KR102541652B1 - 히스톤 또는 루신 지퍼의 인테그라제로의 삽입을 통한 안전한 레트로바이러스 벡터 구축 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 히스톤 또는 루신 지퍼의 인테그라제로의 도입을 통해 구축한 레트로바이러스 벡터, 이의 구축 방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 히스톤 또는 루신 지퍼를 인테그라제 유전자의 37번째 및 273번째 잔기 앞에 삽입하여 전사 개시 부위(transcriptional start site; TSS)에 대한 통합 (integration) 선호도를 소멸시킴으로써, 발암 유전자를 과발현시킬 수 있는 위험성을 제거하므로 임상 응용 및 질병 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

히스톤 또는 루신 지퍼의 인테그라제로의 삽입을 통한 안전한 레트로바이러스 벡터 구축 방법 {Safe retroviral vectors developed by insertion of histone or leucine zipper into the viral integrase}

본 발명은 히스톤 또는 루신 지퍼의 인테그라제로의 도입을 통해 구축한 레트로바이러스 벡터, 이의 구축 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

레트로바이러스 벡터는 최대 8kb의 큰 유전자 단위를 탑재할 수 있으며, 특별한 면역 반응을 일으키지 않는다. 또한, 다른 유형의 바이러스 벡터와는 달리, 레트로바이러스 벡터는 치료용 유전자의 인간 게놈으로의 통합을 통해 장기적인 유전자 발현을 가능케 한다.

오랫동안 연구되어온 마우스 백혈병 바이러스 (Murine leukemia virus; 이하, MLV)는 레트로바이러스 벡터를 개발하기 위한 플랫폼으로 사용되었다. 레트로바이러스 벡터는 X 염색체 연관 중증 복합 면역 결핍 (X-linked severe combined immunodeficiency; SCID-X1), 아데노신 디아미나제 결핍 및 중증 종합 면역 결핍 (adenosine deaminase deficiency-severe combined immunodeficiency; ADA-SCID) 및 Wiskott-Aldrich 증후군 (Wiskott-Aldrich syndrome; WAS) 등의 유전 질환을 치료하는데 사용되어 왔다. 이러한 시도는 환자에게 거의 완전한 치료 효과를 가져왔다.

최근, ADA-SCID 환자를 치료하기 위한 MLV 벡터 기반 유전자 치료 약물인 스트림벨리스 (Strimvelis)가 유럽에서 승인되었다. 스트림벨리스는 인간 아데노신 디아미나제를 코딩하는 유전자를 탑재한 레트로바이러스 벡터가 도입된 CD34+ 세포를 사용하는 요법이다.

추가적으로 두 가지 승인된 레트로바이러스 기반 치료제가 있다. 잘목시스 (Zalmoxis)는 절단된 형태의 인간 저 친화성 신경 성장 인자 수용체 (△LNGFR) 및 돌연변이된 단순 포진 I형 바이러스 티미딘키나제 (HSV-TK Mut2)를 암호화하는 유전자를 탑재한 레트로바이러스 벡터가 도입된 동종 이형 T 세포를 기초로 한다 (HSV-TK Mut2). 예스카다 (Yescarta)는 레트로바이러스 벡터를 적용하여 키메라 항원 수용체를 표면에 발현하도록 조작된 T 세포로 구성된 요법이다.

치료적 사용에 대한 그들의 긍정적인 특성과는 대조적으로, MLV-기반 레트로바이러스 벡터는 발암 가능성을 갖는다. 이러한 불리한 특성은 실험 및 임상적으로 검증되었다. MLV의 발암 가능성은 유전자 발현 조절에 관여하는 인간 게놈 부위를 MLV가 선호하는 것과 관련 있다. 특히, 레트로바이러스가 종양 유전자 TSS 근처의 게놈 부위에 삽입될 때, 해당 유전자가 활성화될 수 있고, 이로부터 통합된 레트로바이러스를 가지는 세포가 암세포로 변형될 수 있다. 이처럼 MLV 고유의, 특정 인간 유전체 부분 삽입 선호는 임상 적용에서 벡터 플랫폼으로서 광범위하게 사용되는 것을 제한한다.

MLV의 인간유전체로의 삽입 패턴은 부분적으로 바이러스 인테그라제와 브로모 도메인 및 외부 말단 (bromodomain and extra-terminal; BET) 패밀리 단백질과의 상호 작용과 관련이 있는 것으로 최근 보고되었다. 이러한 발견에 기초하여 바이러스 인테그라제를 돌연변이 시키거나 작은 분자 (BET 단백질과 염색체의 결합을 선택적으로 방해하는)를 세포 내로 도입함으로써 관련 상호 작용을 차단하려는 여러 시도가 있었다. 이러한 방법들은 TSS를 포함한 조절 게놈 도메인으로의 MLV 삽입을 감소시킬 수 있다. 그러나 조절하려는 영역으로의 바이러스 삽입 빈도는 무작위 확률보다 여전히 훨씬 높다. 이러한 결과는 추가적인 숙주 인자 또는 알려지지 않은 여러 메커니즘들이 MLV의 인간 게놈 특정 영역 삽입 선호도에 기여함을 나타낸다.

다른 유형의 레트로바이러스인 인간 면역 결핍 바이러스 (human immunodeficiency virus; HIV-1)는 상피 유래 성장 인자 (LEDGF/p75)가 전사 단위 (Transcriptional units)로 삽입되도록 유도하는 메커니즘을 따르는 것으로 알려져 있다. 그러나, LEDGF/p75를 암호화하는 유전자의 제거로는 전사 단위로의 HIV-1 삽입을 완전히 차단할 수 없음도 관찰되었다. 추가 숙주 인자 (간세포 유래 성장 인자-관련 단백질 2 [hepatoma-derived growth factor-related protein 2; HRP-2)]) 또한 바이러스 삽입전-복합체 (pro-integration complex)를 특정 선호 게놈 영역으로 인도한다는 발견은, 바이러스 삽입 사이트 결정에 관여하는 숙주 인자에 대한 제한된 지식으로는, HIV-1 삽입 패턴을 완전히 전환하기 어려움을 보여준다.

알려지지 않은 숙주 인자의 작용 모두를 완전히 차단하기는 불가능하므로, 본 발명자들은 대신 레트로바이러스 인테그라제 구조를 교란시켜 레트로바이러스 유전자 삽입 패턴을 변경시키려는 시도를 하였다.

본 발명자들은 인테그라제의 내부 사이트에 히스톤과 루신 지퍼를 삽입하여 TSS를 선호하는 MLV 기반 레트로바이러스 벡터의 유전자 삽입 패턴을 변경하였다. 결과, TSS에 대한 선호도가 무작위 수준으로 낮아진 유전자 삽입 패턴을 얻었다.

또한, 인테그라제 돌연변이는 발암성 영역으로의 레트로바이러스 삽입 빈도를 크게 감소시켰다. 야생형 및 돌연변이 인테그라제의 예측된 구조 비교로부터 변경된 레트로바이러스의 유전자 삽입 패턴이 히스톤과 루신 지퍼의 삽입에 의한 것으로 추정되는, 해당 효소의 일부 하위 도메인 구조상 변화와 관련이 있음을 유추하였다.

인테그라제의 구조적 변형은 삽입된 단백질과 해당 바이러스 단백질의 서브 도메인 사이에 새로 형성된 수소 결합과 부분적으로 연관된다고 추정하였다. 발명자가 얻은 결과는 인테그라제 구조를 정교하게 변화시키는 것이 안전한 레트로바이러스 벡터를 구축하는 좋은 방법임을 보여준다.

이에 본 발명자들은 레트로바이러스 유전자 삽입 패턴을 변경하기 위해 히스톤 또는 루신 지퍼 단백질을 MLV 특정 내부 부위에 도입하였다. 히스톤은 다른 유형의 히스톤과 상호 작용할 수 있으며 루신 지퍼는 다른 루신 지퍼와 이합체를 형성할 수 있다. 두 가지 유형 단백질의 이러한 특성에 기초하여, 본 발명자들은 해당 단백질이 바이러스 인테그라제 내부에 도입될 때, MLV 유전자 삽입 패턴에서 큰 변화가 생김을 확인하였다.

이에, 본 발명의 목적은 히스톤 또는 루신 지퍼의 인테그라제로의 도입을 통해 구축한 레트로바이러스 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 히스톤 또는 루신 지퍼의 인테그라제로의 도입을 통한 레트로바이러스 벡터 구축 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 히스톤 또는 루신 지퍼의 인테그라제로의 도입을 통해 구축한 레트로바이러스 벡터의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명은 히스톤 또는 루신 지퍼의 인테그라제로의 도입을 통한 안전한 레트로바이러스 벡터 구축 방법에 관한 것이다.

본 발명은 히스톤 또는 루신 지퍼를 인테그라제 단백질의 37번째 및/또는 273번째 잔기 앞에 도입하여 전사 개시 부위 (transcriptional start site; TSS)에 대한 삽입 (integration) 선호도를 소멸시킴으로써, 구축된 벡터가 발암 유전자를 과발현시킬 수 있는 위험성을 제거하고 임상 응용 및 질병 치료에 유용하게 사용될 수 있도록 할 것이다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 예는 히스톤 또는 루신 지퍼를 코딩하는 유전자를 레트로바이러스 벡터의 주요소인 Gag-Pol 발현을 위한 유전자 내로 도입하는 것에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 레트로바이러스 벡터는 MLV-기반 레트로바이러스 벡터, HIV-1 기반 레트로바이러스 벡터, ASLV 기반 레트로바이러스 벡터인 것일 수 있으며, 예를 들어, MLV-기반 레트로바이러스 벡터인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 히스톤 또는 루신 지퍼를 코딩하는 유전자는 인테그라제를 코딩하는 유전자에 도입된 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 인테그라제는 MLV 인테그라제, HIV-1 인테그라제, ASLV 인테그라제 등인 것일 수 있으며, 예를 들어, MLV 인테그라제인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 인테그라제를 코딩하는 유전자는 서열번호 83의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 83의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 인테그라제는 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 84의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 히스톤은 서열번호 70 내지 76으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 70 내지 76으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 히스톤을 코딩하는 유전자는 서열번호 52 내지 58로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 52 내지 58로 이루어진 군에서 선택된 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 히스톤은 C-말단, N-말단 또는 양 말단에 제1 링커를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 히스톤을 코딩하는 유전자는 3', 5'또는 이들 모두에 제1 링커를 코딩하는 유전자를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 제1 링커는 통상의 기술자가 사용하는 어떠한 링커도 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 제1 링커는 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 77의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 제1 링커를 코딩하는 유전자는 서열번호 59의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 59의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 루신 지퍼는 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 NZ 서열 및 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 CZ 서열; 또는 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 Jun 서열 및 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 Fos 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 78의 아미노산 서열로 이루어진 NZ 서열 및 서열번호 79의 아미노산 서열로 이루어진 CZ 서열; 또는 서열번호 80의 아미노산 서열로 이루어진 Jun 서열 및 서열번호 81의 아미노산 서열로 이루어진 Fos 서열을 을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 NZ 서열을 코딩하는 유전자는 서열번호 60의 염기서열을 포함하는 염기서열인 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 60의 염기서열로 이루어진 염기서열인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 CZ 서열을 코딩하는 유전자는 서열번호 61의 염기서열을 포함하는 염기서열인 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 61의 염기서열로 이루어진 염기서열인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 Jun 서열을 코딩하는 유전자는 서열번호 62의 염기서열을 포함하는 염기서열인 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 62의 염기서열로 이루어진 염기서열인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 Fos 서열을 코딩하는 유전자는 서열번호 63의 염기서열을 포함하는 염기서열인 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 63의 염기서열로 이루어진 염기서열인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 루신 지퍼는 C-말단, N-말단 또는 양 말단에 제2 링커를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 루신 지퍼를 코딩하는 유전자는 3', 5'또는 이들 모두에 제2 링커를 코딩하는 유전자를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 NZ 서열과 CZ 서열; 또는 Jun 서열과 Fos 서열은 제2 링커를 통해 연결된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 제2 링커는 통상의 기술자가 사용하는 어떠한 링커도 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 제2 링커는 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 82의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 제2 링커를 코딩하는 유전자는 서열번호 64 내지 서열번호 69로 이루어진 군에서 선택된 1종의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 64 내지 서열번호 69로 이루어진 군에서 선택된 1종의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 루신 지퍼가 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 NZ 서열 및 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 CZ 서열을 포함하는 것일 경우, 루신 지퍼를 코딩하는 유전자는 5'에는 서열번호 64를 포함하는 제2 링커를 코딩하는 유전자를 포함하고, 3'에는 서열번호 66을 포함하는 제2 링커를 코딩하는 유전자를 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 5'에는 서열번호 64로 이루어진 제2 링커를 코딩하는 유전자를 포함하고, 3'에는 서열번호 66으로 이루어진 제2 링커를 코딩하는 유전자를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 루신 지퍼가 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 Jun 서열 및 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 Fos 서열을 포함하는 것일 경우, 루신 지퍼를 코딩하는 유전자는 5'에는 서열번호 67를 포함하는 제2 링커를 코딩하는 유전자를 포함하고, 3'에는 서열번호 69을 포함하는 제2 링커를 코딩하는 유전자를 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 5'에는 서열번호 67로 이루어진 제2 링커를 코딩하는 유전자를 포함하고, 3'에는 서열번호 69로 이루어진 제2 링커를 코딩하는 유전자를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, NZ 서열과 CZ 서열이 제2 링커를 통해 연결된 경우, 제2 링커를 코딩하는 유전자는 서열번호 65의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 65의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, Jun 서열과 Fos 서열이 제2 링커를 통해 연결된 경우, 제2 링커를 코딩하는 유전자는 서열번호 68의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 68의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 히스톤을 코딩하는 유전자 또는 루신 지퍼를 코딩하는 유전자는 인테그라제를 코딩하는 유전자의 108 또는 816 번 위치 다음에 삽입된 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 히스톤 또는 루신 지퍼는 인테그라제의 37 또는 273 번 잔기 앞에 삽입된 것일 수 있다. 이를 통해 전사 개시 부위 (transcriptional start site; TSS)에 대한 삽입 (integration) 선호도를 소멸시킴으로써, 발암 유전자를 과발현시킬 수 있는 위험성이 제거되고 임상 응용 및 질병 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터인 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 재조합 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

본 발명의 벡터 생산을 위한 유전자의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 방법을 사용할 수 있다. 상기 방법은, 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 일 예는 하기의 단계를 포함하는 히스톤 또는 루신 지퍼를 코딩하는 유전자가 도입된 레트로바이러스 벡터 구축 방법에 관한 것이다.

히스톤 또는 루신 지퍼를 코딩하는 유전자를 준비하는 유전자 준비 단계; 및

유전자를 레트로바이러스 인테그라제 유전자에 도입하는 도입 단계.

본 발명에 있어서 도입 단계는 히스톤 또는 루신 지퍼를 코딩하는 유전자를 인테그라제를 코딩하는 유전자에 도입하는 것일 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서 히스톤 또는 루신 지퍼에 대한 기재는 기 상술한 바와 동일하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 방법에 있어서 히스톤 또는 루신 지퍼를 코딩하는 유전자에 대한 기재는 기 상술한 바와 동일하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 일 예는 히스톤 또는 루신 지퍼의 인테그라제로의 도입을 통해 구축된 안전한 레트로바이러스 벡터의 용도에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 용도는 다양한 동물 및 인간 세포로의 유전자 도입을 통한 치료 효과 획득 (유전자 치료)용, 목적 유전자를 다양한 동물 및 인간 세포 유전체로 도입하여 연구, 치료 목적을 가진 새로운 세포 개발용, 암을 포함한 다양한 질환을 치료하기 위한 면역치료제 개발용일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 용도에 있어서 레트로바이러스 벡터 및 이의 구축 방법에 대해서는 기 상술한 바와 동일하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명은 히스톤 또는 루신 지퍼의 인테그라제로의 도입을 통해 구축한 레트로바이러스 벡터, 이의 구축 방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 히스톤 또는 루신 지퍼를 인테그라제 단백질의 37번째 및/또는 273번째 잔기 앞에 삽입하여 전사 개시 부위 (transcriptional start site; TSS)에 대한 유전자 삽입 (integration) 선호도를 소멸시킴으로써, 발암 유전자를 과발현시킬 수 있는 위험성을 제거하므로 임상 응용 및 질병 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 히스톤 또는 루신 지퍼를 포함하는 돌연변이 MLV 인테그라제의 구성을 보여주는 그림이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 벡터의 형질 도입 역가 (Transducing titer)를 보여주는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 코딩 유전자의 TSSs 5kb 내의 게놈 부위로의 레트로바이러스 벡터 삽입 빈도를 보여주는 그래프이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 TSS로부터 5kb 이내 레트로바이러스 벡터 삽입 분포를 보여주는 그래프이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 TSS로부터 50kb 이내 레트로바이러스 벡터 삽입 분포를 보여주는 그래프이다.
도 4c는 본 발명의 일 실시예에 따른 TSS로부터의 거리에 따른 바이러스 삽입 누적 빈도를 보여주는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 발암 부위 레트로바이러스 벡터 삽입 빈도를 보여주는 그래프이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 CpG 섬 근처 레트로바이러스 벡터 삽입 빈도를 보여주는 그래프이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 cis 조절 요소 근처 레트로바이러스 벡터 삽입 빈도를 보여주는 그래프이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 CpG 섬 및 cis-조절 요소로부터 5kb 내 레트로바이러스 벡터 삽입 분포를 보여주는 그래프이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 CpG 섬 및 cis-조절 요소에서 50kb의 범위에서 레트로바이러스 벡터 삽입의 공간적 분포를 보여주는 그래프이다.
도 7c는 본 발명의 일 실시예에 따른 CpG 섬으로부터의 거리에 따른 레트로바이러스 벡터 삽입 누적 빈도를 보여주는 그래프이다.
도 7d는 본 발명의 일 실시예에 따른 cis-조절 요소로부터의 거리에 따른 레트로바이러스 벡터 삽입 누적 빈도를 보여주는 그래프이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따른 야생형 및 돌연변이 인테그라제의 예측된 구조를 보여주는 그림이다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따른 MLV 인테그라제와 삽입된 히스톤 (H3.3) 사이의 수소 결합 형성을 예측한 결과 그림이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실험 방법

인테그라제 돌연변이체를 코딩하는 플라스미드의 구축

7 가지 유형의 히스톤 및 2 가지 유형의 루신 지퍼를 코딩하는 유전자를 MLV 인테그라제 유전자 내의 2 개의 부위 (해당 단백질 37 및 273 번째 아미노산 잔기에 해당)에 도입하여, gag-pol 폴리프로틴의 일부로서 돌연변이체 인테그라제를 암호화하는 플라스미드를 구축하였다.

히스톤을 코딩하는 DNA를 얻기 위해, 인간 배아 신장 (human embryonic kidney; HEK) 293T 세포의 H2A (H2A.1 및 H2A.2), H2B 및 H4의 mRNA로부터 cDNA 합성을 수행하고, HeLa 세포의 H3의 mRNA (H3.1, H3.2, 및 H3.3)로부터 cDNA 합성을 수행하였다. cDNA 합성은 올리고 dT 및 랜덤 헥사머와 함께 SuperScript III CellsDirect cDNA 합성 시스템 (미국 캘리포니아 주 칼스배드 소재의 Invitrogen)의 프로토콜에 따라 수행하였다. 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)-기반 cDNA 증폭은 다음의 열 사이클로 수행되었다:

95 ℃에서 2분 동안 초기 변성;

95 ℃에서 30초 동안 변성, 55 ℃에서 30초 동안 어닐링 및 72 ℃에서 27초 동안 연장 40 사이클;

72 ℃에서 2분 동안 최종 연장; 및

4 ℃에서 3 분 동안 냉각.

PCR 반응은 C1000 PCR 기계 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), Taq DNA 폴리머라제 (New England Biolabs (NEB), Ipswich, MA, USA) 또는 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (NEB)를 사용하여 수행하였고, 링커 서열 (서열번호 1)을 갖는 프라이머를 이용하였다. 두 가지 유형의 루신 지퍼 단백질 (NZ-CZ 및 Jun-Fos)을 암호화하는 DNA 서열을 Genescript (홍콩, 중국)으로부터 얻어 증폭 후 pCMV gag-pol 플라스미드 내의 CMV 프로모터 다음에 도입하였다.

서열 번호	명명	서열목록 (5'-> 3')	비고
1	Linker	DDPVAT
2	H2A_sense_primer	AAAAAGCGCTGATCCACCGGTCGCCACCATGTCTGGACGTGGCAAGCAG
3	H2A_antisense_primer	AAAAGCTAGCGGTGGCGACCGGTGGATCCTTGCCCTTAGCTTTGTGGTGG
4	H2B_sense_primer	AAAAGGCGCCGATCCACCGGTCGCCACCATGCCTGAGCCAGCGAAATCC
5	H2B_antisense_primer	AAAAGCTAGCGGTGGCGACCGGTGGATCCTTGGAGCTGGTGTACTTGGTAACG
6	H3.1_sense_primer	AAAAAGCGCTGATCCACCGGTCGCCACCATGGCACGCACGAAGCAAAC
7	H3.1_antisense_primer	AAAAGCTAGCGGTGGCGACCGGTGGATCTGCCCTCTCTCCGCGAATG
8	H3.2_sense_primer	AAAAAGCGCTGATCCACCGGTCGCCACCATGGCCCGTACTAAGCAGACTGC
9	H3.2_antisense_primer	AAAAGCTAGCGGTGGCGACCGGTGGATCAGCCCGCTCTCCACGGATG
10	H3.3_sense_primer	AAAAAGCGCTGATCCACCGGTCGCCACCATGGCTCGTACAAAGCAGACTGCC
11	H3.3_antisense_primer	AAAAGCTAGCGGTGGCGACCGGTGGATCAGCACGTTCTCCACGTATGCG
12	H4_sense_primer	AAAAAGCGCTGATCCACCGGTCGCCACCATGTCCGGCAGAGGAAAGGG
13	H4_antisense_primer	AAAAGCTAGCGGTGGCGACCGGTGGATCGCCTCCGAAGCCGTACAGG

세포 배양

HEK 293T 세포 및 HeLa 세포를 각각 37 ℃ 및 5% CO₂ 조건에서 Modified Dulbecco's medium (Gibco Life Technologies, Carlsbad, CA) 및 Dulbecco's modified Eagle medium (Gibco Life Technologies)를 이용하여 각각 배양하였다. 이들 배지 각각에는 10% 우태아 혈청 (Gibco Life Technologies) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco Life Technologies)이 보충되었다.

레트로바이러스 벡터 패키징

레트로바이러스 벡터를 패키징하기 위해, 벡터 게놈 (pCLPIT GFP, 10 ug), 야생형 gag-pol 폴리프로틴 또는 돌연변이체 (pCMV gag-pol, pCMV gag-pol-histone 또는 pCMV gag-pol-leucine zipper, 6 ug)를 암호화하는 플라스미드, 외피 단백질을 암호화한 플라스미드 (pcDNA IVS VSVG, 4 ug)를 인산 칼슘계 형질 변환 방법에 의해 HEK 293T 세포 내로 도입하였다. 형질 변환된 세포를 형질 변환 12 시간 후 포스페이트-완충 식염수 (PBS, Gibco Life Technologies)로 2회 세척하고, 새로운 배지에서 추가로 배양하였다. 패키징된 바이러스 입자를 함유하는 세포 상청액은 형질 변환 후 36 시간 및 60 시간에 2회 수득되었다. 수득된 세포 상청액을 먼저 0.45 um 주사기 필터를 통해 여과한 다음 Optima ?? Ultracentrifuge LE-80K (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) 기기로 4 ℃에서 20 %(w/v) 수크로오스 쿠션 상에서 초원심 분리, 농축하였다. 초원심 분리는 2시간 동안 24,000 rpm으로 SW28을 사용하여 수행되었다. 수득된 바이러스 입자 펠렛을 냉각된 인산염 완충 식염수로 재현탁하였다.

레트로바이러스 벡터 형질 도입 입자의 적정 (Titration)

바이러스 벡터 입자의 형질 도입 역가를 결정하기 위해, 강화된 녹색 형광 단백질 (eGFP)을 암호화하는 유전자를 원래 바이러스 게놈에 도입하였다. 형질 전환 바이러스 입자의 적정은 HEK 293T 세포를 형질 도입하고 eGFP 양성 세포를 계수함으로써 진행되었다. eGFP-positive 세포는 형질 도입 3일 후 FacsCanto ?? II 유세포 분석기 (BD Biosciences, San Diego, CA)로 유세포 분석에 의해 정량화되었다.

바이러스 세포 게놈 접합의 증폭

야생형 및 돌연변이 레트로바이러스 벡터를 HEK 293T 세포에 형질 도입하였다. 그 다음, 형질 도입된 세포를 며칠 동안 배양하였다. 이어서, QIAamp DNA 미니 키트 (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 세포로부터 세포 게놈 DNA를 추출하였다. 이어서 게놈 DNA를 BamH I (NEB)로 단편화하고, 레트로바이러스 서열을 함유하는 DNA 단편을 단일 유형의 비오티닐화 올리고 뉴클레오티드 (서열번호 14)에 결합하여 PCR에 의해 선택적으로 그리고 선형적으로 증폭시켰다.

서열 번호	명명	서열목록 (5'-> 3')	비고
14	biotinylated oligonucleotide	biotin-ATTTGTTAAAGAVAGGATATCAGTGGTCCAG

관련 수행된 PCR 반응 조건은 다음과 같다:

95 ℃에서 5분 동안 초기 변성;

95 ℃에서 1분 동안 변성, 55 ℃에서 45초 동안 어닐링 및 72 ℃에서 90초 동안 연장 40회 사이클;

최종 72 ℃에서 10분 동안 연장; 및

4 ℃에서 5분 동안 냉각.

그 다음, Dynabeads M-280 스트렙트아비딘 (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 바이러스 서열을 포함하는 증폭된 DNA를 선택적으로 분리하였다. 그 다음, 증폭된 단일 가닥 바이러스-세포 접합 DNA를 dNTP, 랜덤 헥사머 및 Klenow 효소로 이중 가닥 (dsDNA)이 되도록 만들었다. 합성된 dsDNA 생성물을 Mse I (NEB)로 단편화하고, pre-annealed된 이중 가닥 링커에 연결하였다. 링커와 바이러스 게놈의 3 'LTR에 상보적인 2 개의 프라이머를 사용하여 링커에 연결된 바이러스-세포 게놈 접합을 Phusion high fidelity polymerase (NEB)을 사용한 PCR과 반응으로 각각 증폭시켰다.

서열 번호	명명	서열목록 (5'-> 3')	비고
15	linker+	GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC
16	Linker-	TAGTCCCTTAGCGGAG-NH2
17	Primer_F	GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG
18	Primer_R	GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCCCGCTTAAG

관련 PCR 반응 조건은 다음과 같다:

98 ℃에서 2분 동안 초기 변성;

98 ℃에서 2분 동안 변성, 55 ℃에서 90초 동안 어닐링 및 72 ℃에서 1분 동안 연장 25회 사이클;

72 ℃에서 5분 동안 최종 연장; 및

10 ℃에서 3분 동안 냉각.

바이러스-세포 접합부의 차세대 시퀀싱 (Next generation sequencing; NGS)

NGS 분석을 위해, 어댑터 및 인덱스 서열을 PCR을 통해 증폭된 바이러스-세포 게놈 접합 DNA에 첨가하였다. 관련 PCR 반응 조건은 다음과 같다:

98 ℃에서 2분 동안 초기 변성; 및

98 ℃에서 2분 동안 변성, 72 ℃에서 90초 동안 단일 단계로 어닐링 및 확장, 72 ℃에서 5분 동안 최종 확장, 및 10 ℃에서 3분 동안 냉각 25회 사이클.

서열 번호	명명	서열목록 (5'-> 3')	비고
19	Forward primer for adaptor addition	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGGAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC
20	Reverse primer for adaptor addition	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC
21	Forward primer for index addition	AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACFFFFFFFFTCGTCGGCAGCGTC
22	Reverse primer for index addition	CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATRRRRRRRRGTCTCGTGGGCTCGG

서열 번호	명명	서열목록 (5'-> 3')	비고
23	FFFFFFFF_S502	CTCTCTAT
24	FFFFFFFF_S503	TATCCTCT
25	FFFFFFFF_S505	GTAAGGAG
26	FFFFFFFF_S506	ACTGCATA
27	FFFFFFFF_S507	AAGGAGTA
28	FFFFFFFF_S508	CTAAGCCT
29	FFFFFFFF_S510	CGTCTAAT
30	FFFFFFFF_S511	TCTCTCCG
31	FFFFFFFF_S513	TCGACTAG
32	FFFFFFFF_S515	TTCTAGCT
33	FFFFFFFF_S516	CCTAGAGT
34	FFFFFFFF_S517	GCGTAAGA
35	FFFFFFFF_S518	CTATTAAG
36	FFFFFFFF_S520	AAGGCTAT
37	FFFFFFFF_S521	GAGCCTTA
38	FFFFFFFF_S522	TTATGCGA
39	RRRRRRRR_N701	TCGCCTTA
40	RRRRRRRR_N702	CTAGTACG
41	RRRRRRRR_N703	TTCTGCCT
42	RRRRRRRR_N704	GCTCAGGA
43	RRRRRRRR_N705	AGGAGTCC
44	RRRRRRRR_N706	CATGCCTA
45	RRRRRRRR_N707	GTAGAGAG
46	RRRRRRRR_N710	CAGCCTCG
47	RRRRRRRR_N711	TGCCTCTT
48	RRRRRRRR_N712	TCCTCTAC
49	RRRRRRRR_N714	TCATGAGC
50	RRRRRRRR_N715	CCTGAGAT

Illumina MiSeq를 사용한 시퀀싱 및 DNA 판독의 초기 프로세싱은 마크로젠(한국)에 의해 수행되었다. 의미 있는 시퀀스 데이터만 고려하기 위해 평균 품질 점수가 20 미만인 판독 값은 PRINSEQ-lite (v 0.20.4)로 필터링 되었다. 다음(downstream) 분석을 위해 EMBOSS Needle (v 6.6.0.0) 및 마크로젠 자체 스크립트를 사용하여 두 가지 염기 서열 정도의 불일치 또는 그 이하를 허용하는 조건에서, 바이러스 3 'LTR 서열 (서열번호 51)을 포함하는 바이러스-세포 게놈 접합만이 선택되었다. 다운 스트림 분석에서 중복 값은 제거되었다. 바이러스-세포 게놈 접합에서 최종적으로 얻은 세포 서열은 QuickMap 도구 (Gene Therapy Safety Group)를 사용하여 인간 게놈에 매핑하였다. 야생형과 돌연변이 벡터의 유전자 삽입 패턴 차이에 대한 통계적 유의성은 Fisher의 테스트에 기반하여 수행되었다.

서열 번호	명명	서열목록 (5'-> 3')	비고
51	viral 3´ LTR sequence	GGAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACCCGTCAGCGGGGGTCTTTCA	48 bp

야생형 및 돌연변이체 통합 구조의 예측

바이러스 인테그라제의 구조는 I-TASSER를 사용하여 예측되었으며, 이는 복제-교환 Monte Carlo 시뮬레이션에 의해 단백질 구조를 예측한다. 예측된 구조 모델은 신뢰 점수 (C-점수)를 기준으로 평가되었다. C-점수가 -5와 2 사이에 있으면 예측 구조 모델이 높은 신뢰도를 가진다고 할 수 있다. 예측된 구조의 렌더링은 Pymol (DeLano Scientific, 미국 캘리포니아주 산카를로스)을 사용하여 수행되었다.

결과 및 고찰

DNA 결합 단백질을 내부에 포함하는 인테그라제 탑재 MLV 벡터

본 발명자들은 DNA 결합 단백질의 인테그라제 내부 도입을 통합 구조적 교란으로, 레트로바이러스 벡터의 유전자 삽입 패턴을 변화시킬 수 있을 것으로 예상하였다. DNA 결합 단백질로서 히스톤 또는 루신 지퍼를 고려하였다. 히스톤은 링커 히스톤 (H1 및 H5) 및 코어 히스톤 (H2A, H2B, H3 및 H4)으로 분류된다. 코어 히스톤은 구조적으로 보존된 모티프를 가지며, 이는 2개의 짧은 스트랩 고리로 이루어진 3개의 나선으로 구성된다. 이들 히스톤은 다른 히스톤과 상호 작용할 수 있다. 먼저, 두 개의 H2A-H2B 이량체는 H3-H4 사량체와 결합한다. 다음으로, 코어 히스톤의 옥타머는 DNA와 상호 작용함으로써 뉴클레오솜을 형성한다. 이러한 상호 작용에는 극성 상호 작용, 수소 결합 및 비극성 상호 작용을 포함된다. H2A와 H3의 2 내지 3 가지 변형체를 포함하여 7가지 히스톤을 MLV 인테그라제 내부에 삽입하였다 (도 1).

루신 지퍼는 독특한 구조적 특성을 갖는 조절 단백질이다. 루신 지퍼의 지퍼형 구조는 2 개의 알파 나선 단량체의 이량체화에 의해 형성된다. 루신 지퍼는 루신 잔기를 사용하여, 소수성 상호 작용을 통해, DNA에 결합한다. 본 발명자들은 MLV 인테그라제 내부에 2 가지 유형의 루신 지퍼 [인공적인 것 (NZ-CZ (I, AD, & L, 2000))와 자연적으로 파생된 Jun-Fos (Glover & Harrison, 1995)]를 삽입하였다.

인테그라제 내부에 DNA 결합 단백질이 도입된 14 개의 MLV 돌연변이 벡터를 생산하였다. DNA 결합 단백질을 인테그라제 내 2 개 부위에 삽입하였고, '벡터 형질 도입 능력'의 파괴는 없었다 (도 1, 2). 두 부위는 MLV 인테그라제의 N-말단 연장 도메인 (37 번째 잔기 옆) 및 촉매 도메인 (273 번째 잔기 옆)에 있다. H3 (H3.1, H3.2 또는 H3.3) 또는 루신 지퍼 (NZ-CZ 또는 Jun-Fos)가 인테그라제의 앞쪽 위치에 도입되었다. 또한, H2A (H2A.1 또는 H2A.2), H2B, H3 (H3.1, H3.2 또는 H3.3), H4 또는 두 개의 루신 지퍼 중 하나가 후면 위치로 도입되었다 (도 1).

서열 번호	명명	서열목록	비고
52	H3.1	ATGGCACGCACGAAGCAAACAGCTCGTAAGTCCACTGGCGGCAAAGCCCCGCGCAAGCAGCTGGCCACTAAGGCGGCTCGCAAAAGCGCGCCAGCCACCGGTGGCGTGAAGAAGCCCCACCGCTACAGGCCTGGTACTGTCGCCCTCCGTGAAATCCGCCGCTATCAGAAATCGACTGAGCTACTGATTCGCAAGCTACCATTCCAGCGTCTGGTACGTGAGATCGCGCAGGACTTCAAGACCGACCTGCGCTTCCAGAGCTCGGCTGTGATGGCGCTGCAGGAGGCCTGCGAGGCTTACCTGGTGGGGCTCTTTGAGGACACCAACCTGTGTGCTATCCACGCCAAGCGAGTGACTATCATGCCCAAGGACATCCAGCTCGCTCGCCGCATTCGCGGAGAGAGGGCA
53	H3.2	ATGGCCCGTACTAAGCAGACTGCTCGCAAGTCGACCGGCGGCAAGGCCCCGAGGAAGCAGCTGGCCACCAAGGCGGCCCGCAAGAGCGCGCCGGCCACGGGCGGGGTGAAGAAGCCGCACCGCTACCGGCCCGGCACCGTAGCCCTGCGGGAGATCCGGCGCTACCAGAAGTCCACGGAGCTGCTGATCCGCAAGCTGCCCTTCCAGCGGCTGGTACGCGAGATCGCGCAGGACTTTAAGACGGACCTGCGCTTCCAGAGCTCGGCCGTGATGGCGCTGCAGGAGGCCAGCGAGGCCTACCTGGTGGGGCTGTTCGAAGACACGAACCTGTGCGCCATCCACGCCAAGCGCGTGACCATTATGCCCAAGGACATCCAGCTGGCCCGCCGCATCCGTGGAGAGCGGGCT
54	H3.3	ATGGCTCGTACAAAGCAGACTGCCCGCAAATCGACCGGTGGTAAAGCACCCAGGAAGCAACTGGCTACAAAAGCCGCTCGCAAGAGTGCGCCCTCTACCGGAGGGGTGAAGAAACCTCATCGTTACAGGCCTGGTACTGTGGCGCTCCGTGAAATTAGACGTTATCAGAAGTCCACTGAACTTCTGATTCGCAAACTTCCCTTCCAGCGTCTGGTGCGAGAAATTGCTCAGGACTTTAAAACAGATCTGCGCTTCCAGAGCGCAGCTATCGGTGCTTTGCAGGAGGCAAGTGAGGCCTATCTGGTTGGCCTTTTTGAAGACACCAACCTGTGTGCTATCCATGCCAAACGTGTAACAATTATGCCAAAAGACATCCAGCTGGCACGCCGCATACGTGGAGAACGTGCT
55	H2A.1	ATGTCTGGACGTGGCAAGCAGGGCGGCAAGGCTCGCGCCAAGGCCAAAACCCGCTCCTCTAGAGCTGGGCTCCAATTTCCTGTAGGACGAGTGCACCGCCTGCTCCGCAAGGGCAACTACGCTGAGCGGGTCGGGGCCGGCGCGCCGGTTTACCTGGCGGCGGTGCTGGAGTACCTAACTGCCGAGATCCTGGAGCTGGCGGGCAACGCAGCCCGCGACAACAAAAAGACCCGCATCATCCCGCGCCACTTGCAGCTGGCCATCCGCAACGACGAGGAGCTCAACAAGCTGCTTGGTAAAGTTACCATCGCTCAGGGCGGTGTTCTGCCTAACATCCAGGCCGTACTGCTCCCCAAGAAGACTGAGAGCCACCACAAAGCTAAGGGCAAG
56	H2A.2	ATGTCTGGTCGTGGCAAGCAAGGAGGCAAGGCCCGCGCCAAGGCCAAGTCGCGCTCGTCCCGCGCTGGCCTTCAGTTCCCGGTAGGGCGAGTGCATCGCTTGCTGCGCAAAGGCAACTACGCGGAGCGAGTGGGGGCCGGCGCGCCCGTCTACATGGCTGCGGTCCTCGAGTATCTGACCGCCGAGATCCTGGAGCTGGCGGGCAACGCGGCTCGGGACAACAAGAAGACGCGCATCATCCCTCGTCACCTCCAGCTGGCCATCCGCAACGACGAGGAACTGAACAAGCTGCTGGGCAAAGTCACCATCGCCCAGGGCGGCGTCTTGCCTAACATCCAGGCCGTACTGCTCCCTAAGAAGACGGAGAGTCACCACAAGGCAAAGGGCAAG
57	H2B	ATGCCTGAGCCAGCGAAATCCGCTCCCGCCCCGAAGAAGGGCTCCAAGAAGGCCGTGACCAAGGCGCAGAAGAAGGACGGCAAGAAGCGCAAGCGCAGCCGCAAGGAGAGCTACTCCGTATACGTGTACAAGGTGCTGAAACAGGTCCACCCCGACACCGGCATCTCCTCTAAAGCCATGGGGATCATGAATTCCTTTGTCAACGACATCTTCGAGCGCATCGCCGGCGAGGCTTCCCGCCTGGCGCATTACAACAAGCGCTCGACCATCACCTCCAGGGAGATCCAGACGGCCGTGCGCCTGCTGCTTCCCGGGGAGCTGGCCAAGCACGCTGTGTCAGAGGGCACCAAGGCCGTTACCAAGTACACCAGCTCCAAG
58	H4	ATGTCCGGCAGAGGAAAGGGCGGAAAAGGCTTAGGCAAAGGGGGCGCTAAGCGCCACCGCAAGGTCTTGAGAGACAACATTCAGGGCATCACCAAGCCTGCCATTCGGCGTCTAGCTCGGCGTGGCGGCGTTAAGCGGATCTCTGGCCTCATTTACGAGGAGACCCGCGGTGTGCTGAAGGTGTTCCTGGAGAATGTGATTCGGGACGCAGTCACCTACACCGAGCACGCCAAGCGCAAGACCGTCACAGCCATGGATGTGGTGTACGCGCTCAAGCGCCAGGGGCGCACCCTGTACGGCTTCGGAGGC
59	L1	GATCCACCGGTCGCCACC
60	NZ	GCACTGAAAAAGGAACTGCAGGCTAACAAAAAGGAACTGGCACAGCTGAAGTGGGAGCTGCAGGCCCTGAAGAAAGAACTGGCTCAG
61	CZ	GAGCAGCTGGAAAAGAAACTGCAGGCACTGGAGAAGAAACTGGCCCAGCTGGAATGGAAAAACCAGGCTCTGGAAAAGAAACTGGCACAG
62	Jun	ATCGCAAGACTGGAGGAGAAGGTGAAGACACTGAAGGCACAGAATAGTGAGCTGGCCTCAACTGCTAACATGCTGCGAGAACAGGTGGCTCAGCTG
63	Fos	CTGAAGGAGAAAGAAAAGCTGCTGAATGCAATCGAGACCCAGCTGGCCAGTAAAGAGGACGAACTGCAGGATACAGAAGCACAGCTGACCGATACA
64	L2-1	TCAGGGGGCACCTCTGGGTCAACATCTGGCACTGGCTCTACC
65	L2-2	AGTGGAGGGACCAGCGGATCCACCTCTGGAACAGGCTCCACT
66	L2-3	AGCGGCGGGACAAGCGGGAGCACCTCAGGGACTGGGAGCACT
67	L2-4	TCCGGCGGGACAAGCGGCAGCACATCCGGGACTGGCTCAACA
68	L2-5	AGCGGAGGGACCAGCGGGTCCACCTCTGGAACAGGCTCCACT
69	L2-6	TCTGGGGGCACCTCTGGCTCAACCTCTGGGACAGGCTCCACT

서열 번호	명명	서열목록	비고
70	H3.1	MARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGTVALREIRRYQKSTELLIRKLPFQRLVREIAQDFKTDLRFQSSAVMALQEACEAYLVGLFEDTNLCAIHAKRVTIMPKDIQLARRIRGERA
71	H3.2	MARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGTVALREIRRYQKSTELLIRKLPFQRLVREIAQDFKTDLRFQSSAVMALQEASEAYLVGLFEDTNLCAIHAKRVTIMPKDIQLARRIRGERA
72	H3.3	MARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPSTGGVKKPHRYRPGTVALREIRRYQKSTELLIRKLPFQRLVREIAQDFKTDLRFQSAAIGALQEASEAYLVGLFEDTNLCAIHAKRVTIMPKDIQLARRIRGERA
73	H2A.1	MSGRGKQGGKARAKAKTRSSRAGLQFPVGRVHRLLRKGNYAERVGAGAPVYLAAVLEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQLAIRNDEELNKLLGKVTIAQGGVLPNIQAVLLPKKTESHHKAKGK
74	H2A.2	MSGRGKQGGKARAKAKSRSSRAGLQFPVGRVHRLLRKGNYAERVGAGAPVYMAAVLEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQLAIRNDEELNKLLGKVTIAQGGVLPNIQAVLLPKKTESHHKAKGK
75	H2B	MPEPAKSAPAPKKGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQVHPDTGISSKAMGIMNSFVNDIFERIAGEASRLAHYNKRSTITSREIQTAVRLLLPGELAKHAVSEGTKAVTKYTSSK
76	H4	MSGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGITKPAIRRLARRGGVKRISGLIYEETRGVLKVFLENVIRDAVTYTEHAKRKTVTAMDVVYALKRQGRTLYGFGG
77	L1	DPPVAT
78	NZ	ALKKELQANKKELAQLKWELQALKKELAQ
79	CZ	EQLEKKLQALEKKLAQLEWKNQALEKKLAQ
80	Jun	IARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQL
81	Fos	LKEKEKLLNAIETQLASKEDELQDTEAQLTDT
82	L2	SGGTSGSTSGTGST

eGFP 유전자를 함유하는 게놈을 갖는 야생형 및 돌연변이 벡터를 이용 HEK 293T 세포를 형질 전환 (Transduction)하였다. 다음으로, 유세포 분석법으로 eGFP를 발현하는 세포를 계수함으로써 야생형 및 돌연변이체 벡터의 형질 도입 효율을 정량하여, 그 결과를 도 2 및 표 9에 나타내었다.

Vectors	Transducing units/mL
WT	5.08E+06
37-H3.1	3.80E+04
37-H3.2	3.40E+04
37-H3.3	1.88E+04
273-H3.1	2.45E+05
273-H3.2	3.20E+05
273-H3.3	6.81E+05
273-H2A.1	4.46E+05
273-H2A.2	2.38E+05
273-H2B	7.90E+05
273-H4	3.67E+05
37-NZCZ	6.96E+04
37-JunFos	1.92E+05
273-NZCZ	1.30E+06
273-JunFos	1.22E+06

도 2 및 표 9에서 확인할 수 있듯이, 인테그라제 내부에 외래 단백질 (크기 107 내지 154 아미노산)이 도입되더라도, 돌연변이 벡터들은 HEK 293T 세포에 대해 상당한 수준의 형질 도입 능력을 보였다. 예를 들어, 돌연변이체 273-NZ-CZ의 샘플은 1.3E + 06 T.U./mL의 형질 도입 역가 (Transducing titer)를 나타냈다. 이 역가 수준은 야생형 벡터 (5.1E + 06 T.U./mL) 보다 3.9 배 낮다. 전반적으로, 단백질이 인테그라제의 뒷부분에 삽입된 돌연변이체의 형질 도입 역가 (2.4E + 05 TU/mL ~ 1.3E + 06 TU/mL)는 앞부분에 삽입된 돌연변이체의 형질 도입 역가 보다 높았다(1.9E + 04 TU/mL ~ 1.9E + 05 TU/mL).

인간 게놈의 TSS 영역 근처의 벡터 유전자 삽입 빈도

레트로바이러스 벡터의 유전자 삽입 위치를 매핑하기 위해, 야생형 및 돌연변이 벡터로 형질 도입된 HEK 293T 세포로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 바이러스-세포 간 게놈 접합 부분은 PCR에 의해 증폭된 후 NGS 방법으로 분석되었다. 분석에 기초하여, 인간 게놈상의 2,117개의 레트로바이러스 게놈 통합 부위가 확인되었으며 그 결과를 표 10에 나타내었다.

	Numbers of integration sites
WT MLV	234
37-H3.1	268
37-H3.2	257
37-H3.3	126
273-H3.1	107
273-H3.2	102
273-H3.3	209
273-H2A.1	103
273-H2A.2	61
273-H2B	83
273-H4	94
37-NZ-CZ	77
37-Jun-Fos	111
273-NZ-CZ	117
273-Jun-Fos	168
Total	2,117

또한 QuickMap tool (Appelt et al., 2009)을 사용하여 인간 게놈에서 1,000,000개의 계산적으로 생성된 무작위 사이트를 생성하였다. 이전의 학술 논문 (Hacein-Bey-Abina et al., 2008; Deichmann et al., 2007; Howe et al., 2008; LaFave et al., 2014) 결과와 유사하게 야생형 MLV 벡터는 TSS 영역에 높은 유전자 삽입 빈도를 보였다 (TSS 영역은 단백질 코딩 유전자의 TSS로부터 5kb 내의 게놈 부위로 정의됨).

도 3에서 확인할 수 있듯이, 야생형 바이러스 벡터의 TSS로의 유전자 삽입 빈도는 42.3 % 였으며, 이는 무작위 확률보다 6.8 배 높았다 (6.2 %). TSS 영역에 대한 야생형 바이러스의 강력한 삽입 선호도는 종양 유전자의 발현을 초래할 수 있다. 그 이유는, 벡터 삽입 위치가 종양 유전자의 TSS에 인접할 때 벡터 게놈 내의 프로모터(들)가 해당 종양 유전자를 활성화시킬 수 있기 때문이다. 따라서, TSS 영역 주변으로의 벡터 삽입 감소는 레트로바이러스 기반 벡터의 안전성을 향상시키는 데 매우 중요하다.

또한, 도 3에서 확인할 수 있듯이, 히스톤 또는 루신 지퍼를 탑재한 돌연변이체는 6.6-19.6 %의 빈도로 TSS 영역에 삽입되는데, 그 빈도는 야생형 보다 현저히 낮다. 특히, 돌연변이체 273-H2A.2는 TSS 영역에 대한 최저 삽입 빈도 (6.6 %)를 나타내었고, 이는 야생형 벡터의 경우 보다 6.4 배 낮았다. 다른 2개의 돌연변이체 벡터는 또한 TSS 영역 [273-H3.3 (7.7 %) 및 37-H3.1 (9.3 %)]에 대해 상당히 낮은 삽입 수준을 나타냈다.

레트로바이러스 벡터가 TSS에 더 가까운 게놈 부위에 삽입될 때, TSS의 하류에 있는 유전자의 활성화 확률은 더 높을 것이다. 이러한 유전자 조절 교란 가능성을 확인하기 위해, TSS 주위 레트로바이러스 벡터 삽입의 공간적 분포를 더 자세히 조사하였다. 이 분석을 위해, 레트로바이러스 DNA를 가지고 있는 게놈 영역을 TSS에서 시작하여 1 kb의 공간 간격을 가진 더 작은 부분으로 나누어, 도 4a 및 도 4b에 나타내었다.

도 4a에서 확인할 수 있듯이, 야생형 MLV의 삽입은 TSS로부터 3kb 내에서 강하게 농축된 반면, 돌연변이 MLV는 이러한 집중된 삽입 패턴을 나타내지 않았다. TSS 주위의 더 큰 범위 (크기 50 kb)에서 보면, 야생형 바이러스 벡터 삽입이 TSS에 가장 가까운 영역 주위에 집중되어 있음이 더욱 뚜렷하게 확인된다. 이에 비해, 도 4b에서 확인할 수 있듯이, 돌연변이 바이러스 벡터는 TSS 주위에 국소적으로 집중된 명확한 삽입 패턴이 나타나지 않았다.

	<1kb	<2kb	<3kb	<4kb	<5kb
Random	1.3%	2.5%	3.8%	5.0%	6.2%
WT	19.7%	32.9%	40.2%	41.9%	42.3%
37-H3.1	2.6%	3.7%	6.0%	7.1%	9.3%
273-H3.3	2.4%	3.8%	4.5%	7.5%	8.2%
273-H2A.2	4.9%	6.6%	6.6%	6.6%	6.6%

또한, 도 4c 및 표 11에서 확인할 수 있듯이, TSS로부터의 거리에 따른 누적 레트로바이러스 삽입 빈도에 대한 도표는 야생형 벡터의 인간 유전체로의 삽입이 TSS로부터 1kb 이내에 영역 근처에서 매우 높은 빈도로 발생했음을 명백히 보여준다. TSS-근위 영역을 넘어서, 야생형 벡터 삽입 누적 빈도는 TSS로부터의 거리에 따라 크게 증가하지 않았다. 이것은 포화 곡선으로 특징 지어질 수 있다. 대조적으로, 2개의 돌연변이체 (37-H3.1 및 273-H3.3)의 누적된 삽입 빈도는 TSS로부터의 거리에 따라 지속적으로 증가하였으며, 이는 무작위 삽입의 경우와 유사한 패턴이다. 이로부터 돌연변이의 인간유전체로의 삽입 패턴이 야생형과는 매우 다른 무작위 삽입 패턴과 가깝다는 결론을 도출할 수 있다. 요약하면, 실험적으로 얻어진 벡터 삽입 패턴 결과는 히스톤 또는 루신 지퍼를 인테그라제 내부로 삽입하면 TSS 주위의 레트로바이러스 벡터 삽입 집중을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 보여준다.

발암 부위 근처의 레트로바이러스 삽입 빈도

MLV 벡터는 암 유발 가능성을 보여왔으며 이는, MLV 벡터가 게놈을 인간 게놈 종양 유전자 TSS 근처에 높은 빈도로 삽입하는 특성과 관련 있다. 과거 유전자 치료 임상 경우에서, MLV 벡터는 종양 유전자의 하나인 LMO2 (LIM domain only 2) 인핸서 영역에 삽입되었다. 이로 인해 어린 환자에서 백혈병이 발생했다. 돌연변이 벡터의 발암 가능성을 야생형 벡터의 발암 가능성과 비교하기 위해, QuickMap tool을 사용하여 종양 유전자 TSS로부터 5kb 이내 게놈 부위로의 벡터 삽입 빈도를 정량하여, 그 결과를 도 5 및 표 12과 표 13에 나타내었다.

	Number of integrations	Number of integrations within 5 kb of TSSs	Frequency of integrations within 5 kb of TSSs (%)	P-value (compared with the frequency of wild-type)
Random	1,000,000	61,617	6.2**	2.98E-56
WT	234	99	42.3
37-H3.1	268	25	9.3**	3.45E-18
37-H3.2	257	25	9.7**	2.72E-17
37-H3.3	126	22	17.5**	8.80E-07
273-H3.1	107	13	12.1**	7.64E-09
273-H3.2	102	20	19.6**	3.42E-05
273-H3.3	209	16	7.7**	5.58E-18
273-H2A.1	103	12	11.7**	6.39E-09
273-H2A.2	61	4	6.6**	1.40E-08
273-H2B	83	9	10.8**	3.61E-08
273-H4	94	16	17.0**	6.39E-06
37-NZ-CZ	77	12	15.6**	8.98E-06
37-Jun-Fos	111	17	15.3**	2.54E-07
273-NZ-CZ	117	21	17.9**	2.73E-06
273-Jun-Fos	168	28	16.7**	2.22E-08

야생형 벡터의 경우와 비교한 차이에 대한 테스트 P-값이 0.05 미만인 경우 삽입 빈도는 **로 표시

	Number of integrations	Number of integrations near the TSSs of oncogenes	Frequency of integrations near the TSSs of oncogenes (%)	P-value (compared with the frequency of wild-type)
Random	1,000,000	1,577	0.16**	4.08E-05
WT	234	5	2.14
37-H3.1	268	1	0.37*	7.95E-02
37-H3.2	257	0	0.00**	2.40E-02
37-H3.3	126	2	1.59	5.32E-01
273-H3.1	107	1	0.93	3.89E-01
273-H3.2	102	1	0.98	4.11E-01
273-H3.3	209	2	0.96	2.74E-01
273-H2A.1	103	0	0.00	1.59E-01
273-H2A.2	61	0	0.00	3.11E-01
273-H2B	83	0	0.00	2.17E-01
273-H4	94	0	0.00	1.83E-01
37-NZ-CZ	77	0	0.00	2.39E-01
37-Jun-Fos	111	0	0.00	1.42E-01
273-NZ-CZ	117	0	0.00	1.30E-01
273-Jun-Fos	168	0	0.00*	6.56E-02

야생형 벡터의 경우와 비교한 차이에 대한 테스트 P-값이 각각 0.1 및 0.05 미만인 경우, 삽입 빈도는 * 및 **로 표시

도 5 및 표 12에서 확인할 수 있듯이, 이들 게놈 영역으로의 야생형 MLV 삽입 빈도 (2.14 %)는 무작위 경우 삽입 빈도 (0.16 %)보다 13.4 배 더 높았다. 야생형 벡터는 PCM1, HOXD11, RB1, GATA2 및 NACA의 5 가지 종양 유전자 TSS 근처에 삽입되었다.

한편, 도 5 및 표 13에서 확인할 수 있듯이, 이들 지역에 대한 3개의 돌연변이체 (37-H3.1, 37-H3.2 및 273-Jun-Fos)의 삽입 빈도는 야생형보다 훨씬 낮았다 (P-값 < 0.1). 돌연변이체 37-H3.1 및 273-H3.1은 단 하나의 종양 유전자 PBRM1의 TSS 근처에 삽입되었다 (표 12). 273-H3.2은 EVI1 종양 유전자의 TSS 근처에 삽입되었고 또 다른 돌연변이체 37-H3.3은 2개의 종양 유전자, PBRM1 및 TLX3의 TSS 근처에 삽입되었다. 돌연변이체 273-H3.3은 종양 유전자 ERG의 TSS 근처에 2번 독립적으로 삽입되었다. 돌연변이체 37-H3.2의 경우 발암성 영역으로 삽입되지 않았다는 것에 주목할 만하다 (P-값 < 0.05). 이 결과는 히스톤 또는 루신 지퍼를 인테그라제 내부에 삽입하면 레트로바이러스 벡터 삽입 패턴을 크게 변화시켜 발암 가능성을 의미 있는 수준에서 감소시킬 수 있음을 보여준다. 다른 돌연변이체도 발암성 영역으로 삽입되지 않았지만, 바이러스-세포 게놈 접합체 판독 횟수가 통계적으로 유의미한 P-값을 얻기에 충분하지 않았다.

CpG 섬 및 cis-조절 요소 근처의 레트로바이러스 벡터 삽입

CpG 섬과 cis-조절 요소는 종종 유전자의 프로모터 영역 근처에 위치한다. 따라서, CpG 섬 및 cis-조절 요소 근처의 게놈 부위로의 레트로바이러스 삽입은 또한 유전자 발현 조절의 교란을 유발할 수 있다. 야생형 MLV는 삽입하는 동안 CpG 섬 및 cis-조절요소를 매우 선호하였다.

	Number of integrations	Number of integrations into the oncogenic locations	Frequency of integrations into the oncogenic locations (%)	Oncogenes whose TSSs were located near retroviral integration sites (within 5 kb)
WT	234	5	2.14	PCM1 HOXD11 RB1 GATA2 NACA
37-H3.1	268	1	0.37	PBRM1
37-H3.3	126	2	1.59	PBRM1TLX3
273-H3.1	107	1	0.93	PBRM1
273-H3.2	102	1	0.98	EVI1
273-H3.3	209	2	0.96	ERG (two integrations)

	Number of integrations	Number of integrations within 5 kb of CpG islands	Frequency of integrations within 5 kb of CpG islands (%)	P-value (compared with the frequency of wild-type)
Random	1,000,000	71,763	7.2**	2.33E-49
WT	234	98	41.9
37-H3.1	268	21	7.8**	6.09E-20
37-H3.2	257	15	5.8**	1.11E-22
37-H3.3	126	28	22.2**	1.17E-04
273-H3.1	107	19	17.8**	6.38E-06
273-H3.2	102	22	21.6**	2.11E-04
273-H3.3	209	17	8.1**	4.66E-17
273-H2A.1	103	14	13.6**	1.09E-07
273-H2A.2	61	10	16.4**	1.16E-04
273-H2B	83	16	19.3**	1.25E-04
273-H4	94	18	19.1**	5.30E-05
37-NZ-CZ	77	14	18.2**	8.97E-05
37-Jun-Fos	111	23	20.7**	6.88E-05
273-NZ-CZ	117	24	20.5**	4.22E-05
273-Jun-Fos	168	22	13.1**	1.36E-10

야생형 벡터의 경우와 비교한 차이에 대한 테스트 P-값이 0.05 미만인 경우 삽입 빈도는 **로 표시

	Number of integrations	Number of integrations within 5 kb of cis-regulatory elements	Frequency of integrations within 5 kb of cis-regulatory elements (%)	P-value (compared with the frequency of wild-type)
Random	1,000,000	68,572	6.86**	4.05E-55
WT	234	102	43.6
37-H3.1	268	24	9.0**	9.00E-20
37-H3.2	257	29	11.3**	2.14E-16
37-H3.3	126	30	23.8**	1.27E-04
273-H3.1	107	16	15.0**	7.86E-08
273-H3.2	102	21	20.6**	3.16E-05
273-H3.3	209	18	8.6**	9.90E-18
273-H2A.1	103	15	14.6**	7.55E-08
273-H2A.2	61	9	14.8**	1.40E-05
273-H2B	83	8	9.6**	2.71E-09
273-H4	94	14	14.9**	2.89E-07
37-NZ-CZ	77	13	16.9**	1.14E-05
37-Jun-Fos	111	12	10.8**	1.84E-10
273-NZ-CZ	117	23	19.7**	5.27E-06
273-Jun-Fos	168	27	16.1**	2.19E-09

야생형 벡터의 경우와 비교한 차이에 대한 테스트 P-값이 0.05 미만인 경우 삽입 빈도는 **로 표시

도 6a 및 도 6b에서 확인할 수 있듯이, 야생형 MLV 삽입은 CpG 섬 (41.9 % 빈도) 및 cis-조절요소 (43.6 % 빈도)로부터 5kb 내의 게놈 부위에서 주로 발생하였다. 대조적으로, 인테그라제 돌연변이는 이들 영역에 대한 삽입 선호도를 상당히 감소시켰다. 돌연변이 벡터는 5.8-22.2 %의 빈도에서 CpG 섬에서 5kb 내에 삽입되었고 8.6 내지 23.8 %의 빈도에서 cis-조절 요소로부터 5kb 내에 삽입되었다. 또한, TSS 영역에 대한 낮은 삽입 빈도에 기초하여 안전한 돌연변이 벡터로 선택된 3개의 돌연변이체의 CpG 섬 영역 삽입 빈도는 7.7 % (37-H3.1), 8.1 % (273-H3.3)) 및 16.4 % (273-H2A.2) 였다. 이러한 빈도는 야생형 벡터보다 5.4 배, 5.2 배 및 2.6 배 낮다.

한편, 도 6b에서 확인할 수 있듯이, 인테그라제 내부에 히스톤을 삽입하는 것은 돌연변이 벡터의 삽입을 cis-조절 요소로부터 멀어지게 만들었다. cis-조절 요소의 5 kb 내 게놈 부위에 대한 돌연변이체 273-H3.3의 삽입 빈도는 야생형 벡터보다 5.1 배 낮은 8.6 %였다. 또한, 돌연변이체 37-H3.1 및 273-H2A.2는 cis-조절 도메인 근처에 각각 야생형보다 낮은 8.9 % 및 9.8 % (4.9-배 및 4.5-배 낮음)의 빈도로 삽입되었다.

또한, CpG 섬과 cis-조절 요소 위치 5kb 이내 레트로바이러스 벡터 삽입 사이트를 해당 게놈 구성 요소에서 시작하여 1kb 간격의 하위 집합으로 나누어, 그 결과를 도 7a에 나타내었다.

도 7a에서 확인할 수 있듯이, 야생형 MLV 삽입은 CpG 섬으로부터 2kb 이내에 집중되어 있었다. 대조적으로, 2개의 돌연변이 벡터 37-H3.1 및 273-H3.3은 CpG 섬 근처에서 강한 집중적 삽입을 보이지 않았다.

도 7b에서 확인할 수 있듯이, CpG 섬 주변의 더 큰 범위 (CpG 섬으로부터 50kb 영역 내)에서 보면 CpG 섬 근처의 야생형 벡터 삽입 집중도가 보다 명확하게 식별될 수 있다.

	< 1 kb	< 2 kb	< 3 kb	< 4 kb	< 5 kb
Random	1.6%	3.1%	4.5%	5.8%	7.2%
WT	23.1%	37.2%	39.7%	40.6%	41.9%
37-H3.1	1.5%	3.4%	5.2%	6.0%	7.8%
273-H3.3	2.4%	3.8%	4.1%	6.3%	7.1%
273-H2A.2	11.5%	14.8%	14.8%	16.4%	16.4%

도 7c 및 표 17에서 확인할 수 있듯이, CpG 섬으로부터의 거리에 따른 레트로바이러스 벡터 삽입 누적 빈도에 대한 분석은 야생형 벡터 삽입이 CpG 섬 주위에 고도로 집중되어 있음을 보여준다. 한편, 돌연변이체 37-H3.1 및 273-H3.3은 CpG 섬 주위에높은 수준으로 집중된 삽입 패턴을 나타내지 않았다. 오히려, 돌연변이체는 무작위 경우와 비슷하게, CpG 섬으로부터의 거리에 따른 삽입 빈도가 선형으로 증가하는 형태를 보인다. 보다 정량적으로 나타내면, 야생형 MLV 삽입의 37.2 %가 CpG 섬으로부터 2kb 이내에 발생하였다. 그러나 37-H3.2 및 273-H3.3의 경우 삽입이 3.4 % 및 3.8 % 정도만 해당 영역에 발생했다. 돌연변이체 273-H2A.2는 다른 돌연변이체보다 높은 빈도 (14.8 %)로 동일한 게놈 영역에 삽입되었다. 그러나 이 빈도는 여전히 야생형 벡터의 경우 보다 2.5 배 낮다.

	< 1 kb	< 2 kb	< 3 kb	< 4 kb	< 5 kb
Random	2.2%	3.4%	4.6%	5.7%	6.9%
WT	29.9%	36.8%	40.6%	42.7%	43.6%
37-H3.1	3.7%	4.9%	6.0%	7.8%	9.0%
273-H3.3	3.3%	3.3%	5.6%	7.1%	8.2%
273-H2A.2	6.6%	6.6%	8.2%	9.8%	14.8%

도 7d 및 표 18에서 확인할 수 있듯이, 이와 유사하게, 야생형 MLV 인간유전체 삽입은cis-조절 요소로부터 2 kb 내에서 고도로 집중된 반면 (빈도: 36.8 %)에, 돌연변이체는 cis-조절 요소 근처에서 고도로 집중된 삽입 경향을 나타내지 않았다. 예를 들어, 돌연변이체 273-H3.3의 삽입은 cis-조절 요소로부터 2kb 내에 야생형의 경우 보다 11.2 배 낮은, 3.3%의 빈도로 발생하였다. 돌연변이체 벡터 37-H3.1 및 273-H3.3은 또한 무작위 삽입의 경우와 유사한 누적 빈도 형태를 나타내었다 (cis-조절 요소로부터의 거리에 따라 선형적으로 증가함). 얻어진 모든 결과로부터, MLV 인테그라제 내부에 히스톤 또는 루신 지퍼를 삽입함으로써 인간 게놈 조절 영역에 대한 레트로바이러스 고유의 삽입 선호도를 실질적으로 감소시킬 수 있다는 결론에 도달하였다.

돌연변이체 인테그라제의 구조 예측

DNA-결합 단백질의 내부 도입에 의한 인테그라제의 구조적 교란으로 MLV 삽입을 인간 게놈 상 발현을 조절하는 영역으로부터 멀리 이동시킬 것으로 예상할 수 있다. 야생형 MLV 인테그라제의 구조가 아직 밝혀지지 않았기 때문에, 얻어진 돌연변이 인테그라제 구조 역시 실험적으로 밝히기 어려운 상황이다. 이에 본 발명자들은 실험적으로 돌연변이 인테그라제 구조를 푸는 시도 대신 가장 진보된 단백질 구조 예측 도구 중 하나인 I-TASSER (Zhang, 2008)를 사용하여, 히스톤 또는 루신 지퍼 도입이 MLV 인테그라제 구조에 어떤 영향을 끼치는지 이론적으로 예측해보았다.

MLV 인테그라제는 다수의 구조적 하위 도메인, N-말단 확장 도메인 (NED), N-말단 도메인 (NTD), 촉매 코어 도메인 (CCD) 및 C-말단 도메인 (CTD)을 포함하는 것으로 알려져 있다.

도 8a에서 확인할 수 있듯이, 인테그라제 273 번째 아미노산 잔기 위치에 히스톤을 삽입하면 273-H3.3의 예시에서 보듯이 CTD의 구조에 변화가 유발된다. 이 구조 교란에 대한 잠재적인 이유를 파악하기 위해, 우리는 '인테그라제 sub-d main'과 '돌연변이체 인테그라제에 삽입된 히스톤' 사이에 새로이 형성된 수소 결합을 분석하였다.

도 8b에서 확인할 수 있듯이, 히스톤과 3개의 인테그라제 서브 도메인 (CCD, 링커 및 CTD; 도 8B) 사이에 13 개의 새로운 수소 결합이 발생하였다. 삽입된 H3.3 히스톤은 CCD의 아미노산 2개와 수소 결합 (286K (하단, 인테그라제 부분 아미노산은 "i"로 표시))-437T (하단, 히스톤 부분 아미노산은 "h"로 표시) 및 286K(i)-438R(h); 도 8b)을 형성한다. 삽입된 H3.3 히스톤은 인테그라제의 링커와 7개의 수소결합 (285T(i)-442S(h), 287Q(i)-442S(h), 405D(h)-473R(i), 409A(h)-473R(i), 413R(h)-472D(i), 413R(h)-473R(i), 421V(h)-470Q(i))을 형성한다.

도 8a에서 확인할 수 있듯이, 이러한 새로운 수소 결합은 부분적으로 CCD와 링커 구조의 교란을 유발할 수 있다. 또한, 도 8b에서 확인할 수 있듯이, H3.3과 CTD 사이에는 4개의 수소 결합 (351R(h)-495N(i), 387E(h)-489R(i), 387E(h)-527H(i), 390N(h)-529K(i)) 이 존재했다. 이러한 새로운 상호 작용으로 CTD에서 베타 시트가 부분적으로 파괴될 수 있다.

서열 번호	명명	서열목록 (5'-> 3')	비고
83	Integrases_DNA sequence	atagaaaattcatcaccctacacctcagaacattttcattacacagtgactgatataaaggacctaaccaagttgggggccatttatgataaaacaaagaagtattgggtctaccaaggaaaacctgtgatgcctgaccagtttacttttgaattattagactttcttcatcagctgactcacctcagcttctcaaaaatgaaggctctcctagagagaagccacagtccctactacatgctgaaccgggatcgaacactcaaaaatatcactgagacctgcaaagcttgtgcacaagtcaacgccagcaagtctgccgttaaacagggaactagggtccgcgggcatcggcccggcactcattgggagatcgatttcaccgagataaagcccggattgtatggctataaatatcttctagtttttatagataccttttctggctggatagaagccttcccaaccaagaaagaaaccgccaaggtcgtaaccaagaagctactagaggagatcttccccaggttcggcatgcctcaggtattgggaactgacaatgggcctgccttcgtctccaaggtgagtcagacagtggccgatctgttggggattgattggaaattacattgtgcatacagaccccaaagctcaggccaggtagaaagaatgaatagaaccatcaaggagactttaactaaattaacgcttgcaactggctctagagactgggtgctcctactccccttagccctgtaccgagcccgcaacacgccgggcccccatggcctcaccccatatgagatcttatatggggcacccccgccccttgtaaacttccctgaccctgacatgacaagagttactaacagcccctctctccaagctcacttacaggctctctacttagtccagcacgaagtctggagacctctggcggcagcctaccaagaacaactggaccgaccggtggtacctcacccttaccgagtcggcgacacagtgtgggtccgccgacaccagactaagaacctagaacctcgctggaaaggaccttacacagtcctgctgaccacccccaccgccctcaaagtagacggcatcgcagcttggatacacgccgcccacgtgaaggctgccgaccccgggggtggaccatcctctagactgacatggcgcgttcaacgctctcaaaaccccttaaaaataaggttaacccgcgaggccccctaa

서열 번호	명명	서열목록	비고
84	Integrases_Amino acid sequence	iensspytsehfhytvtdikdltklgaiydktkkywvyqgkpvmpdqftfelldflhqlthlsfskmkallershspyymlnrdrtlknitetckacaqvnasksavkqgtrvrghrpgthweidfteikpglygykyllvfidtfsgwieafptkketakvvtkklleeifprfgmpqvlgtdngpafvskvsqtvadllgidwklhcayrpqssgqvermnrtiketltkltlatgsrdwvlllplalyrarntpgphgltpyeilygappplvnfpdpdmtrvtnspslqahlqalylvqhevwrplaaayqeqldrpvvphpyrvgdtvwvrrhqtknleprwkgpytvllttptalkvdgiaawihaahvkaadpgggpssrltwrvqrsqnplkirltreap

<110> Sookmyung Women's university industry-academic cooperation foundation <120> Safe retroviral vectors developed by insertion of histone or leucine zipper into the viral integrase <130> PN200017 <160> 82 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 1 Asp Asp Pro Val Ala Thr 1 5 <210> 2 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H2A_sense_primer <400> 2 aaaaagcgct gatccaccgg tcgccaccat gtctggacgt ggcaagcag 49 <210> 3 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H2A_antisense_primer <400> 3 aaaagctagc ggtggcgacc ggtggatcct tgcccttagc tttgtggtgg 50 <210> 4 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H2B_sense_primer <400> 4 aaaaggcgcc gatccaccgg tcgccaccat gcctgagcca gcgaaatcc 49 <210> 5 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H2B_antisense_primer <400> 5 aaaagctagc ggtggcgacc ggtggatcct tggagctggt gtacttggta acg 53 <210> 6 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3.1_sense_primer <400> 6 aaaaagcgct gatccaccgg tcgccaccat ggcacgcacg aagcaaac 48 <210> 7 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3.1_antisense_primer <400> 7 aaaagctagc ggtggcgacc ggtggatctg ccctctctcc gcgaatg 47 <210> 8 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3.2_sense_primer <400> 8 aaaaagcgct gatccaccgg tcgccaccat ggcccgtact aagcagactg c 51 <210> 9 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3.2_antisense_primer <400> 9 aaaagctagc ggtggcgacc ggtggatcag cccgctctcc acggatg 47 <210> 10 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3.3_sense_primer <400> 10 aaaaagcgct gatccaccgg tcgccaccat ggctcgtaca aagcagactg cc 52 <210> 11 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3.3_antisense_primer <400> 11 aaaagctagc ggtggcgacc ggtggatcag cacgttctcc acgtatgcg 49 <210> 12 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H4_sense_primer <400> 12 aaaaagcgct gatccaccgg tcgccaccat gtccggcaga ggaaaggg 48 <210> 13 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H4_antisense_primer <400> 13 aaaaggcgcc gatccaccgg tcgccaccat gcctgagcca gcgaaatcc 49 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> biotinylated oligonucleotide <400> 14 atttgttaaa gavaggatat cagtggtcca g 31 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker+ <400> 15 gtaatacgac tcactatagg gctccgctta agggac 36 <210> 16 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker- <400> 16 tagtccctta gcggag 16 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer_F <400> 17 gacttgtggt ctcgctgttc cttgg 25 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer_R <400> 18 gtaatacgac tcactatagg gctccccgct taag 34 <210> 19 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for adaptor addition <400> 19 tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagggagggt ctcctctgag tgattgacta 60 cc 62 <210> 20 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for adaptor addition <400> 20 gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagactcac tatagggctc cgcttaaggg 60 ac 62 <210> 21 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for index addition <400> 21 aatgatacgg cgaccaccga gatctacact cgtcggcagc gtc 43 <210> 22 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for index addition <400> 22 caagcagaag acggcatacg agatrrrrrr rrgtctcgtg ggctcgg 47 <210> 23 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FFFFFFFF_S502 <400> 23 ctctctat 8 <210> 24 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FFFFFFFF_S503 <400> 24 tatcctct 8 <210> 25 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FFFFFFFF_S505 <400> 25 gtaaggag 8 <210> 26 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FFFFFFFF_S506 <400> 26 actgcata 8 <210> 27 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FFFFFFFF_S507 <400> 27 aaggagta 8 <210> 28 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial 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Sequence <220> <223> H3.2 <400> 53 atggcccgta ctaagcagac tgctcgcaag tcgaccggcg gcaaggcccc gaggaagcag 60 ctggccacca aggcggcccg caagagcgcg ccggccacgg gcggggtgaa gaagccgcac 120 cgctaccggc ccggcaccgt agccctgcgg gagatccggc gctaccagaa gtccacggag 180 ctgctgatcc gcaagctgcc cttccagcgg ctggtacgcg agatcgcgca ggactttaag 240 acggacctgc gcttccagag ctcggccgtg atggcgctgc aggaggccag cgaggcctac 300 ctggtggggc tgttcgaaga cacgaacctg tgcgccatcc acgccaagcg cgtgaccatt 360 atgcccaagg acatccagct ggcccgccgc atccgtggag agcgggct 408 <210> 54 <211> 408 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3.3 <400> 54 atggctcgta caaagcagac tgcccgcaaa tcgaccggtg gtaaagcacc caggaagcaa 60 ctggctacaa aagccgctcg caagagtgcg ccctctaccg gaggggtgaa gaaacctcat 120 cgttacaggc ctggtactgt ggcgctccgt gaaattagac gttatcagaa gtccactgaa 180 cttctgattc gcaaacttcc cttccagcgt ctggtgcgag aaattgctca ggactttaaa 240 acagatctgc gcttccagag cgcagctatc ggtgctttgc aggaggcaag tgaggcctat 300 ctggttggcc tttttgaaga caccaacctg tgtgctatcc atgccaaacg 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Lys Thr Arg Ile Ile 65 70 75 80 Pro Arg His Leu Gln Leu Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys 85 90 95 Leu Leu Gly Lys Val Thr Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu Pro Asn Ile 100 105 110 Gln Ala Val Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser His His Lys Ala Lys 115 120 125 Gly Lys 130 <210> 75 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H2B <400> 75 Met Pro Glu Pro Ala Lys Ser Ala Pro Ala Pro Lys Lys Gly Ser Lys 1 5 10 15 Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys Arg 20 25 30 Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln 35 40 45 Val His Pro Asp Thr Gly Ile Ser Ser Lys Ala Met Gly Ile Met Asn 50 55 60 Ser Phe Val Asn Asp Ile Phe Glu Arg Ile Ala Gly Glu Ala Ser Arg 65 70 75 80 Leu Ala His Tyr Asn Lys Arg Ser Thr Ile Thr Ser Arg Glu Ile Gln 85 90 95 Thr Ala Val Arg Leu Leu Leu Pro Gly Glu Leu Ala Lys His Ala Val 100 105 110 Ser Glu Gly Thr Lys Ala Val Thr Lys Tyr Thr Ser Ser Lys 115 120 125 <210> 76 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H4 <400> 76 Met Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala 1 5 10 15 Lys Arg His Arg Lys Val Leu Arg Asp Asn Ile Gln Gly Ile Thr Lys 20 25 30 Pro Ala Ile Arg Arg Leu Ala Arg Arg Gly Gly Val Lys Arg Ile Ser 35 40 45 Gly Leu Ile Tyr Glu Glu Thr Arg Gly Val Leu Lys Val Phe Leu Glu 50 55 60 Asn Val Ile Arg Asp Ala Val Thr Tyr Thr Glu His Ala Lys Arg Lys 65 70 75 80 Thr Val Thr Ala Met Asp Val Val Tyr Ala Leu Lys Arg Gln Gly Arg 85 90 95 Thr Leu Tyr Gly Phe Gly Gly 100 <210> 77 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L1 <400> 77 Asp Pro Pro Val Ala Thr 1 5 <210> 78 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NZ <400> 78 Ala Leu Lys Lys Glu Leu Gln Ala Asn Lys Lys Glu Leu Ala Gln Leu 1 5 10 15 Lys Trp Glu Leu Gln Ala Leu Lys Lys Glu Leu Ala Gln 20 25 <210> 79 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CZ <400> 79 Glu Gln Leu Glu Lys Lys Leu Gln Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ala Gln 1 5 10 15 Leu Glu Trp Lys Asn Gln Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ala Gln 20 25 30 <210> 80 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Jun <400> 80 Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser 1 5 10 15 Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu 20 25 30 <210> 81 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fos <400> 81 Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Leu Asn Ala Ile Glu Thr Gln Leu Ala 1 5 10 15 Ser Lys Glu Asp Glu Leu Gln Asp Thr Glu Ala Gln Leu Thr Asp Thr 20 25 30 <210> 82 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L2 <400> 82 Ser Gly Gly Thr Ser Gly Ser Thr Ser Gly Thr Gly Ser Thr 1 5 10

Claims (28)

1. 인테그라제를 코딩하는 유전자에 히스톤 또는 루신 지퍼를 코딩하는 유전자가 도입된 레트로바이러스 벡터로서,
   상기 인테그라제를 코딩하는 유전자는 서열번호 83의 염기서열을 포함하고,
   상기 레트로바이러스 벡터에 의해 암호화되는 인테그라제 단백질은 이의 37 또는 273번 잔기 바로 앞에 히스톤 또는 루신 지퍼가 삽입된 것인, 레트로바이러스 벡터.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 히스톤은 서열번호 70 내지 76으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 레트로바이러스 벡터.
5. 제1항에 있어서, 상기 히스톤을 코딩하는 유전자는 서열번호 52 내지 58로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 포함하는 것인, 레트로바이러스 벡터.
6. 제1항에 있어서, 상기 히스톤은 C-말단, N-말단 또는 양 말단에 제1 링커를 포함하는 것인, 레트로바이러스 벡터.
7. 제1항에 있어서, 상기 히스톤을 코딩하는 유전자는 3', 5'또는 이들 모두에 제1 링커를 코딩하는 유전자를 포함하는 것인, 레트로바이러스 벡터.
8. 제1항에 있어서, 상기 루신 지퍼는 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 NZ 서열 및 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 CZ 서열; 또는 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 Jun 서열 및 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 Fos 서열을 포함하는 것인, 레트로바이러스 벡터.
9. 제8항에 있어서, 상기 NZ 서열을 코딩하는 유전자는 서열번호 60의 염기서열을 포함하는 염기서열이고, 상기 CZ 서열을 코딩하는 유전자는 서열번호 61의 염기서열을 포함하는 염기서열인 것인, 레트로바이러스 벡터.
10. 제8항에 있어서, 상기 Jun 서열을 코딩하는 유전자는 서열번호 62의 염기서열을 포함하는 염기서열이고, 상기 Fos 서열을 코딩하는 유전자는 서열번호 63의 염기서열을 포함하는 염기서열인 것인, 레트로바이러스 벡터.
11. 제1항에 있어서, 상기 루신 지퍼는 C-말단, N-말단 또는 양 말단에 제2 링커를 포함하는 것인, 레트로바이러스 벡터.
12. 제8항에 있어서, 상기 NZ 서열과 CZ 서열; 또는 Jun 서열과 Fos 서열은 제2 링커를 통해 연결된 것인, 레트로바이러스 벡터.
13. 삭제
14. 삭제
15. 다음의 단계를 포함하는 히스톤 또는 루신 지퍼를 코딩하는 유전자가 도입된 레트로바이러스 벡터 구축 방법:
    히스톤 또는 루신 지퍼를 코딩하는 유전자를 준비하는 유전자 준비 단계; 및
    레트로바이러스 벡터에 의해 암호화되는 인테그라제 단백질의 37 또는 273번 잔기 바로 앞에 히스톤 또는 루신 지퍼가 삽입되도록, 상기 히스톤 또는 루신 지퍼를 코딩하는 유전자를 서열번호 83의 염기서열을 포함하는 인테그라제를 코딩하는 유전자에 삽입하는 도입 단계.
16. 삭제
17. 삭제
18. 제15항에 있어서, 상기 히스톤은 서열번호 65 내지 71로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
19. 제15항에 있어서, 상기 히스톤을 코딩하는 유전자는 서열번호 52 내지 58로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 포함하는 것인, 방법.
20. 제15항에 있어서, 상기 히스톤은 C-말단, N-말단 또는 양 말단에 제1 링커를 포함하는 것인, 방법.
21. 제15항에 있어서, 상기 히스톤을 코딩하는 유전자는 3', 5'또는 이들 모두에 제1 링커를 코딩하는 유전자를 포함하는 것인, 방법.
22. 제15항에 있어서, 상기 루신 지퍼는 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 NZ 서열 및 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 CZ 서열; 또는 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 Jun 서열 및 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 Fos 서열을 포함하는 것인, 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 NZ 서열을 코딩하는 유전자는 서열번호 60의 염기서열을 포함하는 염기서열이고, 상기 CZ 서열을 코딩하는 유전자는 서열번호 61의 염기서열을 포함하는 염기서열인 것인, 방법.
24. 제22항에 있어서, 상기 Jun 서열을 코딩하는 유전자는 서열번호 62의 염기서열을 포함하는 염기서열이고, 상기 Fos 서열을 코딩하는 유전자는 서열번호 63의 염기서열을 포함하는 염기서열인 것인, 방법.
25. 제15항에 있어서, 상기 루신 지퍼는 C-말단, N-말단 또는 양 말단에 제2 링커를 포함하는 것인, 방법.
26. 제22항에 있어서, 상기 NZ 서열과 CZ 서열; 또는 Jun 서열과 Fos 서열은 제2 링커를 통해 연결된 것인, 방법.
27. 삭제
28. 삭제

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