CN115074344B

CN115074344B - 一种多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系统及其应用

Info

Publication number: CN115074344B
Application number: CN202210729543.1A
Authority: CN
Inventors: 李燕强; 梅洋; 刘清华; 郭羽白; 李丹花
Original assignee: Xuzhou Medical University
Current assignee: Xuzhou Medical University
Priority date: 2022-06-24
Filing date: 2022-06-24
Publication date: 2023-09-19
Anticipated expiration: 2042-06-24
Also published as: CN115074344A

Abstract

本发明公开了一种多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系统及其应用，该系统包括重组自杀蛋白rCas8、促进重组自杀蛋白rCas8激活的“自杀辅助元件”、保护细胞的“保护元件”以及RNA转录后的“调控元件”；其中，所述“自杀辅助元件”包括链霉亲和素；所述“保护元件”包括烟草蚀纹病毒的半胱氨酸蛋白酶、Strep‑TagⅡ、缺失Strep‑TagⅡ结合能力的突变型链霉亲和素；所述RNA转录后的“调控元件”包括转运蛋白Rev、在mRNA转运过程中降解mRNA的Rev‑RNase。本发明基于通过多层次调控细胞死亡相关蛋白，使其能精准杀死靶标细胞，而对正常细胞具有保护作用。

Description

一种多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系统及其应用

技术领域

本发明属于细胞和基因工程技术领域，具体涉及一种多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系统及其应用。

背景技术

靶向杀死目标细胞同时保护非目标细胞，是人们一直以来追求的方向。嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T疗法)，是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，近几年通过优化改良在临床肿瘤治疗上取得很好的效果，是一种非常有前景的，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗方法。

CAR-T疗法无疑为癌症治疗带来新希望，然而，这种疗法也有严重不良反应，主要是细胞因子释放综合征(也叫细胞因子释放风暴，CRS)和神经毒性。如果处理不及时可能会危及生命。另外，CAR-T疗法具有自相残杀的风险：CAR-T细胞也是一种T细胞，导致免疫细胞和肿瘤细胞拥有相同的靶点。因此，CAR-T不仅会杀灭的肿瘤细胞，亦会“误杀”同样表达靶点的CAR-T伙伴，最终导致CAR-T细胞被快速清除。但以T细胞为靶细胞的CAR-T疗法，大量清除T细胞后可能使患者出现严重的免疫缺陷，因此有科学家担心可能使患者出现类似艾滋病的问题，即由于免疫缺陷导致的感染。而且高昂的治疗费用，会使绝大部分患者承受不起。

对目标细胞导入“自杀基因”，细胞其表达产物具有特别的敏感性，最终导致这些细胞的死亡。如果精确调控这些基因只在靶标细胞表达及形成一个有功能的“自杀蛋白体”，而对非靶标细胞无杀伤性是基因疗法的重要挑战。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系统及其应用，基于通过多层次调控细胞死亡相关蛋白，使其能精准杀死靶标细胞，而对正常细胞具有保护作用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系统，包括重组自杀蛋白rCas8、促进重组自杀蛋白rCas8激活的“自杀辅助元件”、保护细胞的“保护元件”以及RNA转录后的“调控元件”；其中，所述“自杀辅助元件”包括链霉亲和素；所述“保护元件”包括烟草蚀纹病毒的半胱氨酸蛋白酶、Strep-TagⅡ、缺失Strep-TagⅡ结合能力的突变型链霉亲和素；所述RNA转录后的“调控元件”包括转运蛋白Rev、在mRNA转运过程中降解mRNA的Rev-RNase；

所述重组自杀蛋白rCas8包括Strep-TagⅡ、烟草蚀纹病毒的半胱氨酸蛋白酶切位点以及Caspase8凋亡关键结构域，具有如SEQ ID NO.1所示的序列；

所述链霉亲和素具有如SEQ ID NO.2所示的序列；

所述Strep-TagⅡ具有如SEQ ID NO.3所示的序列；

所述烟草蚀纹病毒的半胱氨酸蛋白酶具有如SEQ ID NO.4所示的序列；

所述缺失Strep-TagⅡ结合能力的突变型链霉亲和素具有如SEQ ID NO.5所示的序列；

所述转运蛋白Rev具有如SEQ ID NO.7所示的序列；

所述Rev-RNase包括转运蛋白Rev、柔性连接肽以及RNA酶结构域，具有如SEQ IDNO.8所示的序列。

优选地，所述“调控元件”还包括mRNA调控元件，所述mRNA调控元件为促进HIV1的RNA从细胞核向细胞质转运的RRE序列，具有如SEQ ID NO.6所示的序列。

优选地，所述降解mRNA的Rev-RNase中RNA酶结构域，包括但不限于MCPIP1的RNA酶结构域。

一种多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系统在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗恶性肿瘤的药物中的应用。

上述的多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系统在宿主细胞中调控基因表达的方法，包括以下步骤：

步骤1)根据目标序列A，构建腺相关病毒载体并包装成腺相关病毒，静脉注射进宿主体内以保护非靶向细胞；所述目标序列A中表达的是所述保护细胞的“保护元件”，包括烟草蚀纹病毒的半胱氨酸蛋白酶、Strep-TagⅡ、缺失Strep-TagⅡ结合能力的突变型链霉亲和素；

步骤2)靶向细胞通过慢病毒过表达转运蛋白Rev，并把这些细胞通过皮下移殖至步骤1)所述宿主；

步骤3)根据目标序列B，构建腺病毒载体，并包装成腺病毒，静脉注射步骤2)所述宿主体内杀死靶向细胞；所述目标序列B所含有的成分有：由AFP启动子表达的rCas8和Survivin启动子表达的链霉亲和素，同时在其下游还含有RRE序列。

一种试剂盒，包括上述的多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系统的病毒表达载体。

优选地，所述病毒表达载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体。

优选地，所述多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系统中涉及的蛋白表达可以构建到同一个病毒载体上，也可以把不同的表达产物构建到不同的病毒载体上。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明的多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系统，具体为针对不同的细胞类型，基于由多个细胞特异表达启动子转录不同的mRNA，而转录出来的mRNA通过严格调控的转运蛋白和转运蛋白-RNase融合蛋白调节mRNA由细胞核转至细胞质，而细胞最终是否存亡是由所表达的蛋白组合决定的方法。

(2)本发明通过多个层次的精细调控，大大提高靶向特异性，既有杀伤力，同时也有保护非靶标细胞的能力，适用于肿瘤细胞清除等应用；该方法按照流行的分子生物学方法进行，所需要的试剂和仪器均为常用，无需特殊购买。

附图说明

图1为本发明的多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系统所涉及的主要组成元件；

图2为本发明的多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系统在细胞内各组成部分作用原理图；

图3为本发明的多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系统具体促进细胞死亡的原理示意图；

图4为本发明的多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系统具体保护细胞的原理示意图。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，本领域技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1

一种多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系统，如图1所示，包括重组自杀蛋白rCas8(即图1中Twin-strep-TEVpCS-caspase8)、促进重组自杀蛋白rCas8激活的“自杀辅助元件”、保护细胞的“保护元件”以及RNA转录后的“调控元件”。

所述重组自杀蛋白rCas8具有如SEQ ID NO.1所示的序列，包含有Caspase8大亚基和小亚基(即图1中Large submit+Small submit，构成凋亡关键结构域)，为了防止Caspase8导致的非传统细胞凋亡活性，把Caspase8的C末端的六个氨基酸残基，在N末端增加Strep-TagⅡ序列(即图1中Twin-strep-tag，如SEQ ID NO.3所示)用于含有链霉亲和素时会形成二聚体从而激活rCas8活性，而且在Strep-TagⅡ序列后面跟着一个烟草蚀纹病毒(Tobacco Etch Virus，TEV)的半胱氨酸蛋白酶切位点(即图1中TEVpCS)。

所述促进重组自杀蛋白rCas8激活的“自杀辅助元件”，包括重组自杀蛋白rCas8序列中的Strep-TagⅡ序列和链霉亲和素(即图1中SA，如SEQ ID NO.2所示)。

所述的促进重组自杀蛋白rCas8激活是指rCas8中的Strep-TagⅡ与链霉亲和素结合后形成二聚体，从而使rCas8蛋白自身成熟为一个能引起细胞凋亡的过程。

所述保护细胞的“保护元件”用于破坏重组自杀蛋白rCas8激活，包括重组自杀蛋白rCas8序列中的TEV的半胱氨酸蛋白酶切位点、TEV的半胱氨酸蛋白酶(即图1中TEVp，如SEQ ID NO.4所示)、Strep-TagⅡ和缺失Strep-TagⅡ结合能力的突变型链霉亲和素(即图1中dSA，如SEQ ID NO.5所示)。

重组自杀蛋白rCas8的Strep-TagⅡ与Caspase8凋亡关键结构域之间添加一段蛋白酶切位点如本实施例所涉及的TEV的半胱氨酸蛋白酶切位点(即SEQ ID NO.1所示序列中Strep-TagⅡ序列和Caspase8凋亡关键结构域之间的序列，也即是ENLYFQ)，当非靶标细胞表达有TEV的半胱氨酸蛋白酶时，会把Strep-TagⅡ-Caspase8切成两部分，无论链霉亲和素是否存在，“自杀蛋白体”均不能形成。

所述“保护元件”还可以通过在非靶标细胞表达一些干扰蛋白来影响“自杀蛋白体”的形成，如表达Strep-TagⅡ与rCas8竞争结合链霉亲和素；或者表达缺失Strep-TagⅡ能力的链霉亲和素突变体与正常链霉亲和素形成二聚体，影响rCas8形成二聚体。

所述RNA转录后的“调控元件”包括转运相关的RNA序列如转运蛋白Rev(如SEQ IDNO.7所示)以及在mRNA转运过程中降解mRNA的Rev-RNase(包括转运蛋白Rev、柔性连接肽以及RNA酶结构域，如SEQ ID NO.8所示)。

在本实施例中，所述RNA转录后的“调控元件”还包括mRNA调控元件，所述mRNA调控元件为促进HIV1的RNA从细胞核向细胞质转运的RRE序列(即图1中RRE contained mRNA)，具有如SEQ ID NO.6所示的序列，用于转录后进行调控。

所述的转录后进行调控是指为了进一步调控mRNA表达，在基因rCas8和链霉亲和素的基因序列中人为添加了一段mRNA调控元件如本实施例所述的HIV1的RRE序列，如果所转录的RNA长于4000个碱基，那么RNA不会被细胞内的因子从细胞核里运转到细胞质中起功能，除非在转运蛋白Rev的辅助作用下才能转运，而且当非靶标细胞也微量表达自杀相关基因时，为了保护细胞，在非靶标细胞通过表达Rev-RNase时，在转运过程中就把这些mRNA降解，通过严格调控的转运促进蛋白和转运抑制蛋白蛋白表达，调控mRNA由细胞核转至细胞质从而决定它们是否能翻译出蛋白。也就是说，mRNA由细胞核转运至细胞质是由促进转运的Rev蛋白和抑制转运的Rev-RNase调控的：当靶标细胞表达Rev蛋白时，mRNA可以转运到细胞质，蛋白翻译正常；当非靶标细胞表达Rev-RNase时，mRNA可以转运过程会被RNase降解，蛋白翻译抑制。

如图2所示为本实施例所述系统在细胞内各组成部分作用原理图。首先所构建的基因在细胞核里表达出mRNA，一些比较短的mRNA转录出来后可以利用细胞内的转运体系进入细胞质中翻译出相应的蛋白质，而比较长的含有RRE序列的mRNA转录出来后，如果有Rev表达，那么可以在Rev蛋白作用下转运到细胞质中进行翻译从而促进细胞死亡，而Rev-RNase表达时，会把含有RRE序列的mRNA降解，从而保护细胞；如果Rev和Rev-RNase都没表达，那么长片段RNA会停在细胞核里，不产生相应的功能蛋白，细胞也不会死亡；另外，如果TEV半胱氨酸蛋白酶有表达，那么rCas8会被该蛋白酶破坏，从而保护细胞。

靶标细胞存亡是由该细胞是否存在“自杀蛋白体”即本实施例所提及的rCas8活化状态，而“自杀蛋白体”主要通过三个层次进行调控。首先，“自杀蛋白体”是由“自杀基因”表达而来，细胞特异启动子，很大程度决定了“自杀基因”靶向细胞特异性；然后，“自杀基因”所转录出来的mRNA通过严格调控的转运蛋白Rev和Rev-RNase融合蛋白调节mRNA由细胞核转至细胞质而决定它们是否能翻译出蛋白；最后，所翻译出来的蛋白也受到了“保护元件”调控，决定了“自杀蛋白体”是否完整存在。通过多个层次的精细调控，大大提高靶向特异性，既有杀伤力，同时也有保护非靶向细胞的能力。

本实施例所述系统具体促进细胞死亡的原理如图3所示，当rCas8与SA(链霉亲和素)在同一个细胞表达时，会形成二聚体，从而激活Caspase8的凋亡功能。

本实施例所述系统具体保护细胞的原理如图4所示，其中，dSA(缺失Strep-TagⅡ结合能力的突变型链霉亲和素)可以与SA蛋白结合，形成四聚体，但不能与生物素以及Strep-TagⅡ结合；TEVp(TEV半胱氨酸蛋白酶)识别并切割Twin-strep-TEVpCS-caspase8D(重组自杀蛋白rCas8)中的TEVpCS序列(TEV半胱氨酸蛋白酶切位点)，既能阻止caspase8D形成二聚体，又能产生Twin-strep多肽干扰SA功能；Twin-strep(Strep-TagⅡ)相当于干扰多肽，与Twin-strep-caspase8D竞争结合SA上的结合位点。

本实施例所述系统中的蛋白成分均可通过细胞特异启动子，有选择地在不同细胞里表达系统中的蛋白。

本实施例所涉及的基因及其元件可通过构建到载体或包装成单个或多个病毒实现细胞表达。载体的具体构建方法如下：

载体所涉及的DNA序列通过基因合成公司直接合成得到相关的重组DNA，然后根据所合成的DNA序列，利用常规的载体构建方法构建相应的载体，如酶切及连接方法或通过无缝克隆的方法构建上述载体。

实施例2

本实施例所用实验动物：裸鼠(Nude mouse)，清洁级，10只，雄性，体重20～25g，购自博恩生物。

利用实施例1所述的多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系统，靶向杀死移殖在裸鼠体内的HepG2细胞，具体方法步骤如下：

(1)根据SEQ ID NO.9序列，交由上海生工生物工程股份有限公司合成得到相应的序列，在序列两端合成有BamH1和EcoR1内切酶位点，合成的产物和腺相关病毒载体用BamH1和EcoR1内切酶切开，用胶回收试剂盒回收相应的片段，利用T4DNA连接酶，把合成片段连接到载体，得到重组载体；所得到的重组载体利用辅助质粒共转化到AAV293细胞，中间替换新鲜培养液，转染72h收取腺相关病毒，所得到的粗制病毒经过纯化和浓缩后得到高滴度的病毒液，包装成腺相关病毒，尾静脉注射进裸鼠体内以保护非HepG2细胞；SEQ ID NO.9中表达的是实施例1所述的保护细胞的“保护元件”，包括Strep-TagⅡ、TEV半胱氨酸蛋白酶和缺失Strep-TagⅡ结合能力的链霉亲和素。

(2)HepG2细胞通过慢病毒过表达SEQ ID NO.7，交由上海生工生物工程股份有限公司合成得到相应的序列，在序列两端合成有BamH1和EcoR1内切酶位点，合成的产物和腺相关病毒载体用BamH1和EcoR1内切酶切开，用胶回收试剂盒回收相应的片段，利用T4DNA连接酶，把合成片段连接到载体，得到重组载体；所得到的重组载体利用辅助质粒共转化到293T细胞，中间替换新鲜培养液，转染72h收取上清液，所得到的粗制病毒经过纯化和浓缩后得到高滴度的慢病毒液体，所得到慢病毒感染培养的HepG2细胞，利用慢病毒所带的嘌呤霉素抗性基因，杀死未感染慢病毒细胞，收取感染慢病毒的细胞。并把这些细胞按超过1×10⁶的细胞量通过皮下移殖至步骤(1)的裸鼠；SEQ ID NO.7是表达促进含有RRE序列的mRNA转运蛋白。

(3)根据SEQ ID NO.10序列，构建腺病毒载体，载体按上述方法构建，并包装成腺病毒，腺病毒包装按常规方法进行，尾静脉注射至步骤(2)的裸鼠体内杀死HepG2细胞。SEQID NO.10序列所含有的成分有：由AFP启动子表达的rCas8和Survivin启动子表达的链霉亲和素，同时在其下游还含有RRE序列。

实验结果：一周后测量裸鼠体内成瘤大小，发现种殖瘤减少了95％，证明本发明的系统可以有效杀死外源HepG2细胞。

应该理解，在实施例或实验材料方法中所显示的成分用量、反应条件等数字或是本说明书所使用的其它参数均为近似值(除非特别注明)，可根据所需要获得的结果而加以改变。并且，这些参数并非用来限定本发明保护范围，而是应用正常的操作技术下所得到的较佳数据。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语术与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料及均可以应用于本发明中。文中所述的较佳实验方法与材料仅作为示范之用。此外应该理解，在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落在本申请所附权利要求书所限定的范围内。

序列表

<110> 徐州医科大学

<120> 一种多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系统及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 304

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Glu

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35 40 45

Glu Ser Gln Thr Leu Asp Lys Val Tyr Gln Met Lys Ser Lys Pro Arg

50 55 60

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Ile Tyr Gln Leu Met Asp His Ser Asn Met Asp Cys Phe Ile Cys Cys

130 135 140

Ile Leu Ser His Gly Asp Lys Gly Ile Ile Tyr Gly Thr Asp Gly Gln

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Glu Ala Pro Ile Tyr Glu Leu Thr Ser Gln Phe Thr Gly Leu Lys Cys

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Pro Ser Leu Ala Gly Lys Pro Lys Val Phe Phe Ile Gln Ala Cys Gln

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<210> 2

<211> 158

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Ile Gly Ala Val Gly Asn

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50 55 60

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Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Val

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Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln

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<210> 3

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

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<210> 4

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Gly Glu Ser Leu Phe Lys Gly Pro Arg Asp Tyr Asn Pro Ile Ser

1 5 10 15

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20 25 30

Leu Tyr Gly Ile Gly Phe Gly Pro Phe Ile Ile Thr Asn Lys His Leu

35 40 45

Phe Arg Arg Asn Asn Gly Thr Leu Leu Val Gln Ser Leu His Gly Val

50 55 60

Phe Lys Val Lys Asn Thr Thr Thr Leu Gln Gln His Leu Ile Asp Gly

65 70 75 80

Arg Asp Met Ile Ile Ile Arg Met Pro Lys Asp Phe Pro Pro Phe Pro

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Gln Lys Leu Lys Phe Arg Glu Pro Gln Arg Glu Glu Arg Ile Cys Leu

100 105 110

Val Thr Thr Asn Phe Gln Thr Lys Ser Met Ser Ser Met Val Ser Asp

115 120 125

Thr Ser Cys Thr Phe Pro Ser Ser Asp Gly Ile Phe Trp Lys His Trp

130 135 140

Ile Gln Thr Lys Asp Gly Gln Cys Gly Ser Pro Leu Val Ser Thr Arg

145 150 155 160

Asp Gly Phe Ile Val Gly Ile His Ser Ala Ser Asn Phe Thr Asn Thr

165 170 175

Asn Asn Tyr Phe Thr Ser Val Pro Lys Asn Phe Met Glu Leu Leu Thr

180 185 190

Asn Gln Glu Ala Gln Gln Trp Val Ser Gly Trp Arg Leu Asn Ala Asp

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Ser Val Leu Trp Gly Gly His Lys Val Phe Met Val Lys Pro Glu Glu

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val

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<212> DNA

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<400> 6

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gctgagggct attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca 180

gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcc 233

<210> 7

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<400> 7

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1 5 10 15

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60

ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 120

tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 180

tgggaggttt atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat 240

ccacgctgtt ttgacctcca tagaagattc tagagctagc gaattcgcca ccatgagcaa 300

ctggagccac ccccagttcg agaagggcgg cggcagcggc ggcggcagcg gcggcagcgc 360

ctggagccac ccccagttcg agaaggaggg cagaggaagt cttctaacat gcggtgacgt 420

ggaggagaat cccggccctg gcgagagcct gttcaaggga cctagggact acaaccctat 480

cagtagcaca atttgtcacc tgaccaacga gagtgatggc cacacaacaa gcctgtacgg 540

catcgggttc ggacccttta tcatcaccaa caagcacctg ttcaggcgga ataatggcac 600

tctgctggtg cagagcctgc acggggtgtt caaagtgaag aacacaacca ctctgcagca 660

gcacctgatc gatgggcggg atatgatcat cattaggatg cccaaggact tccccccttt 720

tcctcagaaa ctgaagttcc gagagcccca gagagaggag agaatctgtc tggtgaccac 780

aaactttcag actaagagca tgtccagcat ggtgagcgat actagctgta ccttcccatc 840

atctgacgga atcttctgga agcactggat tcagactaag gacggccagt gtggcagccc 900

actggtgagc acacgagacg gattcatcgt ggggattcac agcgcctcca actttacaaa 960

caccaataac tatttcacct cagtgccaaa gaactttatg gagctgctga ccaaccagga 1020

ggcccagcag tgggtgagcg ggtggcgcct gaacgccgat tccgtgctgt ggggcgggca 1080

caaggtgttt atggtgaagc cagaggagcc tttccagcct gtgaaggagg ccactcagct 1140

gatgaatcgc aggaggcgcc gggagggcag aggaagtctt ctaacatgcg gtgacgtgga 1200

ggagaatccc ggccctccca agaagaagcg caaggtgggc ggcggcagcg aggccggcat 1260

caccggcacc tggtacgccc agctgggcga caccttcatc gtgaccgccg gcgccgacgg 1320

cgccctgacc ggcacctacg aggccgccgt gggcaacgcc gagagccgct acgtgctgac 1380

cggccgctac gacagcgccc ccgccaccga cggcagcggc accgccctgg gctggaccgt 1440

ggcctggaag aacaactacc gcaacgccca cagcgccacc acctggagcg gccagtacgt 1500

gggcggcgcc gaggcccgca tcaacaccca gtggctgctg accagcggca ccaccgaggc 1560

caacgcctgg aagagcaccc tggtgggcca cgacaccttc accaaggtga agcccagcgc 1620

cgccagcatc gacgccgcca agaaggccgg cgtgaacaac ggcaaccccc tggacgccgt 1680

gcagcaggag ggcagaggaa gtcttctaac atgcggtgac gtggaggaga atcccggccc 1740

tagcaactgg agccaccccc agttcgagaa gggcggcggc agcggcggcg gcagcggcgg 1800

cagcgcctgg agccaccccc agttcgagaa gtaa 1834

<210> 10

<211> 4586

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggcctgaaat aacctctgaa agaggaactt ggttaggtac cttctgaggc tgaaagaacc 60

agctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa 120

gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccaggtg tggaaagtcc ccaggctccc 180

cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccata gtcccactgc 240

agtttgagga gaatatttgt tatatttgca aaataaaata agtttgcaag tttttttttt 300

ctgccccaaa gagctctgtg tccttgaaca taaaatacaa ataaccgcta tgctgttaat 360

tattggcaaa tgtcccattt tcaacctaag gaaataccat aaagtaacag atataccaac 420

aaaaggttac tagttaacag gcattgcctg aaaagagtat aaaagaattt cagcatgatt 480

ttccatattg tgcttccacc actgccaata acacctctag agccaccatg agcaactgga 540

gccaccccca gttcgagaag ggcggcggca gcggcggcgg cagcggcggc agcgcctgga 600

gccaccccca gttcgagaag ggaggtggaa gcgaaaacct gtacttccag ggtggcggag 660

gcagcacaat ctcggactct ccaagagaac aggatagtga atcacagact ttggacaaag 720

tttaccaaat gaaaagcaaa cctcggggat actgtctgat catcaacaat cacaattttg 780

caaaagcacg ggagaaagtg cccaaacttc acagcattag ggacaggaat ggaacacact 840

tggatgcagg ggctttgacc acgacctttg aagagcttca ttttgagatc aagccccacg 900

atgactgcac agtagagcaa atctatgaga ttttgaaaat ctaccaactc atggaccaca 960

gtaacatgga ctgcttcatc tgctgtatcc tctcccatgg agacaagggc atcatctatg 1020

gcactgatgg acaggaggcc cccatctatg agctgacatc tcagttcact ggtttgaagt 1080

gcccttccct tgctggaaaa cccaaagtgt tttttattca ggcttgtcag ggggataact 1140

accagaaagg tatacctgtt gagactgatt cagaggagca accctattta gaaatggatt 1200

tatcatcacc tcaaacgaga tatatcccgg atgaggctga ctttctgctg gggatggcca 1260

ctgtgaataa ctgtgtttcc taccgaaacc ctgcagaggg aacctggtac atccagtcac 1320

tttgccagag cctgagagag cgatgtcctc gaggcgatga tattctcacc atcctgactg 1380

aagtgaacta tgaagtaagc aacaaggatg acaagaaaaa catggggaaa cagatgcctc 1440

agcctacttt cacactaaga aaaaaacttg tcttcccttc tgattgagaa ttcgaattta 1500

aatcggatcc gcggccgcaa ggatcagact gagttttgct cttgttgcct aggctggagt 1560

gcaatggcac aatctcagct cactgcaccc tctgcctccc gggttcaagc gattctcctg 1620

cctcagcctc ccgagtagtt gggattacag gcatgcacca ccacgcccag ctaatttttg 1680

tatttttagt agagacaagg tttcaccgtg atggccaggc tggtcttgaa ctccaggact 1740

caagtgatgc tcctgcctag gcctctcaaa gtgttgggat tacaggcgtg agccactgca 1800

cccggcctgc acgcgttctt tgaaagcagt cgagggggcg ctaggtgtgg gcagggacga 1860

gctggcgcgg cgtcgctggg tgcaccgcga ccacgggcag agccacgcgg cgggaggact 1920

acaactcccg gcacaccccg cgccgccccg cctctactcc cagaaggccg cggggggtgg 1980

accgcctaag agggcgtgcg ctcccgacat gccccgcggc gcgccattaa ccgccagatt 2040

tgaatcgcgg gacccgttgg cagaggtggg ccaccatgcc caagaagaag cgcaaggtgg 2100

gcggcggcag cgaggccggc atcaccggca cctggtacaa ccagctgggc agcaccttca 2160

tcgtgaccgc cggcgccgac ggcgccctga ccggcaccta catcggcgcc gtgggcaacg 2220

ccgagagccg ctacgtgctg accggccgct acgacagcgc ccccgccacc gacggcagcg 2280

gcaccgccct gggctggacc gtggcctgga agaacaacta ccgcaacgcc cacagcgcca 2340

ccacctggag cggccagtac gtgggcggcg ccgaggcccg catcaacacc cagtggctgc 2400

tgaccagcgg caccaccgag gccaacgcct ggaagagcac cctggtgggc cacgacacct 2460

tcaccaaggt gaagcccagc gccgccagca tcgacgccgc caagaaggcc ggcgtgaaca 2520

acggcaaccc cctggacgcc gtgcagcagt agaattcgaa tttaaatcgg atccgcggcc 2580

gcaaggatct gcgatcgctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc 2640

cccgagaagt tggggggagg ggtcggcaat tgaacgggtg cctagagaag gtggcgcggg 2700

gtaaactggg aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa 2760

ccgtatataa gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga 2820

acacagctga agcttcgagg ggctcgcatc tctccttcac gcgcccgccg ccctacctga 2880

ggccgccatc cacgccggtt gagtcgcgtt ctgccgcctc ccgcctgtgg tgcctcctga 2940

actgcgtccg ccgtctaggt aagtttaaag ctcaggtcga gaccgggcct ttgtccggcg 3000

ctcccttgga gcctacctag actcagccgg ctctccacgc tttgcctgac cctgcttgct 3060

caactctacg tctttgtttc gttttctgtt ctgcgccgtt acagatccaa gctgtgaccg 3120

gcgcctacgc tagacgaatt cttcgaaatg gtgagcaagg gcgaggagga taacatggcc 3180

atcatcaagg agttcatgcg cttcaaggtg cacatggagg gctccgtgaa cggccacgag 3240

ttcgagatcg agggcgaggg cgagggccgc ccctacgagg gcacccagac cgccaagctg 3300

aaggtgacca agggtggccc cctgcccttc gcctgggaca tcctgtcccc tcagttcatg 3360

tacggctcca aggcctacgt gaagcacccc gccgacatcc ccgactactt gaagctgtcc 3420

ttccccgagg gcttcaagtg ggagcgcgtg atgaacttcg aggacggcgg cgtggtgacc 3480

gtgacccagg actcctccct gcaggacggc gagttcatct acaaggtgaa gctgcgcggc 3540

accaacttcc cctccgacgg ccccgtaatg cagaagaaga ccatgggctg ggaggcctcc 3600

tccgagcgga tgtaccccga ggacggcgcc ctgaagggcg agatcaagca gaggctgaag 3660

ctgaaggacg gcggccacta cgacgctgag gtcaagacca cctacaaggc caagaagccc 3720

gtgcagctgc ccggcgccta caacgtcaac atcaagttgg acatcacctc ccacaacgag 3780

gactacacca tcgtggaaca gtacgaacgc gccgagggcc gccactccac cggcggcatg 3840

gacgagctgt acaagtgaca tatgaggagc tttgttcctt gggttcttgg gagcagcagg 3900

aagcactatg ggcgcagcct caatgacgct gacggtacag gccagacaat tattgtctgg 3960

tatagtgcag cagcagaaca atttgctgag ggctattgag gcgcaacagc atctgttgca 4020

actcacagtc tggggcatca agcagctcca ggcaagaatc ctggctgtgg aaagatacct 4080

aaaggatcaa cagctcctgg ggatttgggg ttgctctgga aaactcattt gcaccactgc 4140

tgtgccttgg aatgctagtt ggagtaataa atctctggaa cagattggaa tcacacgacc 4200

tggatggagt gggacagaga aattaacaat tacacaagct taatacactc cttaattgaa 4260

gaatcgcaaa accagcaaga aaagaatgaa caagaattat tggaattaga taaatgggca 4320

agtttgtgga attggtttaa cataacaaat tggctgtggt atataaaatt attcataatg 4380

atagtaggag gcttggtagg tttaagaata gtttttgctg tactttctat agtgaataga 4440

gttaggcagg gatattcacc attatcgttt cagacccacc tcccaacccc gaggggaccc 4500

gacaggcccg aaggaataga agaagaaggt ggagagagag acagagacag atccattcga 4560

ttagtgaacg gatctcgacg gttaac 4586

Claims

1.一种多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系统，其特征在于，包括重组自杀蛋白rCas8、促进重组自杀蛋白rCas8激活的“自杀辅助元件”、保护细胞的“保护元件”以及RNA转录后的“调控元件”；其中，所述“自杀辅助元件”包括链霉亲和素；所述“保护元件”包括烟草蚀纹病毒的半胱氨酸蛋白酶、Strep-TagⅡ、缺失Strep-TagⅡ结合能力的突变型链霉亲和素；所述RNA转录后的“调控元件”包括转运蛋白Rev、在mRNA转运过程中降解mRNA的Rev-RNase；

所述重组自杀蛋白rCas8的序列如SEQ ID NO.1所示，包括Strep-TagⅡ、烟草蚀纹病毒的半胱氨酸蛋白酶切位点以及Caspase8凋亡关键结构域；所述重组自杀蛋白rCas8由AFP启动子表达；所述重组自杀蛋白rCas8的下游还含有RRE序列；

所述链霉亲和素的序列如SEQ ID NO.2所示；所述链霉亲和素由Survivin启动子表达；所述链霉亲和素的下游还含有RRE序列；

所述Strep-TagⅡ的序列如SEQ ID NO.3所示；

所述烟草蚀纹病毒的半胱氨酸蛋白酶的序列如SEQ ID NO.4所示；

所述缺失Strep-TagⅡ结合能力的突变型链霉亲和素的序列如SEQ ID NO.5所示；

所述转运蛋白Rev的序列如SEQ ID NO.7所示；

所述Rev-RNase的序列如SEQ ID NO.8所示，包括转运蛋白Rev、柔性连接肽以及RNA酶结构域；

所述RRE序列如SEQ ID NO.6所示。

2.权利要求1所述的一种多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系统在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗恶性肿瘤的药物中的应用。

3.一种试剂盒，包括权利要求1所述的多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系统的病毒表达载体。