair inDrosophila. Genetics. 196(4):961-971 (2014)；Heigwer, et al. E-CRISP: fastCRISPR target site identification. Nat Methods. 11(2):122-123 (2014)；Ma, et al.A guide RNA sequence design platform for the CRISPR/Cas9 system for modelorganism genomes. Biomed Res Int. doi:http://doi.org/10.1155/2013/270805 (2013)；Montague,et al. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. NucleicAcids Res. 42(W1):W401-W407 (2014)；Liu, et al. CRISPR-ERA: a comprehensivedesign tool for CRISPR-mediated gene editing, repression and activation.Bioinformatics. 31(22):3676-3678 (2015)；Ran, et al. In vivo genome editingusing Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520(7546):186-191 (2015)；Wu, et al.Target specificity of the CRISPR-Cas9 system. Quant Biol. 2(2):59-70 (2015)；Xiao,et al. CasOT: a genome-wide Cas9/gRNA off-target searching tool.Bioinformatics. 30(8):1180-1182 (2014)；Zetsche, et al. Cpf1 is a singleRNA-guided endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System. Cell. 163(3):759-771(2015)に記載されている。加えて、目的のＤＮＡ標的配列に結合するようにｇＲＮＡを設計するためのさまざまなウェブに基づくツールが公に利用可能であり、例えば、ａｔｕｍ．ｂｉｏ／ｅＣｏｍｍｅｒｃｅ／ｃａｓ９／ｉｎｐｕｔ？ｍｕｌｔｉｐｌｅＣｏｎｔａｃｔｓ＝ｆａｌｓｅにおいてワールドワイドウェブ上でＡＵＴＭから利用可能なＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ Ｄｅｓｉｇｎツール；ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｐｐ／ｐｕｂｌｉｃ／ａｎａｌｙｓｉｓ－ｔｏｏｌｓ／ｓｇｒｎａ－ｄｅｓｉｇｎ－ｃｒｉｓｐｒａｉにおいてワールドワイドウェブ上でＢｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから利用可能なＣＲＩＳＰＲａ／ｉ ｇＲＮＡ設計ツール；ｅ－ｃｒｉｓｐ．ｏｒｇ／Ｅ－ＣＲＩＳＰ／においてワールドワイドウェブ上で利用可能なＤＫＦＺ Ｇｅｒｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒから利用可能なＥ－ＣＲＩＳＰ設計ツール；およびｄｅｓｉｇｎ．ｓｙｎｔｈｅｇｏ．ｃｏｍ／＃／においてワールドワイドウェブ上でＳｙｎｔｈｅｇｏから利用可能なＫｎｏｃｋｏｕｔ Ｇｕｉｄｅ Ｄｅｓｉｇｎツールを参照されたい。加えて、目的のＤＮＡ標的配列に結合するようにｇＲＮＡを設計するためのさまざまな市販のサービスが利用可能であり、例えば、ＩＤＴ（ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ｏｒｄｅｒ／ｄｅｓｉｇｎｔｏｏｌ／ｉｎｄｅｘ／ＣＲＩＳＰＲ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥにおけるワールドワイドウェブ）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｏｒｄｅｒ／ｃｕｓｔｏｍ－ｏｌｉｇｏ／ｃｒｉｓｐｒにおけるワールドワイドウェブ）、およびＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｇＲＮＡ－ｄｅｓｉｇｎ－ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌにおけるワールドワイドウェブ）によって提供される市販のサービスを参照されたい。
例示的な実施形態では、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体であるＤＢＤは、ヌクレアーゼ非活性化（deactivated）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ｄＳａＣａｓ９）またはヌクレアーゼ非活性化Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ｄＳｐＣａｓ９）などの、例えば、ｄＣａｓ９などの、ヌクレアーゼ非活性化Ｃａｓタンパク質またはｄＣａｓを含む。ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体を所望の標的部位に標的化する標的化領域、およびＣａｓタンパク質との相互作用を促進する足場領域を含む配列として提供される。任意の適切なｇＲＮＡ足場を、本明細書において提供されるｇＲＮＡと関連して使用してもよい。例示的な実施形態では、ｇＲＮＡは、シングルｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡであり、以下の足場配列：５’－ＧＴＴＴＴＡＧＴＡＣＴＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＴＣＴＡＣＴＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＴＧＴＴＴＡＴＣＴＣＧＴＣＡＡＣＴＴＧＴＴＧＧＣＧＡＧＡ－３’（配列番号１８３）を含む。ガイドＲＮＡの標的化領域を、足場配列の５’末端に結合させて、完全なｓｇＲＮＡを形成する。ある特定の実施形態では、ｇＲＮＡおよびｄＣａｓタンパク質は、同じ発現カセットから発現されてもよい。ある特定の実施形態では、Ｕ６プロモーターは、ｇＲＮＡを発現させるために使用される。他の実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、ｄＣａｓを、ゲノムに、または染色体外で安定に維持されるプラスミド上に、安定に組み込むことによってのいずれかで、ｄＣａｓ－ＴＡＤタンパク質を安定に発現するように操作された細胞において発現され得る。
他の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において提供されるｅＴＦは、ＴＡＬＥＮからであるか、ＴＡＬＥＮに由来するか、またはヌクレアーゼ不活性化ＴＡＬＥＮである、ＤＢＤを含んでいてもよい。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＤＢＤ、およびＤＮＡの特異的配列を切断するように操作され得るヌクレアーゼドメインを含有する制限酵素である。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメイン（例えば、ヌクレアーゼ）にコンジュゲートすることによって、作出される。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、所望の標的ＤＮＡ配列に結合するように操作され得、それによって、ヌクレアーゼドメインを特定の位置に方向付ける。
ＴＡＬエフェクターは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ細菌由来の細菌タンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインは、多様な１２番目および１３番目のアミノ酸を有する、反復される高度に保存された３３～３４アミノ酸の配列を含有する。これらの２つの位置は、反復可変二残基（ＲＶＤ）と称され、高度に可変性であり、特異的ヌクレオチド認識と強い相関を示す。アミノ酸配列およびＤＮＡ認識の間のこの直接的な関係は、適切なＲＶＤを含有する反復セグメントの組合せを選択することによって所望の配列を特異的に標的化するＤＢＤの操作を可能にする。
ＴＡＬＥを設計するためのさまざまな方法が利用可能である。例えば、目的の標的ＤＮＡ配列に結合するＴＡＬＥを設計するための方法は、T. Cermak et al., Nucleic Acids Research. 39 (12): e82 (2011)；F.Zhang F et al., Nature Biotechnology. 29 (2): 149-53 (2011)；R. Morbitzer etal., Nucleic Acids Research. 39 (13): 5790-9 (2011)；T. Li et al., Nucleic AcidsResearch. 39 (14): 6315-25 (2011)；R. Geissler et al., PLOS One. 6(5): e19509(2011)；およびE. Weber et al., PLOS One. 6 (5): e19722 (2011)に記載されている。加えて、目的のＤＮＡ標的配列に結合するＴＡＬＥを設計するためのさまざまなウェブに基づくツールが公に利用可能であり、例えば、ｅ－ｔａｌｅｎ．ｏｒｇ／Ｅ－ＴＡＬＥＮ／ＴＡＬにおいてワールドワイドウェブ上で利用可能なＥ－Ｔａｌｅｎ、およびｔａｌｅ－ｎｔ．ｃａｃ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ／ｎｏｄｅ／ａｄｄ／ｓｉｎｇｌｅ－ｔａｌｅにおいてワールドワイドウェブ上で利用可能なＥｆｆｅｃｔｏｒ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔａｒｇｅｔｅｒ ２．０ツールを参照されたい。加えて、目的のＤＮＡ標的配列に結合するＴＡＬＥを設計するためのさまざまな市販のサービスが利用可能であり、例えば、ＯｍｉｃＸ（ｏｍｉｃｔｏｏｌｓ．ｃｏｍ／におけるワールドワイドウェブ）、Ａｄｄｇｅｎｅ（ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｔａｌｅｎ／ｇｕｉｄｅ／におけるワールドワイドウェブ）、またはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ｌｉｆｅ－ｓｃｉｅｎｃｅ／ｇｅｎｏｍｅ－ｅｄｉｔｉｎｇ／ｇｅｎｅａｒｔ－ｔａｌｓ／ｔａｌ－ｄｅｓｉｇｎ－ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌにおけるワールドワイドウェブ）によって提供される市販のサービスを参照されたい。加えて、公に利用可能なソフトウェアプログラム（ＤＮＡＷｏｒｋｓ）を、ＴＡＬＥのアセンブリーに適切なオリゴヌクレオチドを設計するために使用してもよく、例えば、D.Hoover D Methods in Molecular Biology. 852: 215-23 (2012)を参照されたい。
転写モジュレーションドメイン
ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において提供されるｅＴＦは、ｅＴＦがＤＢＤ（例えば、ジンクフィンガーＤＢＤ、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ ＤＢＤ、またはＴＡＬＥ ＤＢＤ）を介して標的部位に結合する場合に、目的の遺伝子からの転写をモジュレートすることができる１つもしくは複数のタンパク質因子（例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＣＢＰ／ｐ３００、ＣＲＥＢまたはＫＲＡＢ）、または目的の遺伝子からの遺伝子発現のレベルをモジュレートすることができる１つもしくは複数のタンパク質因子を動員することができる任意の適切なドメインを含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、そのようなドメインは、目的の遺伝子の転写または遺伝子発現のレベルを増加させるタンパク質因子を動員し、それは、転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）である。他の実施形態では、そのようなドメインは、目的の遺伝子からの転写または遺伝子発現のレベルを減少させるタンパク質因子を動員し、転写リプレッサードメイン（ＴＲＤ）である。ある特定の実施形態では、転写モジュレーションドメイン（ＴＡＤまたはＴＲＤ）は、合成的に設計されたドメインであってもよい。他の実施形態では、転写モジュレーションドメイン（ＴＡＤまたはＴＲＤ）は、天然に存在するタンパク質、例えば、転写因子、転写共活性化因子、転写共リプレッサーまたはサイレンサータンパク質に由来していてもよい。さまざまな実施形態では、転写モジュレーションドメイン（ＴＡＤまたはＴＲＤ）は、任意の種、例えば、マウス、ラット、サル、ウイルスまたはヒトのタンパク質に由来していてもよい。
例示的な一実施形態では、ＳＮＣ１Ａを上方調節する本明細書において提供されるｅＴＦにおける使用のために適切なＴＡＤは、ウイルスタンパク質に由来する。ウイルスタンパク質に由来する例示的なＴＡＤとしては、例えば、ＶＰ６４（配列番号１３３）、ＶＰＲ（配列番号１３２）、ＶＰ１６、ＶＰ１２８、ｐ６５、ｐ３００のＴＡＤドメイン、またはそれらの任意の機能的断片もしくはバリアント、あるいはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列が挙げられる。
別の例示的な一実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において提供されるｅＴＦにおける使用のために適切なＴＡＤは、ヒトタンパク質に由来する。ヒトタンパク質に由来する例示的なＴＡＤとしては、例えば、ＣＢＰ／ｐ３００相互作用トランス活性化因子２（ＣＩＴＥＤ２）（配列番号１３４）、ＣＢＰ／ｐ３００相互作用トランス活性化因子４（ＣＩＴＥＤ４）（配列番号１３５）、ＥＧＲ１（配列番号１７６）、ＣＲＥＢ３（配列番号２２４）もしくはＥＧＲ３（配列番号１７５）のＴＡＤドメイン、またはそれらの任意の機能的断片もしくはバリアント、あるいはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列が挙げられる。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦは、転写活性化ドメインまたはＴＡＤにコンジュゲートされたジンクフィンガーＤＢＤを含む。さまざまな実施形態では、ジンクフィンガーＤＢＤは、ＶＰ６４もしくはＶＰＲなどのウイルスタンパク質由来のＴＡＤ、またはＣＩＴＥＤ２、ＣＩＴＥＤ４もしくはＣＲＥＢ３などのヒトタンパク質由来のＴＡＤにコンジュゲートされていてもよい。ある特定の実施形態では、ヒトタンパク質、例えば、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３に由来するジンクフィンガーＤＢＤは、ヒトタンパク質、例えば、ＣＩＴＥＤ２、ＣＩＴＥＤ４またはＣＲＥＢ３に由来するＴＡＤにコンジュゲートされる。ある特定の実施形態では、ヒトタンパク質、例えば、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３に由来するジンクフィンガーＤＢＤは、ＶＰ６４またはＶＰＲ ＴＡＤにコンジュゲートされる。ある特定の実施形態では、合成ジンクフィンガーＤＢＤ、またはヒトタンパク質、例えば、ＥＧＲ１もしくはＥＧＲ３と７５％未満の配列同一性を有するジンクフィンガーＤＢＤは、ヒトタンパク質、例えば、ＣＩＴＥＤ２、ＣＩＴＥＤ４またはＣＲＥＢ３に由来するＴＡＤにコンジュゲートされる。ある特定の実施形態では、合成ジンクフィンガーＤＢＤ、またはヒトタンパク質、例えば、ＥＧＲ１もしくはＥＧＲ３と７５％未満の配列同一性を有するジンクフィンガーＤＢＤは、ＶＰ６４またはＶＰＲ ＴＡＤにコンジュゲートされる。
ある特定の実施形態では、ｄＣａｓタンパク質は、ＴＡＤにコンジュゲートされる。さまざまな実施形態では、ｄＣａｓは、ＶＰ６４もしくはＶＰＲなどのウイルスタンパク質由来のＴＡＤ、またはＣＩＴＥＤ２、ＣＩＴＥＤ４もしくはＣＲＥＢ３などのヒトタンパク質由来のＴＡＤにコンジュゲートされていてもよい。例示的な実施形態では、ｄＣａｓ９は、ＶＰ６４またはＶＰＲ ＴＡＤにコンジュゲートされる。
ある特定の実施形態では、ＴＡＬＥタンパク質は、ＴＡＤにコンジュゲートされる。さまざまな実施形態では、ＴＡＬＥは、ＶＰ６４もしくはＶＰＲなどのウイルスタンパク質由来のＴＡＤ、またはＣＩＴＥＤ２、ＣＩＴＥＤ４もしくはＣＲＥＢ３などのヒトタンパク質由来のＴＡＤにコンジュゲートされていてもよい。例示的な実施形態では、ＴＡＬＥは、ＶＰ６４またはＶＰＲ ＴＡＤにコンジュゲートされる。
ＳＣＮ１Ａを上方調節し、ヒトタンパク質と非常に相同であるｅＴＦ
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質と高い同一性パーセントを有する（下記にさらに記載する）。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の全体的な配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質とのより低い全体的な配列同一性パーセントを有するｅＴＦと比較して、低減された免疫原性を示す。さまざまな実施形態では、免疫原性の低減は、ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ、イムノアッセイまたはｉｎ ｓｉｌｉｃｏ法を使用して測定することができる。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、ヒトＥＧＲ１またはＥＧＲ３に由来するＤＢＤ、およびヒトＥＧＲ１、ＥＧＲ３、ＣＩＴＥＤ２、ＣＩＴＥＤ４またはＣＲＥＢ３に由来するＴＡＤを含んでいてもよい。そのようなｅＴＦは、対象に投与された場合に、ほとんど免疫原性を有さず、またはヒトタンパク質配列とのより低い同一性パーセントを有するｅＴＦと比較して、免疫原性が殆どまたは全くない。
ある特定の実施形態では、ＳＮＣ１Ａを上方調節する本明細書において提供されるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質と少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において提供されるｅＴＦが、同じタンパク質に由来するＤＢＤおよびＴＡＤを含む場合、ヒトタンパク質との同一性パーセントは、それが由来するヒトタンパク質（例えば、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３）と一致するｅＴＦ中のアミノ酸残基の総数をｅＴＦ中のアミノ酸残基の総数によって割って、計算することによって、決定されてもよい。ＳＣＮ１Ａを上方調節する提供されるｅＴＦが、１つのヒトタンパク質由来の１つのＤＢＤ、および異なるヒトタンパク質に由来する１つのＴＡＤを含む場合、ヒトとの同一性パーセントは、それぞれのドメインのヒトとの同一性パーセントを別々に計算し、その２つを一緒に合計することによって、例えば、（ｉ）それが由来するヒトタンパク質（例えば、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３）と一致するＤＢＤ中のアミノ酸残基の総数をｅＴＦ中のアミノ酸残基の総数によって割って、計算すること；（ｉｉ）それが由来するヒトタンパク質（例えば、ＣＩＴＥＤ２、ＣＩＴＥＤ４またはＣＲＥＢ３）と一致するＴＡＤ中のアミノ酸残基の総数をｅＴＦ中のアミノ酸残基の総数によって割って、計算すること；ならびに（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の総計を合計することによって、決定されてもよい。そのような実施形態では、ドメインは、以下のように分割される：第１のドメインは、ｅＴＦのＮ末端から第２のドメインのコード配列の開始点までに及ぶ、および第２のドメインは、第２のドメインのコード配列の開始点からｅＴＦのＣ末端までに及ぶ（例えば、構成ＮＬＳ－ＤＢＤ－リンカー－ＮＬＳ－ＴＡＤを有するｅＴＦについて、第１のドメインはＮＬＳ－ＤＢＤ－リンカーであり、第２のドメインはＮＬＳ－ＴＡＤである）。ＳＮＣ１Ａを上方調節する本明細書において提供されるｅＴＦが、１つのヒトタンパク質由来の１つのＤＢＤおよび１つまたは複数の異なるヒトタンパク質に由来する２つのＴＡＤを含む場合、ヒトとの同一性パーセントは、それぞれのドメインのヒトとの同一性パーセントを別々に計算し、３つすべてを一緒に合計することによって、例えば、（ｉ）それが由来するヒトタンパク質（例えば、ＥＧＲ１またはＥＧＲ３）と一致するＤＢＤ中のアミノ酸残基の総数をｅＴＦ中のアミノ酸残基の総数によって割って、計算すること；（ｉｉ）それが由来するヒトタンパク質（例えば、ＣＩＴＥＤ２、ＣＩＴＥＤ４またはＣＲＥＢ３）と一致する第１のＴＡＤ中のアミノ酸残基の総数をｅＴＦ中のアミノ酸残基の総数によって割って、計算すること；（ｉｉｉ）それが由来するヒトタンパク質（例えば、ＣＩＴＥＤ２、ＣＩＴＥＤ４またはＣＲＥＢ３）と一致する第２のＴＡＤ中のアミノ酸残基の総数をｅＴＦ中のアミノ酸残基の総数によって割って、計算すること；ならびに（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の総計を合計することによって、決定されてもよい。そのような実施形態では、ドメインは、以下のように分割される：第１のドメインは、ｅＴＦのＮ末端から第２のドメインのコード配列の開始点までに及ぶ、第２のドメインは、第２のドメインのコード配列の開始点から第３のドメインのコード配列の開始点までに及ぶ、および第３のドメインは、第３のドメインのコード配列の開始点からｅＴＦのＣ末端までに及ぶ（例えば、構成ＮＬＳ－ＴＡＤ１－リンカー－ＮＬＳ－ＤＢＤ－リンカー－ＮＬＳ－ＴＡＤ２を有するｅＴＦについて、第１のドメインはＮＬＳ－ＴＡＤ１－リンカーであり、第２のドメインはＮＬＳ－ＤＢＤ－リンカーであり、第３のドメインはＮＬＳ－ＴＡＤ２である）。この節に記載の１つまたは複数のヒトタンパク質との同一性パーセントは、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／におけるＮＣＢＩウェブサイトからのワールドワイドウェブ上で利用可能な、ＮＣＢＩから利用可能な標準的なタンパク質ＢＬＡＳＴツール（例えば、デフォルトパラメーターとともにｂｌａｓｔｐ（タンパク質→タンパク質）アルゴリズムを使用するｂｌａｓｔｐスートアライメントツール）を使用して得られる同一性パーセント出力を使用して決定されてもよい。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において提供されるｅＴＦは、天然に存在するヒトタンパク質との高い程度の配列同一性に起因して、ヒト対象において有害な免疫応答をほとんど誘発しない、最小の有害な免疫応答を誘発する、または有害な免疫応答を誘発しないという利益を有する。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において提供されるｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質とのより低い同一性パーセントを含むｅＴＦ、例えば、１つまたは複数のヒトタンパク質との５０％、５５％、６５％または７０％未満の配列同一性を含むｅＴＦで観察された免疫原性と比較して、低減された免疫原性、例えば、免疫原性において、少なくとも０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０倍、またはそれより高い倍数での低減を誘発する。一部の場合では、免疫原性の低減は、ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ、イムノアッセイまたはｉｎ ｓｉｌｉｃｏ法を使用して測定することができる。低い免疫原性または最小の免疫原性を有する遺伝子治療は、改善された患者の耐容能、治療効果を達成するために必要な投薬量の減少、１投与後の延長された治療効果、必要により複数回もしくは複数用量で投与される能力、投与あたりより長い期間にわたって持続する治療有効性、増加した安定性、および／または遺伝子治療の増加した有効性を含む、いくつかの利点を有する。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節し、１つまたは複数のヒトタンパク質と高い配列同一性パーセントを有する本明細書において提供されるｅＴＦは、１つまたは複数の天然に存在するヒトタンパク質に由来するＤＢＤおよびＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＤＢＤを含む任意の天然に存在するヒトタンパク質に由来するＤＢＤを含んでいてもよい。例示的な実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節し、１つまたは複数のヒトタンパク質と高い配列同一性パーセントを有する本明細書において提供されるｅＴＦは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質、例えば、表１に列挙される構築物５～２７、３６～４１または４４～５３のいずれか１つなどに由来するＤＢＤを含む。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節し、１つまたは複数のヒトタンパク質と高い配列同一性パーセントを有する本明細書において提供されるｅＴＦは、ヒトＥＧＲタンパク質、例えば、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３またはＥＧＲ４に由来するＤＢＤを含む。例示的な実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節し、１つまたは複数のヒトタンパク質と高い配列同一性パーセントを有する本明細書において提供されるｅＴＦは、ヒトＥＧＲ１またはＥＧＲ３に由来するＤＢＤを含む。さまざまな実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節し、１つまたは複数のヒトタンパク質と高い配列同一性パーセントを有する本明細書において提供されるｅＴＦは、ヒトジンクフィンガータンパク質に由来するＤＢＤを含み、ここで、最小のアミノ酸変化（例えば、１、２、３、４、５、６、７個、または１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、２～３、２～４、２～５、２～６、２～７、３～４、３～５、３６もしくは３～７個のアミノ酸の変化）が、目的の標的結合部位を認識するＤＢＤの結合特異性を変更するために、ＤＢＤの１つまたは複数のジンクフィンガードメインにおいて行われている。そのような配列改変は、好ましくは、ＤＢＤのジンクフィンガードメインの認識ヘリックスにおいて行われるが、ヒトジンクフィンガーＤＢＤまたはタンパク質（ＴＡＤを含む）の残りは、天然に存在するヒトタンパク質との可能な限り高い配列同一性を保つために未改変のままである。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節し、１つまたは複数のヒトタンパク質と高い配列同一性パーセントを有する本明細書において提供されるｅＴＦは、ヒトタンパク質に由来するＤＢＤにコンジュゲートされた、ヒトタンパク質に由来する１つまたは複数の転写モジュレーションドメイン（例えば、ＴＡＤ）を含む。さまざまな実施形態では、転写モジュレーションドメインは、ｅＴＦがＤＢＤを介して標的部位に結合する場合に、目的の遺伝子からの転写をモジュレートすることができる１つもしくは複数のタンパク質因子（例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、共活性化因子タンパク質または共リプレッサータンパク質）、または目的の遺伝子からの遺伝子発現のレベルをモジュレートすることができる１つもしくは複数のタンパク質因子を動員することができるドメインを有する任意の天然に存在するヒトタンパク質に由来していてもよい。例示的な実施形態では、ＴＡＤは、例えば、ヒトＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３もしくはＥＧＲ４などのヒトＥＧＲタンパク質、または例えば、ヒトＣＩＴＥＤ２もしくはＣＩＴＥＤ４タンパク質などのヒトcitedタンパク質に由来する。例示的な実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節し、１つまたは複数のヒトタンパク質と高い配列同一性パーセントを有する本明細書において提供されるｅＴＦは、ヒトＥＧＲ１またはＥＧＲ３タンパク質由来のＴＡＤを含む。別の例示的な実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節し、１つまたは複数のヒトタンパク質と高い配列同一性パーセントを有する本明細書において提供されるｅＴＦは、ヒトＣＩＴＥＤ２またはＣＩＴＥＤ４タンパク質由来のＴＡＤを含む。
一実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節し、１つまたは複数のヒトタンパク質と高い配列同一性パーセントを有する本明細書において提供されるｅＴＦは、ヒトＤＢＤ（ｈＤＢＤ）およびヒトＴＡＤ（ｈＴＡＤ）を含んでいてもよく（例えば、ｈＴＡＤ－ｈＤＢＤまたはｈＤＢＤ－ｈＴＡＤ）、ここで、ｈＤＢＤおよびｈＴＡＤは、同じヒトタンパク質に由来していてもよく、または異なるヒトタンパク質に由来していてもよい。別の実施形態では、１つまたは複数のヒトタンパク質と高い配列同一性パーセントを有する本明細書において提供されるｅＴＦは、１つのｈＤＢＤおよび２つのｈＴＡＤを含んでいてもよく、ここで、ｈＤＢＤおよびｈＴＡＤは、同じヒトタンパク質に由来するか、ｈＤＢＤは、第１のヒトタンパク質に由来し、両方のｈＴＡＤは、第２のヒトタンパク質に由来するか、ｈＤＢＤおよび１つのｈＴＡＤは、第１のヒトタンパク質に由来し、第２のｈＴＡＤは、第２のヒトタンパク質に由来するか、またはｈＤＢＤは、第１のヒトタンパク質に由来し、１つのｈＴＡＤは、第２のヒトタンパク質に由来し、第２のｈＴＡＤは、第３のヒトタンパク質に由来する（例えば、ｈＴＡＤ１－ｈＤＢＤ－ｈＴＡＤ１、ｈＴＡＤ１－ｈＤＢＤ－ｈＴＡＤ２、ｈＴＡＤ１－ｈＴＡＤ１－ｈＤＢＤ、ｈＴＡＤ１－ｈＴＡＤ２－ｈＤＢＤ、ｈＤＢＤ－ｈＴＡＤ１－ｈＴＡＤ１またはｈＤＢＤ－ｈＴＡＤ１－ｈＴＡＤ２）。
例示的な実施形態では、１つまたは複数のヒトタンパク質と高い配列同一性パーセントを有する本明細書において提供されるｅＴＦは、以下の構成のいずれか１つを含む：（ｉ）両方ともヒトＥＧＲ１に由来する１つのｈＤＢＤおよび１つのｈＴＡＤ；（ｉｉ）両方ともヒトＥＧＲ３に由来する１つのｈＤＢＤおよび１つのｈＴＡＤ；（ｉｉｉ）ヒトＥＧＲ１に由来する１つのｈＤＢＤおよびＣＩＴＥＤ２に由来する１つのｈＴＡＤ（例えば、ｈＥＧＲ１ ＤＢＤ－ｈＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤまたはｈＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤ－ｈＥＧＲ１ ＤＢＤ）；（ｉｖ）ヒトＥＧＲ１に由来する１つのｈＤＢＤおよびヒトＣＩＴＥＤ４に由来する１つのｈＴＡＤ（例えば、ｈＥＧＲ１ ＤＢＤ－ｈＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤまたはｈＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤ－ｈＥＧＲ１ ＤＢＤ）；（ｖ）ヒトＥＧＲ３に由来する１つのｈＤＢＤおよびＣＩＴＥＤ２に由来する１つのｈＴＡＤ（例えば、ｈＥＧＲ３ ＤＢＤ－ｈＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤまたはｈＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤ－ｈＥＧＲ３ ＤＢＤ）；（ｖｉ）ヒトＥＧＲ３に由来する１つのｈＤＢＤおよびヒトＣＩＴＥＤ４に由来する１つのｈＴＡＤ（例えば、ｈＥＧＲ３ ＤＢＤ－ｈＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤまたはｈＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤ－ｈＥＧＲ３ ＤＢＤ）；（ｖｉｉ）ヒトＥＧＲ１に由来する１つのｈＤＢＤおよびＣＩＴＥＤ２に由来する２つのｈＴＡＤ（例えば、ｈＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤ－ｈＥＧＲ１ ＤＢＤ－ｈＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤ、ｈＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤ－ｈＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤ－ｈＥＧＲ１ ＤＢＤまたはｈＥＧＲ１ ＤＢＤ－ｈＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤ－ｈＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤ）；（ｖｉｉｉ）ヒトＥＧＲ１に由来する１つのｈＤＢＤおよびヒトＣＩＴＥＤ４に由来する２つのｈＴＡＤ（例えば、ｈＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤ－ｈＥＧＲ１ ＤＢＤ－ｈＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤ、ｈＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤ－ｈＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤ－ｈＥＧＲ１ ＤＢＤまたはｈＥＧＲ１ ＤＢＤ－ｈＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤ－ｈＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤ）；（ｉｘ）ヒトＥＧＲ３に由来する１つのｈＤＢＤおよびヒトＣＩＴＥＤ２に由来する２つのｈＴＡＤ（例えば、ｈＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤ－ｈＥＧＲ３ ＤＢＤ－ｈＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤ、ｈＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤ－ｈＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤ－ｈＥＧＲ３ ＤＢＤまたはｈＥＧＲ３ ＤＢＤ－ｈＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤ－ｈＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤ）；（ｘ）ヒトＥＧＲ３に由来する１つのｈＤＢＤおよびヒトＣＩＴＥＤ４に由来する２つのｈＴＡＤ（例えば、ｈＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤ－ｈＥＧＲ３ ＤＢＤ－ｈＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤ、ｈＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤ－ｈＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤ－ｈＥＧＲ３ ＤＢＤまたはｈＥＧＲ３ ＤＢＤ－ｈＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤ－ｈＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤ）；（ｘｉ）ヒトＥＧＲ１に由来する１つのｈＤＢＤ、ヒトＣＩＴＥＤ２に由来する第１のｈＴＡＤ、ヒトＣＩＴＥＤ４に由来する第２のｈＴＡＤ（例えば、ｈＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤ－ｈＥＧＲ１ ＤＢＤ－ｈＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤ、ｈＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤ－ｈＥＧＲ１ ＤＢＤ－ｈＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤ、ｈＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤ－ｈＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤ－ｈＥＧＲ１ ＤＢＤ、ｈＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤ－ｈＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤ－ｈＥＧＲ１ ＤＢＤ、ｈＥＧＲ１ ＤＢＤ－ｈＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤ－ｈＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤまたはｈＥＧＲ１ ＤＢＤ－ｈＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤ－ｈＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤ）；または（ｘｉｉ）ヒトＥＧＲ３に由来する１つのｈＤＢＤ、ヒトＣＩＴＥＤ２に由来する第１のｈＴＡＤ、ヒトＣＩＴＥＤ４に由来する第２のｈＴＡＤ（例えば、ｈＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤ－ｈＥＧＲ３ ＤＢＤ－ｈＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤ、ｈＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤ－ｈＥＧＲ３ ＤＢＤ－ｈＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤ、ｈＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤ－ｈＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤ－ｈＥＧＲ３ ＤＢＤ、ｈＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤ－ｈＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤ－ｈＥＧＲ３ ＤＢＤ、ｈＥＧＲ３ ＤＢＤ－ｈＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤ－ｈＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤまたはｈＥＧＲ３ ＤＢＤ－ｈＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤ－ｈＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤ）。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節し、１つまたは複数のヒトタンパク質と高い配列同一性パーセントを有する本明細書において提供されるｅＴＦは、（ｉ）配列番号１０３～１２４、１２８～１３１、２０５、２０７、２０９、２１３、２１７、２１９、２２１または２２３のいずれか１つを含む配列；（ｉｉ）配列番号９２～９８のいずれか１つを含む配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列のいずれかと少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を含む配列；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれかの機能的断片もしくはバリアントのいずれか１つを含む。例示的な実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａ発現を、対照と比較して、少なくとも少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、もしくはそれよりも高く、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％、またはそれよりも高く、上方調節することができる。例示的な実施形態では、そのようなｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質と少なくとも少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の全体的な配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質とのより低い全体的な配列同一性パーセントを有するｅＴＦと比較して、低減された免疫原性を示す。さまざまな実施形態では、免疫原性の低減は、ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ、イムノアッセイまたはｉｎ ｓｉｌｉｃｏ法を使用して測定することができる。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節し、１つまたは複数のヒトタンパク質と高い配列同一性パーセントを有する本明細書において提供されるｅＴＦは、ＤＢＤおよびＴＡＤドメインに加えて、１つもしくは複数のアミノ酸配列またはドメイン、例えば、核局在化シグナルまたはリンカーなどを追加で含んでいてもよい。加えて、１つまたは複数のヒトタンパク質と高い配列同一性パーセントを有する本明細書において提供されるｅＴＦをコードするポリヌクレオチドは、ｅＴＦのコード配列に加えて、１つまたは複数の核酸配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリＡテイルなどを追加で含んでいてもよい。そのような実施形態では、追加のアミノ酸配列および／または核酸配列の１つもしくは複数は、好ましくは、ヒト配列であるか、ヒト配列に由来するか、またはヒトタンパク質と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する。
例示的なＳＣＮ１Ａ ｅＴＦ
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、配列番号１５２～１６７のいずれか１つを含む認識ヘリックスを含む１つまたは複数のジンクフィンガードメインを有するＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のジンクフィンガードメインを有するＤＮＡ結合ドメインを含み、それぞれのジンクフィンガードメインは、独立して、配列番号１５２～１６７のいずれか１つを含む認識ヘリックスを含む。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、６個のジンクフィンガードメインを有するＤＮＡ結合ドメインを含み、それぞれのジンクフィンガードメインは、独立して、配列番号１５２～１６７のいずれか１つを含む認識ヘリックスを含む。ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、９個のジンクフィンガードメインを有するＤＮＡ結合ドメインを含み、それぞれのジンクフィンガードメインは、独立して、配列番号１５２～１６７のいずれか１つを含む認識ヘリックスを含む。例示的な実施形態では、そのようなｅＴＦは、配列番号１４７を有するＤＮＡ結合ドメインを含み、ここで、それぞれのＸは、独立して、配列番号１５２～１６７のいずれか１つから選択され、ｎは、６または９である。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、（ｉ）ＲＳＤＮＬＶＲ ｘ ＲＥＤＮＬＨＴ ｘ ＲＳＤＥＬＶＲ ｘ ＱＳＧＮＬＴＥ ｘ ＴＳＧＨＬＶＲ ｘ ＱＮＳＴＬＴＥ（配列番号１４８）（式中、ｘは、１～５０アミノ酸のリンカーであり得る）を含む配列、（ｉｉ）配列番号１４８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列、または（ｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の機能的断片のいずれか１つを有するＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ＣＩＴＥＤ２、ＣＩＴＥＤ４またはＣＲＥＢ３から選択される１つまたは複数のＴＡＤをさらに含む。一実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＤＢＤのＣ末端にコンジュゲートされたＶＰＲ ＴＡＤドメインを含む。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端またはＣ末端にコンジュゲートされた２つのＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、配列番号１８を有する標的部位に結合することができ、ＳＣＮ１Ａの発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、もしくはそれよりも高く、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％、またはそれよりも高く、上方調節することができる。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、（ｉ）ＲＳＤＮＬＶＲ ｘ ＨＲＴＴＬＴＮ ｘ ＲＥＤＮＬＨＴ ｘ ＴＳＨＳＬＴＥ ｘ ＱＳＳＳＬＶＲ ｘ ＲＥＤＮＬＨＴ（配列番号１４９）（式中、ｘは、１～５０アミノ酸のリンカーであり得る）を含む配列、（ｉｉ）配列番号１４９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列、または（ｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の機能的断片のいずれか１つを有するＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ＣＩＴＥＤ２、ＣＩＴＥＤ４またはＣＲＥＢ３から選択される１つまたは複数のＴＡＤをさらに含む。一実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＤＢＤのＣ末端にコンジュゲートされたＶＰＲ ＴＡＤドメインを含む。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端またはＣ末端にコンジュゲートされた２つのＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、配列番号３０を有する標的部位に結合することができ、ＳＣＮ１Ａの発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、もしくはそれよりも高く、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％、またはそれよりも高く、上方調節することができる。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、（ｉ）ＲＲＤＥＬＮＶ ｘ ＲＳＤＨＬＴＮ ｘ ＲＳＤＤＬＶＲ ｘ ＲＳＤＮＬＶＲ ｘ ＨＲＴＴＬＴＮ ｘ ＲＥＤＮＬＨＴ ｘ ＴＳＨＳＬＴＥ ｘ ＱＳＳＳＬＶＲ ｘ ＲＥＤＮＬＨＴ（配列番号１５１）を含む配列、（ｉｉ）配列番号１５１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列、または（ｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の機能的断片のいずれか１つを有するＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ＣＩＴＥＤ２、ＣＩＴＥＤ４またはＣＲＥＢ３から選択される１つまたは複数のＴＡＤをさらに含む。一実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＤＢＤのＣ末端にコンジュゲートされたＶＰＲ ＴＡＤドメインを含む。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端またはＣ末端にコンジュゲートされた２つのＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、配列番号３２を有する標的部位に結合することができ、ＳＣＮ１Ａの発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、もしくはそれよりも高く、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％、またはそれよりも高く、上方調節することができる。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、（ｉ）ＤＰＧＡＬＶＲ ｘ ＲＳＤＮＬＶＲ ｘ ＱＳＧＤＬＲＲ ｘ ＴＨＬＤＬＩＲ ｘ ＴＳＧＮＬＶＲ ｘ ＲＳＤＮＬＶＲ（配列番号１５０）を含む配列、（ｉｉ）配列番号１５０と少なくとも８９％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列、または（ｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の機能的断片のいずれか１つを有するＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ＣＩＴＥＤ２、ＣＩＴＥＤ４またはＣＲＥＢ３から選択される１つまたは複数のＴＡＤをさらに含む。一実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＤＢＤのＣ末端にコンジュゲートされたＶＰＲ ＴＡＤドメインを含む。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＤＢＤのＮ末端またはＣ末端にコンジュゲートされた２つのＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、配列番号３１を有する標的部位に結合することができ、ＳＣＮ１Ａの発現を、対照と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、もしくはそれよりも高く、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％、またはそれよりも高く、上方調節することができる。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、（ｉ）配列番号９９～１３１、２０５、２０７、２０９、２１３、２１７、２１９、２２１もしくは２２３のいずれか１つを含む配列；（ｉｉ）配列番号７７～９８のいずれか１つを含む配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列のいずれかと少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を含む配列；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれかの機能的断片もしくはバリアントのいずれか１つを含む。例示的な実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａ発現を、対照と比較して、少なくとも少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、もしくはそれよりも高く、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％、またはそれよりも高く、上方調節することができる。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、（ｉ）配列番号９９～１０２もしくは１２５～１２７のいずれか１つを含む配列；（ｉｉ）配列番号７７～９１のいずれか１つを含む配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列のいずれかと少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を含む配列；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれかの機能的断片もしくはバリアントのいずれか１つを含む。例示的な実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａ発現を、対照と比較して、少なくとも少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、もしくはそれよりも高く、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％、またはそれよりも高く、上方調節することができる。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、（ｉ）配列番号１０３～１２４、１２８～１３１、２０５、２０７、２０９、２１３、２１７、２１９、２２１もしくは２２３のいずれか１つを含む配列；（ｉｉ）配列番号９２～９８のいずれか１つを含む配列；（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列のいずれかと少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を含む配列；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の配列のいずれかの機能的断片もしくはバリアントのいずれか１つを含む。例示的な実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａ発現を、対照と比較して、少なくとも少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、もしくはそれよりも高く、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％、またはそれよりも高く、上方調節することができる。例示的な実施形態では、そのようなｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質と少なくとも少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の全体的な配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質とのより低い全体的な配列同一性パーセントを有するｅＴＦと比較して、低減された免疫原性を示す。さまざまな実施形態では、免疫原性の低減は、ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ、イムノアッセイまたはｉｎ ｓｉｌｉｃｏ法を使用して測定することができる。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、（ｉ）配列番号１２７を含む配列；（ｉｉ）配列番号１２７と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を含む配列；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列のいずれかの機能的断片もしくはバリアントのいずれか１つを含む。例示的な実施形態では、そのようなｅＴＦは、配列番号７７を含み、配列番号１８を有する標的部位に結合する。例示的な実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａ発現を、対照と比較して、少なくとも少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、もしくはそれよりも高く、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％、またはそれよりも高く、上方調節することができる。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、（ｉ）配列番号１２８を含む配列；（ｉｉ）配列番号１２８と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を含む配列；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列のいずれかの機能的断片もしくはバリアントのいずれか１つを含む。例示的な実施形態では、そのようなｅＴＦは、配列番号９２を含み、配列番号１８を有する標的部位に結合する。例示的な実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａ発現を、対照と比較して、少なくとも少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、もしくはそれよりも高く、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％、またはそれよりも高く、上方調節することができる。例示的な実施形態では、そのようなｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質と少なくとも少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の全体的な配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質とのより低い全体的な配列同一性パーセントを有するｅＴＦと比較して、低減された免疫原性を示す。さまざまな実施形態では、免疫原性の低減は、ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ、イムノアッセイまたはｉｎ ｓｉｌｉｃｏ法を使用して測定することができる。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、（ｉ）配列番号１２９を含む配列；（ｉｉ）配列番号１２９と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を含む配列；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列のいずれかの機能的断片もしくはバリアントのいずれか１つを含む。例示的な実施形態では、そのようなｅＴＦは、配列番号９２を含み、配列番号１８を有する標的部位に結合する。例示的な実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａ発現を、対照と比較して、少なくとも少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、もしくはそれよりも高く、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％、またはそれよりも高く、上方調節することができる。例示的な実施形態では、そのようなｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質と少なくとも少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の全体的な配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質とのより低い全体的な配列同一性パーセントを有するｅＴＦと比較して、低減された免疫原性を示す。さまざまな実施形態では、免疫原性の低減は、ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ、イムノアッセイまたはｉｎ ｓｉｌｉｃｏ法を使用して測定することができる。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、（ｉ）配列番号１３０を含む配列；（ｉｉ）配列番号１３０と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を含む配列；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列のいずれかの機能的断片もしくはバリアントのいずれか１つを含む。例示的な実施形態では、そのようなｅＴＦは、配列番号９２を含み、配列番号１８を有する標的部位に結合する。例示的な実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａ発現を、対照と比較して、少なくとも少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、もしくはそれよりも高く、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％、またはそれよりも高く、上方調節することができる。例示的な実施形態では、そのようなｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質と少なくとも少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の全体的な配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質とのより低い全体的な配列同一性パーセントを有するｅＴＦと比較して、低減された免疫原性を示す。さまざまな実施形態では、免疫原性の低減は、ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ、イムノアッセイまたはｉｎ ｓｉｌｉｃｏ法を使用して測定することができる。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、（ｉ）配列番号１３１を含む配列；（ｉｉ）配列番号１３１と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を含む配列；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列のいずれかの機能的断片もしくはバリアントのいずれか１つを含む。例示的な実施形態では、そのようなｅＴＦは、配列番号９２を含み、配列番号１８を有する標的部位に結合する。例示的な実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａ発現を、対照と比較して、少なくとも少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、もしくはそれよりも高く、あるいは対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％、またはそれよりも高く、上方調節することができる。例示的な実施形態では、そのようなｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質と少なくとも少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の全体的な配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、１つまたは複数のヒトタンパク質とのより低い全体的な配列同一性パーセントを有するｅＴＦと比較して、低減された免疫原性を示す。さまざまな実施形態では、免疫原性の低減は、ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ、イムノアッセイまたはｉｎ ｓｉｌｉｃｏ法を使用して測定することができる。
ある特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａを上方調節する本明細書において開示されるｅＴＦは、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体を含むＤＢＤを含み、ｇＲＮＡは、配列番号３５～６６のいずれか１つを含む標的化配列を含む。ｇＲＮＡの標的配列は、配列：５’－ＧＴＴＴＴＡＧＴＡＣＴＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＴＣＴＡＣＴＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＴＧＴＴＴＡＴＣＴＣＧＴＣＡＡＣＴＴＧＴＴＧＧＣＧＡＧＡ－３’（配列番号１８３）を有する足場配列の５’末端に結合される。例示的な実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ非活性化Ｃａｓ９タンパク質である。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、Ｃａｓタンパク質にコンジュゲートされた１つまたは複数のＴＡＤをさらに含み、ＴＡＤは、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ＣＩＴＥＤ２、ＣＩＴＥＤ４またはＣＲＥＢ３から選択される。一実施形態では、そのようなｅＴＦは、Ｃａｓタンパク質のＣ末端にコンジュゲートされたＶＰＲ ＴＡＤドメインを含む。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ２ ＴＡＤを含む。ある特定の実施形態では、そのようなｅＴＦは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端にコンジュゲートされたＣＩＴＥＤ４ ＴＡＤを含む。例示的な実施形態では、そのようなｅＴＦは、ＳＣＮ１Ａ発現を、対照と比較して、少なくとも少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、もしくはそれよりも高く、上方調節することができる。
ポリヌクレオチド
別の態様では、本出願は、本明細書に開示されるＳＮＣ１Ａを上方調節するｅＴＦのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。別の態様では、本出願は、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドを提供する。ある特定の実施形態では、本出願は、導入遺伝子およびＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位に作動可能に連結されたＰＶ選択的調節エレメントを含むポリヌクレオチドを提供する。ある特定の実施形態では、本出願は、本明細書において開示されるＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦおよびＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位をコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供する。ある特定の実施形態では、本出願は、ＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦおよびＰＶ選択的調節エレメントをコードする導入遺伝子に作動可能に連結されたＰＶ選択的調節エレメントを提供する。
ＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチド
ある特定の実施形態では、本出願は、以下のいずれか１つ：（ｉ）配列番号７７～１３１、２０５、２０７、２０９、２１３、２１７、２１９、２２１もしくは２２３のいずれか１つを含むＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦをコードする核酸配列、またはそのバリアントもしくは機能的断片；（ｉｉ）配列番号７７～１３１、２０５、２０７、２０９、２１３、２１７、２１９、２２１もしくは２２３のいずれか１つを有するＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦの機能的断片をコードする核酸；あるいは（ｉｉｉ）配列番号７７～１３１、２０５、２０７、２０９、２１３、２１７、２１９、２２１もしくは２２３のいずれか１つを有するＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれよりも高い配列同一性を有するＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦをコードする核酸、またはそのバリアントもしくは機能的断片を含むポリヌクレオチドを提供する。
ある特定の実施形態では、本出願は、以下のいずれか１つ：（ｉ）配列番号９２～９８のいずれか１つを含むＤＢＤをコードする核酸配列、またはそのバリアントもしくは機能的断片；（ｉｉ）配列番号９２～９８のいずれか１つを有するＤＢＤの機能的断片をコードする核酸；あるいは（ｉｉｉ）配列番号９２～９８のいずれか１つを有するＤＢＤと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれよりも高い配列同一性を有するＤＢＤをコードする核酸、またはそのバリアントもしくは機能的断片を含むポリヌクレオチドであって、ＤＢＤは、配列番号９２～９８のいずれか１つが結合する標的部位に結合することができる、ポリヌクレオチドを提供する。
ある特定の実施形態では、本出願は、内因性ＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドが、以下のいずれか１つ：（ｉ）配列番号１０３～１２４、１２８～１３１、２０５、２０７、２０９、２１３、２１７、２１９、２２１もしくは２２３のいずれか１つを含むｅＴＦをコードする核酸配列；（ｉｉ）配列番号１０３～１２４、１２８～１３１、２０５、２０７、２０９、２１３、２１７、２１９、２２１もしくは２２３のいずれか１つを有するｅＴＦの機能的断片をコードする核酸；あるいは（ｉｉｉ）配列番号１０３～１２４、１２８～１３１、２０５、２０７、２０９、２１３、２１７、２１９、２２１もしくは２２３のいずれか１つを有するｅＴＦと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれよりも高い配列同一性を有するｅＴＦをコードする核酸を含み、ｅＴＦが、ＳＣＮ１Ａを上方調節することができる、ポリヌクレオチドを提供する。
ある特定の実施形態では、本出願は、本明細書において開示されるｅＴＦと結合する場合に、内因性ＳＣＮ１Ａを上方調節することができるゲノム標的部位に結合するＤＢＤをコードするポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドが、以下のいずれか１つ：（ｉ）配列番号７７～９８のいずれか１つを含むＤＢＤをコードする核酸配列；（ｉｉ）配列番号７７～９８のいずれか１つを有するＤＢＤの機能的断片をコードする核酸；あるいは（ｉｉｉ）配列番号７７～９８のいずれか１つを有するＤＢＤと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれよりも高い配列同一性を有するｅＴＦをコードする核酸を含み、ＤＢＤは、配列番号７７～９８のいずれか１つが結合する標的部位に結合することができる、ポリヌクレオチドを提供する。
ある特定の実施形態では、本出願は、本明細書において開示されるｅＴＦと結合する場合に、内因性ＳＣＮ１Ａを上方調節することができるゲノム標的部位に結合するＤＢＤをコードするポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドが、以下のいずれか１つ：（ｉ）配列番号１４８～１５１のいずれか１つを含むＤＢＤをコードする核酸配列；（ｉｉ）配列番号１４８～１５１のいずれか１つを有するＤＢＤの機能的断片をコードする核酸；あるいは（ｉｉｉ）配列番号１４８～１５１のいずれか１つを有するＤＢＤと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれよりも高い配列同一性を有するｅＴＦをコードする核酸を含み、ＤＢＤは、配列番号９２～９８のいずれか１つが結合する標的部位に結合することができる、ポリヌクレオチドを提供する。
ある特定の実施形態では、本出願は、内因性ＳＣＮ１Ａを調節することができるｅＴＦをコードするポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドが、以下のいずれか１つ：（ｉ）配列番号７０～７６または１８４のいずれかを有する核酸配列；（ｉｉ）（ｉ）の配列のいずれか１つの機能的断片を有する核酸；あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の配列のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれよりも高い配列同一性を有する核酸を含み、ポリヌクレオチドが、ＳＣＮ１Ａを上方調節することができるｅＴＦをコードする、ポリヌクレオチドを提供する。
ある特定の実施形態では、本出願は、内因性ＳＣＮ１Ａを調節することができるｅＴＦをコードするポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドが、以下のいずれか１つ：（ｉ）配列番号７０を有する核酸配列；（ｉｉ）配列番号７０の機能的断片を有する核酸；あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の配列のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれよりも高い配列同一性を有する核酸を含む、ポリヌクレオチドを提供する。例示的な実施形態では、そのようなポリヌクレオチドは、配列番号１２７を有するｅＴＦ、またはＳＣＮ１Ａを上方調節することができるその機能的断片もしくはバリアントをコードする。
ある特定の実施形態では、本出願は、内因性ＳＣＮ１Ａを調節することができるｅＴＦをコードするポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドが、以下のいずれか１つ：（ｉ）配列番号７１を有する核酸配列；（ｉｉ）配列番号７１の機能的断片を有する核酸；あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の配列のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれよりも高い配列同一性を有する核酸を含む、ポリヌクレオチドを提供する。例示的な実施形態では、そのようなポリヌクレオチドは、配列番号１２７を有するｅＴＦ、またはＳＣＮ１Ａを上方調節することができるその機能的断片もしくはバリアントをコードする。
ある特定の実施形態では、本出願は、内因性ＳＣＮ１Ａを調節することができるｅＴＦをコードするポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドが、以下のいずれか１つ：（ｉ）配列番号７２を有する核酸配列；（ｉｉ）配列番号７２の機能的断片を有する核酸；あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の配列のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれよりも高い配列同一性を有する核酸を含む、ポリヌクレオチドを提供する。例示的な実施形態では、そのようなポリヌクレオチドは、配列番号１３０を有するｅＴＦ、またはＳＣＮ１Ａを上方調節することができるその機能的断片もしくはバリアントをコードする。
ある特定の実施形態では、本出願は、内因性ＳＣＮ１Ａを調節することができるｅＴＦをコードするポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドが、以下のいずれか１つ：（ｉ）配列番号７３を有する核酸配列；（ｉｉ）配列番号７３の機能的断片を有する核酸配列；あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の配列のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれよりも高い配列同一性を有する核酸を含む、ポリヌクレオチドを提供する。例示的な実施形態では、そのようなポリヌクレオチドは、配列番号１３１を有するｅＴＦ、またはＳＣＮ１Ａを上方調節することができるその機能的断片もしくはバリアントをコードする。
ある特定の実施形態では、本出願は、内因性ＳＣＮ１Ａを調節することができるｅＴＦをコードするポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドが、以下のいずれか１つ：（ｉ）配列番号７４を有する核酸配列；（ｉｉ）配列番号７４の機能的断片を有する核酸配列；あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の配列のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれよりも高い配列同一性を有する核酸を含む、ポリヌクレオチドを提供する。例示的な実施形態では、そのようなポリヌクレオチドは、配列番号１２７を有するｅＴＦ、またはＳＣＮ１Ａを上方調節することができるその機能的断片もしくはバリアントをコードする。
ある特定の実施形態では、本出願は、内因性ＳＣＮ１Ａを調節することができるｅＴＦをコードするポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドが、以下のいずれか１つ：（ｉ）配列番号７５を有する核酸配列；（ｉｉ）配列番号７５の機能的断片を有する核酸配列；あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の配列のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれよりも高い配列同一性を有する核酸を含む、ポリヌクレオチドを提供する。例示的な実施形態では、そのようなポリヌクレオチドは、配列番号１２７を有するｅＴＦ、またはＳＣＮ１Ａを上方調節することができるその機能的断片もしくはバリアントをコードする。
ある特定の実施形態では、本出願は、内因性ＳＣＮ１Ａを調節することができるｅＴＦをコードするポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドが、以下のいずれか１つ：（ｉ）配列番号７６を有する核酸配列；（ｉｉ）配列番号７６の機能的断片を有する核酸配列；あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の配列のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれよりも高い配列同一性を有する核酸を含む、ポリヌクレオチドを提供する。例示的な実施形態では、そのようなポリヌクレオチドは、配列番号１０６を有するｅＴＦ、またはＳＣＮ１Ａを上方調節することができるその機能的断片もしくはバリアントをコードする。
ある特定の実施形態では、本出願は、内因性ＳＣＮ１Ａを調節することができるｅＴＦをコードするポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドが、以下のいずれか１つ：（ｉ）配列番号１８４を有する核酸配列；（ｉｉ）配列番号１８４の機能的断片を有する核酸配列；あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の配列のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれよりも高い配列同一性を有する核酸を含む、ポリヌクレオチドを提供する。例示的な実施形態では、そのようなポリヌクレオチドは、配列番号１０６を有するｅＴＦ、またはＳＣＮ１Ａを上方調節することができるその機能的断片もしくはバリアントをコードする。
ＰＶニューロンにおける選択的発現のためのマイクロＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチド
別の態様では、本出願は、パルブアルブミン（ＰＶ）ニューロンにおいて目的の遺伝子の選択的発現をもたらすマイクロＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドを提供する。マイクロＲＮＡまたはｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ分子内の相補的認識部位にハイブリダイズすることによって転写後の遺伝子発現を調節し、かつｍＲＮＡ転写物の分解を促進することによって、またはｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の翻訳を抑制することによって、遺伝子発現の阻害をもたらす、小さい非コードＲＮＡ（約２０ヌクレオチド）である。本明細書において提供されるマイクロＲＮＡ結合部位は、興奮性ニューロンにおける目的の遺伝子の発現を阻害し、それによってＰＶニューロンにおける目的の遺伝子の選択的発現を促進する（例えば、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位）。ある特定の実施形態では、興奮性ニューロンは、ＳＴＡＣ、Ｓｌｃ１７ａ７、Ｃａｒ１２、Ｓｙｔ１７、ＩＴＰＫＡ、Ｃｏｌ６ａ１、ＣａｍＫＩＩ、Ｓｖ２ｂ、ＩＮＨＢＡおよび／またはＤＫＫ３の１つまたは複数を発現するニューロンである。例示的な実施形態では、興奮性ニューロンは、ＣａｍＫＩＩを発現するニューロンである。
ある特定の実施形態では、本出願は、ＰＶ選択的発現を促進する、例えば、興奮性ニューロンにおけるマイクロＲＮＡ結合部位を含むｍＲＮＡの分解を促進する、１つまたは複数のマイクロＲＮＡのための１つまたは複数のマイクロＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドを提供する。ＰＶ選択的発現を促進する例示的なマイクロＲＮＡとしては、例えば、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－２２１およびｍｉＲ－２２２が挙げられる。ある特定の実施形態では、本出願は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多くのＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドを提供する。一実施形態では、本出願は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多くのｍｉＲ－１２８結合部位（配列番号９）を含むポリヌクレオチドを提供する。一実施形態では、本出願は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多くのｍｉＲ－２２１結合部位（配列番号１１）を含むポリヌクレオチドを提供する。一実施形態では、本出願は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多くのｍｉＲ－２２２結合部位（配列番号１３）を含むポリヌクレオチドを提供する。一実施形態では、本出願は、少なくとも１つのｍｉＲ－１２８結合部位、少なくとも１つのｍｉＲ－２２１結合部位、および少なくとも１つのｍｉＲ－２２２結合部位を含むポリヌクレオチドを提供する。一実施形態では、本出願は、少なくとも１つのｍｉＲ－１２８結合部位、および少なくとも１つのｍｉＲ－２２２結合部位を含むポリヌクレオチドを提供する。一実施形態では、本出願は、少なくとも１つのｍｉＲ－２２１結合部位、および少なくとも１つのｍｉＲ－２２２結合部位を含むポリヌクレオチドを提供する。例示的な実施形態では、本出願は、少なくとも１つのｍｉＲ－１２８結合部位（配列番号９）、および少なくとも１つのｍｉＲ－２２１結合部位（配列番号１１）を含むポリヌクレオチドを提供する。一実施形態では、本出願は、少なくとも２つのｍｉＲ－１２８結合部位（配列番号９）、および少なくとも２つのｍｉＲ－２２１結合部位（配列番号１１）を含むポリヌクレオチドを提供する。一実施形態では、本出願は、少なくとも３つのｍｉＲ－１２８結合部位（配列番号９）、および少なくとも３つのｍｉＲ－２２１結合部位（配列番号１１）を含むポリヌクレオチドを提供する。一実施形態では、本出願は、少なくとも４つのｍｉＲ－１２８結合部位（配列番号９）、および少なくとも４つのｍｉＲ－２２１結合部位（配列番号１１）を含むポリヌクレオチドを提供する。一実施形態では、本出願は、少なくとも５つのｍｉＲ－１２８結合部位（配列番号９）、および少なくとも５つのｍｉＲ－２２１結合部位（配列番号１１）を含むポリヌクレオチドを提供する。そのような実施形態では、結合部位は、任意の順序で、配列し得る。例えば、２つのｍｉＲ－１２８結合部位および２つのｍｉＲ－２２１結合部位を含有する構築物について、結合部位は、以下の構成：ｍｉＲ－１２８－ｍｉＲ－１２８－ｍｉＲ－２２１－ｍｉＲ２２１、ｍｉＲ－１２８－ｍｉＲ－２２１－ｍｉＲ－１２８－ｍｉＲ－２２１、ｍｉＲ－１２８－ｍｉＲ２２１－ｍｉＲ２２１－ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－２２１－ｍｉＲ１２８－ｍｉＲ２２１－ｍｉＲ１２８、ｍｉＲ－２２１－ｍｉＲ１２８－ｍｉＲ１２８－ｍｉＲ２２１またはｍｉＲ２２１－ｍｉＲ２２１－ｍｉＲ１２８－ｍｉＲ１２８のいずれかで配置されていてもよい。例示的な実施形態では、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、４つのｍｉＲ－１２８結合部位（配列番号９）に続いて、４つのｍｉＲ－２２１結合部位（配列番号１１）を有する配列、例えば、ｍｉＲ－１２８－ｍｉＲ－１２８－ｍｉＲ１２８－ｍｉＲ－１２８－ｍｉＲ２２１－ｍｉＲ２２１－ｍｉＲ－２２１－ｍｉＲ２２１を含む。別の例示的な実施形態では、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、１つのｍｉＲ－２２１配列（配列番号１１）、１つのｍｉＲ－２２２配列（配列番号１３）、および１つのｍｉＲ－１２８結合部位（配列番号９）を有する配列、例えば、ｍｉＲ－２２１－ｍｉＲ２２２－ｍｉＲ１２８を含む。別の例示的な実施形態では、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、以下の順序：ｍｉＲ－２２１－ｍｉＲ２２２－ｍｉＲ１２８－ｍｉＲ－２２１－ｍｉＲ２２２－ｍｉＲ１２８で配置された２つのｍｉＲ－２２１配列（配列番号１１）、２つのｍｉＲ－２２２配列（配列番号１３）、および２つのｍｉＲ－１２８結合部位（配列番号９）を有する配列を含む。
２つ以上のマイクロＲＮＡ結合部位を有するポリヌクレオチドにおいて、結合部位は、ポリヌクレオチド配列中で互いと直接隣接していてもよく（例えば、リンカーなし、または結合部位の間に介在する配列なし）、あるいは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくはそれよりも多くのヌクレオチド、または１～２０、１～１５、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３もしくは１～２ヌクレオチド、互いと離れていてもよい。例示的な実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、約５ヌクレオチド、または５ヌクレオチド、離れている。例示的な実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位を分離する配列（および、マイクロＲＮＡ結合部位の間で形成される連結、またはマイクロＲＮＡ結合部位およびマイクロＲＮＡ結合部位を分離する配列の間で形成される連結）は、任意の他のマイクロＲＮＡ、や任意の他のニューロンマイクロＲＮＡと相補的ではない。
ある特定の実施形態では、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、配列番号７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％。または１００％の同一性を有するマイクロＲＮＡ結合部位を含む。例示的な実施形態では、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、配列番号７を含むマイクロＲＮＡ結合部位を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、配列番号１４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％。または１００％の同一性を有するマイクロＲＮＡ結合部位を含む。例示的な実施形態では、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、配列番号１４を含むマイクロＲＮＡ結合部位を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、配列番号１５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％。または１００％の同一性を有するマイクロＲＮＡ結合部位を含む。例示的な実施形態では、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、配列番号１５を含むマイクロＲＮＡ結合部位を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書において提供されるマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡ転写物の３’非翻訳領域内、例えば、翻訳終止コドン（すなわち、ＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧ）の後、およびポリＡテイルの前に、位置する。マイクロＲＮＡ結合部位は、翻訳終止コドンと直接隣接して位置していてもよく、あるいは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくはそれよりも多くのヌクレオチド、または１～２０、１～１５、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３もしくは１～２ヌクレオチド、翻訳終止コドンから離れていてもよく、および／あるいはポリＡテイルと隣接して位置していてもよく、あるいは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくはそれよりも多くのヌクレオチド、または１～２０、１～１５、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３または１～２ヌクレオチド、ポリＡテイルから離れていてもよい。
ある特定の実施形態では、本明細書において提供されるマイクロＲＮＡ結合部位は、オフターゲット細胞型と比較して、ＰＶ細胞における選択的遺伝子発現をもたらす。一部の場合では、オフターゲット細胞型としては、限定されるものではないが、興奮性ニューロン、非ＰＶ ＣＮＳ細胞型および非ニューロンＣＮＳ細胞型が挙げられる。ある特定の実施形態では、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位は、少なくとも１、２、３、４、５、またはそれよりも多くの非ＰＶ ＣＮＳ細胞型に対して、ＰＶニューロンにおける選択的遺伝子発現をもたらす。一部の例では、非ＰＶ ＣＮＳ細胞は、興奮性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、星状膠細胞、ミクログリア、運動ニューロン、血管細胞、または非ＧＡＢＡ作動性ニューロン（例えば、ＧＡＤ２、ＧＡＤ１、ＮＫＸ２．１、ＤＬＸ１、ＤＬＸ５、ＳＳＴおよびＶＩＰの１つまたは複数を発現しない細胞）、非ＰＶニューロン（例えば、パルブアルブミンを発現しないＧＡＢＡ作動性ニューロン）、または他のＣＮＳ細胞（例えば、ＰＶ、ＧＡＤ２、ＧＡＤ１、ＮＫＸ２．１、ＤＬＸ１、ＤＬＸ５、ＳＳＴおよびＶＩＰのいずれも発現したことがないＣＮＳ細胞型）である。例示的な実施形態では、本明細書において提供されるＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位は、興奮性ニューロン（例えば、ＳＴＡＣ、Ｓｌｃ１７ａ７、Ｃａｒ１２、Ｓｙｔ１７、ＩＴＰＫＡ、Ｃｏｌ６ａ１、ＣａｍＫＩＩ、Ｓｖ２ｂ、ＩＮＨＢＡおよび／またはＤＫＫ３の１つまたは複数を発現するニューロン）と比較して、興奮性ニューロンにおける発現を減少させることによって、ＰＶニューロンにおいて遺伝子発現の増加した選択性をもたらす。一部の場合では、細胞型は、異なる細胞マーカー、形態、表現型、遺伝子型、機能および／または細胞型を分類するための任意の他の手段を有することによって、識別される。
ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位によって駆動される発現の選択性は、多くの方法で測定することができる。一実施形態では、非ＰＶ細胞に対するＰＶ細胞における遺伝子発現の選択性は、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含有する遺伝子から検出可能なレベルの転写物を発現するＰＶ細胞の数を、その遺伝子を発現する細胞の総数と比較することによって（例えば、その遺伝子を発現する、ＰＶ、対、総細胞（ＰＶ＋非ＰＶ細胞）の比）、測定することができる。例えば、ＰＶニューロンについての選択性は、遺伝子発現を測定するための蛍光タンパク質（例えば、ｅＧＦＰ）およびＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位をコードする遺伝子を含む発現カセット、ならびに第２の蛍光標識（例えば、赤色蛍光タンパク質）に連結されたＰＶ細胞を同定する抗体（例えば、ＰＶニューロンと特異的に相互作用する抗ＰＶ抗体）を使用する、免疫組織化学的検査に基づく共局在化アッセイを使用して、決定することができる。ＰＶ細胞における発現の選択性は、ＰＶおよびｅＧＦＰの両方を発現する細胞（例えば、ＰＶ細胞）の数を、ｅＧＦＰを発現する細胞（例えば、ＰＶ細胞および非ＰＶ細胞）の総数によって割り、１００を掛けて、パーセンテージに変換することによって、計算することができる。別の例では、ＰＶニューロンについての選択性は、遺伝子発現を測定するための蛍光タンパク質（例えば、ｅＧＦＰ）およびＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位をコードする遺伝子を含む発現カセット、ならびに第２の蛍光標識（例えば、赤色蛍光タンパク質）に連結されたＰＶ細胞を同定する第１の抗体（例えば、ＰＶニューロンと特異的に相互作用する抗ＰＶ抗体）および興奮性細胞を同定する第２の抗体（例えば、興奮性ニューロンと特異的に相互作用する抗ＣａｍＫＩＩ抗体）を使用する、免疫組織化学的検査に基づく共局在化アッセイを使用して、決定することができる。ＰＶ細胞における発現の選択性は、ＰＶおよびｅＧＦＰの両方を発現する細胞（例えば、ＰＶ細胞）の数を、ｅＧＦＰ＋ＰＶおよびｅＧＦＰ＋ＣａｍＫＩＩを発現する細胞（例えば、ＰＶ細胞および興奮性細胞）の数によって割り、１００を掛けて、パーセンテージに変換することによって、計算することができる。導入遺伝子を発現するＰＶ細胞のパーセンテージが高くなると、マイクロＲＮＡ結合部位は、ＰＶ細胞についてより選択的になる。ある特定の実施形態では、本明細書において提供されるＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位は、ＰＶ細胞における発現について非常に選択的であり得る。例えば、本明細書において提供されるＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位は、ＰＶニューロンについて、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または約９９％よりも高い選択性（例えば、ＰＶニューロン／総細胞×１００またはＰＶニューロン／ＰＶ＋興奮性ニューロン×１００）を示し得る。
一部の場合では、本明細書において提供されるＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位は、短い。一部の場合では、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位のサイズは、導入遺伝子、プロモーター（および必要に応じて、エンハンサー）およびマイクロＲＮＡ結合部位の組み合わせたサイズが、ベクターのクローニング能力を超えないように、ベクター、例えば、ウイルスベクターまたはｒＡＡＶのクローニング能力と適合する。一部の場合では、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位は、最大で約５００ｂｐ、４００ｂｐ、３００ｂｐ、２５０ｂｐ、２２５ｂｐ、２１５ｂｐ、２１０ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１４０ｂｐ、１３５ｂｐ、１３０ｂｐ、１２５ｂｐ、１２０ｂｐ、１１５ｂｐ、１１０ｂｐ、１００ｂｐ、９０ｂｐ、８０ｂｐ、７５ｂｐ、７０ｂｐ、６５ｂｐ、６０ｂｐまたは５０ｂｐの長さを有する。一部の場合では、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位は、約５０～５００ｂｐ、５０～４００ｂｐ、５０～３００ｂｐ、５０～２５０ｂｐ、５０～２００ｂｐ、５０～１００ｂｐ、５０～７５ｂｐ、５０～７０ｂｐ、１００～５００ｂｐ、１００～４００ｂｐ、１００～３００ｂｐ、１００～２５０ｂｐ、１００～２００ｂｐ、１００～１５０ｂｐ、１００～１４０ｂｐ、１００～１３５ｂｐ、２００～５００ｂｐ、２００～４００ｂｐ、２００～３００ｂｐまたは２００～２５０ｂｐの間である。
例示的な実施形態では、１つまたは複数のＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含む本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、配列番号６７を含まない。
発現カセット
別の態様では、本出願は、本明細書において提供されるポリヌクレオチド（例えば、ＳＣＮ１Ａを上方調節するか、および／またはＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含有する、ｅＴＦをコードする配列を含むポリヌクレオチド）、および１つまたは複数の調節エレメントを含む発現カセットを提供する。ある特定の実施形態では、本出願は、本明細書において提供されるポリヌクレオチド（例えば、ＳＣＮ１Ａを上方調節するか、および／またはＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含有する、ｅＴＦをコードする配列を含むポリヌクレオチド）、およびＰＶ選択的プロモーターを含む発現カセットを提供する。
ある特定の態様では、本明細書において提供されるポリヌクレオチド（例えば、ＳＣＮ１Ａを上方調節するか、および／またはＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含有する、ｅＴＦをコードする配列を含むポリヌクレオチド）は、ｅＴＦをコードする配列に加えて、１つまたは複数の調節エレメントを含む発現カセットの一部である。例示的な実施形態では、本明細書において提供されるポリヌクレオチド（例えば、ＳＣＮ１Ａを上方調節するか、および／またはＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含有する、ｅＴＦをコードする配列を含むポリヌクレオチド）は、細胞において導入遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦ）の発現を駆動することができるように、導入遺伝子配列の上流に置かれたプロモーターを含む発現カセットの一部である。
ある特定の実施形態では、本明細書において開示される発現カセットは、細胞において導入遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦ）の発現を駆動することができるように、本明細書において提供されるポリヌクレオチド（例えば、ＳＣＮ１Ａを上方調節するか、および／またはＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含有する、ｅＴＦをコードする配列を含むポリヌクレオチド）、および導入遺伝子をコードする配列の上流に置かれた構成的プロモーターを含む。構成的プロモーターの例としては、ＧＡＤ２プロモーター、ヒトシナプシンプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ｍｉｎＣＭＶプロモーター、ＴＡＴＡボックス、スーパーコアプロモーターもしくはＥＦ１αプロモーター、またはそれらの組合せが挙げられる。
ある特定の実施形態では、本明細書において開示される発現カセットは、本明細書において提供されるポリヌクレオチド（例えば、ＳＣＮ１Ａを上方調節するか、および／またはＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含有する、ｅＴＦをコードする配列を含むポリヌクレオチド）、および細胞において導入遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦ）の発現を駆動することができる短いプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の核酸分子による使用のために適切な短いプロモーターは、５００ｂｐ、４５０ｂｐ、４００ｂｐ、３５０ｂｐ、３００ｂｐ、２５０ｂｐ、２２５ｂｐ、２００ｂｐ、１７５ｂｐ、１５０ｂｐ、１４５ｂｐ、１４０ｂｐ、１３５ｂｐ、１３０ｂｐ、１２５ｂｐ、１２０ｂｐ、１１５ｂｐ、１１０ｂｐ、１０５ｂｐ、１００ｂｐ、９５ｂｐ、９０ｂｐ、８５ｂｐ、８０ｂｐもしくは７５ｂｐ未満、または約８０～３００ｂｐ、８０～２７５ｂｐ、８０～２５０ｂｐ、８０～２００ｂｐ、８０～１５０ｂｐ、８０～１２５ｂｐ、８０～１２０ｂｐ、８０～１１５ｂｐ、８０～１１０ｂｐ、８０～１０５ｂｐ、８０～１００ｂｐ、８５～３００ｂｐ、８５～２７５ｂｐ、８５～２５０ｂｐ、８５～２００ｂｐ、８５～１５０ｂｐ、８５～１２５ｂｐ、８５～１２０ｂｐ、８５～１１５ｂｐ、８５～１１０ｂｐ、８５～１０５ｂｐ、８５～１００ｂｐ、９０～３００ｂｐ、９０～２７５ｂｐ、９０～２５０ｂｐ、９０～２００ｂｐ、９０～１５０ｂｐ、９０～１２５ｂｐ、９０～１２０ｂｐ、９０～１１５ｂｐ、９０～１１０ｂｐ、９０～１０５ｂｐ、９０～１００ｂｐ、９５～３００ｂｐ、９５～２７５ｂｐ、９５～２５０ｂｐ、９５～２００ｂｐ、９５～１５０ｂｐ、９５～１２５ｂｐ、９５～１２０ｂｐ、９５～１１５ｂｐ、９５～１１０ｂｐ、９５～１０５ｂｐ、９５～１００ｂｐ、１００～３００ｂｐ、１００～２７５ｂｐ、１００～２５０ｂｐ、１００～２００ｂｐ、１００～１５０ｂｐ、１００～１２５ｂｐ、１００～１２０ｂｐ、１００～１１５ｂｐ、１００～１１０ｂｐもしくは１００～１０５ｂｐを含む。例示的な実施形態では、本明細書に記載の発現カセットによる使用のために適切な短いプロモーターは、約１００～１２０ｂｐ、約１１７ｂｐまたは約１００ｂｐを含む。
ある特定の実施形態では、本明細書において開示される発現カセットは、本明細書において開示されるＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節し、必要に応じて本明細書に開示されるマイクロＲＮＡ結合部位を含有するｅＴＦのいずれか１つをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、（ｉ）配列番号１；（ｉｉ）そのバリアントもしくは機能的断片；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列のいずれか１つを含むか、またはそれらからなる短いプロモーターを含む。短いプロモーター配列の他の例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１８／２１３７８６において見出され得る。
ある特定の実施形態では、本明細書において開示される発現カセットは、目的の細胞において導入遺伝子の発現を選択的に駆動することができるように、本明細書において提供されるポリヌクレオチド（例えば、ＳＣＮ１Ａを上方調節するか、および／またはＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含有する、ｅＴＦをコードする配列を含むポリヌクレオチド）、および導入遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦ）をコードする配列の上流に置かれた細胞型選択的プロモーターを含む。ある特定の実施形態では、細胞型選択的プロモーターは、例えば、心臓細胞、肝臓細胞、筋肉細胞、骨細胞、ニューロン、またはそれらの下位集団などの目的の任意の細胞型について選択的であり得る（例えば、目的の任意の細胞型における発現を選択的に駆動し得る）。例示的な実施形態では、本明細書において開示される発現カセットは、ＰＶ細胞においてｅＴＦの発現を選択的に駆動することができるように、ＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチド、およびｅＴＦをコードする配列の上流に置かれたＰＶ選択的調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサーならびに／またはプロモーターおよびエンハンサー）、および必要に応じてＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含む。ＰＶ選択的調節エレメントは、ＰＶニューロンにおいて遺伝子発現を特異的にモジュレートする調節エレメントを指す。ある特定の実施形態では、ＰＶ選択的調節エレメントは、１つまたは複数の他のＣＮＳ細胞型と比べて、ＰＶニューロンにおいて発現を増強する。ある特定の実施形態では、ＰＶ選択的調節エレメントは、オフターゲット細胞型において転写および／または翻訳プロセスを抑制する。
ある特定の実施形態では、本明細書において提供されるＰＶ選択的調節エレメントは、オフターゲット細胞型と比較して、ＰＶ細胞における選択的遺伝子発現をもたらす。一部の場合では、オフターゲット細胞型としては、限定されるものではないが、興奮性ニューロン、非ＰＶ ＣＮＳ細胞型および非ニューロンＣＮＳ細胞型が挙げられる。ある特定の実施形態では、ＰＶ選択的調節エレメントは、少なくとも１、２、３、４、５、またはそれよりも多くの非ＰＶ ＣＮＳ細胞型に対して、ＰＶニューロンにおける選択的遺伝子発現をもたらす。一部の例では、非ＰＶ ＣＮＳ細胞は、興奮性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、星状膠細胞、ミクログリア、運動ニューロン、血管細胞、または非ＧＡＢＡ作動性ニューロン（例えば、ＧＡＤ２、ＧＡＤ１、ＮＫＸ２．１、ＤＬＸ１、ＤＬＸ５、ＳＳＴおよびＶＩＰの１つまたは複数を発現しない細胞）、非ＰＶニューロン（例えば、パルブアルブミンを発現しないＧＡＢＡ作動性ニューロン）、または他のＣＮＳ細胞（例えば、ＰＶ、ＧＡＤ２、ＧＡＤ１、ＮＫＸ２．１、ＤＬＸ１、ＤＬＸ５、ＳＳＴおよびＶＩＰのいずれも発現したことがないＣＮＳ細胞型）である。一部の場合では、本明細書において提供されるＰＶ選択的調節エレメントは、非ＰＶ ＧＡＢＡ作動性細胞と比較して、ＰＶニューロンにおける遺伝子発現の増加した選択性をもたらす。一部の場合では、細胞型は、異なる細胞マーカー、形態、表現型、遺伝子型、機能および／または細胞型を分類するための任意の他の手段を有することによって、識別される。
ＰＶ選択的調節エレメントによって駆動される発現の選択性は、多くの方法で測定することができる。一実施形態では、非ＰＶ細胞に対するＰＶ細胞における遺伝子発現の選択性は、ＰＶ選択的調節エレメントに作動可能に連結された遺伝子から検出可能なレベルの転写物を発現するＰＶ細胞の数を、その遺伝子を発現する細胞の総数と比較することによって（例えば、その遺伝子を発現する、ＰＶ、対、総細胞（ＰＶ＋非ＰＶ細胞）の比）、測定することができる。例えば、ＰＶニューロンについての選択性は、遺伝子発現を測定するためのＰＶ選択的調節エレメントに作動可能に連結された蛍光タンパク質（例えば、ｅＧＦＰ）をコードする遺伝子、および第２の蛍光標識（例えば、赤色蛍光タンパク質）に連結されたＰＶ細胞を同定する抗体（例えば、ＰＶニューロンと特異的に相互作用する抗ＰＶ抗体）を使用する、免疫組織化学的検査に基づく共局在化アッセイを使用して、決定することができる。ＰＶ細胞における発現の選択性は、ＰＶおよびｅＧＦＰの両方を発現する細胞（例えば、ＰＶ細胞）の数を、ｅＧＦＰを発現する細胞（例えば、ＰＶ細胞および非ＰＶ細胞）の総数によって割り、１００を掛けて、パーセンテージに変換することによって、計算することができる。導入遺伝子を発現するＰＶ細胞のパーセンテージが高くなると、調節エレメントは、ＰＶ細胞についてより選択的になる。ある特定の実施形態では、本明細書において提供されるＰＶ選択的調節エレメントは、ＰＶ細胞における発現について非常に選択的であり得る。例えば、本明細書において提供されるＰＶ選択的調節エレメントは、ＰＶニューロンについて、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または約９９％よりも高い選択性（例えば、ＰＶニューロン／総細胞×１００）を示し得る。
一部の場合では、本明細書において提供されるＰＶ選択的調節エレメントは、短い。一部の場合では、ＰＶ選択的調節エレメントのサイズは、導入遺伝子、および１つまたは複数のＰＶ選択的調節エレメントの組み合わせたサイズが、ベクターのクローニング能力を超えないように、ベクター、例えば、ウイルスベクターまたはｒＡＡＶのクローニング能力と適合する。一部の場合では、ＰＶ選択的調節エレメントは、最大で約２０５０ｂｐ、２０００ｂｐ、１９００ｂｐ、１８００ｂｐ、１７００ｂｐ、１６００ｂｐ、１５００ｂｐ、１４００ｂｐ、１３００ｂｐ、１２００ｂｐ、１１００ｂｐ、１０００ｂｐ、９００ｂｐ、８００ｂｐ、７００ｂｐ、６００ｂｐ、５００ｂｐ、４００ｂｐ、３００ｂｐ、２００ｂｐまたは１００ｂｐの長さを有する。一部の場合では、ＰＶ選択的調節エレメントは、約５００～６００ｂｐ、５００～７００ｂｐ、５００～８００ｂｐ、５００～９００ｂｐ、５００～１０００ｂｐ、５００～１５００ｂｐ、５００～２０００ｂｐまたは５００～２０５０ｂｐの間である。
ある特定の実施形態では、本明細書において提供されるＰＶ選択的調節エレメントは、（ｉ）配列番号２～４；（ｉｉ）それらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列のいずれか１つを含むか、またはそれらからなる。一部の場合では、調節エレメントは、配列番号２～４のいずれか１つを含む。ＰＶ選択的調節エレメントの他の例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１８／１８７３６３において見出され得る。
例示的な実施形態では、本出願は、ＰＶ選択的調節エレメントの制御下の、ＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードする核酸配列を含む発現カセットを提供する。ある特定の実施形態では、本出願は、配列番号２～４のいずれか１つを有するＰＶ選択的調節エレメントの制御下の、以下の配列：配列番号７７～９８のいずれか１つを有するＤＢＤを含む、ＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードする核酸配列を含む発現カセットを提供する。ある特定の実施形態では、本出願は、配列番号２～４のいずれか１つを有するＰＶ選択的調節エレメントの制御下の、以下の配列：配列番号９９～１３１、２０５、２０７、２０９、２１３、２１７、２１９、２２１または２２３のいずれか１つを含む、ＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードする核酸配列を含む発現カセットを提供する。ある特定の実施形態では、本出願は、配列番号２～４のいずれか１つを有するＰＶ選択的調節エレメントの制御下の、以下の配列：配列番号６７～７３のいずれか１つを含む核酸配列を含む発現カセットを提供する。ある特定の実施形態では、本出願は、配列番号２のいずれか１つを有するＰＶ選択的調節エレメントの制御下の、以下の配列：配列番号１４８～１５１のいずれか１つを有するＤＢＤを含む、ＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードする核酸配列を含む発現カセットを提供する。ある特定の実施形態では、本出願は、配列番号２のいずれか１つを有するＰＶ選択的調節エレメントの制御下の、以下の配列：配列番号９９～１３１、２０５、２０７、２０９、２１３、２１７、２１９、２２１または２２３のいずれか１つを含む、ＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードする核酸配列を含む発現カセットを提供する。ある特定の実施形態では、本出願は、配列番号２のいずれか１つを有するＰＶ選択的調節エレメントの制御下の、以下の配列：配列番号６７～７６または３１６のいずれか１つを含む核酸配列を含む発現カセットを提供する。
ある特定の実施形態では、本出願は、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位、ならびにプロモーターおよび／またはエンハンサー配列を含む発現カセットを提供する。本明細書に記載のプロモーターのいずれかは、発現カセットに含まれ得る。例示的な実施形態では、本明細書において提供される発現カセットは、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位およびＰＶ選択的調節エレメントを含む。ある特定の実施形態では、本明細書において提供される発現カセットは、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位、および（ｉ）配列番号２～４のいずれか１つ；（ｉｉ）それらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むＰＶ選択的調節エレメントを含む。ある特定の実施形態では、本明細書において提供される発現カセットは、（１）（ｉ）配列番号７、１４もしくは１５のいずれか１つ；（ｉｉ）（ｉ）のそれらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位、および（２）（ｉ）配列番号２～４のいずれか１つ；（ｉｉ）（ｉ）のそれらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むＰＶ選択的調節エレメントを含む。ある特定の実施形態では、本明細書において提供される発現カセットは、（１）（ｉ）配列番号７；（ｉｉ）（ｉ）のそれらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位、および（２）（ｉ）配列番号２；（ｉｉ）（ｉ）のそれらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むＰＶ選択的調節エレメントを含む。一実施形態では、本明細書において提供される発現カセットは、配列番号７を含むマイクロＲＮＡ結合部位、および配列番号２を含むＰＶ選択的調節エレメントを含む。ある特定の実施形態では、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、（１）（ｉ）配列番号１４；（ｉｉ）（ｉ）のそれらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位、および（２）（ｉ）配列番号２；（ｉｉ）（ｉ）のそれらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むＰＶ選択的調節エレメントを含む。一実施形態では、本明細書において提供される発現カセットは、配列番号１５を含むマイクロＲＮＡ結合部位、および配列番号２を含むＰＶ選択的調節エレメントを含む。ある特定の実施形態では、本明細書において提供される発現カセットは、（１）（ｉ）配列番号１５；（ｉｉ）（ｉ）のそれらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位、および（２）（ｉ）配列番号２；（ｉｉ）（ｉ）のそれらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むＰＶ選択的調節エレメントを含む。一実施形態では、本明細書において提供される発現カセットは、配列番号１５を含むマイクロＲＮＡ結合部位、および配列番号２を含むＰＶ選択的調節エレメントを含む。
ある特定の実施形態では、本明細書において提供される発現カセットは、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位、および本明細書において提供されるＳＣＮ１Ａの発現を上方調節するｅＴＦをコードする配列を含む。例示的な実施形態では、本出願は、ＰＶ選択的調節エレメント、本明細書において提供されるＳＣＮ１Ａの発現を上方調節するｅＴＦ、およびＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含む発現カセットを提供する。例示的な実施形態では、本出願は、（１）（ｉ）配列番号２～４のいずれか１つ；（ｉｉ）（ｉ）のそれらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むＰＶ選択的調節エレメント、（２）（ｉ）配列番号７７～１３１、２０５、２０７、２０９、２１３、２１７、２１９、２２１もしくは２２３のいずれか１つ；（ｉｉ）（ｉ）のそれらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦをコードする配列、および（３）（ｉ）配列番号７、１４もしくは１５のいずれか１つ；（ｉｉ）（ｉ）のそれらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含む発現カセットを提供する。別の例示的な実施形態では、本出願は、（１）（ｉ）配列番号２；（ｉｉ）（ｉ）のそれらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むＰＶ選択的調節エレメント、（２）（ｉ）配列番号７７もしくは１２７のいずれか１つ；（ｉｉ）（ｉ）のそれらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦをコードする配列、および（３）（ｉ）配列番号７；（ｉｉ）（ｉ）のそれらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含む発現カセットを提供する。別の例示的な実施形態では、本出願は、（１）（ｉ）配列番号２；（ｉｉ）（ｉ）のそれらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むＰＶ選択的調節エレメント、（２）（ｉ）配列番号７７もしくは１２７のいずれか１つ；（ｉｉ）（ｉ）のそれらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦをコードする配列、および（３）（ｉ）配列番号１４；（ｉｉ）（ｉ）のそれらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含む発現カセットを提供する。別の例示的な実施形態では、本出願は、（１）（ｉ）配列番号２；（ｉｉ）（ｉ）のそれらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むＰＶ選択的調節エレメント、（２）（ｉ）配列番号７７もしくは１２７のいずれか１つ；（ｉｉ）（ｉ）のそれらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦをコードする配列、および（３）（ｉ）配列番号１５；（ｉｉ）（ｉ）のそれらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含む発現カセットを提供する。別の例示的な実施形態では、本出願は、（１）（ｉ）配列番号２；（ｉｉ）（ｉ）のそれらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むＰＶ選択的調節エレメント、（２）（ｉ）配列番号９２もしくは１０６のいずれか１つ；（ｉｉ）（ｉ）のそれらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦをコードする配列、および（３）（ｉ）配列番号７；（ｉｉ）（ｉ）のそれらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含む発現カセットを提供する。別の例示的な実施形態では、本出願は、（１）（ｉ）配列番号２；（ｉｉ）（ｉ）のそれらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むＰＶ選択的調節エレメント、（２）（ｉ）配列番号９２もしくは１０６のいずれか１つ；（ｉｉ）（ｉ）のそれらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦをコードする配列、および（３）（ｉ）配列番号１４；（ｉｉ）（ｉ）のそれらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含む発現カセットを提供する。別の例示的な実施形態では、本出願は、（１）（ｉ）配列番号２；（ｉｉ）（ｉ）のそれらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むＰＶ選択的調節エレメント、（２）（ｉ）配列番号９２もしくは１０６のいずれか１つ；（ｉｉ）（ｉ）のそれらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むＳＣＮ１Ａを上方調節するｅＴＦをコードする配列、および（３）（ｉ）配列番号１５；（ｉｉ）（ｉ）のそれらのバリアント、機能的断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含む発現カセットを提供する。
ある特定の実施形態では、ＰＶ選択的調節エレメントおよびＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含む本明細書において提供される発現カセットは、５ｋｂ未満、４．９ｋｂ、４．８ｋｂ、４．７ｋｂ、４．６ｋｂ、４．５ｋｂ、４．４ｋｂ、４．３ｋｂ、４．２ｋｂ、４．１ｋｂ、４．０ｋｂ、３．９ｋｂ、３．８ｋｂ、３．７ｋｂ、３．６ｋｂ、３．５ｋｂ、３．４ｋｂ、３．３ｋｂ、３．２ｋｂ、３．１ｋｂ、３．０ｋｂ、２．９ｋｂ、２．８ｋｂ、２．７ｋｂ、２．６ｋｂ、２．５ｋｂ、２．４ｋｂ、２．３ｋｂ、２．２ｋｂ、２．１ｋｂ、２．０ｋｂ、１．９ｋｂ、１．８ｋｂ、１．７ｋｂ、１．６ｋｂもしくは１．５ｋｂ、またはそれよりも小さいサイズであるか、あるいは約１．５～５ｋｂ、１．５～４．７ｋｂ、１．５～４．５ｋｂ、１．５～４．０ｋｂ、１．５～３．５ｋｂ、１．５～３．０ｋｂ、１．５～２．５ｋｂ、１．５～２．０ｋｂのサイズである。
ある特定の実施形態では、本明細書において提供される発現カセットは、プロモーターに加えて１つより多くの追加の調節エレメント、例えば、転写開始または終結に関連する配列、エンハンサー配列、および効率的なＲＮＡプロセシングシグナルなどを含んでいてもよい。例示的な調節エレメントとしては、例えば、イントロン、エンハンサー、ＵＴＲ、安定エレメント、ＷＰＲＥ配列、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、翻訳後応答エレメント、マイクロＲＮＡ結合部位もしくはポリアデニル化（ポリＡ）配列、またはそれらの組合せが挙げられる。調節エレメントは、遺伝子発現の転写段階、転写後段階または翻訳段階において遺伝子発現をモジュレートするように機能し得る。ＲＮＡレベルにおいて、調節は、翻訳（例えば、翻訳のためにｍＲＮＡを安定化する安定性エレメント）、ＲＮＡ切断、ＲＮＡスプライシングおよび／または転写終結のレベルで生じ得る。さまざまな実施形態では、調節エレメントは、コード領域に、目的の細胞型における遺伝子発現選択性を増加させるか、ＲＮＡ転写物が産生される速度を増加させるか、産生されたＲＮＡの安定性を増加させるか、および／またはＲＮＡ転写物からのタンパク質合成の速度を増加させる、転写因子を動員することができる。例示的な実施形態では、本明細書において提供される発現カセットは、本明細書において提供される少なくとも１つのＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の発現カセットは、ポリＡ配列をさらに含む。適切なポリＡ配列としては、例えば、約７５ｂｐ長である人工ポリＡ（ＰＡ７５）（例えば、ＷＯ２０１８／１２６１１６を参照されたい）、ウシ成長ホルモンポリＡ、ＳＶ４０初期ポリＡシグナル、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル、ウサギベータグロビンポリＡ、ＨＳＶチミジンキナーゼポリＡ、プロタミン遺伝子ポリＡ、アデノウイルス５ ＥＩｂポリＡ、成長ホルモンポリＡまたはＰＢＧＤポリＡが挙げられる。例示的な実施形態では、本明細書において提供される発現カセットにおける使用のために適切なポリＡ配列は、ｈＧＨポリＡ（配列番号１７）または合成ポリＡ（配列番号１６）である。典型的には、ポリＡ配列は、本明細書に記載の発現カセットにおいて、ｅＴＦをコードするポリヌクレオチドの下流に位置する。
ある特定の実施形態では、本明細書において提供される発現カセットは、１つまたは複数の核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする１つまたは複数の核酸配列をさらに含む。任意のＮＬＳペプチドであって、それが結合するタンパク質の細胞核への移入を促進する該ペプチドを使用してもよい。ＮＬＳの例としては、例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ、ヌクレオプラスミンＮＬＳ、ＥＧＬ－１３ＮＬＳ、ｃ－Ｍｙｃ ＮＬＳおよびＴＵＳタンパク質ＮＬＳが挙げられる。例えば、C. Dingwall et al., J. Cell Biol. 107: 841-9 (1988)；J.P. Makkerh etal., Curr Biol. 6: 1025-7 (1996)；および M. Ray et al., Bioconjug. Chem. 26: 1004-7(2015)を参照されたい。ＮＬＳは、ｅＴＦタンパク質配列上のどこにでも位置していてもよいが、好ましい実施形態では、ｅＴＦのＮ末端またはｅＴＦのドメインにコンジュゲートされる。例示的な実施形態では、本明細書において提供される核酸カセットは、ｅＴＦのＮ末端に融合したＮＬＳを有するｅＴＦをコードする。他の実施形態では、本明細書において提供される核酸カセットは、ｅＴＦのＮ末端に融合した第１のＮＬＳ、ならびにｅＴＦのＤＢＤおよびＴＡＤドメインの間に位置する第２のＮＬＳを有するｅＴＦをコードする。
発現ベクター
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の発現カセットは、発現ベクターに組み入れられていてもよい。発現ベクターは、トランスフェクションまたは形質導入を介して、標的細胞に発現カセットを送達するために使用され得る。ベクターは、組み込みまたは非組み込みベクターであってもよく、宿主細胞のゲノムに発現カセットまたは導入遺伝子を組み込むベクターの能力を指す。発現ベクターの例としては、限定されるものではないが、（ａ）線状オリゴヌクレオチドおよび環状プラスミドを含む、核酸ベクターなどの非ウイルスベクター；ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）および細菌人工染色体（ＢＡＣまたはＰＡＣ）などの人工染色体；エピソームベクター；トランスポゾン（例えば、ＰｉｇｇｙＢａｃ）；ならびに（ｂ）レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。
発現ベクターは、線状オリゴヌクレオチドまたは環状プラスミドであってもよく、物理的および化学的方法を含むさまざまなトランスフェクション法を介して、細胞に送達され得る。物理的方法は、一般に、遺伝子材料の細胞内送達を促進するにあたり、細胞膜障壁に対抗するために物理的力を用いる送達の方法を指す。物理的方法の例としては、ニードル、弾道ＤＮＡ、電気穿孔、ソノポレーション、フォトポレーション、マグネトフェクションおよびハイドロポレーションの使用が挙げられる。化学的方法は、一般に、化学的担体が核酸分子を細胞に送達する方法を指し、無機粒子、脂質系ベクター、ポリマー系ベクターおよびペプチド系ベクターが挙げられ得る。
一部の実施形態では、発現ベクターは、カチオン性脂質（例えば、カチオン性リポソーム）を使用して、標的細胞に投与される。例えば、脂質ナノエマルジョン（例えば、乳化剤によって安定化された別の不混和性液体中の１つの不混和性液体の分散物である）または固体脂質ナノ粒子などのさまざまな種類の脂質が、遺伝子送達のために研究されている。
一部の実施形態では、発現ベクターは、ペプチド系送達ビヒクルを使用して、標的細胞に投与される。ペプチド系送達ビヒクルは、送達される遺伝子材料を保護する、特異的細胞受容体を標的化する、エンドソーム膜を破壊する、および遺伝子材料を核に送達するという利点を有し得る。一部の実施形態では、発現ベクターは、ポリマー系送達ビヒクルを使用して、標的細胞に投与される。ポリマー系送達ビヒクルは、天然タンパク質、ペプチドおよび／もしくは多糖、または合成ポリマーを含み得る。一実施形態では、ポリマー系送達ビヒクルは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。ＰＥＩは、アニオン性細胞表面残基に結合し、エンドサイトーシスを介して細胞中に組み込まれる、正に荷電した粒子にＤＮＡを凝縮させることができる。他の実施形態では、ポリマー系送達ビヒクルは、ポリ－Ｌ－リシン（ＰＬＬ）、ポリ（ＤＬ－乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（ＤＬ－ラクチド－コ－グリコシド）（ＰＬＧＡ）、ポリオルニチン、ポリアルギニン、ヒストン、プロタミン、デンドリマー、キトサン、デキストランの合成アミノ誘導体および／またはカチオン性アクリルポリマーを含み得る。ある特定の実施形態では、ポリマー系送達ビヒクルは、例えば、ＰＥＧおよびＰＬＬなどのポリマーの混合物を含み得る。
ある特定の実施形態では、発現ベクターは、遺伝子治療のために適切なウイルスベクターであってもよい。ウイルス遺伝子治療ベクターまたは遺伝子送達ベクターの好ましい特徴としては、再現性よく安定に増殖し、かつ高い力価まで精製される能力；標的化された送達を媒介する能力（例えば、他の場所に広範なベクターの播種なく、目的の組織または器官に導入遺伝子を特異的に送達する能力）；ならびに有害な副作用を誘導することなく、遺伝子送達および導入遺伝子発現を媒介する能力が挙げられ得る。
いくつかの種類のウイルス、例えば、アデノ随伴ウイルスと称される非病原性パルボウイルスは、ウイルス感染経路を利用するが、複製および毒性をもたらし得るウイルス遺伝子のその後の発現を回避することによって、遺伝子治療の目的のために操作されている。そのようなウイルスベクターは、ウイルスゲノムからコード領域のすべてまたは一部を欠失させるが、ウイルスキャプシドへのベクターゲノムのパッケージングまたは宿主クロマチンへのベクター核酸（例えば、ＤＮＡ）の組み込みなどの機能について必要であり得るインタクトなこれらの配列（例えば、末端反復配列）を残すことによって、得ることができる。
さまざまな実施形態では、適切なウイルスベクターとしては、レトロウイルス（例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型およびＤ型ウイルス）、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルスまたはＡＡＶ）、コロナウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えば、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）、プラス鎖ＲＮＡウイルス、例えば、ピコルナウイルスおよびアルファウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス）およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘およびカナリアポックス）を含む二本鎖ＤＮＡウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としは、トリ白血症肉腫ウイルス、ヒトＴリンパ向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、レンチウイルスおよびスプーマウイルスが挙げられる。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルスおよび肝炎ウイルスが挙げられる。ウイルスベクターは、宿主ゲノムに組み込まれるそれらの能力により、２つの群－組み込みおよび非組み込み－に分類され得る。オンコレトロウイルスおよびレンチウイルスは、宿主細胞のクロマチンに組み込まれ得るが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびヘルペスウイルスは、主に、細胞核中で染色体外エピソームとして存続する。
ある特定の実施形態では、適切なウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。レトロウイルスは、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスを指す。レトロウイルスの例としては、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）などのオンコレトロウイルス、およびヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）などのレンチウイルスが挙げられる。レトロウイルスゲノムは、一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡであり、シスまたはトランスで提供され得るさまざまな遺伝子を含む。例えば、レトロウイルスゲノムは、遺伝子発現、逆転写および宿主染色体への組み込みのためのエレメントとともに、２つの長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）などのシス作用性配列を含有していてもよい。他の構成成分としては、新たに形成されたビリオンへの特異的ＲＮＡパッケージングのためのパッケージングシグナル（プサイまたはψ）、および逆転写の間のプラス鎖ＤＮＡ合成の開始の部位であるポリプリントラクト（ＰＰＴ）が挙げられる。加えて、レトロウイルスゲノムは、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子を含んでいてもよい。ｇａｇ遺伝子は、構造タンパク質をコードし、ｐｏｌ遺伝子は、ｓｓＲＮＡに付随し、ウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写を行う酵素をコードし、ｅｎｖ遺伝子は、ウイルスエンベロープをコードする。一般に、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖは、ウイルスの複製およびパッケージングのためにトランスで提供される。
ある特定の実施形態では、本明細書において提供されるレトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターであってもよい。少なくとも５つの血清群または血清型のレンチウイルスが認識されている。異なる血清型のウイルスは、ある特定の細胞型および／または宿主に異なって感染し得る。レンチウイルスとしては、例えば、霊長類レトロウイルスおよび非霊長類レトロウイルスが挙げられる。霊長類レトロウイルスとしては、ＨＩＶおよびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。非霊長類レトロウイルスとしては、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）およびビスナウイルスが挙げられる。レンチウイルスまたはレンチベクターは、静止状態の細胞を形質導入することが可能であり得る。オンコレトロウイルスベクターのように、レンチベクターの設計は、シスおよびトランス作用性配列の分離に基づき得る。
ある特定の実施形態では、本出願は、最適化された治療用レトロウイルスベクターによる送達のために設計された発現ベクターを提供する。レトロウイルスベクターは、左（５’）ＬＴＲ；ウイルスのパッケージングおよび／または核移入を補助する配列；プロモーター；必要に応じて、１つまたは複数の追加の調節エレメント（例えば、エンハンサーまたはポリＡ配列など）；必要に応じて、レンチウイルス逆応答エレメント（ＲＲＥ）；ｅＴＦをコードする配列に作動可能に連結したＰＶ選択的調節エレメントを含む構築物；必要に応じて、インスレーター；ならびに右（３’）レトロウイルスＬＴＲを含むレンチウイルスであり得る。
例示的な実施形態では、本明細書において提供されるウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。ＡＡＶは、ヒトおよび一部の他の霊長類種に感染する、小さな複製欠損非エンベロープ動物ウイルスである。ＡＡＶは、ヒト疾患を引き起こすことは知られておらず、軽度の免疫応答を誘導する。ＡＡＶベクターは、宿主細胞ゲノムに組み込まれることなく、分裂細胞および静止状態細胞の両方に感染することもできる。
ＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ長である線状の一本鎖ＤＮＡからなる。ゲノムは、約１４５ｂｐ長である逆位末端反復（ＩＴＲ）配列に挟まれた２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなる。ＩＴＲは、回文構造の配列を含有する、５’末端におけるヌクレオチド配列（５’ＩＴＲ）および３’末端に位置するヌクレオチド配列（３’ＩＴＲ）からなる。ＩＴＲは、第２鎖合成のためのＤＮＡ複製の開始の間にプライマーとして機能する相補的塩基対合によりＴ字型ヘアピン構造を形成するように折り畳まれることによって、シスで機能する。２つのオープンリーディングフレームは、ビリオンの複製およびパッケージングに関与するｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする。例示的な実施形態では、本明細書において提供されるＡＡＶベクターは、ｒｅｐ遺伝子もｃａｐ遺伝子も含有しない。そのような遺伝子は、下記にさらに記載するように、ビリオンを産生するためにトランスで提供されてもよい。
ある特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、スタッファー核酸を含んでいてもよい。一部の実施形態では、スタッファー核酸は、緑色蛍光タンパク質、またはカナマイシンもしくはアンピシリンなどの抗生物質耐性遺伝子をコードし得る。ある特定の実施形態では、スタッファー核酸は、ＩＴＲ配列の外側に位置していてもよい（例えば、５’および３’ＩＴＲ配列の間に位置するｅＴＦ導入遺伝子配列および調節配列と比較して）。
ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２およびＡＡＶ１３を含むさまざまな血清型のＡＡＶが存在する。これらの血清型は、それらのトロピズム、またはそれらが感染する細胞の型が異なる。ＡＡＶは、複数の血清型由来のゲノムおよびキャプシドを含み得る（例えば、シュードタイプ）。例えば、ＡＡＶは、血清型５または血清型９由来のキャプシドにパッケージングされた血清型２のゲノム（例えば、ＩＴＲ）を含んでいてもよい。シュードタイプは、形質導入効率を改善し得るだけでなく、トロピズムを変え得る。
一部の場合では、血液脳関門を通過することができるか、またはＣＮＳの細胞に感染することができるＡＡＶ血清型が好ましい。一部の場合では、ＡＡＶ９またはそのバリアントは、ＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードする導入遺伝子に作動可能に連結したＰＶ選択的調節エレメントを含む本開示の発現カセットを送達するために使用される。一部の場合では、ＡＡＶ９またはそのバリアントは、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含む本開示の発現カセットを送達するために使用される。一部の場合では、ＡＡＶ９またはそのバリアントは、ＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードする導入遺伝子に作動可能に連結したＰＶ選択的調節エレメント、およびＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含む本開示の発現カセットを送達するために使用される。
例示的な実施形態では、本出願は、ＡＡＶによる送達のために設計された発現ベクターを提供する。ＡＡＶは、任意の血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ－ＤＪ、またはキメラ、ハイブリッドもしくはバリアントＡＡＶであり得る。ＡＡＶはまた、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）であり得る。ある特定の実施形態では、ＡＡＶによる送達のために設計された発現ベクターは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶによる送達のために設計された発現ベクターは、５’ＩＴＲ、プロモーター、ｅＴＦをコードする導入遺伝子、および３’ＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶによる送達のために設計された発現ベクターは、５’ＩＴＲ、エンハンサー、プロモーター、ｅＴＦをコードする導入遺伝子、ポリＡ配列、および３’ＩＴＲを含む。
宿主細胞
別の態様では、本発明は、本発明において開示される発現カセットまたは発現ベクターを含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞であってもよい。例示的な実施形態では、宿主細胞は、目的のウイルスによる感染に対して感受性であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養に適した、任意の細胞系を指す。
ある特定の実施形態では、本明細書において提供される宿主細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝子治療の目的のために使用されてもよい。そのような実施形態では、細胞は、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位および／または本明細書において開示されるＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードする配列を含む核酸分子または発現ベクターでトランスフェクトされ、その後、患者または対象に移植される。移植された細胞は、自家、同種または異種の起源を有し得る。臨床使用のために、細胞単離は、一般に、優良医薬品製造基準（ＧＭＰ）条件下で行われる。移植前に、細胞の品質、および微生物または他の混入物の非存在が、典型的にはチェックされ、放射線および／または免疫抑制処理などによるプレコンディショニングが行われてもよい。さらにまた、宿主細胞は、細胞の増殖および／または分化を刺激する成長因子と一緒に移植されてもよい。
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝子治療のために使用されてもよい。好ましくは、前記細胞は、哺乳動物細胞などの真核細胞であり、これらとしては、限定されるものではないが、ヒト、類人猿、チンパンジー、サルおよびオランウータンなどの非ヒト霊長類、イヌおよびネコを含む飼育動物、ならびにウマ、ウシ、ブタ、ヒツジおよびヤギなどの家畜、または限定されないがマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスターなどを含む他の哺乳動物種が挙げられる。当業者は、移植される患者または対象にしたがって、より適切な細胞を選択する。
ある特定の実施形態では、本明細書において提供される宿主細胞は、自己再生性および多能性を有する細胞、例えば、幹細胞または人工多能性幹細胞であってもよい。幹細胞は、好ましくは、間葉系幹細胞である。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞または筋細胞の少なくとも１つに分化することができ、任意の種類の組織から単離され得る。一般に、ＭＳＣは、骨髄、脂肪組織、臍帯または末梢血から単離される。それを得るための方法は、当業者に周知である。人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣとしても公知）は、成体細胞から直接生成することができる多能性幹細胞の一種である。Ｙａｍａｎａｋａらは、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃ遺伝子をマウスおよびヒトの線維芽細胞に移入し、細胞に遺伝子を発現させることによって、ｉＰＳ細胞を誘導した（国際公開第２００７／０６９６６６号）。Ｔｈｏｍｓｏｎらは、その後、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃの代わりに、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８を使用して、ヒトｉＰＳ細胞を生成した（国際公開第２００８／１１８８２０号）。
例示的な実施形態では、本明細書において提供される宿主細胞は、パッケージング細胞である。前記細胞は、接着細胞または浮遊細胞であり得る。パッケージング細胞、およびヘルパーベクターまたはウイルスまたはＤＮＡ構築物（複数可）は、ウイルスベクターの完全な複製およびパッケージングのために必要とされるすべての欠けた機能をトランスで一緒に提供する。
好ましくは、前記パッケージング細胞は、サル、ヒト、イヌおよびげっ歯類の細胞を含む哺乳動物細胞などの真核細胞である。ヒト細胞の例は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（国際公開第０１／３８３６２号）、ＭＲＣ－５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１７１）、ＷＩ－３８（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－７５）、ＨＥＫ－２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３）、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）および胎仔アカゲザル肺細胞（ＡＴＣＣ ＣＬ－１６０）である。非ヒト霊長類細胞の例は、Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ８１）、ＣＯＳ－１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５０）またはＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５１）である。イヌ細胞の例は、ＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－３４）である。げっ歯類細胞の例は、ＢＨＫ２１－Ｆ、ＨＫＣＣ細胞またはＣＨＯ細胞などのハムスター細胞である。
哺乳動物供給源の代替として、本発明における使用のための細胞系は、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラまたはキジなどのトリ供給源に由来していてもよい。トリ細胞系の例としては、トリ胚性幹細胞（国際公開第０１／８５９３８号および国際公開第０３／０７６６０１号）、不死化アヒル網膜細胞（国際公開第２００５／０４２７２８号）、およびニワトリ細胞（国際公開第２００６／１０８８４６号）またはＥＢ６６細胞系（国際公開第２００８／１２９０５８号および国際公開第２００８／１４２１２４号）などのアヒル細胞を含むトリ胚性幹細胞由来細胞が挙げられる。
別の実施形態では、前記宿主細胞は、ＳＦ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１７１１）、Ｓｆ２１細胞（ＩＰＬＢ－Ｓｆ２１）、ＭＧ１細胞（ＢＴＩ－ＴＮ－ＭＧ１）またはＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ（商標）細胞（ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４）などの昆虫細胞である。
ある特定の実施形態では、本発明の組換えＡＡＶベクター／ゲノム（例えば、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位および／またはＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードする配列を含む）を含む本明細書において提供される宿主細胞は、例えば、（ｉ）ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードするがＩＴＲ配列を有さない核酸構築物（例えば、ＡＡＶヘルパープラスミド）；ならびに／または（ｉｉ）ＡＡＶ複製のために必要なアデノウイルス機能を提供する核酸構築物（例えば、プラスミド）などの１つまたは複数の追加の核酸構築物をさらに含んでいてもよい。例示的な実施形態では、本明細書において提供される宿主細胞は、ｉ）本明細書において提供されるＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位および／またはＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードする配列を含む発現ベクター（すなわち、組換えＡＡＶゲノム）；ｉｉ）ＩＴＲ配列を有さない、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする核酸構築物；ならびにｉｉｉ）アデノウイルスヘルパー遺伝子（下記にさらに記載する）を含む核酸構築物を含む。
ある特定の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子およびアデノウイルスヘルパー遺伝子を、単一プラスミド上で組み合わせることができる（Blouin V et al. J Gene Med. 2004; 6(suppl): S223-S228；Grimm D. etal. Hum. Gene Ther. 2003; 7: 839-850）。したがって、別の例示的な実施形態では、本明細書において提供される宿主細胞は、ｉ）本明細書において開示されるＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位および／またはＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードする配列を含む発現ベクター（すなわち、組換えＡＡＶゲノム）；ならびにｉｉ）ＩＴＲ配列を有さない、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードし、アデノウイルスヘルパー遺伝子をさらに含むプラスミドを含む。
別の実施形態では、本明細書において提供される宿主細胞は、ａ）本明細書において開示されるＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位および／またはＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードする配列を含む発現ベクター（すなわち、組換えＡＡＶゲノム）；ｂ）ＩＴＲ配列を有さない、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードするプラスミド；ならびにｃ）アデノウイルスヘルパー遺伝子Ｅ２ａ、Ｅ４およびＶＡのＲＮＡを含むプラスミドを含み、ここで、共トランスフェクションは、アデノウイルスＥ１遺伝子を構成的に発現し、それをトランス補完する、細胞、好ましくは、ＨＥＫ－２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３）のような哺乳動物細胞において行われる。
ある特定の実施形態では、ＡＡＶベクターの大スケールでの産生のために適切な宿主細胞は、組換えバキュロウイルスの組合せで感染し得る昆虫細胞である（Urabe et al. Hum. Gene Ther. 2002; 13: 1935-1943）。例えば、ＳＦ９細胞を、パッケージングされるＡＡＶ ｒｅｐ、ＡＡＶ ｃａｐおよびＡＡＶベクターをそれぞれ発現する３つのバキュロウイルスベクターで共感染させてもよい。組換えバキュロウイルスベクターは、ウイルスの複製および／またはパッケージングのために必要なウイルスヘルパー遺伝子機能を提供する。
本発明による遺伝子治療のためのビリオンの構築および産生のためのさらなるガイダンスは、ViralVectors for Gene Therapy, Methods and Protocols. Series: Methods in MolecularBiology, Vol. 737. Merten and Al-Rubeai (Eds.); 2011 Humana Press (Springer)；GeneTherapy. M. Giacca. 2010 Springer-Verlag; Heilbronn R. and Weger S. ViralVectors for Gene Transfer: Current Status of Gene Therapeutics. In: DrugDelivery, Handbook of Experimental Pharmacology 197; M. Schafer-Korting (Ed.).2010 Springer-Verlag; pp. 143-170；Adeno-Associated Virus: Methods andProtocols. R. O. Snyder and P. Moulllier (Eds). 2011 Humana Press (Springer)；BunningH. et al. Recent developments in adeno-associated virus technology. J. GeneMed. 2008; 10:717-733；およびAdenovirus: Methods and Protocols. M. Chillon and A.Bosch (Eds.); Third. Edition. 2014 Humana Press (Springer)において見出され得る。
ビリオンおよびビリオンを産生する方法
ある特定の実施形態では、本出願は、本発明において開示されるＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位および／またはＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードする配列を含むウイルスベクターを含むウイルス粒子を提供する。「ウイルス粒子」および「ビリオン」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、キャプシド内、場合により、例えば、レトロウイルスについて、キャプシドを取り囲む脂質エンベロープ内にパッケージングされたウイルスゲノム（例えば、ウイルス発現ベクター）を含む、感染性の、典型的には複製欠損性のウイルス粒子に関する。「キャプシド」は、ウイルスゲノムがパッケージングされる構造物を指す。キャプシドは、タンパク質で作られたいくつかのオリゴマー構造サブユニットからなる。例えば、ＡＡＶは、３つのキャプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の相互作用によって形成される正二十面体キャプシドを有する。一実施形態では、本明細書において提供されるビリオンは、ＰＶ選択的調節エレメントおよびＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含むＡＡＶベクターにパッケージングすることによって得られる、組換えＡＡＶビリオンまたはｒＡＡＶビリオンである。別の実施形態では、本明細書において提供されるビリオンは、本明細書に記載のＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードする配列に作動可能に連結されたＰＶ選択的調節エレメントを含むＡＡＶベクターをタンパク質シェルにパッケージングすることによって得られる、組換えＡＡＶビリオンまたはｒＡＡＶビリオンである。別の実施形態では、本明細書において提供されるビリオンは、本明細書に記載のＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードする配列に作動可能に連結されたＰＶ選択的調節エレメントおよびＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含むＡＡＶベクターをタンパク質シェルにパッケージングすることによって得られる、組換えＡＡＶビリオンまたはｒＡＡＶビリオンである。
ある特定の実施形態では、本明細書において提供される組換えＡＡＶビリオンは、特定のＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶゲノムを、同じ特定の血清型のＡＡＶに対応する天然のＣａｐタンパク質によって形成されるウイルス粒子にキャプシド封入することによって調製されてもよい。他の実施形態では、本明細書において提供されるＡＡＶウイルス粒子は、異なる血清型由来のタンパク質にパッケージングされた所与のＡＡＶ血清型のＩＴＲ（複数可）を含むウイルスベクターを含む。例えば、Bunning H et al. J Gene Med 2008; 10: 717-733を参照されたい。例えば、所与のＡＡＶ血清型由来のＩＴＲを有するウイルスベクターは、ａ）同じもしくは異なるＡＡＶ血清型に由来するキャプシドタンパク質で構成されるウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲおよびＡＡＶ９のキャプシドタンパク質；ＡＡＶ２のＩＴＲおよびＡＡＶ８のキャプシドタンパク質；など）；ｂ）異なるＡＡＶ血清型もしくは変異体由来のキャプシドタンパク質の混合物で構成されるモザイクウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ１およびＡＡＶ９のキャプシドタンパク質を有するＡＡＶ２のＩＴＲ）；ｃ）異なるＡＡＶ血清型もしくはバリアント間でのドメイン交換によってトランケートされたキャプシドタンパク質で構成されるキメラウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ９ドメインを有するＡＡＶ８のキャプシドタンパク質を有するＡＡＶ２のＩＴＲ）；またはｄ）標的細胞特異的受容体とのストリンジェントな相互作用を可能にする選択的結合ドメインを提示するように操作された標的化ウイルス粒子（例えば、ペプチドリガンドの挿入によって遺伝的にトランケートされたＡＡＶ９のキャプシドタンパク質を有するＡＡＶ５のＩＴＲ；またはキャプシド表面へのペプチドリガンドのカップリングによって非遺伝的に改変されたＡＡＶ９のキャプシドタンパク質）にパッケージングされてもよい。
当業者は、本明細書において提供されるＡＡＶビリオンが、任意のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質を含んでいてもよいことを理解する。一実施形態では、ウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からなる群から選択されるＡＡＶ血清型由来のキャプシドタンパク質を含み、これらは、ＣＮＳへの送達のためにより適切である（M. Hocquemiller et al., Hum Gene Ther 27(7): 478-496 (2016)）。特定の実施形態では、ウイルス粒子は、本発明の発現カセットを含み、ここで、発現カセットの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの配列は、ＡＡＶ２血清型のものであり、キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ９血清型のものである。
トランスフェクション、安定な細胞系生成、ならびにアデノウイルス－ＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルス－ＡＡＶハイブリッド（Conway, J E et al., (1997) J. Virology 71(11):8780-8789）およびバキュロウイルス－ＡＡＶハイブリッドを含む感染性ハイブリッドウイルス産生系を含む多数の方法が、ｒＡＡＶビリオンの産生のために当技術分野において公知である。ｒＡＡＶウイルス粒子の産生のためのｒＡＡＶ産生培養は、１）例えば、ＨｅＬａ、Ａ５４９もしくは２９３細胞などのヒト由来細胞系、またはバキュロウイルス産生系の場合、ＳＦ－９などの昆虫由来細胞系を含む、適切な宿主細胞；２）野生型もしくは変異体アデノウイルス（温度感受性アデノウイルスなど）、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミド構築物によって提供される、適切なヘルパーウイルス機能；３）ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐの遺伝子、ならびに遺伝子産物；４）ＡＡＶのＩＴＲ配列に挟まれた導入遺伝子（例えば、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位、本明細書に記載のＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードする配列、および／またはＰＶ選択的プロモーターの１つまたは複数を含む）；ならびに５）ｒＡＡＶ産生を支持するための適切な培地および培地構成成分のすべてを必要とする。
さまざまな実施形態では、本明細書に記載の宿主細胞は、以下の３つの成分：（１）ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、（２）ヘルパー機能を提供する遺伝子、ならびに（３）ＩＴＲに挟まれた導入遺伝子（例えば、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位、本明細書に記載のＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードする配列、および／またはＰＶ選択的プロモーターの１つまたは複数を含む）を含む。ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、およびヘルパー機能を提供する遺伝子は、前記遺伝子を、例えば、プラスミドなどベクターに組み込み、前記ベクターを宿主細胞に導入することによって、細胞に導入され得る。ｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子およびヘルパー機能遺伝子は、同じプラスミドまたは異なるプラスミドに組み入れられてもよい。好ましい実施形態では、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子は、１つのプラスミド中に組み入れられ、ヘルパー機能を提供する遺伝子は、別のプラスミド中に組み入れられる。ビリオン産生のための宿主細胞の作出のためのさまざまなプラスミド（例えば、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、ヘルパー機能、または導入遺伝子を含む）は、当技術分野において周知の任意の適切な方法を使用することによって、細胞に導入することができる。トランスフェクション法の例としては、限定されるものではないが、リン酸カルシウムによる共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリブレン、電気穿孔、マイクロインジェクション、リポソーム媒介融合、リポフェクション、レトロウイルス感染および遺伝子銃トランスフェクションが挙げられる。ある特定の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、ヘルパー機能、ならびにＩＴＲに挟まれた導入遺伝子を提供するプラスミドは、細胞に同時に導入され得る。別の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパー機能を提供するプラスミドは、導入遺伝子を含むプラスミドの導入の前または後に、細胞中に導入され得る。例示的な実施形態では、細胞は、３つのプラスミド：（１）ＩＴＲに挟まれた導入遺伝子（例えば、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位、本明細書に記載のＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードする配列、および／またはＰＶ選択的プロモーターの１つまたは複数を含む）を含むプラスミド、（２）ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含むプラスミド、ならびに（３）ヘルパー機能を提供する遺伝子を含むプラスミドを同時にトランスフェクトされる（例えば、三重トランスフェクション法）。例示的な宿主細胞は、２９３、Ａ５４９またはＨｅＬａ細胞であり得る。
他の実施形態では、（１）ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、（２）ヘルパー機能を提供する遺伝子、ならびに（３）ＩＴＲに挟まれた導入遺伝子（例えば、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位、本明細書に記載のＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードする配列、および／またはＰＶ選択的プロモーターの１つまたは複数を含む）の１つまたは複数は、エピソームで、および／またはパッケージング細胞のゲノムに組み込まれてのいずれかで、パッケージング細胞によって保有されていてもよい。一実施形態では、宿主細胞は、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパー機能が宿主細胞中で安定に維持されるパッケージング細胞であってもよく、宿主細胞は、ＩＴＲに挟まれた導入遺伝子（例えば、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位、本明細書に記載のＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードする配列、および／またはＰＶ選択的プロモーターの１つまたは複数を含む）を含有するプラスミドで、一過的にトランスフェクトされる。別の実施形態では、宿主細胞は、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子が宿主細胞中で安定に維持されるパッケージング細胞であり、宿主細胞は、ＩＴＲに挟まれた導入遺伝子（例えば、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位、本明細書に記載のＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードする配列、および／またはＰＶ選択的プロモーターの１つまたは複数を含む）を含有するプラスミド、およびヘルパー機能を含有するプラスミドで、一過的にトランスフェクトされる。別の実施形態では、宿主細胞は、ヘルパー機能が宿主細胞中で安定に維持されるパッケージング細胞であってもよく、宿主細胞は、ＩＴＲに挟まれた導入遺伝子（例えば、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位、本明細書に記載のＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードする配列、および／またはＰＶ選択的プロモーターの１つまたは複数を含む）を含有するプラスミド、ならびにｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含有するプラスミドで、一過的にトランスフェクトされる。別の実施形態では、宿主細胞は、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、ヘルパー機能、ならびにＩＴＲに挟まれた導入遺伝子配列（例えば、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位、本明細書に記載のＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードする配列、および／またはＰＶ選択的プロモーターの１つまたは複数を含む）で安定にトランスフェクトされた産生細胞系であってもよい。例示的なパッケージング細胞および産生細胞は、２９３、Ａ５４９またはＨｅＬａ細胞に由来していてもよい。
別の実施形態では、産生細胞系は、Ｒｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質を提供するバキュロウイルス発現ベクターに感染した昆虫細胞系（典型的には、Ｓｆ９細胞）である。この系は、アデノウイルスヘルパー遺伝子を必要としない（Ayuso E, et al., Curr. Gene Ther. 2010, 10:423-436）。
「ｃａｐタンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、ネイティブＡＡＶ Ｃａｐタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）の少なくとも１つの機能活性を有するポリペプチドを指す。ｃａｐタンパク質の機能活性の例としては、キャプシドの形成を誘導する能力、一本鎖ＤＮＡの蓄積を促進する能力、キャプシドへのＡＡＶ ＤＮＡのパッケージング（すなわち、キャプシド封入）を促進する能力、細胞受容体に結合する能力、およびビリオンの宿主細胞への進入を促進する能力が挙げられる。原則として、任意のＣａｐタンパク質を、本発明の文脈において使用することができる。
ｃａｐタンパク質は、ＡＡＶウイルスの宿主トロピズム、細胞、組織または器官特異性、受容体の利用、感染効率、および免疫原性に対する効果を有することが報告されている。したがって、ｒＡＡＶにおける使用のためのＡＡＶ ｃａｐは、例えば、対象の種（例えば、ヒトまたは非ヒト）、対象の免疫学的状態、長期もしくは短期処置に対する対象の適合性、または特定の治療適用（例えば、特定の疾患もしくは障害の処置、または特定の細胞、組織もしくは器官への送達）を考慮して選択され得る。ある特定の実施形態では、ｃａｐタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９の血清型からなる群のＡＡＶに由来する。例示的な実施形態では、ｃａｐタンパク質は、ＡＡＶ９に由来する。
一部の実施形態では、本発明の方法における使用のためのＡＡＶ Ｃａｐは、前述のＡＡＶ ｃａｐまたはそのコード核酸の１つの変異誘発によって（すなわち、挿入、欠失または置換によって）、生成することができる。一部の実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐは、前述のＡＡＶ ｃａｐの１つまたは複数と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％、またはそれより高く類似している。
一部の実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐは、前述のＡＡＶ ｃａｐの２、３、４、またはそれよりも多くに由来するドメインを含むキメラである。一部の実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐは、２もしくは３つの異なるＡＡＶまたは組換えＡＡＶが起源のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３モノマーのモザイクである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は、前述のｃａｐの２つ以上を含む。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンにおける使用のためのＡＡＶ ｃａｐは、異種配列または他の改変を含有するように操作される。例えば、選択的標的化または免疫回避を付与するペプチドまたはタンパク質配列が、ｃａｐタンパク質に操作されてもよい。あるいは、または加えて、ｃａｐは、ｒＡＡＶの表面がポリエチレングリコール化（すなわち、ペグ化）されるように化学的に改変されてもよく、これは、免疫回避を促進し得る。ｃａｐタンパク質はまた、（例えば、その天然の受容体結合を除去するため、または免疫原性エピトープをマスクするために）変異誘発されてもよい。
「ｒｅｐタンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、ネイティブＡＡＶ ｒｅｐタンパク質（例えば、ｒｅｐ ４０、５２、６８、７８）の少なくとも１つの機能活性を有するポリペプチドを指す。ｒｅｐタンパク質の機能活性の例としては、ＡＡＶのＤＮＡ複製起点の認識、結合およびニッキングによりＤＮＡの複製を促進すること、ならびにＤＮＡヘリカーゼ活性を含む、タンパク質の生理学的機能に関連する任意の活性が挙げられる。追加の機能としては、ＡＡＶ（または他の異種）プロモーターからの転写のモジュレーション、および宿主染色体へのＡＡＶ ＤＮＡの部位特異的組み込みが挙げられる。特定の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０またはＡＡＶｒｈ１０由来；より好ましくは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からなる群から選択されるＡＡＶ血清型由来であってもよい。
一部の実施形態では、本発明の方法における使用のためのＡＡＶ ｒｅｐタンパク質は、前述のＡＡＶ ｒｅｐまたはそのコード核酸の１つの変異誘発によって（すなわち、挿入、欠失または置換によって）、生成することができる。一部の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐは、前述のＡＡＶ ｒｅｐの１つまたは複数と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％、またはそれより高く類似している。
「ヘルパー機能」または「ヘルパー遺伝子」という表現は、本明細書で使用される場合、ＡＡＶが複製のために依存するウイルスタンパク質を指す。ヘルパー機能としては、限定されないが、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、ステージ特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成、およびＡＡＶカプシドアセンブリーに関与するタンパク質を含む、ＡＡＶ複製のために必要なされるタンパク質が挙げられる。ウイルスに基づくアクセサリー機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）およびワクシニアウイルスなどの公知のヘルパーウイルスのいずれかに由来し得る。ヘルパー機能としては、限定されないが、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡおよびＥ４、またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬＢ、ＵＬ５２およびＵＬ２９、ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼが挙げられる。好ましい実施形態では、ＡＡＶが複製のために依存するタンパク質は、アデノウイルスに由来する。
一部の実施形態では、本発明の方法における使用のための、ＡＡＶが複製のために依存するウイルスタンパク質は、前述のウイルスタンパク質またはそのコード核酸の１つの変異誘発によって（すなわち、挿入、欠失または置換によって）、生成することができる。一部の実施形態では、ウイルスタンパク質は、前述のウイルスタンパク質の１つまたは複数と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％、またはそれより高く類似している。
ＡＡＶが複製のために依存するｃａｐタンパク質、ｒｅｐタンパク質およびウイルスタンパク質の機能をアッセイするための方法は、当技術分野において周知である。
目的の導入遺伝子（例えば、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位、本明細書に記載のＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードする配列、および／またはＰＶ選択的プロモーターの１つまたは複数を含む）を発現させるための宿主細胞を、ＡＡＶビリオンのアセンブリーのため適切な条件下で成長させてもよい。ある特定の実施形態では、宿主細胞を、ＡＡＶビリオンのアセンブリーおよび培地中へのビリオンの放出を促進するために、適切な期間にわたって成長させる。一般に、細胞を、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、または最長で約１０日間にわたって成長させてもよい。約１０日後（または使用する培養条件および特定の宿主細胞に依存して、より早く）、産生のレベルは、一般に、有意に減少する。一般に、培養の時間は、ウイルス産生の観点から測定される。例えば、ＡＡＶの場合では、ウイルス産生は、一般に、本明細書に記載されるように、適切な宿主細胞においてヘルパーウイルス機能を供給する際に開始する。一般に、細胞は、ヘルパーウイルス感染後（またはウイルス産生が開始した後）の約４８～約１００時間、好ましくは、約４８～約９６時間、好ましくは、約７２～約９６時間、好ましくは、約６８～約７２時間に回収される。
ｒＡＡＶ産生培養物は、用いられる特定の宿主細胞に適切な種々の条件（広い温度範囲にわたって、種々の期間にわたってなど）下で成長させることができる。ｒＡＡＶ産生培養物は、例えば、ローラーボトル、ホローファイバーフィルター、マイクロキャリアおよび充填床または流動床バイオリアクターなどの適切な接着依存性容器において培養することができる接着依存性培養物を含む。ｒＡＡＶベクター産生培養物はまた、例えば、スピナーフラスコ、撹拌タンクバイオリアクター、およびＷａｖｅバッグシステムなどの使い捨てシステムを含む、さまざまな方法で培養することができる、ＨｅＬａ、２９３およびＳＦ－９細胞などの浮遊に適応した宿主細胞を含んでいてもよい。
当技術分野において公知の適切な培地を、ｒＡＡＶビリオンの産生のために使用してもよい。これらの培地としては、限定されないが、改変イーグル培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む、Ｈｙｃｌｏｎｅ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＪＲＨが製造する培地が挙げられ、これらのそれぞれは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ産生培養培地は、０．５％～２０％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）のレベルで血清または血清由来組換えタンパク質が補充されていてもよい。あるいは、ｒＡＡＶベクターは、動物由来産物を有さない培地とも称され得る、無血清条件で産生されてもよい。
ＡＡＶビリオン産生を可能にするために宿主細胞を培養した後、次いで、得られたビリオンを、回収および精製してもよい。ある特定の実施形態では、ＡＡＶビリオンは、（１）宿主細胞の溶解によって産生培養物の宿主細胞から、および／または（２）トランスフェクション後一定期間の後、好ましくは、７２時間後に、前記細胞の培養培地から、得ることができる。ｒＡＡＶビリオンは、産生培養物由来の消費された培地から回収され得るが、ただし、細胞は、インタクトな細胞から培地へのｒＡＡＶビリオンの放出を引き起こす条件下で培養される（例えば、米国特許第６，５６６，１１８号を参照されたい）。細胞を溶解させる適切な方法も、当技術分野において公知であり、例えば、複数回の凍結／解凍サイクル、超音波処理、微小流体化、ならびに界面活性剤および／またはプロテアーゼなどの化学物質による処理が挙げられる。
回収後、ｒＡＡＶビリオンを、精製してもよい。「精製された」という用語は、本明細書で使用される場合、ｒＡＡＶビリオンが天然に存在する場所またはそれらが最初にそこから調製された場所にも存在し得る他の構成成分の少なくとも一部が欠けているｒＡＡＶビリオンの調製物を含む。したがって、例えば、精製されたｒＡＡＶビリオンは、供給源混合物、例えば、培養溶解物または産生培養物の上清からそれを富化するための単離技法を使用して、調製されてもよい。富化は、例えば、溶液中に存在するＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）もしくはゲノムコピー（ｇｃ）の割合によって、または感染力によるなどの種々の方法で測定することができ、あるいは、供給源混合物中に存在する第２の潜在的に干渉する物質、例えば、ヘルパーウイルス、培地構成成分などを含む産生培養混入物またはプロセス内混入物を含む混入物に関して測定することができる。
ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ産生培養回収物は、宿主細胞デブリを除去するために清澄化されてもよい。一部の実施形態では、産生培養回収物は、遠心分離、または０．２μｍもしくはそれよりも大きい細孔サイズのフィルター（例えば、酢酸セルロースフィルターまたは一連のデプスフィルター）を通す濾過などの種々の標準的な技法を使用して、清澄化されてもよい。
ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ産生培養回収物は、産生培養物中に存在する任意の高分子量ＤＮＡを消化するＢｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）でさらに処理される。一部の実施形態では、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）消化は、標準的な条件下、例えば、３０分間～数時間の期間にわたって、周囲～３７℃の範囲の温度で、１～２．５単位／ｍｌの最終濃度のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）で行われる。
ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンを、以下の精製ステップ：平衡遠心分離；フロースルーアニオン交換濾過；ｒＡＡＶ粒子を濃縮するための接線流濾過（ＴＦＦ）；アパタイトクロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉；ヘルパーウイルスの熱不活性化；疎水性相互作用クロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉；サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による緩衝液交換；ナノ濾過；およびアニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーもしくはアフィニティークロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉の１つまたは複数を使用して、単離または精製してもよい。これらのステップは、単独で、さまざまな組合せで、または異なる順序で使用してもよい。ｒＡＡＶ粒子を精製するための方法は、例えば、Xiao et al., (1998) Journal of Virology 72:2224-2232；米国特許第６，９８９，２６４号および同第８，１３７，９４８号；ならびに国際公開第２０１０／１４８１４３号において見出される。
ある特定の実施形態では、精製されたＡＡＶビリオンは、ＰＢＳに対して透析し、濾過し、－８０℃で貯蔵することができる。ウイルスゲノムの力価は、検量線として線状化プラスミドＤＮＡを使用する定量的ＰＣＲによって決定することができる（例えば、Lock M, et al., Hum. Gene Ther. 2010; 21:1273-1285を参照されたい）。
医薬組成物
ある特定の実施形態では、本出願は、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位および／またはＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードする配列、ならびに薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。他の実施形態では、本出願は、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位および／またはＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードする配列、ならびに薬学的に許容される担体を含むビリオンを提供する。例示的な実施形態では、そのような組成物は、遺伝子治療適用のために適切である。医薬組成物は、好ましくは、製造および貯蔵条件下で、無菌かつ安定である。無菌溶液は、例えば、無菌濾過メンブレンを通す濾過によって達成されてもよい。
医薬組成物中の許容される担体および賦形剤は、好ましくは、用いられる投与量および濃度でレシピエントに非毒性である。許容される担体および賦形剤としては、リン酸塩、クエン酸塩、ＨＥＰＥＳおよびＴＡＥなどのバッファー、アスコルビン酸およびメチオニンなどの抗酸化剤、塩化ヘキサメトニウム、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、レゾルシノールおよび塩化ベンザルコニウムなどの保存剤、ヒト血清アルブミン、ゼラチン、デキストランおよび免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、ヒスチジンおよびリシンなどのアミノ酸、ならびにグルコース、マンノース、スクロースおよびソルビトールなどの炭水化物が挙げられ得る。本開示の医薬組成物は、注射用製剤の形態で非経口投与することができる。注射のための医薬組成物は、ビヒクルとして無菌溶液または任意の薬学的に許容される液体を使用して、製剤化することができる。薬学的に許容されるビヒクルとしては、限定されるものではないが、滅菌水および生理的食塩水が挙げられる。
本開示の医薬組成物は、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン－マイクロカプセル、およびポリメチルメタクリレートマイクロカプセルなどのマイクロカプセルに調製されてもよい。本開示の医薬組成物はまた、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセルなどの他の薬物送達系に調製されてもよい。遺伝子治療のための医薬組成物は、許容される希釈剤中にあり得るか、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放性マトリックスを含み得る。
本明細書において提供される医薬組成物は、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、実質内投与、髄腔内投与、大槽内投与、脳室内投与または腹腔内投与のために製剤化されてもよい。医薬組成物はまた、経鼻、スプレー、経口、エアロゾル、直腸もしくは膣投与のために製剤化されてもよく、またはそれらを介して投与されてもよい。一実施形態では、本明細書において提供される医薬組成物は、ＣＮＳまたは脳脊髄液（ＣＳＦ）に、すなわち、実質内注射、髄腔内注射、大槽内注射または脳室内注射によって、投与される。組織標的は、例えば、ＣＮＳに特異的であってもよく、またはいくつかの組織、例えば、筋肉およびＣＮＳ組織の組合せであってもよい。例示的な組織または他の標的としては、肝臓、骨格筋、心筋、脂肪蓄積物、腎臓、肺、血管内皮、上皮、造血細胞、ＣＮＳおよび／またはＣＳＦが挙げられ得る。好ましい実施形態では、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位および／またはＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦを含む本明細書において提供される医薬組成物は、ＣＮＳまたはＣＳＦ注射に、すなわち、実質内注射、髄腔内注射、大槽内注射または脳室内注射によって、投与される。これらの方法の１つまたは複数を、本開示の医薬組成物を投与するために使用してもよい。
ある特定の実施形態では、本明細書において提供される医薬組成物は、「有効量」または「治療有効量」を含む。本明細書で使用される場合、そのような量は、所望の治療結果、例えば、ＳＣＮ１Ａ発現のレベルを増加させること、ならびに／または発作の頻度および／もしくは持続時間を減少させることを達成するために必要な投与量および期間において有効な量を指す。
本開示の医薬組成物の投与量は、投与の経路、処置される疾患、および対象の身体的特徴（例えば、年齢、体重、全体的健康）を含む因子に依存する。投与量は、最適な治療応答を提供するために調整され得る。典型的には、投与量は、著しい毒性を誘導することなく、疾患を有効に処置する量であり得る。一実施形態では、本明細書において提供されるＡＡＶベクターは、５×１０１１～１×１０１４ｇｃ／ｋｇ（患者の体重１キログラムあたりのゲノムコピー数（ｇｃ／ｋｇ））の範囲内の量または用量で、ＳＣＮ１Ａ欠損（例えば、ドラベ症候群を含む）の処置のために、患者に投与することができる。より特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、約５×１０１１ｇｃ／ｋｇ～約３×１０１３ｇｃ／ｋｇ、もしくは約１×１０１２～約１×１０１４ｇｃ／ｋｇ、もしくは約１×１０１２～約１×１０１３ｇｃ／ｋｇの範囲内、または約５×１０１１ｇｃ／ｋｇ、１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、１．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、２．０×１０１２ｇｃ／ｋｇ、２．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、３×１０１２ｇｃ／ｋｇ、３．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、４×１０１２ｇｃ／ｋｇ、４．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、５．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、６×１０１２ｇｃ／ｋｇ、６．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、７×１０１２ｇｃ／ｋｇ、７．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、８×１０１２ｇｃ／ｋｇ、８．５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、９×１０１２ｇｃ／ｋｇ、または９．５×１０１２ｇｃ／ｋｇを含む量で投与される。ｇｃ／ｋｇは、例えば、ｑＰＣＲまたはデジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって決定されてもよい（例えば、M. Lock et al, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr;25(2): 115-25を参照されたい）。別の実施形態では、本明細書で提供されるＡＡＶベクターは、１×１０９～１×１０１１ｉｕ／ｋｇ（ベクターの感染単位（ｉｕ）／対象または患者の体重（ｋｇ））の範囲内の量または用量で、ＳＣＮ１Ａ欠損（例えば、ドラベ症候群を含む）の処置のために、患者に投与することができる。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、必要により、単位用量で形成されていてもよい。そのような単一投与単位は、約１×１０９ｇｃ～約１×１０１５ｇｃを含有していてもよい。
本開示の医薬組成物は、それを必要とする対象に、例えば、１または複数回（例えば、１～１０回またはそれよりも多く）、毎日、毎週、毎月、年に２回、毎年、または医学的な必要により、投与されてもよい。例示的な実施形態では、単回投与が十分である。一実施形態では、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位および／またはＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードする発現カセットを含む医薬組成物は、ヒト対象における使用に適切であり、実質内注射、髄腔内注射、大槽内注射または脳室内注射によって投与される。一実施形態では、医薬組成物は、ボーラス注射によって末梢静脈を介して送達される。他の実施形態では、医薬組成物は、約１０分間（±５分間）にわたる、約２０分間（±５分間）にわたる、約３０分間（±５分間）にわたる、約６０分間（±５分間）にわたる、または約９０分間（±１０分間）にわたる注入によって、末梢静脈を介して送達される。
別の態様では、本出願は、１つまたは複数の容器中に、本明細書に記載の核酸分子、ベクター、宿主細胞、ビリオン、または医薬組成物を含むキットをさらに提供する。キットは、キット内に含有される核酸分子、ベクター、宿主細胞またはビリオンを患者に投与する方法を記載する指示または包装材料を含んでいてもよい。キットの容器は、任意の適切な材料、例えば、ガラス、プラスチック、金属などの容器、および任意の適切なサイズ、形状または構成の容器であってもよい。ある特定の実施形態では、キットは、適切な液体または溶液形態で、核酸分子、ベクター、宿主細胞、ビリオンまたは医薬組成物を含有する、１つもしくは複数のアンプルまたはシリンジを含んでいてもよい。
処置の方法
一態様では、本出願は、本明細書において開示されるＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦを使用するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本出願は、細胞におけるＳＣＮ１Ａの発現を上方調節するために、本明細書において開示されるＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子を投与するための方法を提供する。さまざまな実施形態では、本明細書において開示されるＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで、細胞におけるＳＣＮ１Ａの発現をモジュレートするために使用されてもよい。
ある特定の実施形態では、本出願は、本明細書において開示されるＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子を、それを必要とする対象に投与することによる、ＳＣＮ１Ａに関連する疾患または障害を処置するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、障害は、中枢神経系障害である。例示的な実施形態では、疾患または障害は、ＳＣＮ１Ａのハプロ不全に関連する。ある特定の実施形態では、障害は、ＳＣＮ１Ａハプロ不全に関連するてんかんである。ある特定の実施形態では、ハプロ不全は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の機能欠失変異についてヘテロ接合性である対象の結果である。ある特定の実施形態では、障害は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子における、挿入、欠失または置換に関連するてんかんである。ある特定の実施形態では、障害は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子における点変異に関連するてんかんである。ある特定の実施形態では、疾患または障害を処置する方法は、ＳＣＮ１Ａの過少発現が、標準的な医療によって、修正されるか、健康な個体のレベルの範囲内に入るか、または定義された正常範囲内に入るように、本明細書において開示されるＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子を投与することを含む。ある特定の実施形態では、本明細書において開示される方法は、ＳＣＮ１Ａの異常な発現をもたらす１つまたは複数の変異を含む内因性ＳＣＮ１Ａに関連する疾患または障害を処置するために使用される。
ある特定の実施形態では、本出願は、本明細書において開示されるＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子をそれを必要とする対象に投与することによる、疾患または障害に関連する症状を軽減させるための方法を提供する。
例示的な実施形態では、本出願は、それを必要とする対象に、ＳＣＮ１Ａ遺伝子またはそのタンパク質産物であるＮａｖ１．１の発現を選択的に上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子を投与することによる、ＳＣＮ１Ａにおける変異（例えば、点変異、置換、欠失、逆位など）、Ｎａｖ１．１における欠損および／またはＮａｖ１．１の低減された活性に関連する疾患、障害または症状を処置するための方法を提供する。電位依存性ナトリウムイオンチャネルは、横紋筋およびニューロン組織における活動電位の発生および伝播のために重要である。電位依存性ナトリウムイオンチャネルは、１つの大きな中央の孔形成グリコシル化アルファサブユニットおよび２つのより小さな補助的ベータサブユニットからなる異種複合体である。ＳＣＮ１Ａ遺伝子によってコードされる大きなアルファサブユニットのＮａｖ１．１サブユニットは、ドラベ症候群などの種々の疾患または障害に関連している。Ｎａｖ１．１は、ニューロンにおいて発現され、ＳＣＮ１Ｂ遺伝子によって発現されるＮａｖβ１を含むさまざまなベータサブユニットとアセンブルされ得る。
ある特定の実施形態では、本出願は、内因性ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を選択的に上方調節するｅＴＦを使用して、ＳＣＮ１Ａにおける変異（例えば、欠失、挿入、逆位、点変異（例えば、ナンセンス変異、ミスセンス変異）など）、またはＮａｖ１．１の低減された活性に関連する疾患を処置するための方法を提供する。ＳＣＮ１Ａ変異に関連する疾患および障害としては、限定されるものではないが、ドラベ症候群、大田原症候群、てんかん、早期乳児てんかん性脳症６（ＥＩＥＥ６）、家族性熱性けいれん３Ａ（ＦＥＢ３Ａ）、全身性強直間代発作を伴う難治性小児てんかん（ＩＣＥＧＴＣ）、片頭痛、家族性片麻痺３（ＦＨＭ３）、パナイトポーラス症候群、家族性心房細動１３（ＡＴＦＢ１３）、熱性けいれんプラスを伴う全般性てんかん１型（ｇｅｆｓ＋１型）、ブルガダ症候群、非特異的心伝導障害、熱性けいれんプラスを伴う全般性てんかん、良性家族性乳児発作、早期乳児てんかん性脳症１１（ＥＩＥＥ１１）、良性家族性乳児てんかん、神経変性、タウオパチーおよびアルツハイマー病が挙げられる。一部の場合では、神経学的状態は、ドラベ症候群である。ＳＣＮ１Ａにおける変異または異常は、発作性障害、てんかん、自閉症、家族性片麻痺性片頭痛３型（ＦＨＭ３）、熱性けいれんプラスを伴う遺伝性てんかん（ＧＥＦＳ＋）、およびある特定の抗てんかん薬物療法の有効性にも関連付けられている。例えば、ＳＣＮ１ＡにおけるＩＣＳ５Ｎ＋５Ｇ＞Ａ変異は、抗てんかん薬であるフェニトインおよびカルバマゼピンの最大安全量（用量）に関連する。
ある特定の実施形態では、本出願は、ＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子を投与することによる、ドラベ症候群を有する対象またはドラベ症候群を発生する危険性がある対象を処置するための方法を提供する。ドラベ症候群は、小児の人生の最初の１年以内の長期にわたる熱性けいれんおよび非熱性けいれんによって特徴付けられている。この疾患は、ミオクローヌス発作および部分発作のような他の発作型、精神運動遅滞ならびに運動失調に進行する。これは、認知機能障害、行動障害および運動障害によって特徴付けられる。行動障害は、多くの場合、多動性および衝動性、ならびにより稀な症例では、自閉症様行動を含む。ドラベ症候群は、傾眠および不眠症を含む睡眠障害にも関連する。多くの患者において、ドラベ症候群は、非機能的タンパク質の産生をもたらす遺伝的変異によって引き起こされる。遺伝的原因に関連する障害を処置することには、多くの課題が存在する。したがって、ほとんどの既存の処置は、発作および他の症状の予防的医学管理に向けられていた。
７０～９０％の患者において、ドラベ症候群は、未成熟終止コドン、およびしたがって、非機能的タンパク質を生じる、ＳＣＮ１Ａ遺伝子におけるナンセンス変異によって引き起こされる。典型的には、ナトリウムチャネルポアのＳ５またはＳ６セグメントのいずれかにおけるミスセンス変異は、チャネル機能の喪失、およびドラベ症候群の発生をもたらす。ＳＣＮ１Ａ変異、例えば、ナンセンス変異、ミスセンス変異、欠失、挿入、逆位などのヘテロ接合性遺伝は、欠陥のあるナトリウムチャネルを生じさせるのに必要であるすべてであり；ドラベ症候群を有する患者は、１つの正常コピーの遺伝子を依然として有する。そのため、疾患は、ハプロ不全の１つとして特徴付けられ、したがって、ＳＣＮ１Ａの機能するコピーの発現を増加させることで、Ｎａｖ１．１の正常な産生レベルの戻すことができた。
ドラベ症候群に関連する症状としては、発作、記憶障害、発育遅延、不十分な筋緊張および／または認知的問題が挙げられる。本明細書に記載の発現カセット、発現ベクターまたはウイルス（virial）粒子による処置は、発作の回数、持続時間および／または強度の低減などの１つまたは複数の症状の改善をもたらすことができる。ドラベ症候群を発生する危険性がある対象への本明細書に記載の遺伝子治療の投与は、ドラベの１つもしくは複数の症状の発生を予防することができるか、またはその進行を遅らせることができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス（virial）粒子による処置は、発作の持続時間および／または頻度、例えば、ドラベ症候群に関連する発作を、未処置の対照と比較して、または処置前のレベルと比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれよりも高く低減する。
一部のアルツハイマー患者において、多くのペプチドおよびプロテアーゼが関与するアミロイドβ（Ａβ）の産生が、ニューロンの興奮性に影響を与え得、発作、およびＰＶニューロンにおけるＮａｖ１．１ナトリウムチャネルの下方調節を引き起こす。別の実施形態では、本出願は、ＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む本明細書に記載の発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子を投与することによる、アルツハイマー病に罹患している対象を処置するための方法を提供する。アルツハイマー病に関連する症状としては、短期記憶喪失、認知的困難、発作、ならびに言語、実行機能、知覚（失認）および動作の実行（失行）に関する困難が挙げられる。ＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子による処置は、記憶喪失の進行の低減、または１つもしくは複数の症状の予防などの１つまたは複数のアルツハイマー病の症状の改善をもたらすことができる。一部の場合では、処置は、高ガンマパワーの脳活動の修正をもたらすことができる。処置は、処置なしと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％またはそれよりも高い、発作の頻度および／もしくは発作の重症度の減少、または高ガンマパワーの活動の減少をもたらすことができる。一部の場合では、処置は、認知機能における改善をもたらすことができる。学習および／または記憶は、処置なし、または本明細書において開示されるＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドによる処置の前と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または１００％よりも高く、改善され得る。
一部の場合では、ＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子による処置は、高ガンマパワーの活動（例えば、アルツハイマー病に関連する高ガンマパワーの活動）を、未処置の対照と比較して、または処置前のレベルと比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％低減する。
パーキンソニズムは、緩慢さ（動作緩慢）、こわばり（硬直）、振戦および不均衡（姿勢の不安定性）を含む、パーキンソン病（ＰＤ）において見出される徴候および症状の集合を指す。一部の場合では、パーキンソン病を発生する危険性がある対象またはそれに罹患している対象への、本明細書に記載のＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子の投与は、その１つもしくは複数の症状の発生を予防することができるか、または、処置なしと比較して、パーキンソン病の進行を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％遅らせることができる。
ある特定の実施形態では、本出願は、疾患を発生する危険性がある対象を処置するために使用することができる方法を提供する。対象は、疾患、例えば、神経疾患、またはてんかん、発作および／もしくは脳症に関連する疾患に罹り易いことが公知であり得る。対象は、遺伝的事象に起因して、または既知の危険性因子に起因して、疾患に罹り易い可能性がある。例えば、対象は、（例えば、ドラベ症候群などの）てんかんに関連するＳＣＮ１Ａ中の変異を有し得る。その活性を（発現レベルを低減すること、タンパク質の機能を損なうこと、または両方の組合せにより）低減するＳＣＮ１Ａ遺伝子中の任意の変異は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子中の挿入、欠失、逆位、転位または置換のいずれか１つまたは複数（例えば、ナンセンス変異および／またはミスセンス変異を含む点変異）を含んで、対象を疾患に罹り易くし得る。一部の場合では、対象は、対象の年齢に起因して、アルツハイマー病などの疾患に罹り易い可能性がある。一部の場合では、対象は、不十分な量のＳＣＮ１Ａタンパク質を有する場合があり、ＳＣＮ１Ａに関連する疾患を処置することには、本明細書に記載の内因性ＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子を投与することを含む。
ある特定の実施形態では、本明細書において提供される内因性ＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子を使用する処置は、ドラベまたは他のＳＣＮ１Ａ関連疾患もしくは障害、例えば、ＳＣＮ１Ａハプロ不全に関連するてんかんに関連する症状の減少または休止をもたすことができる。例えば、処置は、学習、記憶、認知機能および／もしくは運動機能を改善することができ；発作の頻度および／もしくは持続時間を低減させることができ；ならびに／または温度感受性を低減させることができる（または発作を引き起こす温度閾値を上昇させる）。
別の態様では、本出願は、少なくとも１つのＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子を投与することによる、ＰＶニューロンにおける導入遺伝子の選択的発現のための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本出願は、導入遺伝子および少なくとも１つのＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子を投与することによる、霊長類のＰＶニューロンにおける導入遺伝子の選択的発現のための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本出願は、導入遺伝子および少なくとも１つのＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位に作動可能に連結されたＰＶ選択的調節エレメントを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子を投与することによる、ＰＶニューロンにおける導入遺伝子の選択的発現のための方法を提供する。例示的な実施形態では、導入遺伝子は、本明細書に記載のＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦのいずれかをコードする配列を含む。
ある特定の実施形態では、本出願は、対象に、導入遺伝子および少なくとも１つのＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子を投与することを含む、遺伝子治療のための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本出願は、対象に、導入遺伝子および少なくとも１つのＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位に作動可能に連結されたＰＶ選択的調節エレメントを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子を投与することを含む、遺伝子治療のための方法を提供する。例示的な実施形態では、導入遺伝子は、本明細書に記載のＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦのいずれかをコードする配列を含む。
ある特定の実施形態では、本出願は、導入遺伝子および少なくとも１つのＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子を投与することを含む、疾患または障害を処置するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本出願は、対象に、導入遺伝子および少なくとも１つのＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位に作動可能に連結されたＰＶ選択的調節エレメントを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子を投与することを含む、疾患または障害を処置するための方法を提供する。例示的な実施形態では、導入遺伝子は、本明細書に記載のＳＣＮ１Ａを選択的に上方調節するｅＴＦのいずれかをコードする配列を含む。ある特定の実施形態では、導入遺伝子およびＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位、ならびに必要に応じてＰＶ選択的調節エレメントを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子を、ＰＶニューロンが関わる疾患または障害を処置するために使用してもよい。ある特定の実施形態では、導入遺伝子およびＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位、ならびに必要に応じてＰＶ選択的調節エレメントを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子を、ニューロンの状態を処置するために使用する。処置のために適切なニューロンの疾患または障害としては、限定されるものではないが、ドラベ症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、てんかん、神経変性障害、運動障害（motor disorder）、運動障害（movement disorder）、気分障害、運動ニューロン障害、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、進行性球麻痺、仮性球麻痺、原発性側索硬化症、ＡＩＤＳの神経学的帰結、発達障害、多発性硬化症、神経形成障害、脳卒中、脊髄損傷、外傷性脳損傷、タウオパチー、ニューロンの低興奮性、および／または発作が挙げられる。一部の実施形態では、導入遺伝子およびＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位、ならびに必要に応じてＰＶ選択的調節エレメントを含むウイルスベクター、ウイルス粒子または医薬組成物は、精神障害（例えば、統合失調症、強迫性障害、嗜癖、うつ、不安、精神病）；自閉症スペクトラム障害（例えば、脆弱Ｘ症候群、レット症候群）；てんかん（例えば、ドラベ症候群、慢性外傷性脳症、熱性けいれんプラスを伴う全般性てんかん（ＧＥＦＳ＋）、てんかん性脳症、側頭葉てんかん、焦点性てんかん、結節性硬化症、ＳＣＮ１Ａハプロ不全に関連するてんかん）；および／または神経変性（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病）を処置するために使用される。ＳＣＮ１ＡまたはＮａｖ１．１中の機能欠失変異に起因する疾患などの機能障害性ＰＶニューロンに関連する疾患としては、ドラベ症候群、大田原症候群、てんかん、早期乳児てんかん性脳症６（ＥＩＥＥ６）、家族性熱性けいれん３Ａ（ＦＥＢ３Ａ）、全身性強直間代発作を伴う難治性小児てんかん（ＩＣＥＧＴＣ）、片頭痛、家族性片麻痺３（ＦＨＭ３）、パナイトポーラス症候群、家族性心房細動１３（ＡＴＦＢ１３）、熱性けいれんプラスを伴う全般性てんかん１型（ｇｅｆｓ＋１型）、ブルガダ症候群、非特異的心伝導障害、熱性けいれんプラスを伴う全般性てんかん、良性家族性乳児発作、早期乳児てんかん性脳症１１（ＥＩＥＥ１１）、良性家族性乳児てんかん、神経変性、タウオパチーおよびアルツハイマー病が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の、導入遺伝子およびＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位、ならびに必要に応じてＰＶ選択的調節エレメントを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子を使用する処置は、ニューロンの疾患または障害に関連する症状の改善をもたらす。例えば、パーキンソン患者を、処置に対する正の応答を示す改善された運動機能について、対症的にモニターすることができる。ニューロンの障害を発生する危険性がある対象への本明細書に記載の方法を使用する治療の投与は、１つもしくは複数の症状の発生を予防することができるか、またはその進行を遅らせることができる。
ある特定の実施形態では、本明細書において提供される、導入遺伝子およびＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位、ならびに必要に応じてＰＶ選択的調節エレメントを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子は、ニューロンの疾患、例えば、ドラベ症候群などのＳＣＮ１Ａのハプロ不全に関連するてんかんと診断されている対象を処置するために使用することができる。さまざまな実施形態では、本明細書において開示されるニューロンの疾患または障害のいずれかは、公知の遺伝的事象（例えば、当技術分野において公知のＳＣＮ１Ａの変異のいずれか）によって引き起こされるか、または未知の原因を有する。
ある特定の実施形態では、本明細書において提供される、導入遺伝子およびＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位、ならびに必要に応じてＰＶ選択的調節エレメントを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子は、疾患または障害を発生する危険性がある対象を処置するために使用することができる。一部の実施形態では、対象は、疾患、例えば、ニューロンの疾患（例えば、ドラベ症候群などのＳＣＮ１Ａのハプロ不全に関連するてんかんなど）に罹り易いことが公知であり得る。一部の実施形態では、対象は、遺伝的事象に起因して、または既知の危険性因子に起因して、疾患に罹り易い可能性がある。例えば、対象は、てんかんまたはドラベ症候群に関連するＳＣＮ１Ａ中の変異、例えば、挿入、欠失、逆位、転位または置換（例えば、ナンセンス変異および／またはミスセンス変異を含む点変異）を有し得る。
ある特定の実施形態では、本明細書において提供される、導入遺伝子およびＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位、ならびに必要に応じてＰＶ選択的調節エレメントを含む発現カセット、発現ベクターまたはウイルス粒子は、疾患または障害に関連する１つまたは複数の症状を低減するために使用することができる。例えば、ドラベ症候群に関連する症状としては、発作、記憶障害、発育遅延、不十分な筋緊張および／または認知的問題が挙げられる。本明細書において提供される、導入遺伝子およびＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位、ならびに必要に応じてＰＶ選択的調節エレメントを含むウイルスベクター、ウイルス粒子または医薬組成物による処置は、発作の回数、持続期間および／または強度の低減などの１つまたは複数の症状の改善をもたらすことができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＰＶニューロンにおける導入遺伝子の発現を増加させるため、遺伝子治療のため、または霊長類における疾患もしくは障害を処置するために、使用される。ある特定の実施形態では、霊長類は、ヒトである。ある特定の実施形態では、霊長類は、非ヒト霊長類である。ある特定の実施形態では、非ヒト霊長類は、旧世界ザル、オランウータン、ゴリラ、チンパンジー、カニクイザル、アカゲザルまたはブタオザルである。
「対象」および「個体」という用語は、脊椎動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒトを指すために、本明細書において互換可能に使用される。本明細書に記載の方法は、ヒトの治療、獣医学適用、および／または疾患もしくは状態の動物モデルにおける前臨床研究において有用であり得る。さまざまな実施形態では、本明細書に記載の方法に関連して処置され得る対象は、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、スナネズミ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ロバ、ウマ、イヌ、ネコ、ラマ、またはサル（例えば、旧世界ザル、マーモセット、またはマカク、例えば、アカゲザル、ブタオザル、またはカニクイザル（ｃｒａｂ－ｅａｔｉｎｇ ｍａｃａｑｕｅ）（すなわち、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）））、類人猿（例えば、オランウータン、ゴリラまたはチンパンジー）もしくはヒトなどである。例示的な実施形態では、対象は、ヒトである。
以下の表は、本明細書において開示される配列を提供する。
表1. 本明細書に開示される例示的な操作された転写因子。調節エレメント(RE)の配列を、下記の表2および8に開示する。REについて、m1が示される場合、それは、m1マイクロRNA結合部位(配列番号7、表8)がコード領域およびポリAテイルの間に含まれることを意味する。DNA結合ドメイン(DBD)についての配列を、下記の表3に開示する。DBDについて、操作されたジンクフィンガー(eZF)は、構築物が配列番号147(表10)に記述される式を有することを示し;EGR1は、DBDが野生型ヒトEGR1(配列番号176;表12)に由来することを示し;EGR3は、DBDが野生型ヒトEGR3(配列番号175、表12)に由来することを示す。標的部位についての配列(例えば、DBDと結合する配列)を、下記の表4に提供する。転写活性化ドメイン(TAD)についての配列を、下記の表5に開示する。TADについて、(c)は、TADがDBDのc末端に位置することを示し、(n)は、TADがDBDのn末端に位置することを示し、(n/c)は、DBDのn末端およびc末端の両方に位置するTADが存在することを意味し、2×CITED4(n)は、DBDのn末端に位置する2コピーのCITED4TADが存在することを示す。全長の操作された転写因子(DBD+TAD)についての配列を、下記の表6に提供する。
表2. 本明細書において開示されるさまざまな調節エレメント(RE)についての核酸配列
表3. 本明細書において提供される例示的なDNA結合ドメイン(DBD)についてのアミノ酸配列。DBDについて、操作されたジンクフィンガー(eZF)は、構築物が配列番号147(表10)に記述される式を有することを示し;EGR1は、DBDが野生型ヒトEGR1(配列番号176;表12)に由来することを示し;EGR3は、DBDが野生型ヒトEGR3(配列番号175、表12)に由来することを示す。標的部位は、DBDと結合する配列であり、下記の表4に提供する。
表4. 本明細書において開示されるDNA結合ドメインと結合する例示的な標的部位についての標的部位の配列および染色体位置
表5. 本明細書において開示される例示的な転写活性化ドメイン(TAD)についてのアミノ酸配列
表6. 本明細書において開示される例示的な操作された転写因子(DBD+TAD)についてのアミノ酸配列
表7.本明細書において開示される例示的な操作された転写因子をコードする核酸配列
表8. 例示的なマイクロRNAおよびマイクロRNA結合部位についての核酸配列
表9. 異なる型のジンクフィンガー構造およびeTFを作製するための例示的なジンクフィンガータンパク質
表10.例示的なジンクフィンガーDNA結合ドメインについてのアミノ酸配列
表11. 本明細書において開示される例示的なジンクフィンガー認識配列についてのアミノ酸配列
表12. 本明細書において開示される他のヌクレオチドおよびアミノ酸配列
以下の実施例は、本開示の一部の態様をさらに記載するために含まれ、本発明の範囲を限定するのに使用されるべきではない。
（実施例１）
ＳＣＮ１Ａ特異的転写活性化因子を使用するＳＣＮ１Ａを上方調節することができる標的領域の特定
内因性ＳＣＮ１Ａ発現を上方調節することができるゲノムの領域を特定するために、上記の表４および１３に記述されるゲノムのさまざまな領域を標的化するさまざまな操作された転写因子（ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはｇＲＮＡ／ｄａＣａｓ９構築物のいずれか）を設計した。ｇＲＮＡ／ｄａＣａｓ構築物のために、ｇＲＮＡは、相補的ゲノム鎖を標的化するように設計されたので、ｇＲＮＡは、標的領域と同じ配列を有していた。ｄＧａｓ９タンパク質は、ｄＣＡＳ９－ＶＰ６４構築物（配列番号１７４）であった。
ＨＥＫ２９３細胞を、標準的な方法に従って培養し、操作された転写因子または対照構築物を有する３ｕｇのプラスミドで、６ウェルプレートのウェルごとに、トランスフェクトした（ＦｕｇｅｎｅＨＤ、Ｐｒｏｍｅｇａ）。細胞を、下記の表１３に示される構築物を発現するプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を収集し、ＲＮＡを単離し（Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット）、ＤＮａｓｅ処理した。ＲＮＡ（３ｕｇ）を、ＯｌｉｇｏＤＴプライマー（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、逆転写した。ｃＤＮＡ試料を、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ：（９８℃で３０秒、４０×［９８℃で１０秒、６６℃で１５秒、７２℃で１５秒］）を使用して、ｑＰＣＲによって分析した。ＳＣＮ１Ａに対するプライマー（５’－ＴＧＴＣＴＣＧＧＣＡＴＴＧＡＧＡＡＣＡＴＴＣ－３’（配列番号１８５）；５’－ＡＴＴＧＧＴＧＧＧＡＧＧＣＣＡＴＴＧＴＡＴ－３’（配列番号１８６））を使用して、内因性ＳＣＮ１Ａ転写物のレベルを定量し、ＳＣＮ１Ａ発現の相対レベルを、参照遺伝子（５’－ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ’－３’（配列番号１８７）；５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ－３’（配列番号１８８））としてＧＡＰＤＨを用いるデルタ－デルタＣｔ法によって決定した。データは、対照条件に対する倍数変化として表す。
結果を、対照条件（例えば、ＥＧＦＰ－ＫＡＳＨレポーター構築物）に対するＳＣＮ１Ａ転写物の倍数変化として、図１および下記の表１３に示す。表１３は、対照条件に対して、転写の少なくとも１．５倍の増加をもたらした構築物についての値を報告する。
表13. 異なるゲノム標的部位および対応するeTFの転写に対する効果。CONは、実験で使用されたジンクフィンガー構築物を示す(表1を参照されたい)。gRNA構築物について、gRNAが相補的DNA鎖を標的とするように設計されたので、標的部位およびgRNA配列は同じである。
（実施例２）
ＳＣＮ１Ａ特異的転写因子を使用するＨＥＫ２９３細胞における内因性ＳＣＮ１Ａの上方調節
ＨＥＫ２９３細胞を、標準的な方法に従って培養し、６ウェルプレートに蒔いた。それぞれのウェル中の細胞を、単一の操作された転写因子構築物、ＷＴヒトＣＲＥＢ３（配列番号２１１）、またはＥＧＦＰ対照構築物のいずれかを有する３ｕｇのプラスミドでトランスフェクトした（ＦｕｇｅｎｅＨＤ、Ｐｒｏｍｅｇａ）。試験された操作された転写因子構築物は、構築物１～２７および４６～５３（表１）、ならびにＣＲＥＢ３－ＴＲＥを発現するプラスミド（配列番号２１５；ＴＥＴプロモーター標的化合成ＺＦドメインで置き換えられたｂＺＩＰ ＤＮＡ結合ドメインを有するＣＲＥＢ３）を含んでいた（それぞれ別々に試験した）。トランスフェクションの４８時間後、細胞を収集し、ＲＮＡを単離し（Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット）、ＤＮａｓｅ処理した。ＲＮＡ（３ｕｇ）を、ＯｌｉｇｏＤＴプライマー（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、逆転写した。ｃＤＮＡ試料を、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ：（９８℃で３０秒、４０×［９８℃で１０秒、６６℃で１５秒、７２℃で１５秒］）を使用して、ｑＰＣＲによって分析した。ＳＣＮ１Ａに対するプライマー（５’－ＴＧＴＣＴＣＧＧＣＡＴＴＧＡＧＡＡＣＡＴＴＣ－３’（配列番号１８５）；５’－ＡＴＴＧＧＴＧＧＧＡＧＧＣＣＡＴＴＧＴＡＴ－３’（配列番号１８６））を使用して、内因性ＳＣＮ１Ａ転写物のレベルを定量し、ＳＣＮ１Ａ発現の相対レベルを、参照遺伝子（５’－ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ’３’（配列番号１８７）；５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ－３’（配列番号１８８））としてＧＡＰＤＨを用いるデルタ－デルタＣｔ法によって決定した。データは、対照条件に対する倍数変化として表す（図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｃを参照されたい）。対照構築物は、ＲＥ１（配列番号１）の制御下で発現するＥＧＦＰからなった。操作された転写因子の送達は、ＥＧＦＰ条件に関して、内因性ＳＣＮ１Ａ転写物のさまざまな程度の上方調節を誘導した。
（実施例３）
ＳＣＮ１Ａ特異的転写因子を使用するＧＡＢＡニューロンにおける内因性ＳＣＮ１Ａの上方調節
ｉＣｅｌｌ ＧＡＢＡニューロン（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を、６ウェルプレートに蒔き（約１Ｅ６個細胞／ウェル）、製造者の推奨プロトコールに従って維持した。蒔いた７２時間後、ユビキタスプロモーター（ＣＢＡプロモーター）の制御下のＥＧＦＰあるいは図３Ａの活性化因子構築物３０または図３Ｂの構築物２５もしくは構築物１６を発現する組換えＡＡＶ（血清型ＡＡＶ－ＤＪ）を、およそ２Ｅ１１ゲノムコピー／ウェルで、培養培地に添加した。感染の１週間後（図３Ａ）または２週間後（図３Ｂ）、ＲＮＡを、培養細胞から単離し（Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット）、ＤＮａｓｅ処理した。回収されたＲＮＡを、ＯｌｉｇｏＤＴプライマー（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、逆転写した。ｃＤＮＡ試料を、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ：（９８℃で３０秒、４０×［９８℃で１０秒、６６℃で１５秒、７２℃で１５秒］）を使用して、ｑＰＣＲによって分析した。ＳＣＮ１Ａに対するプライマー（５’－ＴＧＴＣＴＣＧＧＣＡＴＴＧＡＧＡＡＣＡＴＴＣ－３’（配列番号１８５）；５’－ＡＴＴＧＧＴＧＧＧＡＧＧＣＣＡＴＴＧＴＡＴ－３’（配列番号１８６））を使用して、内因性ＳＣＮ１Ａ転写物のレベルを定量し、ＳＣＮ１Ａ発現の相対レベルを、参照遺伝子（５’－ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ’３’（配列番号１８７）；５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ－３’（配列番号１８８））としてＧＡＰＤＨを用いるデルタ－デルタＣｔ法によって決定した。データは、対照条件に対する倍数変化として表す（図３Ａおよび図３Ｂを参照されたい）。操作された転写因子のＡＡＶ駆動発現は、培養されたｉＰＳ由来ＧＡＢＡニューロンにおいて、内因性ＳＣＮ１Ａ転写物の有意な上方調節を生じた。
（実施例４）
ＳＣＮ１Ａ特異的転写因子を使用するＧＡＢＡニューロンにおける内因性ＳＣＮ１Ａの特異的上方調節
ｉＣｅｌｌ ＧＡＢＡニューロン（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を、６ウェルプレートに蒔き（約１Ｅ６個細胞／ウェル）、製造者の推奨プロトコールに従って維持した。蒔いた７２時間後、ＣＢＡプロモーターの制御下のＣＢＡプロモーターによって駆動されるＶＰＲ ＴＡＤに融合されたジンクフィンガーＤＢＤを含む、ＥＧＦＰまたは活性化因子（構築物３０）を発現する組換えＡＡＶ（血清型ＡＡＶ－ＤＪ）を、およそ２Ｅ１１ゲノムコピー／ウェルで、培養培地に添加した。
感染の１週間後、ＲＮＡを、培養細胞から単離し（Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット）、ＤＮａｓｅ処理した。ＲＮＡｓｅｑライブラリーを、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡライブラリーキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、回収されたＲＮＡから調製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑにおいて配列決定した（２×７５サイクルのペアエンド配列決定）。配列決定リードを、ヒトゲノム（ＲＮＡＳＴＡＲ）と整列させ、差次的発現分析を、ＤＥＳＳｅｑ２を用いて行った。データは、対照（ＡＡＶＤＪ－ＣＢＡ－ＥＧＦＰ）試料に関する倍数変化として表す（図４を参照されたい）。結果を表１４に示し、図４は、対照条件に対する倍数変化として表された、内因性ＳＣＮ１Ａおよび４０個の最も近い隣接する遺伝子転写物の相対発現を図示する。表１に記載の構築物３０は、実験された他の遺伝子と比較して、ＳＣＮ１Ａ遺伝子またはＮａｖ１．１タンパク質の発現を有意に増加させることが可能であった。これは、構築物３０の転写活性化因子によって認識される標的部位が、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に特異的であり、したがって、ＧＡＢＡニューロンにおけるＳＣＮ１Ａ遺伝子発現の増加をもたらすことを示した。
表14. 内因性SCN1A、およびSCN1A特異的転写因子（構築物３０）で処置されたGABAニューロン中の40個の最も近い隣接遺伝子の転写に対する効果
（実施例５）
ｉｎ ｖｉｖｏでの発現カセットからのＳＣＮ１Ａの発現
ＳＣＮ１Ａの転写活性化因子の発現をｉｎ ｖｉｖｏで試験するために、組換えＡＡＶ９ベクターを、Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＰＡ）によって作製した。雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（群あたりＮ＝５、７～８週齢）に、１．５ｕｌの精製ＡＡＶベクターを、背側海馬（硬膜から、ＡＰ －２．０ｍｍ、側面±１．５、ＤＶ －１．４ｍｍ）および腹側海馬（硬膜から、ＡＰ －３．１ｍｍ、側面±２．８、ＤＶ －３．８ｍｍ）へと、両側に合計で４つの注射部位に対して注入した。ＡＡＶを、それぞれの注射後４ｍの休息期間で、０．３ｕｌ／分の速度で送達した。処置の４週間後、マウスを安楽死させ、海馬組織を解剖した。それぞれの群について、左海馬のみを収集してホモジネートした１匹の動物を除き、ほとんどの動物（Ｎ＝４）において、左および右の両方の海馬組織からの組織をホモジネートのために収集してプールした。ＲＮＡを、ホモジネートから単離し（Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット）、ＤＮａｓｅ処理した。ＲＮＡ（３μｇ）を、ＯｌｉｇｏＤＴプライマー（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、逆転写した。ｃＤＮＡ試料を、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ：９８℃で３０秒、４０×［９８℃で１０秒、６４℃で１５秒、７２℃で１５秒］を使用して、マウスＳＣＮ１Ａの発現について、ｑＰＣＲによって分析した。マウスＳＣＮ１Ａに対するプライマー（５’－ＣＡＡＡＡＡＡＧＣＣＡＣＡＡＡＡＧＣＣＴ－３’（配列番号１８９）；５’－ＴＴＡＧＣＴＣＣＧＣＡＡＧＡＡＡＣＡＴＣ－３’（配列番号１９０））を使用して、内因性ＳＣＮ１Ａ転写物のレベルを定量し、ｉｎ ｖｉｖｏでのＳＣＮ１Ａ発現の相対レベルを、参照遺伝子（５’－ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ’３’（配列番号１８７）； ５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ－３’（配列番号１８８））としてＧＡＰＤＨを用いるデルタ－デルタＣｔ法によって決定した。
図５Ａおよび図５Ｂは、ＡＡＶ９構築物をそれぞれ注射された５匹の動物の平均結果を図示する。ｅＧＦＰ対照構築物は、ｅＧＦＰレポーター導入遺伝子を含んでいた。構築物４（表１を参照されたい）は、上記の表１に記載の配列番号１８を含む標的配列を認識した転写活性化因子を含んでいた。図５Ａは、ｉｎ ｖｉｖｏでのＳＣＮ１Ａの相対発現を図示する。図５Ｂは、平均ｅＧＦＰ発現のパーセンテージとして、ｉｎ ｖｉｖｏでのＳＣＮ１Ａ発現における変化を図示する。これらの結果は、発現カセットＡのＳＣＮ１Ａ転写活性化因子が、ｉｎ ｖｉｖｏでのＳＣＮ１Ａ発現のおよそ２０～３０％の上方調節をもたらしたことを示した。
このような発現カセットは、ドラベ症候群、てんかん、発作、アルツハイマー病、パーキンソン病、ならびに／またはＳＣＮ１Ａの欠損および／または損なわれた活性に関連する任意の他の疾患もしくは状態を処置するためのヒトにおける使用のために適合し得る。
（実施例６）
ドラベ症候群のマウスモデルにおける高体温発作（ＨＴＳ）アッセイ
Ａ．ヘテロ接合性Ｓｃｎ１ａノックアウトマウスモデル
発現カセットを使用するドラベ症候群および／またはその症状の処置を、Ｓｃｎ１ａｔｍ１Ｋｅａマウス系統において試験した。このマウス系統は、ドラベ症候群のための確立されたマウスモデルである。Ｓｃｎ１ａｔｍ１Ｋｅａマウス系統は、ＣＲＥリコンビナーゼを必要としない。Ｓｃｎ１ａｔｍ１Ｋｅａマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手可能；Hawkins et al., Scientific Reports, vol. 7: 15327 (2017)に記載）は、ＳＣＮ１Ａの第１のコードエクソンの欠失を含む。ＳＣＮ１Ａノックアウト対立遺伝子についてホモ接合性のマウスは、振戦、運動失調、発作、および生後１６日目までの死亡によって特徴付けられる。Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンドのヘテロ接合性マウスは、自発性発作、および数週間以内の大きいパーセンテージの死亡を発生する。このようなマウス系統を使用して、てんかんおよびドラベ症候群の処置の安全性および有効性を研究することができる。追加情報について、Milleret al., Genes Brain Behav. 2014 Feb;13(2):163-72を参照されたい。
Ｓｃｎ１ａｔｍ１Ｋｅａマウス系統における転写活性化因子の有効性を試験するために、雄Ｓｃｎ１ａ＋／－と雌Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊを交配して生まれ、飼育している同腹仔の仔に、Ｐ１において、両側ＩＣＶを介してＡＡＶベクターを投与した。マウスに、構築物３１～３４（表１）を投与した。マウスは、Ｐ１８で離乳する（weening）までそれらの母獣とともにそのままにし、次いで、高体温発作（ＨＴＳ）アッセイが開始されるＰ２６～Ｐ２８まで再びそのままにした。投与されたＰ１マウスの別の同腹仔は、Ｐ１８で離乳させ（weened）、毎日の死亡している状態について観察した。高体温発作誘導を、混合１２９Ｓｔａｃ×Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＰ２６～Ｐ２８ヘテロ接合性（ＨＥＴ）およびＷＴ Ｓｃｎ１ａマウスにおいて行った。アッセイの前に、マウスに、潤滑にした直腸温度プローブ（Ｒｅｔ－４）を挿入し、加熱ランプ（ＨＬ－１）と直列に接続された温度制御モジュール（ＴＣＡＴ ２ＤＦ、Ｐｈｙｓｉｔｅｍｐ）に接続した。次いで、マウスを、大きなガラスビーカーに入れ、短時間で環境と平衡化した。この後、体温を、姿勢の喪失を伴う最初の強直間代発作の発症まで、または４３℃に達するまで、２分ごとに約０．５℃ずつ上昇させた。マウスが姿勢の喪失を伴う発作を経験した場合、実験を終了し、マウスの内部体温を記録した。姿勢の喪失を伴う発作が、実験の全過程にわたって検出されなかった場合、そのマウスは発作なしと考え、アッセイを終了した。組織試料を、Ｐ１でマウスから得て、マウスのジェノタイピングを、リアルタイムＰＣＲを使用して、実験の過程の間に行った。ジェノタイピングは、アッセイが終了した後、非盲検であり、ＨＥＴまたはＷＴのようなマウスの状態を、得られたデータと相関させた。データを、カプランマイヤー生存曲線においてプロットし、有意性を、マンテルコックス検定によって決定した。結果を、表１５および表１６、ならびに図６Ａ～Ｅに示す。
表15. 実施例6で使用された条件の概要
表16. 高体温発作アッセイの結果の概要
追加の実験を、上記に記載のＳｃｎ１ａｔｍ１Ｋｅａマウスにおいて実施して、ＨＴＳアッセイにおける発作に対するそれらの効果について、構築物４２および４３を試験した。これらの実験において、構築物４２を、Ｐ１において、両側ＩＣＶを介して９×１０１０ｇｃ／マウスで投与し、構築物４３を、Ｐ１またはＰ５において、両側ＩＣＶを介して６×１０１０ｇｃ／マウスで投与した。結果を、図６Ｆ（構築物４２）および図６Ｇ（構築物４３）に示す。両方の構築物は、ＥＧＦＰ対照と比較して、発作の有意な低減を示した（構築物４２および４３の両方についてＰ＜０．０００１）。
Ｂ．ヘテロ接合性Ｓｃｎ１ａＲＸ変異体マウスモデル
本開示の発現カセットを使用するドラベ症候群および／またはその症状の処置を、Ｓｃｎ１ａＲＸマウス系統において試験した。このマウス系統は、ドラベ症候群のための確立されたマウスモデルである。Ｓｃｎ１ａＲＸマウス系統は、ＣＲＥリコンビナーゼを必要としない。Ｓｃｎ１ａＲＸマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手可能；Ogiwara et al., J. Neuroscience, vol. 27: 5903-5914 (2007)に記載）は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のエクソン２１における機能喪失一塩基ナンセンス変異を含む（ＣｇＧからＴｇＡ；Ｒ１４０７Ｘ）。Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンドのヘテロ接合性マウスは、自発性発作、および数週間以内の大きいパーセンテージの死亡を発生する。
Ｓｃｎ１ａＲＸマウス系統における転写活性化因子の有効性を試験するために、雄、およびＳｃｎ１ａＲＸ／＋の精子と雌Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊの卵子をＩＶＦ交配して胚移植したＣＤ－１母獣から生まれた同腹仔の仔に、Ｐ１において、両側ＩＣＶを介して、５．１×１０１０ゲノムコピー（ｇｃ）／マウスのＡＡＶベクター（構築物３１）、またはＰＢＳ対照を投与した。マウスは、Ｐ１８で離乳するまでそれらの母獣とともにそのままにし、次いで、ＨＴＳアッセイが開始されるＰ２６～Ｐ２８まで再びそのままにした。投与されたＰ１マウスの別の同腹仔は、Ｐ１８で離乳させ、毎日の死亡している状態について観察した。高体温発作誘導を、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＰ２６～Ｐ２８ヘテロ接合性（ＨＥＴ）およびＷＴ Ｓｃｎ１ａマウスにおいて行った。アッセイの前に、マウスに、潤滑にした直腸温度プローブ（Ｒｅｔ－４）を挿入し、加熱ランプ（ＨＬ－１）と直列に接続された温度制御モジュール（ＴＣＡＴ ２ＤＦ、Ｐｈｙｓｉｔｅｍｐ）に接続した。次いで、マウスを、大きなガラスビーカーに入れ、短時間で環境と平衡化した。この後、体温を、姿勢の喪失を伴う最初の強直間代発作の発症まで、または４３℃に達するまで、２分ごとに約０．５℃ずつ上昇させた。マウスが姿勢の喪失を伴う発作を経験した場合、実験を終了し、マウスの内部体温を記録した。姿勢の喪失を伴う発作が、実験の全過程にわたって検出されなかった場合、そのマウスは発作なしと考え、アッセイを終了した。組織試料を、Ｐ１でマウスから得て、マウスのジェノタイピングを、リアルタイムＰＣＲを使用して、実験の過程の間に行った。ジェノタイピングは、アッセイが終了した後、非盲検であり、ＨＥＴまたはＷＴのようなマウスの状態を、得られたデータと相関させた。試験されたＷＴ Ｓｃｎａ１マウスは、発作を経験しなかった。処置された構築物３１（ｎ＝１３）および処置されたＰＢＳ対照（ｎ＝１４）のＨＥＴマウスについてのデータを、カプランマイヤー生存曲線においてプロットし、有意性を、マンテルコックス検定によって決定した。図６Ｈに示されるように、構築物３１で処置されたＨＥＴマウスは、ＰＢＳ対照で処置されたＨＥＴマウスに対して、高体温発作誘導の有意な低減を示す（Ｐ＜０．０１）。
（実施例７）
ドラベ症候群のマウスモデルにおける生存アッセイ
Ａ．ヘテロ接合性Ｓｃｎ１ａノックアウトマウスモデル
Ｓｃｎ１ａｔｍ１Ｋｅａマウス系統における転写活性化因子の有効性を試験するために、雄Ｓｃｎ１ａ＋／－と雌Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊを交配して生まれ、飼育している同腹仔の仔に、Ｐ１において、両側ＩＣＶを介してＡＡＶベクターを投与した。マウスは、離乳するまでそれらの母獣とともにそのままにした。Ｓｃｎ１ａ＋／－マウスの健康状態の観察を、Ｐ１８での離乳後、毎日行った。それらのホームケージにおいて任意の原因で死亡したことが見出されたマウスは、その日付を記録した。データを、カプランマイヤー生存曲線においてプロットし、有意性を、マンテルコックス検定によって決定した。
結果を、表１７および図７Ａ～Ｄに示す。
表17. 生存アッセイについての条件および結果の概要
Ｂ．ヘテロ接合性Ｓｃｎ１ａＲＸ変異体マウスモデル
Ｓｃｎ１ａＲＸマウス系統における転写活性化因子の有効性を試験するために、雄、およびＳｃｎ１ａＲＸ／＋の精子と雌Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊの卵子をＩＶＦ交配して肺移植したＣＤ－１母獣から生まれた同腹仔の仔に、Ｐ１において、両側ＩＣＶを介して、５．１×１０１０ゲノムコピー（ｇｃ）／マウスのＡＡＶベクター（構築物３１）、またはＰＢＳ対照を投与した。マウスは、離乳するまでそれらの母獣とともにそのままにした。Ｓｃｎ１ａＲＸ／＋マウスの健康状態の観察を、Ｐ１８での離乳後、毎日行った。それらのホームケージにおいて任意の原因で死亡したことが見出されたマウスは、その日付を記録した。処置された構築物３１（ｎ＝２７）および処置された対照（ｎ＝１８）についてのデータを、カプランマイヤー生存曲線においてプロットし、有意性を、マンテルコックス検定によって決定した。
図７Ｅに示されるように、構築物３１で処置されたＳｃｎ１ａＲＸ／＋マウスは、ＰＢＳ対照処置されたＳｃｎ１ａＲＸ／＋マウスに対して生存が増加した（Ｐ＜０．０００１）。
（実施例８）
ＳＣＮ１Ａ特異的転写因子をコードするＡＡＶによる処置後の非ヒト霊長類におけるＳＣＮ１Ａ転写レベル
研究は、２～３歳の間の雄のカニクイザル（ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を使用した。動物を、研究への登録前に、ＡＡＶ９への交差反応性抗体について、細胞に基づく中和抗体アッセイによってプレスクリーニングした。ＳＣＮ１Ａ特異的転写因子（構築物３３）を発現するＡＡＶ９または対照を、ＰＢＳに希釈し、１．２Ｅ１２ｇｃ／動物で実質内に注射した。それぞれの半球中の３つの異なる定位座標の、動物１匹あたり６つの注射部位を、注射のために識別した。１０ｕｌ体積を、１つの部位あたり、注射した。右半球における注射は、左における注射と対称であった。２匹の未処置動物を、対照として使用した。
Ｓｃｎ１Ａ ｍＲＮＡ発現を評価するために、逆転写、続いてｑＰＣＲ法を実施した。投与２８日後の剖検の際に、対照および処置動物からの脳のさまざまな領域（前頭皮質、頭頂皮質、側頭皮質、後頭皮質、海馬、髄質、小脳；それぞれ２００ｍｇ）由来の組織切片を、ＲＮＡｌａｔｅｒに収集し、次いで、凍結した。簡潔には、３０ｍｇの組織を切断し、ＲＮＡを、（Ｑｉａｇｅｎ Ｒｎｅａｓｙ Ｌｉｐｉｄ ｔｉｓｓｕｅミニキット、カタログ番号１０２３５３９を用いて）抽出し、（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット、カタログ番号４３６８８１４を使用して）逆転写によってｃＤＮＡに転換し、Ｓｃｎ１Ａおよびハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対するプライマー／プローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号Ｒｈ０２６２１７４５－ｇＩ ＦＡＭ）を使用してｑＰＣＲを行った。
ＳＣＮ１Ａに対するプライマー／プローブセットを下記に示す。
表18. 実施例8で使用されたプライマー配列
それぞれの試験試料中のＳｃｎ１Ａの遺伝子発現を、比較Ｃｔ（ΔＣｔ）法を使用する相対定量（ＲＱ）によって決定した。この方法は、標的遺伝子およびハウスキーピング遺伝子の間のＣｔ差（ΔＣｔ）を測定し、次いで、対照試料に対する処置試料のΔＣｔ値を比較する。
ΔＣｔ＝標的遺伝子のＣｔ平均－ハウスキーピング遺伝子のＣｔ平均
ΔΔＣｔ＝処置試料のΔＣｔ－ΔＣｔ対照試料
相対発現（処置試料）＝２－ΔΔＣｔ
データを、脳由来の異なる組織切片における標的ｍＲＮＡの正規化された発現として報告する（図８を参照されたい）。図８に図示されるように、実質内の注射部位の近位にある脳の部位は、最高レベルのＳＣＮ１Ａ転写物発現を示した。
（実施例９）
ＰＶ選択的プロモーターおよびマイクロＲＮＡ結合部位を有するＡＡＶによる処置後の非ヒト霊長類におけるＰＶニューロンの選択的導入遺伝子発現
研究は、研究への登録前にＡＡＶ９への交差反応性抗体についてプレスクリーニングされた６匹のマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）を使用した。２匹のサルは、ＥＦ１アルファプロモーターの制御下のＥＧＦＰ導入遺伝子を含有するＡＡＶ９で処置され、２匹のサルは、ＲＥ２（配列番号２）の制御下のＥＧＦＰ導入遺伝子を含有するＡＡＶ９で処置され、２匹のサルは、ＲＥ２（配列番号２）の制御下のＥＧＦＰ導入遺伝子を含有し、ならびにＥＧＦＰおよびポリＡテイルのコード領域の間に位置するマイクロＲＮＡ結合部位（配列番号７）も含有するＡＡＶ９で処置された。ＡＡＶ９ベクターをＰＢＳに希釈し、動物を、３回の大脳内注射（それぞれ２ｕＬ）で、それぞれの半球の海馬／嗅内皮質に、動物あたり合計で６つの注射部位で処置した。ＥＦ１アルファ－ＥＧＦＰを含有するＡＡＶ９ベクターで処置された２匹の動物は、５．８Ｅ＋１１ｇｃ／動物の合計用量をそれぞれ受け、ＲＥ２－ＥＧＦＰを含有するＡＡＶ９ベクターで処置された２匹の動物は、３．０Ｅ＋１１ｇｃ／動物の合計用量をそれぞれ受け、ＲＥ２＋ｍ１－ＥＧＦＰを含有するＡＡＶ９ベクターで処置された２匹の動物は、２．３Ｅ＋１１ｇｃ／動物の合計用量をそれぞれ受けた。
免疫組織化学的検査を使用して、パルブアルブミン（paravalbumin）（ＰＶ）選択的発現を評価した。投与２８日後の剖検の際に、脳のさまざまな領域由来の組織切片を収集した。浮動するマーモセット脳切片（３５ｕｍ）を、４％のパラホルムアルデヒド中で固定し、緩衝液（ＰＢＳ、３％のＢＳＡ、３％のロバ血清、０．３％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ １００、０．２％のＴｗｅｅｎ（登録商標）－２０）でブロッキングし、次いで、抗ＧＦＰ（Ａｂｃａｍ ａｂ２９０）、続いてＡｌｅｘａ－４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ａ２１２０６）とコンジュゲートされた二次抗体で染色した。これに、抗ＰＶ抗体（Ｓｗａｎｔ）、ならびにＡｌｅｘａ－６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ａ３１５７１）とコンジュゲートされた二次抗体および４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）が続いた。切片を、マウントし、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｖｅｃｔｒａ３を使用して撮像した。
結果を、図９Ａ～Ｆおよび１０Ａ～Ｌに示す。
（実施例１０）
ｅＴＦＳＣＮ１Ａ生体内分布
この研究の目的は、片側脳室内（ＩＣＶ）注射を介して４．８Ｅ＋１３の用量で投与された場合に、若年のカニクイザルの中枢神経系（ＣＮＳ）中のｅＴＦＳＣＮ１Ａの生体内分布を比較することであった。それぞれの動物に、ＧＡＢＡ選択的調節エレメント（ＲＥＧＡＢＡ－ｅＴＦＳＣＮ１Ａ）の制御下のｅＴＦＳＣＮ１Ａをコードする発現カセットを含有するＡＡＶ９を注射した。ＡＡＶ９粒子を、ＰＢＳ＋０．００１％のプルロニック（登録商標）酸中で調合し、４．８Ｅ＋１３または８Ｅ＋１３ｖｇ／動物の用量で投与した。２ｍｌの体積の調合されたウイルス粒子を、それぞれの動物に投与した。研究の設計を表１９に記述する。
２４か月齢のカニクイザルを、表１９に示すように群分けした。研究の開始前に、動物からの血液試料を、上記に記載のＮＡｂ力価アッセイを使用して、ＡＡＶ９に対する中和抗体の力価のレベルについて試験した。抗体について低いか、または陰性の結果を有する動物を、研究のために選択した。試料を、標準的な外科的手順を使用して、ＩＣＶ注射を介して投与した。解凍された投与材料を、湿った氷上で短時間貯蔵し、投与直前に室温に温めた。動物を、麻酔し、外科手術のために準備し、ＭＲＩ適合定位フレーム（Ｋｏｐｆ）に配置した。ベースラインＭＲＩを、ターゲット座標を確立するために行った。切開を行い、単一の孔を、標的位置上の頭蓋骨を通して開けた。３６’’マイクロボア伸長セットが取り付けられた３ｍＬのＢＤシリンジを、試料を用いて調製し、注入ポンプに設置した。伸長ラインを準備した。硬膜を開け、投与針を、軟膜から１３．０～１８．１ｍｍの深さまで進めた。造影剤の注射および蛍光透視法を使用して、右の側脳室へのくも膜下穿刺針の設置を確認した。３．０’’の２２ｇ Ｑｕｉｎｋｅ ＢＤくも膜下フーバーポイント穿刺針を造影剤で満たし、準備された伸長ラインおよびシリンジを取り付ける前に、設置を決定した。ポンプの設定は、１９～２０分間、０．１ｍＬ／分であった。緩衝液を、投与後に手でプッシュして、伸長ラインをきれいにした。針は、注入の終了後１～２分間、そのままにし、次いで、針を引き抜いた。ビヒクルおよび試験物を、１日目に１回投与し、対象を、２７または２９日の回復期間の間、維持した。
表19.生体内分布研究の設計
投与後、動物を、研究の期間全体にわたって日常的にモニターし、血液試料を、定期的に採取した。ｅＴＦＳＣＮ１Ａ投与は、任意の予想外の死亡している状態、臨床所見や肉眼による観察に関連しなかった。ＡＡＶ９－ＲＥＧＡＢＡ－ｅＴＦＳＣＮ１Ａで処置された動物は、２８日目±２日のスケジュールされた剖検まで生存した。臨床的および行動的兆候、体温の上昇、や体重の低減は、毎日または毎週の健康診断の間に観察されなかった。ＡＡＶ９－ＲＥＧＡＢＡ－ｅＴＦＳＣＮ１Ａで処置された動物において肝臓トランスアミナーゼ（ＡＬＴおよびＡＳＴ）の一時的な上昇が観察されたが、免疫調節なしで、研究の最後までに完全に消散し、血清ビリルビンやアルカリホスファターゼの付随する増加は記録されなかった。他の測定された臨床化学エンドポイントは、注目に値しなかった。顕微鏡観察は、肝臓の組織病理研究において報告されなかった。ＣＳＦ白血球は、事前処置の値と比べて最後の収集において上昇したが、対照およびＡＡＶ９－ＲＥＧＡＢＡ－ｅＴＦＳＣＮ１Ａで処置された動物の間で同等であった。ＡＡＶ９－ＲＥＧＡＢＡ－ｅＴＦＳＣＮ１Ａ関連の髄液細胞増加は、観察されなかった。すべての動物にわたる非ニューロン組織のマクロ観察および詳細なミクロ組織病理学検査は、顕著ではなかった。組織は、主な末梢器官（すなわち、心臓、肺、脾臓、肝臓および生殖腺）を含んでいた。ニューロン組織のマクロ観察および詳細なミクロ組織病理学は、任意の注目に値する所見を示さなかった。組織は、脳、脊髄、および関連する後根神経節（頸部、胸部および腰部組織由来）を含んでいた。研究は、専門の神経病理学サイトの１人を含む３人の独立した病理学者によって実施した。
ＡＡＶ９のＩＣＶ投与は、抗ＡＡＶ９キャプシド中和抗体が投与後４週間に観察されたので、血清中の投与後免疫応答を防止しなかった。しかしながら、ＣＳＦ中の中和抗ＡＡＶ９抗体レベルは、未変化のままであり、投与前レベルと同等であった（表２０）。
表20. AAV9血清NAb力価
試料を、投与後２７～２９日間に、スケジュール剖検の間に、主要な器官（心室、肝葉、肺心臓葉、腎臓、脾臓、膵臓および頸部リンパ節）から、収集した。パンチを、８ミリメートルの穿孔を介して収集し、下記に議論するようにさらに処理した。
（実施例１１）
脳中のｅＴＦＳＣＮ１Ａの生体内分布
ｄｄＰＣＲを使用して、脳中のｅＴＦＳＣＮ１Ａ生体内分布を測定した。カニクイザルの脳組織のさまざまな領域由来の試料（ＦＣ：前頭皮質；ＰＣ：頭頂皮質；ＴＣ：側頭皮質；Ｈｉｐ：海馬；Ｍｅｄ：髄質；ＯＣ：後頭皮質）を、ベクターのコピー数について測定して、片側ＩＣＶによってＡＡＶ９が投与された場合のＧＡＢＡ選択的調節エレメント（ＲＥＧＡＢＡ－ｅＴＦＳＣＮ１Ａ）の制御下のｅＴＦＳＣＮ１Ａの生体内分布を評価した。組織ＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅｓキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。ＤＮＡ量を、決定し、ＵＶ分光光度計を使用して正規化した。２０ナノグラムの組織ＤＮＡを、ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒ Ｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ｄＵＴＰなし）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）およびＴａｑＭａｎプライマーと一緒に２０マイクロリットルの反応物に添加し、プローブを、ｅＴＦＳＣＮ１Ａ配列の領域に対して向けた。液滴を発生させ、鋳型を、自動液滴発生器およびサーモサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して増幅した。ＰＣＲステップの後、プレートを、ロードし、ＱＸ２０００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｒｅａｄｅｒによって読み取り、組織中のベクターのコピー数を決定した。サルアルブミン（ＭｆＡｌｂ）遺伝子は、ゲノムＤＮＡ含量を正規化するために内部対照としての役割を果たし、同じ反応物で増幅された。ｅＴＦＳＣＮ１ＡおよびＭｆＡｌｂについてのプライマーおよびプローブを、表２１に記述する。
表21. eTFSCN1AおよびMfAlbについてのプライマーおよびプローブ
ｅＴＦＳＣＮ１Ａは、動物あたり４．８Ｅ＋１３ウイルスゲノムで、１．３～３．５ＶＧ／二倍体ゲノムの平均で投与された場合に、脳全体にわたって広く分布した（図１１）。加えて、動物あたり４．８Ｅ＋１３ウイルスゲノムで投与されたＲＥＧＡＢＡ－ｅＴＦＳＣＮ１Ａの脳全体にわたる遺伝子移入を、さまざまな用量でＩＣＶを介して投与されたｅＧＦＰの脳全体にわたる遺伝子移入と比較した場合、ＶＧ／二倍体ゲノムにおける増加が、用量の増加とともに観察された。これは、ＩＣＶを介してＡＡＶが投与された場合に、脳における遺伝子移入が用量依存的な様式で起こることを示した。
（実施例１２）
脳中のｅＴＦＳＣＮ１Ａ転写
ＧＡＢＡ選択的調節エレメントのＲＥＧＡＢＡの制御下のｅＴＦＳＣＮ１Ａ（ＲＥＧＡＢＡ－ｅＴＦＳＣＮ１Ａ）の転写を、ｄｄＰＣＲに基づく遺伝子発現アッセイを使用してｅＴＦＳＣＮ１Ａ ｍＲＮＡを測定することによって評価した。組織ＲＮＡを、脳組織について、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）またはＲＮｅａｓｙ Ｌｉｐｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。ＲＮＡ量を、決定し、ＵＶ分光光度計を使用して正規化し、ＲＮＡ量（ＲＩＮ）を、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ＲＮＡ Ｃｈｉｐを使用してチェックした。１マイクログラムの組織ＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ合成キットとｅｚＤＮａｓｅ（商標）Ｅｎｚｙｍｅキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いるＤＮａｓｅ処理およびｃＤＮＡ合成のために使用した。５０マイクログラムのＲＮＡを、ｃＤＮＡに変換した。ｃＤＮＡを、ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒ Ｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ｄＵＴＰなし）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）およびＴａｑＭａｎプライマーと一緒に２０μリットルの反応物に添加し、プローブを、ｅＴＦＳＣＮ１Ａ配列（表２２）の領域に対して向けた。液滴を発生させ、鋳型を、自動液滴発生器およびサーモサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して増幅した。ＰＣＲ増幅後、プレートを、ロードし、ＱＸ２０００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｒｅａｄｅｒによって読み取って、組織中の遺伝子発現レベルを提供した。サル遺伝子ＡＲＦＧＡＰ２（ＭｆＡＲＦＧＡＰ２）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、遺伝子発現レベルを正規化するための内因性対照としての役割を果たし、同じ反応物で増幅させた。ＡＲＦＧＡＰ２についての平均転写物は、１．８５Ｅ＋６／ｕｇのＲＮＡであった（図１２、上側境界）。検出限界は、下側境界によって示した。
ｅＴＦＳＣＮ１Ａ ｍＲＮＡは、すべての動物において、脳全体にわたって観察され、ＧＡＢＡ選択的プロモーターのＲＥＧＡＢＡが、ＡＡＶ９－ＲＥＧＡＢＡ－ｅＴＦＳＣＮ１Ａで処置されたマカクすべてについての脳組織中で転写的に活性であったことを示した（図１２）。ＦＣ：前頭皮質；ＰＣ：頭頂皮質；ＴＣ：側頭皮質；Ｈｉｐ：海馬；Ｍｅｄ：髄質；ＯＣ：後頭皮質。
表22. eTFSCN1A配列の領域に対して向けられたTaqManプライマーおよびプローブ
（実施例１３）
末梢組織におけるｅＴＦＳＣＮ１Ａの生体内分布および転写
ベクターのコピー数を、さまざまな器官においてさらに測定し、片側ＩＣＶによってＡＡＶ９が投与された場合に、身体全体にわたる組織中のＲＥＧＡＢＡ－ｅＴＦＳＣＮ１Ａの形質導入を評価した。ｅＴＦＳＣＮ１Ａの転写物レベルも、ｄｄＰＣＲによって測定して、片側ＩＣＶによってＡＡＶ９が投与された場合に、身体全体にわたる組織中のＧＡＢＡ選択的調節エレメントのＲＥＧＡＢＡの制御下のｅＴＦＳＣＮ１Ａの転写活性を評価した。両方の方法を、上記に一般に記載されるようにして行った。脊髄（ＳＣ）および後根神経節（ＤＲＧ）中のＲＥＧＡＢＡ－ｅＴＦＳＣＮ１Ａ形質導入およびｅＴＦＳＣＮ１Ａの転写は、脳中で観察されたレベルと同等であった。肝臓を除いて、ＲＥＧＡＢＡ－ｅＴＦＳＣＮ１Ａ形質導入は、脳の外側の末梢組織において、より低かった（図１３）。肝臓におけるＲＥＧＡＢＡ－ｅＴＦＳＣＮ１Ａの形質導入は、脳中よりも高かった。ｅＴＦＳＣＮ１Ａの転写は、心臓、肺および生殖腺を含む末梢組織において検出されなかった。しかしながら、肝臓におけるｅＴＦＳＣＮ１Ａ転写物レベルは、脳において測定されたｅＴＦＳＣＮ１Ａのレベルと同等であった。さらにまた、肝臓におけるｅＴＦＳＣＮ１Ａ転写は、存在するベクターコピー数に対して正規化された場合に、極めて低かった（脳におけるｅＴＦＳＣＮ１Ａの転写と比較して、およそ１０００倍低い）。全体として、これは、ＧＡＢＡ選択的調節エレメントのＲＥＧＡＢＡの制御下のｅＴＦＳＣＮ１Ａの転写が、ＣＮＳに限定されることを実証した。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
細胞におけるＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させる天然に存在しない転写因子をコードする配列を含む発現カセットであって、前記天然に存在しない転写因子が、少なくとも２つの転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）に、以下の様式：ＴＡＤ１－ＴＡＤ２－ＤＢＤ、ＤＢＤ－ＴＡＤ３－ＴＡＤ４またはＴＡＤ１－ＴＡＤ２－ＤＢＤ－ＴＡＤ３－ＴＡＤ４で作動可能に連結されたＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を含む、発現カセット。
(項目２)
ＴＡＤ１、ＴＡＤ２、ＴＡＤ３およびＴＡＤ４が、独立して、以下：ＶＰ１６、ＶＰ６４、Ｖｉｐｅｒ、ＣＩＴＥＤ２、ＣＩＴＥＤ４、ＣＲＥＢ３、またはそれらの機能的断片から選択される、項目１に記載の発現カセット。
(項目３)
ＴＡＤ１およびＴＡＤ２が、同じＴＡＤである、項目１または２に記載の発現カセット。
(項目４)
ＴＡＤ１およびＴＡＤ２が、ＣＩＴＥＤ２またはその機能的断片である、項目３に記載の発現カセット。
(項目５)
ＴＡＤ１およびＴＡＤ２が、ＣＩＴＥＤ４またはその機能的断片である、項目３に記載の発現カセット。
(項目６)
ＴＡＤ３およびＴＡＤ４が、同じＴＡＤである、項目１～５のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目７)
ＴＡＤ３およびＴＡＤ４が、ＣＩＴＥＤ２またはその機能的断片である、項目６に記載の発現カセット。
(項目８)
ＴＡＤ３およびＴＡＤ４が、ＣＩＴＥＤ４またはその機能的断片である、項目６に記載の発現カセット。
(項目９)
ＴＡＤ１、ＴＡＤ２、ＴＡＤ３およびＴＡＤ４が、同じＴＡＤである、項目１または２に記載の発現カセット。
(項目１０)
ＴＡＤ１、ＴＡＤ２、ＴＡＤ３およびＴＡＤ４が、ＣＩＴＥＤ２またはその機能的断片である、項目９に記載の発現カセット。
(項目１１)
ＴＡＤ１、ＴＡＤ２、ＴＡＤ３およびＴＡＤ４が、ＣＩＴＥＤ４またはその機能的断片である、項目９に記載の発現カセット。
(項目１２)
少なくとも２つのＴＡＤドメインの間にリンカーが存在しない、項目１～１１のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１３)
少なくとも２つのＴＡＤドメインの間にリンカーが存在する、項目１～１１のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１４)
前記リンカーが、ＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号１７７）またはＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号１７８）である、項目１３に記載の発現カセット。
(項目１５)
前記ＤＢＤが、１８～２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する、項目１～１４のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１６)
前記ＤＢＤが、その最も近いヒト対応物と少なくとも８０％の配列同一性を含む、項目１～１５のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１７)
前記ＤＢＤが、その最も近いヒト対応物と少なくとも９０％の配列同一性を含む、項目１６に記載の発現カセット。
(項目１８)
前記ＤＢＤおよび前記少なくとも２つのＴＡＤが、それらの最も近いヒト対応物と少なくとも８０％の配列同一性をそれぞれ含む、項目１～１５のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１９)
前記ＤＢＤおよび前記少なくとも２つのＴＡＤが、それらの最も近いヒト対応物と少なくとも９０％の配列同一性をそれぞれ含む、項目１８に記載の発現カセット。
(項目２０)
前記ＤＢＤが、ガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質を含む、項目１～１５のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目２１)
前記ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質が、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９である、項目２０に記載の発現カセット。
(項目２２)
前記ＤＢＤが、ジンクフィンガードメインを含む、項目１～１９のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目２３)
前記ＤＢＤが、６～９個のジンクフィンガードメインを含む、項目２２に記載の発現カセット。
(項目２４)
前記ＤＢＤが、６個のジンクフィンガーを含む、項目２３に記載の発現カセット。
(項目２５)
前記ＤＢＤが、１８ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する、項目２４に記載の発現カセット。
(項目２６)
前記ＤＢＤが、９個のジンクフィンガーを含む、項目２３に記載の発現カセット。
(項目２７)
前記ＤＢＤが、２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する、項目２６に記載の発現カセット。
(項目２８)
前記ＤＢＤが、配列番号１４８～１５１のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、項目１～１９または２２～２７のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目２９)
前記ＤＢＤが、配列番号１４８～１５１のいずれか１つを有する配列を含む、項目２８に記載の発現カセット。
(項目３０)
前記ＤＢＤが、ヒトＥＧＲ１またはヒトＥＧＲ３に由来する、項目１～１９または２２～２９のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目３１)
前記ＤＢＤが、配列番号７７～９８のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、項目１～１９または２２～３０のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目３２)
前記ＤＢＤが、配列番号７７～９８を含む、項目３１に記載の発現カセット。
(項目３３)
前記ＤＢＤが、配列番号９２と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、項目１に記載の発現カセット。
(項目３４)
前記ＤＢＤが、配列番号９２を含む、項目３３に記載の発現カセット。
(項目３５)
前記天然に存在しない転写因子が、配列番号１３０または１３１と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、項目１に記載の発現カセット。
(項目３６)
前記天然に存在しない転写因子が、配列番号１３０または１３１を含む、項目３５に記載の発現カセット。
(項目３７)
配列番号７２または７３のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の発現カセット。
(項目３８)
配列番号７２または７３のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、項目３７に記載の発現カセット。
(項目３９)
前記発現カセットが、他の細胞型におけるよりもＰＶニューロンにおいてより高いレベルで前記転写因子の発現を駆動する調節エレメントをさらに含む、項目１～３８のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目４０)
前記調節エレメントが、配列番号１～４のいずれか１つを含む、項目３９に記載の発現カセット。
(項目４１)
前記調節エレメントが、配列番号２または３を含む、項目４０に記載の発現カセット。
(項目４２)
前記発現カセットが、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位をさらに含む、項目１～４１のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目４３)
前記ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号７、１４または１５のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を含む、項目４２に記載の発現カセット。
(項目４４)
前記ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号７、１４または１５のいずれか１つを含む、項目４３に記載の発現カセット。
(項目４５)
前記発現カセットが、ウイルスベクターの一部である、項目１～４４のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目４６)
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶウイルスである、項目４５に記載の発現カセット。
(項目４７)
前記ＡＡＶウイルスが、ＡＡＶ９ウイルスまたはｓｃＡＡＶ９ウイルスである、項目４６に記載の発現カセット。
(項目４８)
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスである、項目４５に記載の発現カセット。
(項目４９)
細胞におけるＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させる天然に存在しない転写因子をコードする配列を含む発現カセットであって、前記天然に存在しない転写因子が、転写活性化ドメインに作動可能に連結されたＤＮＡ結合ドメインを含み、前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列ＬＥＰＧＥＫＰ－［ＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳ Ｘ ＨＱＲＴＨ ＴＧＥＫＰ］ｎ－ＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳ Ｘ ＨＱＲＴＨ－ＴＧＫＫＴＳ（配列番号１４７）を含むジンクフィンガータンパク質であり、前記ＤＮＡ結合ドメインおよび前記転写活性化ドメインの間にＨＡタグ（配列番号１７１）が存在しない、発現カセット。
(項目５０)
前記転写活性化ドメインが、ＶＰ１６、ＶＰＲもしくはＶＰ６４配列、またはそれらの機能的断片を含む、項目４９のいずれか一項に記載の発現カセット
(項目５１)
前記転写活性化ドメインが、ＶＰ６４を含む、項目５０に記載の発現カセット
(項目５２)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、１８～２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する、項目４９～５１のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目５３)
ｎ＝６～９である、項目４９～５２のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目５４)
ｎ＝６である、項目５３に記載の発現カセット。
(項目５５)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、１８ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する、項目５４に記載の発現カセット。
(項目５６)
ｎ＝９である、項目５３に記載の発現カセット。
(項目５７)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する、項目５６に記載の発現カセット。
(項目５８)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１４８～１５１のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、項目４９～５７のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目５９)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１４８～１５１のいずれか１つを有する配列を含む、項目５８に記載の発現カセット。
(項目６０)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号７７～９１のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、項目４９～５９のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目６１)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号７７～９１のいずれか１つを含む、項目６０に記載の発現カセット。
(項目６２)
前記発現カセットが、他の細胞型におけるよりもＰＶニューロンにおいてより高いレベルで前記転写因子の発現を駆動する調節エレメントをさらに含む、項目４９～６１のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目６３)
前記調節エレメントが、配列番号１～４のいずれか１つを含む、項目６２に記載の発現カセット。
(項目６４)
前記調節エレメントが、配列番号２または３を含む、項目６３に記載の発現カセット。
(項目６５)
前記天然に存在しない転写因子が、配列番号１２７と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、項目４９に記載の発現カセット。
(項目６６)
前記天然に存在しない転写因子が、配列番号１２７を含む、項目６５に記載の発現カセット。
(項目６７)
配列番号７０または７１のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目４９に記載の発現カセット。
(項目６８)
配列番号７０または７１のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、項目６７に記載の発現カセット。
(項目６９)
前記発現カセットが、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位をさらに含む、項目１～６８のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目７０)
前記ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号７、１４または１５のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を含む、項目６９に記載の発現カセット。
(項目７１)
前記ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号７、１４または１５のいずれか１つを含む、項目７０に記載の発現カセット。
(項目７２)
前記発現カセットが、ウイルスベクターの一部である、項目４９～７１のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目７３)
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶウイルスである、項目７２に記載の発現カセット。
(項目７４)
前記ＡＡＶウイルスが、ＡＡＶ９ウイルスまたはｓｃＡＡＶ９ウイルスである、項目７３に記載の発現カセット。
(項目７５)
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスである、項目７２に記載の発現カセット。
(項目７６)
配列番号１４または１５と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドであって、前記マイクロＲＮＡ結合部位が、興奮性ニューロンにおける導入遺伝子の発現を低減させる、ポリヌクレオチド。
(項目７７)
前記ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号１４を含む、項目７６に記載のポリヌクレオチド。
(項目７８)
前記ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号１５を含む、項目７６に記載のポリヌクレオチド。
(項目７９)
項目７６～７８のいずれか一項に記載のＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位、ならびにプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む発現カセット。
(項目８０)
前記プロモーターおよび／またはエンハンサーが、他の細胞型におけるよりもパルブアルブミン（ＰＶ）ニューロンにおいてより高いレベルで前記導入遺伝子の発現を駆動するＰＶ選択的調節エレメントである、項目７９に記載の発現カセット。
(項目８１)
前記ＰＶ選択的調節エレメントが、導入遺伝子に作動可能に連結されている、項目８０に記載の発現カセット。
(項目８２)
導入遺伝子および少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位に作動可能に連結された調節エレメントを含む発現カセットであって、前記調節エレメントが、他の細胞型におけるよりもパルブアルブミン（ＰＶ）ニューロンにおいてより高いレベルで前記導入遺伝子の発現を駆動し、前記マイクロＲＮＡ結合部位が、興奮性ニューロンにおける前記導入遺伝子の発現を低減させ、前記発現カセットが、配列番号６７を含まない、発現カセット。
(項目８３)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ＭＩＲ１２８（配列番号９）に対する少なくとも１つの結合部位を含む、項目８２に記載の発現カセット。
(項目８４)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ＭＩＲ２２１（配列番号１１）に対する少なくとも１つの結合部位を含む、項目８２または８３に記載の発現カセット。
(項目８５)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ＭＩＲ２２２（配列番号１３）に対する少なくとも１つの結合部位を含む、項目８２～８４のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目８６)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ＭＩＲ１２８（配列番号９）に対する少なくとも１つの結合部位、およびＭＩＲ２２１（配列番号１１）に対する少なくとも１つの結合部位を含む、項目８２に記載の発現カセット。
(項目８７)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ＭＩＲ１２８（配列番号９）に対する少なくとも１つの結合部位、ＭＩＲ２２１（配列番号１１）に対する少なくとも１つの結合部位、およびＭＩＲ２２２（配列番号１３）に対する少なくとも１つの結合部位を含む、項目８２に記載の発現カセット。
(項目８８)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号７、１４または１５のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、項目８２～８４のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目８９)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号７を含む、項目８８に記載の発現カセット。
(項目９０)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号１４を含む、項目８９に記載の発現カセット。
(項目９１)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号１５を含む、項目８９に記載の発現カセット。
(項目９２)
前記導入遺伝子が、細胞におけるＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させる天然に存在しない転写因子を含むポリペプチドをコードする、項目８１～９１のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目９３)
前記転写因子が、１８～２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する、項目９２に記載の発現カセット。
(項目９４)
前記転写因子が、ＤＮＡ結合ドメインを含む、項目９２または９３のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目９５)
前記転写因子が、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含む、項目９２～９４のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目９６)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、その最も近いヒト対応物と少なくとも８０％の配列同一性を含む、項目９２～９５のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目９７)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、その最も近いヒト対応物と少なくとも９０％の配列同一性を含む、項目９６に記載の発現カセット。
(項目９８)
前記ＤＮＡ結合ドメインおよび前記転写活性化ドメインの両方が、それらの最も近いヒト対応物と少なくとも８０％の配列同一性を含む、項目９２～９６のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目９９)
前記ＤＮＡ結合ドメインおよび前記転写活性化ドメインの両方が、それらの最も近いヒト対応物と少なくとも９０％の配列同一性を含む、項目９８に記載の発現カセット。
(項目１００)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質を含む、項目９２～９５のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１０１)
前記ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質が、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９である、項目１００に記載の発現カセット。
(項目１０２)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガードメインを含む、項目９２～９９のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１０３)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、６～９個のジンクフィンガードメインを含む、項目１０２に記載の発現カセット。
(項目１０４)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、６個のジンクフィンガーを含む、項目１０３に記載の発現カセット。
(項目１０５)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、１８ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する、項目１０４に記載の発現カセット。
(項目１０６)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、９個のジンクフィンガーを含む、項目１０３に記載の発現カセット。
(項目１０７)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する、項目１０６に記載の発現カセット。
(項目１０８)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１４８～１５１のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、項目９２～９９または１０２～１０７のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１０９)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１４８～１５１のいずれか１つを有する配列を含む、項目１０８に記載の発現カセット。
(項目１１０)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号９２～９８のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、項目９２～９９または１０２～１０９のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１１１)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号９２～９８のいずれか１つを含む、項目１１０に記載の発現カセット。
(項目１１２)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列ＬＥＰＧＥＫＰ－［ＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳ Ｘ ＨＱＲＴＨ ＴＧＥＫＰ］ｎ－ＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳ Ｘ ＨＱＲＴＨ－ＴＧＫＫＴＳ（配列番号１４７）を含むジンクフィンガータンパク質である、項目９２～９９または１０２～１１１のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１１３)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号７７～９１のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、項目１１１または１１２に記載の発現カセット。
(項目１１４)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号７７～９１のいずれか１つを含む、項目１１３のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１１５)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ヒトＥＧＲ１またはヒトＥＧＲ３に由来する、項目９２～９９または１０２～１１１のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１１６)
前記転写活性化ドメインが、ＶＰ１６、ＶＰＲ、ＶＰ６４、ＣＩＴＥＤ２、ＣＩＴＥＤ４もしくはＣＲＥＢ３配列、またはそれらの機能的断片を含む、項目９５～９９のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１１７)
前記転写活性化ドメインが、ヒトＣＩＴＥＤ２、ＣＩＴＥＤ４もしくはＣＲＥＢ３配列、またはそれらの機能的断片を含む、項目９２～９９のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１１８)
前記調節エレメントが、配列番号１～４のいずれか１つを有する配列を含む、項目８１～１１７のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１１９)
前記調節エレメントが、配列番号２または３を有する配列を含む、項目１１８に記載の発現カセット。
(項目１２０)
前記天然に存在しない転写因子が、配列番号１０５、１０６および１２７～１２９のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、項目８１または８２に記載の発現カセット。
(項目１２１)
前記天然に存在しない転写因子が、配列番号１０５、１０６および１２７～１２９のいずれか１つを含む、項目１２０に記載の発現カセット。
(項目１２２)
前記導入遺伝子が、配列番号７１、７４、７５、７６または１８４のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目８１、８２または１２０に記載の発現カセット。
(項目１２３)
前記導入遺伝子が、配列番号７１、７４、７５、７６または１８４のいずれか１つを含む、項目１２２に記載の発現カセット。
(項目１２４)
前記発現カセットが、ウイルスベクターの一部である、項目８１～１２３のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１２５)
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶウイルスである、項目１２４に記載の発現カセット。
(項目１２６)
前記ＡＡＶウイルスが、ＡＡＶ９ウイルスまたはｓｃＡＡＶ９ウイルスである、項目１２５に記載の発現カセット。
(項目１２７)
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスである、項目１２４に記載の発現カセット。
(項目１２８)
霊長類のパルブアルブミン（ＰＶ）ニューロンにおける導入遺伝子の選択的発現のための方法であって、霊長類に、導入遺伝子および少なくとも１つのマクロＲＮＡ結合部位を含むウイルスベクターを投与するステップを含み、前記マイクロＲＮＡ結合部位が、興奮性ニューロンにおける前記導入遺伝子の発現を低減させる、方法。
(項目１２９)
前記ウイルスベクターが、前記導入遺伝子に作動可能に連結された調節エレメントをさらに含み、前記調節エレメントが、他の細胞型におけるよりもパルブアルブミン（ＰＶ）ニューロンにおいてより高いレベルで前記導入遺伝子の発現を駆動する、項目１２８に記載の方法。
(項目１３０)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ＭＩＲ１２８（配列番号９）に対する少なくとも１つの結合部位を含む、項目１２８または１２９に記載の方法。
(項目１３１)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ＭＩＲ２２１（配列番号１１）に対する少なくとも１つの結合部位を含む、項目１２８～１３０のいずれか一項に記載の方法。
(項目１３２)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ＭＩＲ２２２（配列番号１３）に対する少なくとも１つの結合部位を含む、項目１２８～１３１のいずれか一項に記載の方法。
(項目１３３)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ＭＩＲ１２８（配列番号９）に対する少なくとも１つの結合部位、およびＭＩＲ２２１（配列番号１１）に対する少なくとも１つの結合部位を含む、項目１２８に記載の方法。
(項目１３４)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ＭＩＲ１２８（配列番号９）に対する少なくとも１つの結合部位、ＭＩＲ２２１（配列番号１１）に対する少なくとも１つの結合部位、およびＭＩＲ２２２（配列番号１３）に対する少なくとも１つの結合部位を含む、項目１２８に記載の方法。
(項目１３５)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号７、１４または１５のいずれかと少なくとも９０％の同一性である配列を含む、項目１２８～１３４のいずれか一項に記載の方法。
(項目１３６)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号７を含む、項目１３５に記載の方法。
(項目１３７)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号１４を含む、項目１３５に記載の方法。
(項目１３８)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号１５を含む、項目１３５に記載の方法。
(項目１３９)
前記導入遺伝子が、細胞におけるＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させる天然に存在しない転写因子をコードする配列を含む、項目１２８～１３８のいずれか一項に記載の方法。
(項目１４０)
前記転写因子が、１８～２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する、項目１３９に記載の方法。
(項目１４１)
前記転写因子が、ＤＮＡ結合ドメインを含む、項目１３９または１４０のいずれか一項に記載の方法。
(項目１４２)
前記転写因子が、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含む、項目１３９～１４１のいずれか一項に記載の方法。
(項目１４３)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、その最も近いヒト対応物と少なくとも８０％の配列同一性を含む、項目１３９～１４２のいずれか一項に記載の方法。
(項目１４４)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、その最も近いヒト対応物と少なくとも９０％の配列同一性を含む、項目１４３に記載の方法。
(項目１４５)
前記ＤＮＡ結合ドメインおよび前記転写活性化ドメインの両方が、それらの最も近いヒト対応物と少なくとも８０％の配列同一性を含む、項目１４２または１４３のいずれか一項に記載の方法。
(項目１４６)
前記ＤＮＡ結合ドメインおよび前記転写活性化ドメインの両方が、それらの最も近いヒト対応物と少なくとも９０％の配列同一性を含む、項目１４５に記載の方法。
(項目１４７)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質を含む、項目１３９～１４２のいずれか一項に記載の方法。
(項目１４８)
前記ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質が、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９である、項目１４７に記載の方法。
(項目１４９)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガードメインを含む、項目１３９～１４６のいずれか一項に記載の方法。
(項目１５０)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、６～９個のジンクフィンガードメインを含む、項目１４９に記載の方法。
(項目１５１)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、６個のジンクフィンガーを含む、項目１５０に記載の方法。
(項目１５２)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、１８ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する、項目１５１に記載の方法。
(項目１５３)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、９個のジンクフィンガーを含む、項目１５０に記載の方法。
(項目１５４)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する、項目１５３に記載の方法。
(項目１５５)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、１４８～１５１のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、項目１３９～１４６または１４９～１５４のいずれか一項に記載の方法。
(項目１５６)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１４８～１５１のいずれか１つを有する配列を含む、項目１５５に記載の方法。
(項目１５７)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ヒトＥＧＲ１またはヒトＥＧＲ３に由来する、項目１３９～１４６または１４９～１５６のいずれか一項に記載の方法。
(項目１５８)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号９２～９８のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、項目１３９～１４６または１４９～１５７のいずれか一項に記載の方法。
(項目１５９)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号９２～９８のいずれか１つを含む、項目１５８に記載の方法。
(項目１６０)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列ＬＥＰＧＥＫＰ－［ＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳ Ｘ ＨＱＲＴＨ ＴＧＥＫＰ］ｎ－ＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳ Ｘ ＨＱＲＴＨ－ＴＧＫＫＴＳ（配列番号１４７）を含むジンクフィンガータンパク質である、項目１３９～１４６または１４９～１５６のいずれか一項に記載の方法。
(項目１６１)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号７７～９１のいずれかと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、項目１６０のいずれか一項に記載の方法。
(項目１６２)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号７７～９１のいずれか１つを含む、項目１６１のいずれか一項に記載の方法。
(項目１６３)
前記転写活性化ドメインが、ＶＰ１６、ＶＰＲ、ＶＰ６４、ＣＩＴＥＤ２、ＣＩＴＥＤ４もしくはＣＲＥＢ３配列、またはそれらの機能的断片を含む、項目１４２～１６２のいずれか一項に記載の方法。
(項目１６４)
前記転写活性化ドメインが、ヒトＣＩＴＥＤ２、ＣＩＴＥＤ４もしくはＣＲＥＢ３配列、またはそれらの機能的断片を含む、項目１６３に記載の方法。
(項目１６５)
前記調節エレメントが、配列番号１～４のいずれか１つを有する配列を含む、項目１２８～１６４のいずれか一項に記載の方法。
(項目１６６)
前記調節エレメントが、配列番号２または３を有する配列を含む、項目１６５に記載の方法。
(項目１６７)
前記天然に存在しない転写因子が、配列番号１０５、１０６および１２７～１２９のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、項目１３９に記載の方法。
(項目１６８)
前記天然に存在しない転写因子が、配列番号１０５、１０６および１２７～１２９のいずれか１つを含む、項目１６７に記載の方法。
(項目１６９)
前記導入遺伝子が、配列番号７１、７４、７５、７６または１８４のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目１３９に記載の方法。
(項目１７０)
前記導入遺伝子が、配列番号７１、７４、７５、７６または１８４のいずれか１つを含む、項目１６９に記載の方法。
(項目１７１)
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶウイルスである、項目１２８～１７０のいずれか一項に記載の方法。
(項目１７２)
前記ＡＡＶウイルスが、ＡＡＶ９ウイルスまたはｓｃＡＡＶ９ウイルスである、項目１７１に記載の方法。
(項目１７３)
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスである、項目１２８～１７０のいずれか一項に記載の方法。
(項目１７４)
前記霊長類が、ヒトである、項目１２８～１７３のいずれか一項に記載の方法。
(項目１７５)
前記霊長類が、非ヒト霊長類である、項目１２８～１７３のいずれか一項に記載の方法。
(項目１７６)
前記非ヒト霊長類が、旧世界ザル、オランウータン、ゴリラ、チンパンジー、マーモセット、カニクイザル、アカゲザルまたはブタオザルである、項目１７５に記載の方法。
(項目１７７)
細胞におけるＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させる天然に存在しない転写因子をコードする配列を含む発現カセットであって、前記天然に存在しない転写因子が、配列番号１２８または１２９と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、発現カセット。
(項目１７８)
前記天然に存在しない転写因子が、配列番号１２８または１２９を含む、項目１７７に記載の発現カセット。
(項目１７９)
項目１～１２７または１７７～１７８のいずれか一項に記載の発現カセットを投与することによる、細胞におけるＳＣＮ１Ａの発現を増加させる方法。
(項目１８０)
前記細胞が、ＰＶニューロンである、項目１７９に記載の方法。
(項目１８１)
前記細胞が、対象内にある、項目１７９または１８０のいずれか一項に記載の方法。
(項目１８２)
前記対象が、哺乳動物である、項目１８１に記載の方法。
(項目１８３)
前記対象が、ヒトである、項目１８２に記載の方法。
(項目１８４)
ＳＣＮ１Ａの発現を増加させることが、疾患、障害または症状を処置する、項目１７９～１８３のいずれか一項に記載の方法。
(項目１８５)
前記障害が、中枢神経系障害である、項目１８４に記載の方法。
(項目１８６)
前記障害が、ＳＣＮ１Ａハプロ不全に関連するてんかんである、項目１８５に記載の方法。
(項目１８７)
前記ハプロ不全が、前記ＳＣＮ１Ａ遺伝子の機能欠失変異についてヘテロ接合性である前記対象の結果である、項目１８６に記載の方法。
(項目１８８)
前記障害が、前記ＳＣＮ１Ａ遺伝子における、挿入、欠失、逆位または置換に関連するてんかんである、項目１８７に記載の方法。
(項目１８９)
前記障害が、前記ＳＣＮ１Ａ遺伝子における点変異に関連するてんかんである、項目１８８に記載の方法。
(項目１９０)
前記障害が、ドラベ症候群である、項目１８６～１８９のいずれか一項に記載の方法。
(項目１９１)
前記中枢神経系障害の症状が、ニューロン活動亢進である、項目１８５～１９０のいずれか一項に記載の方法。
(項目１９２)
前記中枢神経系障害を処置することが、ニューロン活動亢進を低減させることを含む、項目１９１に記載の方法。
(項目１９３)
前記中枢神経系障害の症状が、発作である、項目１８５～１９０のいずれか一項に記載の方法。
(項目１９４)
前記中枢神経系障害を処置することが、発作の頻度を低減させることを含む、項目１９３に記載の方法。
(項目１９５)
前記中枢神経系障害を処置することが、発作の重症度を低減させることを含む、項目１９３または１９４のいずれか一項に記載の方法。
(項目１９６)
前記細胞が、ニューロン細胞である、項目１７９に記載の方法。
(項目１９７)
前記ニューロン細胞が、単極ニューロン、双極ニューロン、多極ニューロンまたは偽単極ニューロンからなる群から選択される、項目１９６に記載の方法。
(項目１９８)
前記細胞が、ＧＡＢＡ作動性ニューロンである、項目１９６に記載の方法。
(項目１９９)
前記細胞が、非ニューロン細胞である、項目１７９に記載の方法。
(項目２００)
前記細胞が、グリア細胞である、項目１９９に記載の方法。
(項目２０１)
前記グリア細胞が、星状膠細胞、乏突起膠細胞、上衣細胞、シュワン細胞および衛星細胞からなる群から選択される、項目２００に記載の方法。
(項目２０２)
項目１～１２７または１７７～１７８のいずれか一項に記載の発現カセットを投与することによる、前記ＣＮＳにおけるＳＣＮ１Ａの発現を増加させる方法。
(項目２０３)
ＳＣＮ１Ａの前記増加した発現が、脳において起こる、項目２０２のいずれか一項に記載の方法。
(項目２０４)
ＳＣＮ１Ａの前記増加した発現が、前頭皮質、頭頂皮質、側頭皮質、海馬、髄質および／または後頭皮質において起こる、項目２０３に記載の方法。
(項目２０５)
ＳＣＮ１Ａの前記増加した発現が、脊椎において起こる、項目２０２のいずれか一項に記載の方法。
(項目２０６)
ＳＣＮ１Ａの前記増加した発現が、脊髄および／または後根神経節において起こる、項目２０５に記載の方法。

Claims (27)

  1. 操作された転写因子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、前記操作された転写因子が、配列番号１２７のアミノ酸配列を含み、前記核酸配列が、前記核酸配列の発現を促進するために前記操作された転写因子をコードする前記核酸配列に作動可能に連結した調節エレメントをさらに含み、それにより、発現カセットを形成する、ポリヌクレオチド。
  2. 前記調節エレメントが、ＧＡＤ２プロモーター、ヒトシナプシンプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ｍｉｎＣＭＶプロモーター、ＴＡＴＡボックス、スーパーコアプロモーターもしくはＥＦ１αプロモーター、またはそれらの組合せを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 前記調節エレメントが、パルブアルブミン（ＰＶ）ニューロン選択調節エレメントである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  4. 前記調節エレメントが、配列番号２～４のいずれか１つを含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
  5. 前記調節エレメントが、配列番号２を含む、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
  6. 前記発現カセットが興奮性ニューロンにおける前記操作された転写因子の発現を阻害するマイクロＲＮＡ結合部位をさらに含み、前記マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号７、１４または１５を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  7. 前記マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号７を含む、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
  8. 前記ポリヌクレオチドが配列番号７１の核酸配列を含む、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
  9. 請求項１～８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  10. 前記発現ベクターがウイルスベクターである、請求項９に記載の発現ベクター。
  11. 前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項１０に記載の発現ベクター。
  12. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ｓｃＡＡＶ、ｓｃＡＡＶ１、ｓｃＡＡＶ２、ｓｃＡＡＶ５、ｓｃＡＡＶ８、ｓｃＡＡＶ９および任意のこれらのハイブリッドからなる群から選択される血清型を有する、請求項１１に記載の発現ベクター。
  13. 前記発現カセットが、５’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列および３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列をさらに含む、請求項１１または１２に記載の発現ベクター。
  14. 前記５’ＡＡＶ ＩＴＲ配列および前記３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列が、互いに独立して、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に由来するＩＴＲ配列である、請求項１３に記載の発現ベクター。
  15. 前記発現カセットが配列番号７１を含む、請求項９～１４のいずれか一項に記載の発現ベクター。
  16. 前記発現カセットが５’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列および３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列を有するＡＡＶを含み、前記ＡＡＶがＡＡＶ９であり、前記５’ＡＡＶ ＩＴＲ配列および前記３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列がＡＡＶ２に由来する、請求項１５に記載の発現ベクター。
  17. （ａ）請求項１～８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項９～１６のいずれか一項に記載の発現ベクター、および（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  18. ドラベ症候群に関連する症状の処置における使用のための、請求項１７に記載の医薬組成物。
  19. 前記症状が発作であり、前記処置が、発作の重症度、発作の頻度、または、発作の重症度と頻度を低減させることを含む、請求項１８に記載の使用のための医薬組成物。
  20. 請求項１～８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項９～１６のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む細胞。
  21. 前記細胞が２９３細胞、Ａ５４９細胞またはＨｅＬａ細胞である、請求項２０に記載の細胞。
  22. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンの製造方法であって、
    ａ）請求項２０または２１に記載の細胞を、組換えＡＡＶビリオンを産生するための条件下で培養する工程、
    ｂ）前記細胞の培養物を回収する工程、および
    ｃ）前記細胞により産生された前記組換えＡＡＶビリオンを精製する工程
    を含む、方法。
  23. 細胞におけるＳＣＮ１Ａ発現の増加のための組成物であって、請求項１～８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項９～１６のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む、組成物。
  24. 前記細胞が、対象内にある、請求項２３に記載の組成物。
  25. 前記対象が、ヒトである、請求項２４に記載の組成物。
  26. 前記細胞におけるＳＣＮ１Ａの発現の増加が、ＳＣＮ１Ａに関連する疾患または障害を処置する、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の組成物。
  27. 前記障害が、ＳＣＮ１Ａハプロ不全に関連するてんかんである、請求項２６に記載の組成物。
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