CN107759673B - 可对hbv的dna进行表观甲基化修饰的蛋白分子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程生物医药技术领域，具体为可对乙型肝炎病毒基因的DNA进行表观甲基化修饰的蛋白分子及其应用。本发明根据生物信息学及表观遗传工程和免疫学原理，设计了具有针对乙肝病毒基因靶向特异性亲和作用、且可对HBV基因的DNA进行表观甲基化修饰，进而使HBV基因沉默的全新蛋白分子；将该蛋白克隆于各种表达载体导入人、动物体内或细胞内，可高效表达出针对HBV靶向特异的蛋白分子，并对HBV病毒基因产生高效甲基化化学修饰；经在动物体内和体外细胞内实验验证，具有高效长期阻断HBV基因表达的功能，从而实现慢性感染者体内病毒持续沉默，实现抗乙肝病毒的细胞内免疫治疗效果，具有广泛的应用前景。

Description

可对HBV的DNA进行表观甲基化修饰的蛋白分子及其应用

技术领域

本发明属于基因工程生物医药技术领域，具体涉及一种可对乙型肝炎病毒基因的DNA进行表观甲基化修饰的蛋白分子及其应用。

背景技术

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）致病过程中，通常呈现慢性肝炎、肝硬化及肝癌典型的病理进程三步曲，机体可发生染色体和基因序列水平上的突变，包括染色体缺失与重排、非整倍性、基因扩大与突变等传统分子遗传学的变化，HBV慢性感染已成为全球健康的一个主要问题。目前全世界有近3.5亿人为乙型肝炎病毒慢性感染者，我国也是乙肝高发区，约有1.2亿乙肝携带者。其中有1/4的感染者会发展成严重的肝脏疾病，且每年约有1000万以上的新增感染者，约60万人死于HBV急性和慢性感染相关疾病，目前尚缺乏有效的治疗方法。HBV慢性感染治疗的总体目标是：最大限度地长期抑制HBV，减轻炎症和纤维化，延缓疾病进展及并发症的发生。

核苷（酸）类药物（NAs）是临床最常用的抗 HBV 感染治疗药物，包括拉米夫定（lamivudine, LAM）、恩替卡韦（entecavir, ETV）、替比夫定（tebivudine, LdT）和阿德福韦酯（adefovir dipivoxil, ADV），这些药物直接作用于HBV的反转录酶及DNA多聚酶，可显著抑制病毒的复制但却无法清除肝细胞内的共价闭合环状DNA (covalently closedcircular DNA, cccDNA)。而且，上述药物在停止用药后会有强烈的反跳现象，造成严重的病理后果甚至死亡。如何长期有效抑制HBV的复制与表达成为一个急需解决的重要生命科学问题。

HBV感染肝细胞后，其部分双链环状的基因组进入肝细胞核，生成cccDNA。cccDNA在肝细胞核内以微染色体的形式存在，结合多种人体组蛋白，持续表达前基因组RNA和各种病毒蛋白的mRNA。通过软件预测，3.2 kb的HBV基因组上有3个CpG岛。岛1大小在55～281 bp的位置，含有表面抗原的ATG起始密码子；岛2在1228～1663 bp，含有增强子l和X基因启动子；岛3在2295～2446bp处，含有聚合酶ATG起始密码子。CpG岛2含CG序列较多，且多为基因调控序列，因此天然可作为人工甲基化干预的靶序列。HBV复制的肝肿瘤细胞系，正常人肝细胞均可利用DNA甲基化转移酶（DNAmethyltrans, DNMTs）对cccDNA进行甲基化修饰。

基因治疗的核心问题是选用安全有效的载体并将治疗基因导入靶细胞。腺病毒(Adenovirus, Ad)载体具有宿主范围广、效率高、稳定、安全、易操作等优点而备受重视,具有明显的噬肝性，因此是慢性肝炎及肝癌基因治疗的首选载体。

本研究选择亚洲流行的HBV毒种作为细胞模型和动物模型的病原，针对HBV CpGII的X P核心序列设计特异结合的蛋白，并与具有催化DNA甲基化酶结构域融合，采用腺病毒进行包装，通过对HBV XP的靶向甲基化，实现了对HBV病毒表达实现可持续的沉默效应。

发明内容

本发明目的是提供一种能够调控抗乙型肝炎病毒的胞内免疫的蛋白分子及其应用。

本发明通过对HBV XP的靶向甲基化，期望对HBV病毒表达实现可持续的沉默效应，为乙肝病毒的防治与治疗提供相应的理论基础和技术手段。

本发明提供的蛋白分子，其氨基酸序列为SEQ.ID. No.1所示，命名为HBeM。该蛋白分子可与乙型肝炎病毒 CpGII的X基因启动子核心序列特异结合，并可对乙型肝炎病毒基因的DNA进行表观甲基化修饰。

本发明还提供上述HBeM蛋白的基因，其DNA核苷酸序列为SEQ.ID.No.2所示。

本发明还提供能够编码上述的HBeM蛋白，且能与HBV的DNA结合的HBeM蛋白结构域，其氨基酸序列为SEQ.ID.No.3所示。

本发明还提供能够编码上述的HBeM蛋白，且能与HBV的DNA结合的HBeM蛋白结构域，其核苷酸序列为SEQ.ID.No.4所示。

本发明还提供能够编码上述的HBeM蛋白，且可对HBV的DNA进行甲基化修饰的HBeM蛋白结构域，其氨基酸序列为SEQ.ID.No.5所示。

本发明还提供能够编码上述的HBeM蛋白，且可对HBV的DNA进行甲基化修饰的HBeM蛋白结构域，其氨基酸序列为SEQ.ID.No.6所示。

本发明还提供用于克隆所述HBeM的基因（核苷酸序列为SEQ.ID.No.2）腺病毒表达载体或慢病毒表达载体，或其他任何哺乳细胞表达载体，其结构如图1.所示。

本发明还提供上述的HBeM蛋白、HBeM蛋白的基因、如SEQ.ID.No.2-- SEQ.ID.No.6所示的HBeM蛋白结构域，以及用于克隆所述HBeM的基因的表达载体，在制备乙型肝炎病毒基因工程药物中的应用，制备的药物可注射及口服或粘膜给药。

本发明还提供上述的HBeM蛋白、HBeM蛋白的基因、如SEQ.ID.No.2-- SEQ.ID.No.6所示的HBeM蛋白结构域，以及用于克隆所述HBeM的基因的表达载体，在制备使HBV基因沉默的制剂中的应用。在体内和细胞内试验证实，可有效的降低乙肝病毒含量，从而对HBV表达实现可持续的基因沉默。

本发明首先设计针对HBV XP的DNA结合蛋白介导DNA甲基化酶，其活性域进行融合连接，所有质粒均用腺病毒包装，其氨基酸序列为SEQ.ID.No.1所示。

本发明结合生物信息学手段，分析HBV DNA序列CpG和基因启动子间的位置关系，确定可作为甲基化修饰研究的基因启动子；然后采用相应软件，设计具有针对DNA序列特异性识别和结合功能蛋白结构域来介导甲基化酶的靶向修饰，即XP特异性结合蛋白。

本发明选择人甲基化酶重组至pcDNA3.1上并在Ｎ端串联表达X启动子特异性结合蛋白（XPZF），并进行腺病毒包装，XP靶向DNA甲基化酶结构域的构建见模式图（见附图1）。

本发明使用的腺病毒（Adenovirus, Ad），该载体能有效地将外源基因转移到各种靶细胞或组织中。感染性强，能感染分化后的非分裂期细胞。在Ad生活周期中，其基因不整合到宿主细胞中，无插入突变激活癌基因的危险，外源基因能游离地表达。

附图说明

图1是HBeM-AdV腺病毒表达质粒结构。

图2 是HBeM-AdV的HBeM基因免疫荧光表达图谱。

图3是HBeM-AdV的HBeM基因表达在肝细胞中的蛋白表达图谱。

图4是HBeM-AdV使肝细胞HBV病毒甲基化率显著提高。

图5 是HBeM-AdV使细胞中HBV病毒复制转录下降图谱。

图6是HBeM-AdV对HBV转基因小鼠的抗病毒免疫注射治疗效果图。

具体实施方式

一、HBV稳定转染细胞系的筛选及构建

本发明采用pcDNA3.1构建了HBV全基因组1.3倍体，转染HepG2细胞后可自主复制HBV病毒，经过G418筛选，得到稳定分泌病毒颗粒和标志抗原的细胞株HepG2-HBV 1.3，并且该细胞株所依赖的HBV病毒是代表东亚地区流行株C基因型。

二、HBV X基因启动子特异性结合的设计和合成

采用ZF Tools Ver3.0软件，根据HBV XP区CpG位点，选择最佳序列，设计特异性结合蛋白。所选用的针对HBV XP的DNA结合蛋白介导DNA甲基化酶的氨基酸序列为SEQ.ID.No.3，SEQ.ID. No.5。相应的DNA结合结构域核苷酸序列为SEQ.ID.No.4，SEQ.ID.No.6。采用Reverse Translate软件转换为核苷酸序列SEQ.ID.No.4和SEQ.ID.No.6，合成克隆至载体。

三、HBV靶向特异性HBeM基因表达载体的构建及腺病毒包装

将人工合成的编码HBeM的DNA片段克隆重组至pcDNA3.1上，其中串联表达X启动子特异性结合蛋白结构域和甲基化酶结构域，并且克隆于腺病毒载体，进行包装（图1）。

四、HBV XP靶向甲基化酶对HBV XP的甲基化及抗病毒作用

1. EMSA实验检测结合蛋白介导甲基化酶与HBV XP核心序列的结合特异性结果显示，所有腺病毒包装的结合蛋白介导甲基化酶可通过结合有效特异结合HBV X启动子的核心序列。本发明设计的结合蛋白介导DNA甲基化酶，与HBV的DNA靶向结构域融合连接，结果表明，HBeM于HepG2-HBV1.3细胞和肝细胞中可高效表达（图2、图3），并M-TgHBV转基因小鼠肝脏的HBV XP序列具有较强的甲基化修饰功能，且具有可持续性（图4）。本发明中形态学的结果进一步证明，在HBeM对HBV XP序列发生甲基化作用的过程中，HepG2-HBV1.3细胞核及M-TgHBV转基因小鼠肝脏胞核的甲基化酶的表达均明显提高，从而可加大核内发生特异性甲基化修饰的概率（图4）。

2.本发明的HBeM表达载体导入细胞和动物体内，以Southern blot实验检测并在DNA水平上证实HBV XP 区域的DNA高甲基化可影响HBV的复制，转录合成前基因组pgRNA的前体，pgRNA前体与聚合酶被核衣壳包裹，形成核心颗粒，移至细胞浆。核心颗粒内，pgRNA在逆转录酶的作用下转录HBV负链，然后以负链为模板生成各种转录子包括subgenome（图5）。

3.Nouthern blot的实验结果进一步证实结合蛋白介导DNA甲基化酶在DNA水平即可降低HBV的复制中间体，因此可间接发挥对HBV RNA转录子的抑制（图5）。

4.以HBV靶向特异性HBeM基因表达载体或包装的腺病毒10⁸ pfu/mouse剂量对HBV转基因小鼠体内（静脉或腹腔）免疫治疗注射，实验结果证实，对HBV转基因小鼠的病毒HBsAg的分泌具有长期的高效抑制作用（见图6）。综上，结合HBV复制、转录及表达的各个生活周期阶段，均表明通过HBeM的靶向甲基化，可影响HBV的扩大生长，从而达到有效沉默HBV的表达，使HBV始终处于较低的复制水平。

综上，本发明针对HBV CpGII的X P核心序列设计特异结合的蛋白，并与甲基化酶的催化域融合以构建XP靶向DNA甲基化酶，采用腺病毒进行包装，通过对HBV XP的靶向甲基化，期望对HBV病毒表达实现可持续的沉默效应。

本发明证实HBeM具有持续特异甲基化修饰的功能，同时对HBV的复制中间体、主要转录子及表达抑制具有持续性，因此可以作为基因治疗乙肝病毒的一种有效方法，该方法为乙肝病毒治疗提供了基础性的可供选择的技术手段。

序列表

<110> 复旦大学

<120> 可对HBV的DNA进行表观甲基化修饰的蛋白分子及其应用

<130> 001

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1102

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1 5 10 15

Leu Glu Pro Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser

20 25 30

Phe Ser Gln Ser Ser Asn Leu Val Arg His Gln Arg Thr His Thr Gly

35 40 45

Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Glu Arg

50 55 60

Ser His Leu Arg Glu His Gln Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr

65 70 75 80

Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Thr

85 90 95

Thr His Gln Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu

100 105 110

Cys Gly Lys Ser Phe Ser Asp Pro Gly Ala Leu Val Arg His Gln Arg

115 120 125

Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser

130 135 140

Phe Ser Arg Asn Asp Thr Leu Thr Glu His Gln Arg Thr His Thr Gly

145 150 155 160

Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Arg Ala

165 170 175

Asp Asn Leu Thr Glu His Gln Arg Thr His Thr Gly Lys Lys Thr Ser

180 185 190

Gly Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Glu Lys

195 200 205

Arg Lys Pro Ile Arg Val Leu Ser Leu Phe Asp Gly Ile Ala Thr Gly

210 215 220

Leu Leu Val Leu Lys Asp Leu Gly Ile Gln Val Asp Arg Tyr Ile Ala

225 230 235 240

Ser Glu Val Cys Glu Asp Ser Ile Thr Val Gly Met Val Arg His Gln

245 250 255

Gly Lys Ile Met Tyr Val Gly Asp Val Arg Ser Val Thr Gln Lys His

260 265 270

Ile Gln Glu Trp Gly Pro Phe Asp Leu Val Ile Gly Gly Ser Pro Cys

275 280 285

Asn Asp Leu Ser Ile Val Asn Pro Ala Arg Lys Gly Leu Tyr Glu Gly

290 295 300

Thr Gly Arg Leu Phe Phe Glu Phe Tyr Arg Leu Leu His Asp Ala Arg

305 310 315 320

Pro Lys Glu Gly Asp Asp Arg Pro Phe Phe Trp Leu Phe Glu Asn Val

325 330 335

Val Ala Met Gly Val Ser Asp Lys Arg Asp Ile Ser Arg Phe Leu Glu

340 345 350

Ser Asn Pro Val Met Ile Asp Ala Lys Glu Val Ser Ala Ala His Arg

355 360 365

Ala Arg Tyr Phe Trp Gly Asn Leu Pro Gly Met Asn Arg Pro Leu Ala

370 375 380

Ser Thr Val Asn Asp Lys Leu Glu Leu Gln Glu Cys Leu Glu His Gly

385 390 395 400

Arg Ile Ala Lys Phe Ser Lys Val Arg Thr Ile Thr Thr Arg Ser Asn

405 410 415

Ser Ile Lys Gln Gly Lys Asp Gln His Phe Pro Val Phe Met Asn Glu

420 425 430

Lys Glu Asp Ile Leu Trp Cys Thr Glu Met Glu Arg Val Phe Gly Phe

435 440 445

Pro Val His Tyr Thr Asp Val Ser Asn Met Ser Arg Leu Ala Arg Gln

450 455 460

Arg Leu Leu Gly Arg Ser Trp Ser Val Pro Val Ile Arg His Leu Phe

465 470 475 480

Ala Pro Leu Lys Glu Tyr Phe Ala Cys Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly

485 490 495

Gly Gly Gly Ser Lys Ile Arg Val Asn Lys Phe Tyr Arg Pro Glu Asn

500 505 510

Thr His Lys Ser Thr Pro Ala Ser Tyr His Ala Asp Ile Asn Leu Leu

515 520 525

Tyr Trp Ser Asp Glu Glu Ala Val Val Asp Phe Lys Ala Val Gln Gly

530 535 540

Arg Cys Thr Val Glu Tyr Gly Glu Asp Leu Pro Glu Cys Val Gln Val

545 550 555 560

Tyr Ser Met Gly Gly Pro Asn Arg Phe Tyr Phe Leu Glu Ala Tyr Asn

565 570 575

Ala Lys Ser Lys Ser Phe Glu Asp Pro Pro Asn His Ala Arg Ser Pro

580 585 590

Gly Asn Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Pro Lys Ser

595 600 605

Gln Ala Cys Glu Pro Ser Glu Pro Glu Ile Glu Ile Lys Leu Pro Lys

610 615 620

Leu Arg Thr Leu Asp Val Phe Ser Gly Cys Gly Gly Leu Ser Glu Gly

625 630 635 640

Phe His Gln Ala Gly Ile Ser Asp Thr Leu Trp Ala Ile Glu Met Trp

645 650 655

Asp Pro Ala Ala Gln Ala Phe Arg Leu Asn Asn Pro Gly Ser Thr Val

660 665 670

Phe Thr Glu Asp Cys Asn Ile Leu Leu Lys Leu Val Met Ala Gly Glu

675 680 685

Thr Thr Asn Ser Arg Gly Gln Arg Leu Pro Gln Lys Gly Asp Val Glu

690 695 700

Met Leu Cys Gly Gly Pro Pro Cys Gln Gly Phe Ser Gly Met Asn Arg

705 710 715 720

Phe Asn Ser Arg Thr Tyr Ser Lys Phe Lys Asn Ser Leu Val Val Ser

725 730 735

Phe Leu Ser Tyr Cys Asp Tyr Tyr Arg Pro Arg Phe Phe Leu Leu Glu

740 745 750

Asn Val Arg Asn Phe Val Ser Phe Lys Arg Ser Met Val Leu Lys Leu

755 760 765

Thr Leu Arg Cys Leu Val Arg Met Gly Tyr Gln Cys Thr Phe Gly Val

770 775 780

Leu Gln Ala Gly Gln Tyr Gly Val Ala Gln Thr Arg Arg Arg Ala Ile

785 790 795 800

Ile Leu Ala Ala Ala Pro Gly Glu Lys Leu Pro Leu Phe Pro Glu Pro

805 810 815

Leu His Val Phe Ala Pro Arg Ala Cys Gln Leu Ser Val Val Val Asp

820 825 830

Asp Lys Lys Phe Val Ser Asn Ile Thr Arg Leu Ser Ser Gly Pro Phe

835 840 845

Arg Thr Ile Thr Val Arg Asp Thr Met Ser Asp Leu Pro Glu Val Arg

850 855 860

Asn Gly Ala Ser Ala Leu Glu Ile Ser Tyr Asn Gly Glu Pro Gln Ser

865 870 875 880

Trp Phe Gln Arg Gln Leu Arg Gly Ala Gln Tyr Gln Pro Ile Leu Arg

885 890 895

Asp His Ile Cys Lys Asp Met Ser Ala Leu Val Ala Ala Arg Met Arg

900 905 910

His Ile Pro Leu Ala Pro Gly Ser Asp Trp Arg Asp Leu Pro Asn Ile

915 920 925

Glu Val Arg Leu Ser Asp Gly Thr Met Ala Arg Lys Leu Arg Tyr Thr

930 935 940

His His Asp Arg Lys Asn Gly Arg Ser Ser Ser Gly Ala Leu Arg Gly

945 950 955 960

Val Cys Ser Cys Val Glu Ala Gly Lys Ala Cys Asp Pro Ala Ala Arg

965 970 975

Gln Phe Asn Thr Leu Ile Pro Trp Cys Leu Pro His Thr Gly Asn Arg

980 985 990

His Asn His Trp Ala Gly Leu Tyr Gly Arg Leu Glu Trp Asp Gly Phe

995 1000 1005

Phe Ser Thr Thr Val Thr Asn Pro Glu Pro Met Gly Lys Gln Gly Arg

1010 1015 1020

Val Leu His Pro Glu Gln His Arg Val Val Ser Val Arg Glu Cys Ala

1025 1030 1035 1040

Arg Ser Gln Gly Phe Pro Asp Thr Tyr Arg Leu Phe Gly Asn Ile Leu

1045 1050 1055

Asp Lys His Arg Gln Val Gly Asn Ala Val Pro Pro Pro Leu Ala Lys

1060 1065 1070

Ala Ile Gly Leu Glu Ile Lys Leu Cys Met Leu Ala Lys Ala Arg Glu

1075 1080 1085

Ser Ala Ser Ala Lys Ile Lys Glu Glu Glu Ala Ala Lys Asp

1090 1095 1100

<210> 2

<211> 3309

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggattaca aggatgacga cgataagccc aagaagaagc gcaaggtgct ggaaccgggc 60

gaaaaaccgt ataaatgccc ggaatgcggc aaaagcttta gccagagcag caacctggtg 120

cgccatcagc gcacccatac cggcgaaaaa ccgtataaat gcccggaatg cggcaaaagc 180

tttagcgaac gcagccatct gcgcgaacat cagcgcaccc ataccggcga aaaaccgtat 240

aaatgcccgg aatgcggcaa aagctttagc cgcagcgatc atctgaccac ccatcagcgc 300

acccataccg gcgaaaaacc gtataaatgc ccggaatgcg gcaaaagctt tagcgatccg 360

ggcgcgctgg tgcgccatca gcgcacccat accggcgaaa aaccgtataa atgcccggaa 420

tgcggcaaaa gctttagccg caacgatacc ctgaccgaac atcagcgcac ccataccggc 480

gaaaaaccgt ataaatgccc ggaatgcggc aaaagcttta gccgcgcgga taacctgacc 540

gaacatcagc gcacccatac cggcaaaaaa accagcggcc gcggcggcgg cggcagcggc 600

ggcggcggca gcccagctga gaagaggaag cccatccggg tgctgtctct ctttgatgga 660

atcgctacag ggctcctggt gctgaaggac ttgggcattc aggtggaccg ctacattgcc 720

tcggaggtgt gtgaggactc catcacggtg ggcatggtgc ggcaccaggg gaagatcatg 780

tacgtcgggg acgtccgcag cgtcacacag aagcatatcc aggagtgggg cccattcgat 840

ctggtgattg ggggcagtcc ctgcaatgac ctctccatcg tcaaccctgc tcgcaagggc 900

ctctacgagg gcactggccg gctcttcttt gagttctacc gcctcctgca tgatgcgcgg 960

cccaaggagg gagatgatcg ccccttcttc tggctctttg agaatgtggt ggccatgggc 1020

gttagtgaca agagggacat ctcgcgattt ctcgagtcca accctgtgat gattgatgcc 1080

aaagaagtgt cagctgcaca cagggcccgc tacttctggg gtaaccttcc cggtatgaac 1140

aggccgttgg catccactgt gaatgataag ctggagctgc aggagtgtct ggagcatggc 1200

aggatagcca agttcagcaa agtgaggacc attactacga ggtcaaactc cataaagcag 1260

ggcaaagacc agcattttcc tgtcttcatg aatgagaaag aggacatctt atggtgcact 1320

gaaatggaaa gggtatttgg tttcccagtc cactatactg acgtctccaa catgagccgc 1380

ttggcgaggc agagactgct gggccggtca tggagcgtgc cagtcatccg ccacctcttc 1440

gctccgctga aggagtattt tgcgtgtgtg ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 1500

aaaatccggg tcaacaagtt ctacaggcct gagaacaccc acaagtccac tccagcgagc 1560

taccacgcag acatcaacct gctctactgg agcgacgagg aggccgtggt ggacttcaag 1620

gctgtgcagg gccgctgcac cgtggagtat ggggaggacc tgcccgagtg cgtccaggtg 1680

tactccatgg gcggccccaa ccgcttctac ttcctcgagg cctataatgc aaagagcaaa 1740

agctttgaag atcctcccaa ccatgcccgt agccctggaa acaaagggaa gggcaaggga 1800

aaagggaagg gcaagcccaa gtcccaagcc tgtgagccga gcgagccaga gatagagatc 1860

aagctgccca agctgcggac cctggatgtg ttttctggct gcggggggtt gtcggaggga 1920

ttccaccaag caggcatctc tgacacgctg tgggccatcg agatgtggga ccctgcggcc 1980

caggcgttcc ggctgaacaa ccccggctcc acagtgttca cagaggactg caacatcctg 2040

ctgaagctgg tcatggctgg ggagaccacc aactcccgcg gccagcggct gccccagaag 2100

ggagacgtgg agatgctgtg cggcgggccg ccctgccagg gcttcagcgg catgaaccgc 2160

ttcaattcgc gcacctactc caagttcaaa aactctctgg tggtttcctt cctcagctac 2220

tgcgactact accggccccg gttcttcctc ctggagaatg tcaggaactt tgtctccttc 2280

aagcgctcca tggtcctgaa gctcaccctc cgctgcctgg tccgcatggg ctatcagtgc 2340

accttcggcg tgctgcaggc cggtcagtac ggcgtggccc agactaggag gcgggccatc 2400

atcctggccg cggcccctgg agagaagctc cctctgttcc cggagccact gcacgtgttt 2460

gctccccggg cctgccagct gagcgtggtg gtggatgaca agaagtttgt gagcaacata 2520

accaggttga gctcgggtcc tttccggacc atcacggtgc gagacacgat gtccgacctg 2580

ccggaggtgc ggaatggagc ctcggcactg gagatctcct acaacgggga gcctcagtcc 2640

tggttccaga ggcagctccg gggcgcacag taccagccca tcctcaggga ccacatctgt 2700

aaggacatga gtgcattggt ggctgcccgc atgcggcaca tccccttggc cccagggtca 2760

gactggcgcg atctgcccaa catcgaggtg cggctctcag acggcaccat ggccaggaag 2820

ctgcggtata cccaccatga caggaagaac ggccgcagca gctctggggc cctccgtggg 2880

gtctgctcct gcgtggaagc cggcaaagcc tgcgaccccg cagccaggca gttcaacacc 2940

ctcatcccct ggtgcctgcc ccacaccggg aaccggcaca accactgggc tggcctctat 3000

ggaaggctcg agtgggacgg cttcttcagc acaaccgtca ccaaccccga gcccatgggc 3060

aagcagggcc gcgtgctcca cccagagcag caccgtgtgg tgagcgtgcg ggagtgtgcc 3120

cgctcccagg gcttccctga cacctaccgg ctcttcggca acatcctgga caagcaccgg 3180

caggtgggca atgccgtgcc accgcccctg gccaaagcca ttggcttgga gatcaagctt 3240

tgtatgttgg ccaaagcccg agagagtgcc tcagctaaaa taaaggagga ggaagctgct 3300

aaggactag 3309

<210> 3

<211> 176

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Leu Glu Pro Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser

1 5 10 15

Phe Ser Gln Ser Ser Asn Leu Val Arg His Gln Arg Thr His Thr Gly

20 25 30

Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Glu Arg

35 40 45

Ser His Leu Arg Glu His Gln Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr

50 55 60

Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Thr

65 70 75 80

Thr His Gln Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu

85 90 95

Cys Gly Lys Ser Phe Ser Asp Pro Gly Ala Leu Val Arg His Gln Arg

100 105 110

Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser

115 120 125

Phe Ser Arg Asn Asp Thr Leu Thr Glu His Gln Arg Thr His Thr Gly

130 135 140

Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Arg Ala

145 150 155 160

Asp Asn Leu Thr Glu His Gln Arg Thr His Thr Gly Lys Lys Thr Ser

165 170 175

<210> 4

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctggaaccgg gcgaaaaacc gtataaatgc ccggaatgcg gcaaaagctt tagccagagc 60

agcaacctgg tgcgccatca gcgcacccat accggcgaaa aaccgtataa atgcccggaa 120

tgcggcaaaa gctttagcga acgcagccat ctgcgcgaac atcagcgcac ccataccggc 180

gaaaaaccgt ataaatgccc ggaatgcggc aaaagcttta gccgcagcga tcatctgacc 240

acccatcagc gcacccatac cggcgaaaaa ccgtataaat gcccggaatg cggcaaaagc 300

tttagcgatc cgggcgcgct ggtgcgccat cagcgcaccc ataccggcga aaaaccgtat 360

aaatgcccgg aatgcggcaa aagctttagc cgcaacgata ccctgaccga acatcagcgc 420

acccataccg gcgaaaaacc gtataaatgc ccggaatgcg gcaaaagctt tagccgcgcg 480

gataacctga ccgaacatca gcgcacccat accggcaaaa aaaccagcgg ccgc 534

<210> 5

<211> 898

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Pro Ala Glu Lys Arg Lys Pro Ile Arg Val Leu Ser Leu Phe Asp Gly

1 5 10 15

Ile Ala Thr Gly Leu Leu Val Leu Lys Asp Leu Gly Ile Gln Val Asp

20 25 30

Arg Tyr Ile Ala Ser Glu Val Cys Glu Asp Ser Ile Thr Val Gly Met

35 40 45

Val Arg His Gln Gly Lys Ile Met Tyr Val Gly Asp Val Arg Ser Val

50 55 60

Thr Gln Lys His Ile Gln Glu Trp Gly Pro Phe Asp Leu Val Ile Gly

65 70 75 80

Gly Ser Pro Cys Asn Asp Leu Ser Ile Val Asn Pro Ala Arg Lys Gly

85 90 95

Leu Tyr Glu Gly Thr Gly Arg Leu Phe Phe Glu Phe Tyr Arg Leu Leu

100 105 110

His Asp Ala Arg Pro Lys Glu Gly Asp Asp Arg Pro Phe Phe Trp Leu

115 120 125

Phe Glu Asn Val Val Ala Met Gly Val Ser Asp Lys Arg Asp Ile Ser

130 135 140

Arg Phe Leu Glu Ser Asn Pro Val Met Ile Asp Ala Lys Glu Val Ser

145 150 155 160

Ala Ala His Arg Ala Arg Tyr Phe Trp Gly Asn Leu Pro Gly Met Asn

165 170 175

Arg Pro Leu Ala Ser Thr Val Asn Asp Lys Leu Glu Leu Gln Glu Cys

180 185 190

Leu Glu His Gly Arg Ile Ala Lys Phe Ser Lys Val Arg Thr Ile Thr

195 200 205

Thr Arg Ser Asn Ser Ile Lys Gln Gly Lys Asp Gln His Phe Pro Val

210 215 220

Phe Met Asn Glu Lys Glu Asp Ile Leu Trp Cys Thr Glu Met Glu Arg

225 230 235 240

Val Phe Gly Phe Pro Val His Tyr Thr Asp Val Ser Asn Met Ser Arg

245 250 255

Leu Ala Arg Gln Arg Leu Leu Gly Arg Ser Trp Ser Val Pro Val Ile

260 265 270

Arg His Leu Phe Ala Pro Leu Lys Glu Tyr Phe Ala Cys Val Gly Gly

275 280 285

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Ile Arg Val Asn Lys Phe Tyr

290 295 300

Arg Pro Glu Asn Thr His Lys Ser Thr Pro Ala Ser Tyr His Ala Asp

305 310 315 320

Ile Asn Leu Leu Tyr Trp Ser Asp Glu Glu Ala Val Val Asp Phe Lys

325 330 335

Ala Val Gln Gly Arg Cys Thr Val Glu Tyr Gly Glu Asp Leu Pro Glu

340 345 350

Cys Val Gln Val Tyr Ser Met Gly Gly Pro Asn Arg Phe Tyr Phe Leu

355 360 365

Glu Ala Tyr Asn Ala Lys Ser Lys Ser Phe Glu Asp Pro Pro Asn His

370 375 380

Ala Arg Ser Pro Gly Asn Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly

385 390 395 400

Lys Pro Lys Ser Gln Ala Cys Glu Pro Ser Glu Pro Glu Ile Glu Ile

405 410 415

Lys Leu Pro Lys Leu Arg Thr Leu Asp Val Phe Ser Gly Cys Gly Gly

420 425 430

Leu Ser Glu Gly Phe His Gln Ala Gly Ile Ser Asp Thr Leu Trp Ala

435 440 445

Ile Glu Met Trp Asp Pro Ala Ala Gln Ala Phe Arg Leu Asn Asn Pro

450 455 460

Gly Ser Thr Val Phe Thr Glu Asp Cys Asn Ile Leu Leu Lys Leu Val

465 470 475 480

Met Ala Gly Glu Thr Thr Asn Ser Arg Gly Gln Arg Leu Pro Gln Lys

485 490 495

Gly Asp Val Glu Met Leu Cys Gly Gly Pro Pro Cys Gln Gly Phe Ser

500 505 510

Gly Met Asn Arg Phe Asn Ser Arg Thr Tyr Ser Lys Phe Lys Asn Ser

515 520 525

Leu Val Val Ser Phe Leu Ser Tyr Cys Asp Tyr Tyr Arg Pro Arg Phe

530 535 540

Phe Leu Leu Glu Asn Val Arg Asn Phe Val Ser Phe Lys Arg Ser Met

545 550 555 560

Val Leu Lys Leu Thr Leu Arg Cys Leu Val Arg Met Gly Tyr Gln Cys

565 570 575

Thr Phe Gly Val Leu Gln Ala Gly Gln Tyr Gly Val Ala Gln Thr Arg

580 585 590

Arg Arg Ala Ile Ile Leu Ala Ala Ala Pro Gly Glu Lys Leu Pro Leu

595 600 605

Phe Pro Glu Pro Leu His Val Phe Ala Pro Arg Ala Cys Gln Leu Ser

610 615 620

Val Val Val Asp Asp Lys Lys Phe Val Ser Asn Ile Thr Arg Leu Ser

625 630 635 640

Ser Gly Pro Phe Arg Thr Ile Thr Val Arg Asp Thr Met Ser Asp Leu

645 650 655

Pro Glu Val Arg Asn Gly Ala Ser Ala Leu Glu Ile Ser Tyr Asn Gly

660 665 670

Glu Pro Gln Ser Trp Phe Gln Arg Gln Leu Arg Gly Ala Gln Tyr Gln

675 680 685

Pro Ile Leu Arg Asp His Ile Cys Lys Asp Met Ser Ala Leu Val Ala

690 695 700

Ala Arg Met Arg His Ile Pro Leu Ala Pro Gly Ser Asp Trp Arg Asp

705 710 715 720

Leu Pro Asn Ile Glu Val Arg Leu Ser Asp Gly Thr Met Ala Arg Lys

725 730 735

Leu Arg Tyr Thr His His Asp Arg Lys Asn Gly Arg Ser Ser Ser Gly

740 745 750

Ala Leu Arg Gly Val Cys Ser Cys Val Glu Ala Gly Lys Ala Cys Asp

755 760 765

Pro Ala Ala Arg Gln Phe Asn Thr Leu Ile Pro Trp Cys Leu Pro His

770 775 780

Thr Gly Asn Arg His Asn His Trp Ala Gly Leu Tyr Gly Arg Leu Glu

785 790 795 800

Trp Asp Gly Phe Phe Ser Thr Thr Val Thr Asn Pro Glu Pro Met Gly

805 810 815

Lys Gln Gly Arg Val Leu His Pro Glu Gln His Arg Val Val Ser Val

820 825 830

Arg Glu Cys Ala Arg Ser Gln Gly Phe Pro Asp Thr Tyr Arg Leu Phe

835 840 845

Gly Asn Ile Leu Asp Lys His Arg Gln Val Gly Asn Ala Val Pro Pro

850 855 860

Pro Leu Ala Lys Ala Ile Gly Leu Glu Ile Lys Leu Cys Met Leu Ala

865 870 875 880

Lys Ala Arg Glu Ser Ala Ser Ala Lys Ile Lys Glu Glu Glu Ala Ala

885 890 895

Lys Asp

<210> 6

<211> 2697

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccagctgaga agaggaagcc catccgggtg ctgtctctct ttgatggaat cgctacaggg 60

ctcctggtgc tgaaggactt gggcattcag gtggaccgct acattgcctc ggaggtgtgt 120

gaggactcca tcacggtggg catggtgcgg caccagggga agatcatgta cgtcggggac 180

gtccgcagcg tcacacagaa gcatatccag gagtggggcc cattcgatct ggtgattggg 240

ggcagtccct gcaatgacct ctccatcgtc aaccctgctc gcaagggcct ctacgagggc 300

actggccggc tcttctttga gttctaccgc ctcctgcatg atgcgcggcc caaggaggga 360

gatgatcgcc ccttcttctg gctctttgag aatgtggtgg ccatgggcgt tagtgacaag 420

agggacatct cgcgatttct cgagtccaac cctgtgatga ttgatgccaa agaagtgtca 480

gctgcacaca gggcccgcta cttctggggt aaccttcccg gtatgaacag gccgttggca 540

tccactgtga atgataagct ggagctgcag gagtgtctgg agcatggcag gatagccaag 600

ttcagcaaag tgaggaccat tactacgagg tcaaactcca taaagcaggg caaagaccag 660

cattttcctg tcttcatgaa tgagaaagag gacatcttat ggtgcactga aatggaaagg 720

gtatttggtt tcccagtcca ctatactgac gtctccaaca tgagccgctt ggcgaggcag 780

agactgctgg gccggtcatg gagcgtgcca gtcatccgcc acctcttcgc tccgctgaag 840

gagtattttg cgtgtgtggg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcaa aatccgggtc 900

aacaagttct acaggcctga gaacacccac aagtccactc cagcgagcta ccacgcagac 960

atcaacctgc tctactggag cgacgaggag gccgtggtgg acttcaaggc tgtgcagggc 1020

cgctgcaccg tggagtatgg ggaggacctg cccgagtgcg tccaggtgta ctccatgggc 1080

ggccccaacc gcttctactt cctcgaggcc tataatgcaa agagcaaaag ctttgaagat 1140

cctcccaacc atgcccgtag ccctggaaac aaagggaagg gcaagggaaa agggaagggc 1200

aagcccaagt cccaagcctg tgagccgagc gagccagaga tagagatcaa gctgcccaag 1260

ctgcggaccc tggatgtgtt ttctggctgc ggggggttgt cggagggatt ccaccaagca 1320

ggcatctctg acacgctgtg ggccatcgag atgtgggacc ctgcggccca ggcgttccgg 1380

ctgaacaacc ccggctccac agtgttcaca gaggactgca acatcctgct gaagctggtc 1440

atggctgggg agaccaccaa ctcccgcggc cagcggctgc cccagaaggg agacgtggag 1500

atgctgtgcg gcgggccgcc ctgccagggc ttcagcggca tgaaccgctt caattcgcgc 1560

acctactcca agttcaaaaa ctctctggtg gtttccttcc tcagctactg cgactactac 1620

cggccccggt tcttcctcct ggagaatgtc aggaactttg tctccttcaa gcgctccatg 1680

gtcctgaagc tcaccctccg ctgcctggtc cgcatgggct atcagtgcac cttcggcgtg 1740

ctgcaggccg gtcagtacgg cgtggcccag actaggaggc gggccatcat cctggccgcg 1800

gcccctggag agaagctccc tctgttcccg gagccactgc acgtgtttgc tccccgggcc 1860

tgccagctga gcgtggtggt ggatgacaag aagtttgtga gcaacataac caggttgagc 1920

tcgggtcctt tccggaccat cacggtgcga gacacgatgt ccgacctgcc ggaggtgcgg 1980

aatggagcct cggcactgga gatctcctac aacggggagc ctcagtcctg gttccagagg 2040

cagctccggg gcgcacagta ccagcccatc ctcagggacc acatctgtaa ggacatgagt 2100

gcattggtgg ctgcccgcat gcggcacatc cccttggccc cagggtcaga ctggcgcgat 2160

ctgcccaaca tcgaggtgcg gctctcagac ggcaccatgg ccaggaagct gcggtatacc 2220

caccatgaca ggaagaacgg ccgcagcagc tctggggccc tccgtggggt ctgctcctgc 2280

gtggaagccg gcaaagcctg cgaccccgca gccaggcagt tcaacaccct catcccctgg 2340

tgcctgcccc acaccgggaa ccggcacaac cactgggctg gcctctatgg aaggctcgag 2400

tgggacggct tcttcagcac aaccgtcacc aaccccgagc ccatgggcaa gcagggccgc 2460

gtgctccacc cagagcagca ccgtgtggtg agcgtgcggg agtgtgcccg ctcccagggc 2520

ttccctgaca cctaccggct cttcggcaac atcctggaca agcaccggca ggtgggcaat 2580

gccgtgccac cgcccctggc caaagccatt ggcttggaga tcaagctttg tatgttggcc 2640

aaagcccgag agagtgcctc agctaaaata aaggaggagg aagctgctaa ggactag 2697

Claims (4)

1. 一种能与乙型肝炎病毒 CpGII的X基因启动子核心序列特异结合，并可对乙型肝炎病毒基因的DNA进行表观甲基化修饰的蛋白分子，其氨基酸序列为SEQ.ID. No.1所示，命名为HBeM。

2.一种编码如权利要求1所述的HBeM蛋白的基因，其DNA核苷酸序列为SEQ.ID.No.2所示。

3.如权利要求1所述的HBeM蛋白、权利要求2所述的编码HBeM蛋白的基因在制备乙型肝炎病毒基因工程药物中的应用。

4.如权利要求1所述的HBeM蛋白、权利要求2所述的编码HBeM蛋白的基因在制备使HBV基因沉默的制剂中的应用。

Images