KR20160011645A - MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터들 - Google Patents

Abstract

본 발명은 바이러스 역가들을 증가시키도록 렌티바이러스 벡터 내로의 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열의 삽입에 관한 것이다. 본 발명은 이들 벡터들, 상기 벡터를 만드는 방법들, 그리고 약제 용도들 포함하여 이들을 사용하는 방법들을 포괄한다.

Description

MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터들{LENTIVIRAL VECTORS CONTAINING AN MHC CLASS I, MHC CLASS II OR β2 MICROGLOBULIN UPSTREAM PROMOTER SEQUENCE}

본 발명은 재조합 백신 기술의 분야에 관한 것이며, 치료 및 예방 백신들로 사용될 수 있는 렌티바이러스 벡터들의 개량들에 관한 것이다. MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열들을 포함하는 상기 벡터들은 다른 벡터들보다 향상된 특성들을 제공한다.

재조합 백신들은 재조합 DNA 기술의 진보와 함께 발전되어왔고, 바이러스 게놈들(genomes)의 변형이 변형된 바이러스들을 생산하게 한다. 이러한 방식에 있어서, 유전자 서열들을 비병원성 바이러스들 내로 도입하는 것이 가능하였으므로, 이들은 이들의 숙주 내에서 특정 면역 반응을 진전시키기 위해 감염에 따라 표적 세포들 내에서 발현되는 면역원성 단백질들을 인코드한다.

이와 같은 백신들은 백신 기술의 주요 발전을 구성한다(Kutzler 등의 "Nat Rev Genet"(9(10)：776-788, 2008)). 특히, 이들은 종래의 백신들에 비해 살아있는(약화된) 바이러스를 회피하고 비활성화된 백신들의 제조와 관련되는 위험들을 제거하는 이점을 가진다.

변형된 레트로바이러스들(retroviruses)(레트로바이러스 벡터들)을 이용하는 유전자 전달은 Mann 등("Cell"(33(1)： 153-9, 1983))에 의해 1980년대 초기에 도입되었다. 가장 보편적으로 사용된 종양 레트로바이러스 벡터들은 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus： MLV)를 기초로 한다. 이들은 그로부터 다단백질들 Gag, Pol 및 Env가 생성되고, 바이러스 복제를 위해 트란스(trans)로 요구되는 간단한 게놈을 가진다(Breckpot 등의 "Gene Ther"(2007, 14(11)：847-62)); He 등의 "Expert Rev vaccines"(2007 6(6)：913-24)). 시스(cis)로 요구되는 서열들은 일반적으로 긴 말단 반복 순서들(long terminal repeats: LTR들)이며, 통합을 위해 요구되는 반전된 반복 순서들(IR 또는 att 부위들), 포장(packaging) 서열 Ψ, 전달 RNA-결합 부위(프라이머 결합 부위(primer binding site: PBS)) 그리고 역전사에 수반되는 일부 첨가 서열들(플러스 가닥(plus strand) 개시를 위해 필요한 상기 LTR들 및 상기 폴리푸린관들 내의 반복 R, PPT)의 부근이다. 복제 결함 레트로바이러스 벡터들을 발생시키기 위하여, 상기 gag, pol 및 env 유전자들이 일반적으로 완전히 결실되고 발현 카세트로 대체된다.

렌티바이러스 게놈들(즉, 렌티바이러스 벡터들(lentiviral vectors))로부터 유래되는 레트로바이러스 벡터들은 이들이 다른 바이러스 시스템들에 비해 몇 가지 장점들을 나타내기 때문에 유전자치료 및 면역치료 목적들 모두를 위해 유망한 도구들로 알려졌다. 특히, 렌티바이러스 벡터들 자체가 독성이 아니며, 다른 레트로바이러스들과는 달리, 렌티바이러스들은 분열하지 않는(non-dividing) 세포들, 특히 수지상 세포들(dendritic cells)을 형질도입할 수 있고(He 등의 "Expert Rev vaccines"(2007, 6(6)：913-24)), 내재성 경로를 통한 항원 표출을 가능하게 한다.

렌티바이러스들은 유전자의 조성, 복제의 분자 메커니즘 및 이들의 숙주들과의 생물학적 상호작용들에서의 유사성들에 의해 연계된다. 이들은 무증상 감염의 연장된 기간들 이후에 은밀하게 시작되고 서서히 진행되는 지연성 질환 증후군들의 제제들로 가장 잘 알려져 있으며, 이에 따라 이들은 "지연성(slow)" 바이러스들로 언급된다(Narayan 등의 "J Gen Virol"(1989, 70(7)：1617-39)). 이들은 모든 레트로바이러스들과 동일한 기본 구조를 가지지만, 생체 내의 렌티바이러스 복제에 중요한 역할을 하는 악세사리 유전자들(accessory genes)(예를 들면, vif, vpr, vpu, nef, tat 및 rev)의 존재로 인해 보다 복잡하다.

렌티바이러스들은 레트로바이러스과 패밀리의 지연성 바이러스들의 속을 대표하며, 이들은 사람 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency viruses：HIV), 원숭이 면역결핍 바이러스(simian immunodeficiency virus：SIV), 말 전염성 뇌염 바이러스(equine infectious encephalitis virus：EIAV), 산양 관절염 뇌염 바이러스(caprinearthritis encephalitis virus：CAEV), 소 면역결핍 바이러스(bovine immunodeficiency virus：BIV) 및 고양이 면역결핍 바이러스(feline immunodeficiency virus：FIV)를 포함한다. 렌티바이러스들은 이들의 숙주들 내에서 무기한으로 지속될 수 있고, 평생 감염의 과정 동안에 가변적인 속도들로 지속적으로 복제될 수 있다. 이들의 숙주들 내에서의 상기 바이러스들의 지속적인 복제는 숙주 방어들을 피하는 이들의 능력에 의존한다.

재조합의 통합 렌티바이러스 벡터의 설계는 상기 렌티바이러스의 시스(cis)- 및 트란스(trans)-작용 서열들의 분리를 기초로 한다. 분열하지 않는 세포들 내의 효율적인 형질도입은 상기 렌티바이러스 게놈, 중심 폴리푸린관(central polypurine tract：cPPT) 및 중심 종결 서열(central termination sequence：CTS) 내에 두 시스-작용 서열들의 존재를 요구한다. 이들은 중심 DNA "플랩(flap)"으로 호칭되는 3중가닥 DNA 구조의 형성을 가져오며, 이는 수지상 세포들(DC들)을 포함하는 분열하지 않는 세포들의 핵들 내로 게놈 도입의 효율을 최대화한다(Zennou 등의 "Cell"(2000, 101(2)：173-85); Arhel 등의 "EMBO J"(2007, 26(12)：3025-37)).

수지상 세포들은 이들이 그 기본 기능이 항원들을 표출하고 면역반응을 개시하는 항원 표출 세포(antigen presenting cell：APC)들의 주요 클래스를 구성하기 때문에 항원 표출을 위해 기본적으로 중요하다.

면역반응을 발생시키기 위해, 항원 단백질들이 세포들에 의해 주조직 적합성 복합체(major histocompatibility complex: MHC) 단백질들에 의해 세포 표면상에 표시되는 펩티드들로 처리되어야 한다. 순환하는 APC들은 배출 림프절들 내의 T 세포들에 펩티드-MHC 복합체들을 표출하며, 여기서 이들은 T 세포 수용체들과 상호작용하고, 보조자극(co-stimulatory) 신호들과 함께 상기 T 세포들을 활성화시킨다.

다양한 연구들은 렌티바이러스 벡터들로의 접종이 DC들에 의한 항원 표출 및 항원 특이적 세포독성 T 림프구들(CTL들; CD8⁺ T 세포들)의 강한 활성화를 가져오는 점을 보여주었다. 이에 따라, 렌티바이러스 벡터들은 유전자 전달 및 면역 치료 적용들을 위해 조작되어 왔다.

렌티바이러스 벡터들은 LTR U3 서열의 제거에 의해 이들의 안전성이 향상되어왔으며, 상기 LTR들 내에 최초로는 존재하는 바이러스 프로모터 및 인헨서(enhancer) 서열들이 완전히 없는 "자가 불활성(self-inactivating)" 벡터들의 결과로 되었다.

렌티바이러스 벡터들을 함유하는 렌티바이러스 입자들은 다른 DNA 플라스미드들(plasmids)에 의한 HEK 293T 사람 배양 세포들의 일시적인 형질전환에 따라 재조합 기술에 의해 생산될 수 있다.

(i) 적어도 상기 Gag, Pol Rev, Tat 그리고, 일부 경우들에서, 전달 구성의 포장을 위해 필요한 구조 및 효소 단백질들을 발현시키는 포장 플라스미드;

(ii) 포장, 역전사 및 통합을 위해 필요한 발현 카세트 및 HIV 시스 작용 인자들 을 함유하는 전달 플라스미드; 그리고

(iii) 대부분의 경우들에서 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus: VSV.G)의 글리코프로테인(glycoprotein), 폭넓게 다양한 세포들, 특히 DC들을 포함하는 주조직 적합성(MHC) 항원 표출 세포들(APC들)을 표적으로 할 수 있는 혼합된 입자들(위형들(pseudotypes))의 형성을 가능하게 하는 단백질인 외피를 인코딩하는 플라스미드.

이러한 과정은 감염 세포들에 의한 렌티바이러스 입자 벡터들의 일시적 생산의 수득을 가능하게 한다. 그러나, 상기 렌티바이러스 입자 벡터들은 또한 포장 유전자들, 프로바이러스(proviral) 코딩 DNA 및 외피 유전자를 세포 게놈 내로 안정적으로 삽입하여 세포들에 의해 계속적으로 생산될 수 있다. 이는 일시적인 형질전환에 대한 필요성이 없이 상기 세포들에 의한 렌티바이러스 입자 벡터들의 연속적인 생산을 가능하게 한다. 물론, 상기 세포 게놈 내로 통합되는 DNA들/플라스미드들의 일부 및 일시적인 형질전환에 의해 제공되는 다른 것들과 함께 이들 과정들의 결합도 이용될 수 있다.

비통합 렌티바이러스 벡터들은 특히 백신 접종 목적을 위하여 삽입 돌연변이유발 사건들과 연계된 잠재적 종양 형성의 위험을 경감시키려는 시도로 설계되어 왔다.

항원을 인코딩하는 통합 렌티바이러스 벡터들의 직접 주입에 기초하는 백신 접종에 있어서, 관련된 항원을 발현시키는 형질도입 세포들은 이끌어진 면역반응의 표적들이 되며, 백신 접종된 조직체로부터 수 일 또는 수 주 이내에 제거된다.

또한, 자가 불활성 렌티바이러스 벡터들 내의 상기 바이러스 프로모터 및 인헨서 서열들의 3' LTR의 U3 내의 결손은 내재성 프로모터 활성화의 가능성을 제한한다. 이러한 결손은 X-연계(SCID-X1 유전자) 중증 면역결핍증들(Cavazzana-Calvo 등의 "Science"(2000, 288(5466)：669-72))의 희귀형을 앓는 어린이들에 대해 몰로니 바이러스계 레트로바이러스 벡터들로 수행되었고, 1998-1999에 수행되었던 SCID-X1 유전자 치료 시도로부터 얻어진 경험들을 직접적으로 처리한다. 이러한 시도 동안, 9명의 어린이들의 넷이사람 LM02 원암유전자(proto-oncogene)에 가깝게 근접하는 몰로니-유도 레트로바이러스 벡터의 통합의 결과로 백혈병이 진행되었다(Hacein-Bey-Abina 등의 "J. Clin. Invest"(2008, 118(9)：3132-3142). 이는 악성 종양이 상기 LM02 원암유전자에 대한 상기 바이러스 U3 프로모터/인헨서의 근접의 결과였던 점을 나타내었다.

인헨서들은 시스(cis) 작용 서열들이며, 이들은 멀리 떨어져 전사 활성자들로서 작용할 수 있다. 이들은 다양한 세포 유형들, 특히 DC들 내에서 전이유전자의 강한 발현을 수득하기 위해 가장 효율적인 것으로 나타나기 때문에 바이러스 유도 벡터들 내에 폭넓게 사용되어 왔다(Chinnasamy, Chinnasamy 등의 "Hum Gene Ther"(2000, 11(13)：1901-9; Rouas 등의 "Cancer Gene Ther"(2008, 9(9)：715-24; Kimura 등의 "Mol Ther"(2007, 15(7)：1390-9; Gruh 등의 "J Gene Med"(2008, 10(1)：21-32)). 그러나, 삽입 돌연변이 유발의 안정성 문제를 고려할 경우, 이와 같은 전사 인헨서 서열들은 인헨서 근접 효과에 의한 상기 삽입 돌연변이 유발의 위험을 폐지하도록 상기 렌티바이러스 벡터 구성들로부터 제거되어야 한다. 이러한 인헨서 근접 효과는 분명히 삽입 돌연변이 유발의 가장 빈번한 메커니즘이며, 유전자 전달 후의 종양 형성 사건들의 경우에 사람이나 동물 내에서 형성되는 유일한 효과이다.

따라서, 바이러스 인헨서들을 포함하지 않으며, 상기 CMV 프로모터를 사용할 때에 관찰되는 바와 같은 많은 발현이 기능할 경우, 면역원성 펩티드들을 인코딩하는 전이유전자들의 충분한 발현을 가능하게 하는 레트로바이러스, 특히 렌티바이러스 벡터들을 개발하기 위한 요구가 존재한다. 특히, 향상된 역가들(titers)을 갖는 벡터들에 대한 요구가 존재한다.

주조직 적합성 복합체 클래스 II 유전자들(MHC 클래스 II)(Kimura 등의 "Mol Ther"(2007, 15(7)：1390-9) 및 덱틴(dectin)-2 유전자들(Lopes 등의 "J Virol"(2008, 82(1)：86-95)로부터 유래되는 DC-특이적 프로모터들에 의한 바이러스 프로모터들의 대체에 대한 연구가 보고되었다. Lopes 등에서 사용된 상기 덱틴-2 유전자 프로모터는 잠정적인 인헨서 및 아데노바이러스 보존(adenoviral conserved) 서열(아데노바이러스 프로모터 내의 반전된 말단 반복 순서들)을 함유한다(Bonkabara 등의 "J. Immunology"(2001, 167：6893-6900)). Kimura 등에 의해 사용된 상기 MHC 클래스 II 유전자 프로모터는 어떠한 알려진 인헨서도 함유하지 않는다.

아직까지, 인헨서 없이, DC들 내에서 충분한 전이유전자 발현을 제공하는 상기 MHC 클래스 II 프로모터는 발견되지 않았다. 특히, MHC 클래스 II 프로모터들을 포함하는 렌티바이러스 벡터들은 CMV 프로모터들/인헨서들로 관찰되는 면역반응과는 대조적으로 면역력이 있는 C57BL/6 생쥐들 내에서 면역반응을 유발하지 못한다. 비록 생쥐들 내로 주입 후에 통합과 지속적인 전이유전자 발현이 관찰되었지만, MHC 클래스 II 프로모터들을 통해 전사된 상기 렌티바이러스 벡터들은 백신 접종 조사 후에도 항원 특이적 CD8+ 세포독성 T-림프구 반응을 자극하는 데 실패하였다. 이들 연구들의 저자들은 이에 따라 상기 MHC 클래스 II 프로모터들의 사용은 발현의 지속이 면역 치료의 내용이 아니라 유전자 치환 치료로 생각되었던 적용들에 대해서만 관심의 대상이 되었던 것으로 결론지었다.

따라서, 상기 MHC 클래스 II 프로모터는 항원에 대한 면역반응의 유도를 위한 렌티바이러스 벡터들에 대한 충분한 프로모터가 아니다. 또한, 상기 덱틴-2 프로모터는 수지상 세포 특이적이며, 다른 비발현 세포 유형들 내로 통합되는 벡터들의 제거가 가능하지 않다. 더욱이, 상기 덱틴-2 프로모터는 인헨서를 함유하는 것으로 나타난다. 따라서, 상기 덱틴-2 프로모터는 안전성의 이유들로 렌티바이러스 벡터들에 대한 우수한 프로모터가 아니다.

바람직하게는, 면역 치료에서, 렌티바이러스 벡터들은 원하는 특정 면역반응을 이끌어내는 상기 전이유전자의 효과적인 발현을 제공한다. 이는 상기 발현이 수지상 세포들과 같은는 APC들 내에서 높은 레벨에 있는 것을 요구한다.

또한, 상기 렌티바이러스 벡터들에 의해 높은 정도의 안전성을 제공하도록 형질도입된 세포들이 상기 면역반응에 의해 제거되는 것이 바람직하다. 즉, 상기 전이유전자에 대하여 발생된 상기 면역반응은 상기 렌티바이러스 벡터들에 의해 형질도입된 세포들을 제거하기에 충분한 숙주 세포 내에서의 면역반응을 이끌어 낼 수 있다. T 형질도입 세포들의 제거는 상기 숙주 세포 내의 렌티바이러스 벡터의 지속 및 상기 벡터의 가능한 이차적인 효과들을 제거한다. 상기 형질도입 세포들이 제거되도록 하기 위하여, 발현이 상기 면역반응에 의한 제거가 가능한 레벨로 비수지상 세포들 내에 요구된다.

동시에, 상기 프로모터는 자연 및 기억 T 세포들의 활성화에 수반되는 키(key) 세포(즉, 수지상 세포들)를 통한 면역 자극을 최대화해야 하며, 상기 삽입 돌연변이 유발의 위험 및 악성 종양들을 야기하는 줄기 세포들 내의 유전독성을 최소화해야 한다. 따라서, 상기 프로모터는 수지상 및 다른 세포들 내에서 충분히 높은 활성을 가져야 하지만, 인헨서를 함유하지 않아야 한다. 이들 기준들에 근거하여, 상기 CMV 프로모터와 같은 바이러스 프로모터들은 강한 인헨서들의 존재로 인해 이상적이지 않다. 이들 기준들은 다음과 같이 요약된다.

1. 최대의 면역반응을 유도하기 위한 수지상 세포들 내에서 높은 발현;

2. 유도된 면역반응에 의한 제거를 위해 충분한 다른 형질도입 세포 유형들 내에서의 발현; 그리고

3. 삽입 효과들을 방지하기 위한 인헨서 요소의 결핍.

상기 벡터는 오염물들을 최소화하면서 전달 및 발현을 최대화하기 위해 높은 역가들로 생성될 수 있어야 한다.

이에 따라, 개선된 벡터들에 대한 요구가 해당 기술 분야에 존재한다. 본 발명은 해당 기술 분야에서의 이들 요구들을 만족시킨다.

본 발명은 렌티바이러스 벡터들(lentiviral vectors)을 포함하는 조성물들 및 상기 벡터들을 만들고 이용하는 방법들을 포괄한다. 일 실시예에 있어서, 본 발명은 MHC 클래스(class) I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린(microglobuli) 업스트림 프로모터(upstream promoter) 서열을 포함하며, 바람직하게는 MHC 클래스 I 또는 β2 마이크로글로불린 프로모터를 더 포함하는 렌티바이러스 벡터를 포괄한다.

본 발명은 렌티바이러스 벡터 내로 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열의 적어도 300개의 뉴클레오티드들, 바람직하게는 300개-400개, 300개-600개 또는 300개-1100개 뉴클레오티드들을 삽입하는 단계를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법들을 포괄한다.

바람직하게는, 상기 업스트림 프로모터 서열은 상기 MHC 클래스 I 또는 β2 마이크로글로불린 프로모터의 업스트림으로 삽입된다. 가장 바람직하게는, 상기 업스트림 프로모터 서열은 상기 MHC 클래스 I 또는 β2 마이크로글로불린 프로모터와 동일한 배향으로 삽입된다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 업스트림 프로모터 서열은 MHC 클래스 I 업스트림 프로모터 서열이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 업스트림 프로모터 서열은 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열이며, 바람직하게는 SEQ ID NO：1 또는 SEQ ID NO：27을 포함한다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 프로모터는 MHC 클래스 I 프로모터이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 프로모터는 β2 마이크로글로불린 프로모터이다.

본 발명은 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열의 적어도 300개의 뉴클레오티드들, 바람직하게는 300개-400개, 300개-600개 또는 300개-1100개의 뉴클레오티드들을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 포괄한다.

바람직하게는, 상기 업스트림 프로모터 서열은 MHC 클래스 I 또는 β2 마이크로글로불린 프로모터의 업스트림이다. 가장 바람직하게는, 상기 업스트림 프로모터 서열은 상기 MHC 클래스 I 또는 β2 마이크로글로불린 프로모터와 동일한 배향이다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 업스트림 프로모터 서열은 MHC 클래스 I 업스트림 프로모터 서열이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 업스트림 프로모터 서열은 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열이며, 바람직하게는 SEQ ID NO：1 또는 SEQ ID NO：27을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 프로모터는 MHC 클래스 I 프로모터이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 프로모터는 β2 마이크로글로불린 프로모터이다.

바람직하게는, 상기 MHC 클래스 I 프로모터는 HLA-A2 프로모터, HLA-B7 프로모터, 또는 HLA-E 프로모터이다.

바람직하게는, 상기 업스트림 프로모터 서열은 HLA-A2, HLA-B7 또는 HLA-E, 혹은 HLA-DRα업스트림 프로모터 서열이다.

바람직하게는, 상기 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 cPPT/CTS 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 Ψ(프사이) 서열을 포함한다.

본 발명은 본 발명의 렌티바이러스 벡터를 포함하는 분리된 숙주 세포(isolated host cell)를 포괄한다. 본 발명은 약제 또는 백신으로서 사용을 위한, 특히 유전자 치료를 위한 본 발명의 렌티바이러스 벡터를 포괄한다.

바람직한 실시예들에 있어서, 상기 업스트림 프로모터 서열은 SEQ ID NO：2, SEQ ID NO：3, SEQ ID NO：4, SEQ ID NO：5, SEQ ID NO：6, SEQ ID NO：7, SEQ ID NO：27, SEQ ID NO：28, SEQ ID NO：29, SEQ ID NO：30, SEQ ID NO：31, SEQ ID NO：32, SEQ ID NO：33, SEQ ID NO：34, SEQ ID NO：35, 또는 SEQ ID NO：36 중의 임의의 것의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

도 1a, 도 1b 및 도 1c는, (A) β2m 프로모터(프로모터 영역 및 업스트림 염색체 영역), (B) MHC 클래스 I 프로모터 및 (C) MHC 클래스 II 프로모터의 개략적인 표현들을 도시한다.
도 2는 다양한 프로모터들의 업스트림으로 복제된 β2m 업스트림 프로모터 서열을 갖거나 갖지 않는 다양한 렌티바이러스 구성들의 생산 수율들을 도시한다. 상기 β2m 업스트림 프로모터 서열은 융합 PCR에 의해 다양한 프로모터들의 업스트림으로 복제되었다. 결과적인 렌티바이러스 벡터들이 생산되었고, HEK-293T 세포들을 형질도입하는 데 사용되었으며, 형질도입 세포들의 퍼센티지는 특정 qPCR에 의해 평가되었다.
도 3은 직접 또는 역배향으로 다양한 프로모터들의 업스트림으로 복제된 β2m 업스트림 프로모터 서열을 갖거나 갖지 않는 다양한 렌티바이러스 구성들의 생산 수율들을 도시한다. 상기 β2m 업스트림 프로모터 서열은 직접(5'-3') 또는 역(3'-5') 배향으로 융합 PCR에 의해 다양한 프로모터들의 업스트림으로 복제되었다. 결과적인 렌티바이러스 벡터들이 생산되었고, HEK-293T 세포들을 형질도입하는 데 사용되었으며, 형질도입 세포들의 퍼센티지는 특정 qPCR에 의해 평가되었다.
도 4는 직접 또는 역배향으로 전이유전자의 업스트림으로 복제된 β2m 업스트림 프로모터 서열을 갖거나 갖지 않는 다양한 렌티바이러스 구성들의 생산 수율들을 도시한다. 상기 β2m 업스트림 프로모터 서열은 직접(5'-3') 또는 역(3'-5') 배향으로 다양한 프로모터들을 번식시키는 렌티바이러스 렌티바이러스 구성들의 전지유전자(GFP)의 업스트림으로 복제되었다. 결과적인 렌티바이러스 벡터들이 생산되었고, HEK-293T 세포들을 형질도입하는 데 사용되었으며, 형질도입 세포들의 퍼센티지는 특정 qPCR에 의해 평가되었다.
도 5는 직접 또는 역배향으로 프로바이러스 서열의 외측으로(플러스미드 골격 내로) 복제된 β2m 업스트림 프로모터 서열을 갖거나 갖지 않는 다양한 렌티바이러스 구성들의 생산 수율들을 도시한다. 상기 β2m 업스트림 프로모터 서열은 직접(5'-3') 또는 역(3'-5') 다양한 프로모터들을 번식시키는 구성들의 상기 프로바이러스 서열(상기 플라스미드 골격 내부)의 외측으로 복제되었다. 결과적인 렌티바이러스 벡터들이 생산되었고, HEK-293T 세포들을 형질도입하는 데 사용되었으며, 형질도입 세포들의 퍼센티지는 특정 qPCR에 의해 평가되었다.
도 6은 직접 또는 역배향으로 다양한 프로모터들의 업스트림으로 복제된 HLA-E 업스트림 프로모터 서열을 갖거나 갖지 않는 다양한 렌티바이러스 구성들의 생산 수율들을 도시한다. 상기 HLA-E 업스트림 프로모터 서열은 직접(5'-3') 또는 역(3'-5') 배향으로 융합 PCR에 의해 다양한 프로모터들의 업스트림으로 복제되었다. 결과적인 렌티바이러스 벡터들이 생산되었고, HEK-293T 세포들을 형질도입하는 데 사용되었으며, 형질도입 세포들의 퍼센티지는 FACS 분석에 의해 평가되었다.
도 7은 β2-마이크로글로불린(SEQ ID NO：1) 및 MHC 클래스 I(SEQ ID NOs：2-7) 업스트림 프로모터 서열들의 뉴클레오티드 서열들을 도시한다. 공통 서열이 도시된다(SEQ ID NO：8).
도 8a-도 8b는 β2-마이크로글로불린(SEQ ID NO：40), MHC 클래스 I(SEQ ID NOs：37-39) 및 MHC 클래스 II(SEQ ID NO：41) 프로모터들 그리고 짧은 업스트림 프로모터 서열들의 뉴클레오티드 서열들을 도시한다. κB, ISRE 및 SXY 모듈의 위치들이 표시된다.
도 9a-도 9c는 β2-마이크로글로불린(SEQ ID NO：45), MHC 클래스 I(SEQ ID NOs：42-44) 및 MHC 클래스 II(SEQ ID NO：46) 프로모터들, 그리고 긴 업스트림 프로모터 서열들의 뉴클레오티드 서열들을 도시한다. κB, ISRE 및 SXY 모듈의 위치들이 표시된다.
도 10은 직접 배향으로 이들의 자연 프로모터들의 업스트림인 짧거나 긴 β2-m, HLA-A2, HLA-B7, HLA-E, 또는 HLA-DRα 업스트림 프로모터 서열들을 갖는 다양한 렌티바이러스 구성들의 생산 수율을 도시한다.

렌티바이러스 벡터(lentiviral vector) 역가들(titers)에 대한 MHC 클래스(class) I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린(microglobulin) 업스트림 프로모터(upstream promoter) 서열들의 효과가 조사되었다. 상기 업스트림 프로모터 서열들은 상기 β2 마이크로글로불린 및 MHC 클래스 I 프로모터들 내에서 발견되는 Ets/ISRE 및 NF-Kb 결합 부위들의 업스트림에 위치한다(도 1). 상기 업스트림 프로모터 서열들은 MHC 클래스 II 프로모터들 내에서 발견되는 SXY 모듈의 업스트림에 위치한다(도 1). 사람 β2-마이크로글로불린(β2m) 프로모터는 상기 MHC 클래스 I 프로모터들과 일부 유사성을 나타내지만, 이는 단일 NF-Kb 결합 부위의 ISRE 업스트림을 포함한다.

상기 β2m 및 MHC 클래스 I 프로모터들의 업스트림 프로모터 서열들은 뉴클레오티드 레벨에서 일부 유사성을 나타낸다(도 7). 두 업스트림 프로모터 서열들, β2m 및 HLA-E가 분석을 위해 선택되었다.

먼저, β2m의 업스트림 프로모터 서열이 상기 β2m 및 MHCI 프로모터들 HLA-A2, HLA-B7 및 HLA-E과 동일한 배향으로 이들의 렌티바이러스 벡터 업스트립 내로 삽입되었다. 비교를 위하여, 상기 β2m의 업스트림 프로모터 서열이 유비퀴틴(Ubiquitin: UBC) 유전자 프로모터, 상기 CMV 프로모터 또는 MHC II 프로모터(HLA-DRα)와 동일한 배향으로 이의 렌티바이러스 벡터들 업스트립 내로 삽입되었다. 이들 벡터들에 있어서, 상기 프로모터들은 녹색 형광 단백질(GFP)의 발현을 촉진시킨다.

발현을 조사하기 위하여, 상기 벡터들은, 기본적으로 Naldini 등의 "Science"(1996, 272： 263-7)에 기재된 바와 같이, HEK-293T 세포들 내에서 캡슐화 플라스미드(encapsidation plasmid) 및 VSV.G 외피(envelope)를 제공하는 플라스미드로 동시전이(cotransfection)에 의해 포장되었다. HEK-293T 세포들은 이후에 다른 벡터들의 입자들로 형질도입되었다. 발현은 모든 벡터들을 갖는 세포들 내에서 검출되었다.

β2m, HLA-A2, HLA-B7 또는 HLA-E 프로모터를 갖는 렌티바이러스 벡터들 내로의 상기 β2m 업스트림 프로모터 서열의 첨가는 바이러스 역가들에서 대략 2-5폴드(fold) 증가의 결과로 되었다. 대조적으로, CMV 프로모터, UBC 프로모터 또는 HLA-A2 프로모터를 갖는 렌티바이러스 벡터들 내로의 상기 β2m 업스트림 프로모터 서열의 첨가는 상기 역가들에 작은 영향을 나타내었다(도 2). 따라서, 상기 β2m 업스트림 프로모터 서열은 β2m 또는 MHC I 프로모터를 포함하는 렌티바이러스 벡터로부터 역가들을 증가시킬 수 있었다.

다음에, 상기 β2m의 업스트림 프로모터 서열이 상기 β2m 및 MHC I 프로모터들 HLA-A2, HLA-B7 및 HLA-E와 역배향으로 이들의 렌티바이러스 벡터 업스트림 내로 삽입되었다. 비교를 위하여, 상기 β2m의 업스트림 프로모터 서열이 상기 유비퀴틴(UBC) 유전자들 프로모터, 상기 CMV 프로모터 또는 MHC II 프로모터(HLA-DRα)와 역배향으로 이들의 렌티바이러스 벡터들 업스트림 내로 삽입되었다. 상기 HLA-A2, HLA-B7 또는 HLA-E 프로모터와 역배향으로 이들의 렌티바이러스 벡터들 업스트림 내로의 상기 β2m 업스트림 프로모터 서열의 삽입은 바이러스 역가들에서의 증가를 가져오지 않았다(도 3). 사실상, 상기 역배향으로 삽입된 몇몇의 상기 β2m의 업스트림 프로모터 서열을 갖는 상기 렌티바이러스 벡터들은 역가들d[서의 감소를 보였다. 따라서, 상기 β2m 업스트림 프로모터 서열에 의해 야기된 렌티바이러스 벡터로부터의 역가들의 증가는 배향 의존적이었다.

다음에, 상기 β2m의 업스트림 프로모터 서열이 상기 전이유전자의 렌티바이러스 벡터 다운스트림 내로 및 상기 β2m 및 MHC I 프로모터들 HLA-A2, HLA-B7 및 HLA-E와 동일하거나 역배향으로 삽입되었다. 비교를 위하여, 상기 β2m의 업스트림 프로모터 서열이 상기 전이유전자의 렌티바이러스 벡터들 다운스트림 내로 및 상기 유비퀴틴(UBC) 유전자들 프로모터, 상기 CMV 프로모터 또는 MHC II 프로모터(HLA-DRα)와 동일하거나 역배향으로 삽입되었다. 상기 전이유전자의 다운스트림으로 및 상기β2m, HLA-A2, HLA-B7 또는 HLA-E 프로모터와 동일한 배향으로 상기 β2m 업스트림 프로모터 서열의 첨가는 바이러스 역가들에서 작은 증가만을 가져왔다(도 4). 따라서, 상기 β2m 업스트림 프로모터 서열에 의해 야기된 렌티바이러스 벡터로부터의 역가들의 증가는 위치 의존적이었다.

다음에, 상기 β2m의 업스트림 프로모터 서열이 상기 β2m 및 MHC I 프로모터들 HLA-A2, HLA-B7 및 HLA-E와 동일하거나 역배향으로 LTR-LTR 영역의 외측의 렌티바이러스 벡터로 삽입되었다. 비교를 위하여, 상기 β2m의 업스트림 프로모터 서열이 상기 유비퀴틴(UBC) 유전자들 프로모터, 상기 CMV 프로모터 또는 MHC II 프로모터(HLA-DRα)와 동일하거나 역배향으로 상기 LTR-LTR의 외측의 렌티바이러스 벡터들 내로 삽입되었다. 동일하거나 역배향으로 상기 LTR-LTR 영역의 외측의 상기 β2m 업스트림 프로모터 서열의 첨가는 바이러스 역가들에서 분명한 차이를 가져오지 않았다(도 5). 따라서, 상기 β2m 업스트림 프로모터 서열에 의해 야기된 렌티바이러스 벡터로부터의 역가들의 증가는 상기 벡터 내의 LTR들 사이의 이의 존재에 의존하였다.

다음에, HLA-E의 업스트림 프로모터 서열이 상기 β2m 및 MHC I 프로모터들 HLA-A2, HLA-B7 및 HLA-E와 동일한 배향으로 이들의 렌티바이러스 벡터 업스트림 내로 삽입되었다. 비교를 위하여, HLA-E의 업스트림 프로모터 서열이 상기 유비퀴틴(UBC) 유전자들 프로모터, 상기 CMV 프로모터 또는 MHC II 프로모터(HLA-DRα)와 동일한 배향으로 이들의 렌티바이러스 벡터 업스트림 내로 삽입되었다.

상기 β2m, HLA-A2, HLA-B7 또는 HLA-E 프로모터의 렌티바이러스 벡터들 업스트림 내로의 상기 HLA-E 업스트림 프로모터 서열의 첨가는 바이러스 역가들에서 대략 2-4폴드 증가의 결과가 되었다(도 6). 대부분의 구성들에서, 상기 HLA-E 업스트림 프로모터 서열은 양 배향들로 유사하게 작용하였다. CMV 프로모터 또는 UBC 프로모터를 갖는 렌티바이러스 벡터들 내로의 상기 HLA-E 업스트림 프로모터 서열의 첨가는 상기 역가들에서 대략 2폴드의 증가를 나타내었다(도 6). 그러나, HLA-DRα 프로모터를 갖는 렌티바이러스 벡터 내로의 상기 HLA-E 업스트림 프로모터 서열의 첨가는 상기 역가들에 작은 영향을 나타내었거나 영향을 나타내지 않았다. 따라서, 상기 HLA-E 업스트림 프로모터 서열은 β2m, MHCI, CMV 또는 UBC 프로모터를 포함하는 렌티바이러스 벡터로부터 역가들을 증가시킬 수 있었다.

HLA-A2의 업스트림 프로모터 서열이 상기 β2m 프로모터와 동일하거나 역배향으로 이의 렌티바이러스 벡터 업스트림 내로 삽입되었다. 상기 β2m 프로모터의 렌티바이러스 벡터들 업스트립 내로의 상기 HLA-A2 업스트림 프로모터 서열의 첨가는 양 배향들로 바이러스 역가들에서 대략 3-4폴드 증가를 가져왔다.

HLA-B7의 업스트림 프로모터 서열이 상기 β2m 프로모터와 동일하거나 역배향으로 이의 렌티바이러스 벡터 업스트림 내로 삽입되었다. 상기 β2m 프로모터의 렌티바이러스 벡터들 업스트림 내로의 상기 HLA-B7 업스트림 프로모터 서열의 첨가는 동일한 배향으로 바이러스 역가들에서 대략 10폴드 증가 및 역배향으로 바이러스 역가들에서 대략 4폴드 증가의 결과가 되었다.

HLA-DRα의 업스트림 프로모터 서열이 상기 β2m 프로모터와 동일한 배향으로 이의 렌티바이러스 벡터 업스트림 내로 삽입되었다. 상기 β2m 프로모터의 렌티바이러스 벡터들 업스트림 내로의 상기 HLA-DRα 업스트림 프로모터 서열의 첨가는 동일한 배향으로 바이러스 역가들에서 대략 6폴드 증가 및 역배향으로 바이러스 역가들에서 대략 4폴드 증가의 결과로 되었다.

상기 업스트림 서열들이 모두 크기가 약 300-400nt이었기 때문에, 보다 큰 업스트립 서열들(500-1100nt)의 효과가 조사되었다. β2m의 보다 큰 업스트림 프로모터 서열(1058bp)이 상기 β2m 프로모터와 동일한 배향으로 이의 렌티바이러스 벡터 업스트림 내로 삽입되었다. 상기 보다 큰 업스트림 프로모터 서열은 바이러스 역가들을 더 이상 증가시키지 않았지만, 상기 보다 작은(330bp) 업스트림 서열과 비교할 경우에 대부분의 상기 증가된 바이러스 역가들을 보유하였다(도 10).

HLA-A2의 보다 큰 업스트림 프로모터 서열(531bp)이 상기 HLA-A2 프로모터와 동일한 배향으로 이의 렌티바이러스 벡터 업스트림 내로 삽입되었다. 이 경우, 상기 보다 큰 HLA-A2 업스트림 프로모터 서열은 바이러스 역가들을 3폴드 증가시켰지만; 반면에, 상기 보다 작은(322bp) HLA-A2 업스트림 서열은 상기 HLA-A2 프로모터에 부정적인 영향을 미쳤다(도 10).

HLA-B7의 보다 큰 업스트림 프로모터 서열(511bp)이 상기 HLA-B7 프로모터와 동일한 배향으로 이의 렌티바이러스 벡터 업스트림 내로 삽입되었다. 이 경우, 상기 보다 큰 HLA-B7 업스트림 프로모터 서열은 보다 작은(352bp) HLA-B7 업스트립 서열과 비교할 경우에 바이러스 역가들을 2-3폴드 더 증가시켰다(도 10). HLA-E의 보다 큰 업스트림 프로모터 서열(1047bp)이 상기 HLA-E 프로모터와 동일한 배향으로 이의 렌티바이러스 벡터 업스트림 내로 삽입되었다. 상기 보다 큰 업스트림 프로모터 서열은 상기 보다 작은(328bp) 업스트립 서열과 비교할 경우에 바이러스 역가들에서의증가를 제거하였다(도 10).

HLA-DRα의 보다 큰 업스트림 프로모터 서열(522bp)이 상기 HLA-DRα 프로모터와 동일한 배향으로 이의 렌티바이러스 벡터 업스트림 내로 삽입되었다. 이 경우, 상기 보다 큰 HLA-DRα 업스트림 프로모터 서열은 상기 보다 작은(356bp) HLA-DRα 업스트림 서열과 비교하여 상기 바이러스 역가들d[ 동일한 영향을 미쳤다(도 10).

다중 업스트림 프로모터 서열들의 삽입의 효과가 조사되었다. 상기 HLA-E 업스트림 프로모터 서열은 렌티바이러스 벡터 업스트림, 다운스트림 내로 및 상기 β2m 프로모터의 업스트림과 다운스트림 모두 내로 삽입되었다. 삽입 업스트림이 역가들에 3-4폴드 증가를 가져왔지만, 삽입 다운스트림은 역가들에 영향을 미치지 않았고, 삽입 업스트림과 다운스트림 모두는 바이러스 역가들에 감소를 가져왔다.

본 발명은 이에 따라 주요 목적으로서 β2m 또는 MHC I 혹은 MHC II 업스트림 프로모터 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 및 이와 같은 벡터를 만들고 사용하기 위한 방법들을 가진다.

렌티바이러스 벡터

본 발명의 내용에 있어서, "렌티바이러스 벡터"는 시스-작용 렌티바이러스 RNA 또는 DNA 서열들을 포함하고, 트란스(trans)로 제공되는 렌티바이러스 단백질들(예를 들면, Gag, Pol 및/또는 Env)을 요구하는 전이유전자(transgene)로 숙주 세포의 형질도입(transduction)을 위한 비복제 벡터를 의미한다. 상기 렌티바이러스 벡터는 시스-작용 포장 서열들을 포함하지만, 기능성 Gag, Pol 및 Env 단백질들의 발현이 결핍된다. 상기 렌티바이러스 벡터는 상기 레트로바이러스 벡터들의 생산이나 발달의 단계에 따라 RNA 또는 DNA 분자의 형태로 존재할 수 있다.

상기 렌티바이러스 벡터는 플라스미드와 같은 재조합 DNA 분자의 형태가 될 수 있다. 상기 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 및 다른 단백질들의 복합체 내의 RNA 분자(들)과 같은 렌티바이러스 입자 벡터의 형태가 될 수 있다. 통상적으로, 변형되거나 재조합 렌티바이러스 입자들에 대응되는 렌티바이러스 입자 벡터들은 단일가닥 RNA의 두 복제들로 구성되는 게놈을 포함한다. 이들 RNA 서열들은 숙주 세포 게놈(프로바이러스 벡터 DNA) 내로 삽입되는 2중가닥 DNA 서열로부터의 전사에 의해 수득될 수 있거나, 형질전환 숙주세포 내의 플라스미드 DNA(플라스미드 백터 DNA)의 일과성 발현으로부터 얻어질 수 있다.

렌티바이러스 벡터들은 렌티바이러스들, 특히 사람 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus: HIV-1 또는 HIV-2), 원숭이 면역결핍 바이러스(simian immunodeficiency virus: SIV), 말 전염성 뇌염 바이러스(equine infectious encephalitis virus: EIAV), 산양 관절염 뇌염 바이러스(caprinearthritis encephalitis virus: CAEV), 소 면역결핍 바이러스(bovine immunodeficiency virus: BIV) 및 고양이 면역결핍 바이러스(feline immunodeficiency virus: FIV)로부터 유도되며, 이들은 병원성을 수반하는 유전적 결정기들(determinants)을 제거하고, 치료적 효과들을 얻기 위해 유용한 새로운 결정기들을 도입하도록 변형된다.

이와 같은 벡터들은 상기 시스- 및 트란스(trans)-작용 서열들의 분리에 기초한다. 복제 결함 벡터들을 생성하기 위하여, 상기 트란스-작용 서열들(예를 들면, gag, pol, tat, rev 및 env 유전자들)이 결실될 수 있고, 전이유전자를 인코딩하는 발현 카세트로 대체될 수 있다.

분열하지 않는(non-dividing) 세포들 내의 효과적인 통합과 복제는 일반적으로 상기 렌티바이러스 게놈의 중심에 두 시스-작용 서열들, 상기 중심 폴리푸린관(the central polypurine tract: cPPT) 및 상기 중심 종결 서열(central termination sequence: CTS)을 요구한다. 이들은 중심 DNA "플랩(flap)"으로 호칭되는 3중가닥 DNA 구조의 형성을 가져오며, 이는 핵공에서의 예비 통합 복합체의 언코팅(uncoating) 및 수지상 세포들과 같은 분열하지 않는 세포들의 핵들 내로의 발현 카세트의 효과적인 도입을 위한 신호로 작용한다.

일 실시예에 있어서, 본 발명은, 특히 상기 유럽 특허 출원 EP 2 169 073에 기재된 바와 같은 cPPT/CTS 서열로 언급되는 중심 폴리푸린관 및 중심 종결 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 포괄한다.

다른 서열들은 통상적으로 숙주 세포 게놈 내로의 상기 벡터 프로바이러스 DNA 서열의 통합에 수반되는 긴말단 반복순서들(LTR들)과 같은 시스(cis)로 존재한다. 벡터들은 상기 LTR의 도메인 U3(ΔU3) 내에서 상기 LTR 서열들을 돌연 변이시켜 얻어질 수 있다(Miyoshi H 등의 "J Virol"(1998, 72(10)：8150-7); Zufferey 등의 "J Virol"(1998, 72(12)：9873-80)).

일 실시예에 있어서, 본 발명은 바람직하게는 상기 3' LTR 내의 프로모터 및 인헨서 서열들을 제거하는 돌연변이 U3 영역(ΔU3)을 갖는 LTR 서열들을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 포괄한다.

상기 포장 서열 Ψ(프사이)는 상기 벡터 입자들 내로의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 캡슐화(encapsidation)를 유지하도록 포함된다(Kessler 등의 "Leukemia"(2007, 21(9)：1859-74); Paschen 등의 "Cancer Immunol Immunother"(2004, 12(6)：196-203)).

일 실시예에 있어서, 본 발명은 렌티바이러스 포장 서열 Ψ(프사이) 및 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 포괄한다.

운반 RNA-결합 부위 또는 프라이머 결합 부위(primer binding site: PBS) 혹은 우드척 후조절 요소(Woodchuck PostRegulation Element: WPRE)와 같은 다른 추가적인 기능성 서열들 또한 생체 내의 상기 전이유전자의 보다 안정한 발현을 얻기 위해 본 발명의 렌티바이러스 벡터 폴리뉴클레오티드 서열 내에 유리하게 포함될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 본 발명은 PBS를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 포괄한다. 일 실시예에 있어서, 본 발명은 WPRE 및/또는 IRES를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 포괄한다.

따라서, 바람직한 실시예에서, 상기 렌티바이러스 벡터는 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열, 적어도 하나의 cPPT/CTS 서열, 하나의 Ψ 서열, 하나의(바람직하게는, 2개) LTR 서열, 그리고 프로모터, 특히 MHC 클래스 I 또는 β2 마이크로글로불린 프로모터의 ㅈ너사 제어 하에서 전이유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함한다.

전이유전자

본 발명은 전이유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 포괄한다. 본 발명의 내용에서, "전이유전자"는 상기 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 세포 내에 정상적으로는 존재하지 않는 렌티바이러스 벡터 내의 핵산 서열이다. 상기 렌티바이러스 벡터는 이러한 서열을 상기 형질도입 세포들 내로 도입하는 데 기여한다. "전이유전자"라는 용어는 상기 전이유전자의 형질도입을 가능하게 하는 벡터의 이들 서열들을 포함하지 않는다. 상기 전이유전자는 다른 유기체로부터의 핵산 서열이 될 수 있다. 선택적으로는, 상기 전이유전자는 동일한 유기체로부터의 핵산 서열이 될 수 있지만, 그 발현을 제어하는 다른 조절 서열들을 가진다. 상기 전이유전자는 센스 또는 안티센스 핵산 분자가 될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 전이유전자 서열은 면역원성 폴리펩티드를 인코드한다.

바람직하게는, 상기 면역원성 폴리펩티드는 바이러스성, 기생성, 세균성 또는 진균성이다. 일 실시예에 있어서, 상기 면역원성 폴리펩티드는 종양 항원(tumor antigen)이다.

이러한 면역원성 폴리펩티드는 바람직하게는 감염증들의 제제들로부터의 하나 또는 몇몇의 에피토프(epitope)(들), 예를 들면 HIV의 Gag, Pol 및/또는 Nef 단백질들로부터의 항원(들)을 포함한다.

폴리에피토프를 형성하는 몇몇 에피토프들 또한 본 발명의 전이유전자에 의해 인코드될 수 있다.

특정 실시예에 있어서, 이와 같은 에피토프는 종양들 내에서 확인되는 표적 항원들로부터 유래되며, 이에 대해 세포매개 면역반응이 얻어지는 방식으로 선택될 수 있다. 표적 항원들은 해당 기술 분야에 잘 기록되어 있으며, 이는 몇몇 유형들의 종양들에 대하여, 특히 흑색종들(melanomas) 내에서나 신장 암종들(renal carcinomas), 방광 암종들(bladder carcinomas), 결장 암종들(colon carcinomas), 폐 암종들(lung carcinomas), 유방암들(breast cancers), 백혈병들(leukemias) 그리고 림프종들(lymphomas)을 포함하는 암종들 내에서 선택될 수 있다.

B2M 및 MHC I 프로모터들

본 발명은 렌티바이러스 벡터 내로의 β2m 또는 MHC 클래스 I(MHC I) 프로모터의 삽입을 포괄한다. 여기에 사용되는 바에 있어서, "MHC 클래스 I(MHC I) 프로모터"는 자연 발생적이거나 합성 MHC 클래스 I 프로모터를 포함하고, "MHC 클래스 I 프로모터"라는 용어는 β2m 프로모터를 포함하지는 않는다.

자연 발생적 MHC I 및 β2m 프로모터들

자연 발생적 MHC I 프로모터들의 예들은 HLA-A2, HLA-B7, HLA-Cw5, HLA-E, HLA-G 유전자 프로모터들이다. 이들 자연 발생적 MHC I 프로모터들은 일반적으로 상기 MHC 클래스 I 단백질을 인코딩하는 유전자의 프로모터 영역으로부터 복제되거나 재성되거나, 게놈 데이터베이스들(예：NCBI 폴리뉴클레오티드 데이터베이스 ) 내의 이러한 단백질을 인코딩하는 것으로 추정되는 것을 언급한다. β2m 및 클래스 I MHC 단백질들 모두는 주조직 적합성 복합체(MHC)로 들어간다. 바람직한 프로모터들은 여기에 참조로 포함되는 미국 특허출원 공개 제2014/0120132호(A1)에 설시된다.

이들 유전자들에 의해 인코드되는 단백질들은 거의 모든 세포 유형들 내에서 발견된다. MHC I 단백질들은 일반적으로 백혈구들의 막의 표면에 존재하며, 여기서 이들은 상기 β2-마이크로글로불린(β2m) 단백질과 연관된다. 이들 연관 단백질들의 역할은 CD8+ T 세포들에 대한 내재성 소스들로부터 펩티드들을 존재시키는 것이다. 이들은 이에 따라 상기 항원 특이 면역반응의 발생에 중심 역할을 한다. β2m 및 MHC 단백질들이 수 년 동안 폭넓게 연구되고 설명되었기 때문에, 이들의 유전자들은 잘 특성화되어 있고, BLAST 방법과 같은 서열 비교 도구들을 이용하여 검출될 수 있다(Altschul, S. F. 등의 "Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol."(1990, 215(3)：403-410)).

β2m 및 MHC 클래스 I 프로모터들은 수지상 세포들 내에서 뿐만 아니라 대부분의 다른 사람 신체 조직들 내에서 보다 낮은 강도로 강하게 활성화되는 능력을 공유한다.

본 발명의 β2m 및 MHC 클래스 I 프로모터들은 하나 또는 그 이상의 Sp1 및 ETs 결합 부위들과 같은 다른 조절 요소들을 포함할 수 있다. 바람직한 실시예에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 프로모터는 2 Sp1 결합 부위들 및 1 Ets 결합 부위를 포함한다. 다른 실시예들에 있어서, Ap1 및/또는 Ap2 부위들이 상기 MHC 클래스 I 프로모터 내에 더 포함된다.

바람직한 MHC 클래스 I 프로모터들은 사람 HLA-A2, HLA-B7, HLA-Cw5, HLA-E, HLA-F 및 HLA-G 프로모터들이다.

합성 β2m 및 MHC 클래스 I 프로모터들

β2m 및 MHC 클래스 I 프로모터들은 또한 합성이 될 수 있다. 합성 β2m 및 MHC 클래스 I 프로모터들은 β2m 및 MHC 클래스 I 프로모터의 개별적인 성분들을 조립하도록 분자 생물학적 기술들을 이용하여 합성되거나, 분자 생물학적 기술들을 이용하여 자연 발생적인 β2m 및 MHC 클래스 I 프로모터들로부터 유래되는 프로모터들을 포함한다.

ISRE

상기 β2m 및 MHC 클래스 유전자들의 전사는 통상적으로 인터페론 자극 반응 요소(interferon stimulated response element: ISRE) 및 SXY 모듈(W/S, X1X2/부위α 및 Y/인헨서 B 조절 요소들을 포괄하는)(도 1 참조)의 두 가지 주요한 조절 요소들에 의해 매개된다. 또한, Van den Elsen의 "Immunogenetics"((1998) 48：208-211)을 참조하기 바란다.

이들 조절 프로모터 요소들은 전사 개시 부위의 뉴클레오티드들 -220 내지 -95 업스트림으로부터 대략적으로 연장되는 영역 내에 국부화된다. 이들은 β2m 및 MHC 클래스 I 유전자들의 조직 특이적 및 시토카인(cytokine) 유래 전사를 매개한다.

β2m 및 MHC 클래스 I 유전자 프로모터들의 ISRE는 일반적으로 인터페론 조절 인자(interferon regulatory factor: IRF) 패밀리 구성원들을 위한 결합 부위들을 포함한다. 이에 따라 이는 인터페론 조절 인자(IRF) 패밀리 구성원들에 결합하는 MHC 클래스 I 프로모터들의 성질이 된다. 이는, 예를 들면, 겔 이동(gel shift) 분석들에 의해 입증될 수 있다.

NF _- κB 결합 부위

또 다른 조절 요소인 인헨서 A(핵전사 인자 κB(NF_-κB)를 위한 결합 부위들을 포함하는)는 대부분의 경우들에서 존재한다. 이에 따라 이는 핵전사 인자 κB(NF_-κB)에 결합하는 β2m 및 MHC 클래스 I 프로모터들의 성질이 된다. 이는, 예를 들면, 겔 이동 분석들에 의해 입증될 수 있다.

SXY 모듈

ISRE 이외에도, β2m 및 MHC 클래스 I 프로모터들은 일반적으로 다음의 네 조절 요소들로 구성되는 보존 업스트림 서열 모티브들(motifs)의 또 다른 세트를 공유한다. 상기 S 또는 W 박스, 상기 X1/CREX2 박스들 또는 부위 α, 그리고 상기 Y 박스 또는 인헨서 B, 이들은 함께 상기 SXY 모듈로 호칭된다. 이러한 SXY 모듈은 일반적으로 조절 인자 X(RFX; RFX5, RFXB/ANK 및 RFXAP로 구성되는)를 포함하는 다중단백질 복합체, cAMP 반응 요소 결합 단백질(CREB)/활성화 전사 인자(ATF), 그리고 핵 인자 Y(NFY)에 의해 협력적으로 제한되며, 이는 이들 유전자들의 전사 촉진을 유도하는 인헨서좀(enhanceosome)으로 작용한다. 이에 따라 이는 이들 인자들에 결합하는 β2m 및 MHC 클래스 I 프로모터들의 성질이 된다. 이는, 예를 들면, 겔 이동 분석들에 의해 입증될 수 있다.

대조적으로, MHC 클래스 II 프로모터들은 인헨서 A도 ISRE 요소들도 나타내지 않는다(Van den Elsen, P.J. 등의 1998, Immunogenetics. 48：208-221). 더욱이, MHC 클래스 II 유전자 조절 내의 RFX 및 CIITA는 상기 RFX 서브유닛들 또는 CIITA의 하나의 돌연변이들로 인한 중증의 복합 면역결핍인 무표지 림프 증후군(bare lymphocyte syndrome: BLS)가 있는 환자들로부터 구현된 세포주들로의 연구에 의헤 예시되었던 바와 같이 결정적으로 중요한 것으로 발견되었다(DeSandro, A. 등의 "Am J Hum Genet"(1999, 65：279-286)). 또한, CIITA 또는 상기 RFX 서브유닛들 중의 하나의 결핍은 상기 MHC 인헨서좀의 작용과 조립에 각기 영향을 미치며, MHC 클래스 II의 결실 및 MHC 클래스 I 전사의 감소된 레벨들을 가져온다(Van den Elsen, P. J. 등의 "Current Opinionin Immunology"(2004, 16：67-75)).

β2M과 MHC I 및 MHC II 업스트림 프로모터 서열들

본 발명은 렌티바이러스 벡터 내로의 β2m, MHC 클래스 I(MHC I) 또는 MHC 클래스 II(MHC II) 업스트림 프로모터 서열의 삽입을 포괄한다. 여기에 사용되는 바에 있어서, "β2m 업스트림 프로모터 서열"은 도 8a-도 8b 및 도 9a-도 9c에 예시된 바와 같이 상기 자연 발생적 β2 마이크로글로불린 프로모터 내의 Ets/ISRE 결합 부위의 바로 업스트림으로 발견되는 서열들의 1100개의 염기 쌍들 또는 그 이하를 언급한다. 또한, 여기에 참조로 포함되는 Van den Elsen 등의 "Current Opinion in Immunology"(2004, 16：67-75)의 도 1을 참조하기 바란다. 여기에 사용되는 바에 있어서, "MHC 클래스 I(MHC I) 업스트림 프로모터 서열"은 도 8a-도 8b 및 도 9a-도 9c에 예시된 바와 같이 상기 자연 발생적 MHC 클래스 I 프로모터들 내의 NF-Kb 결합 부위의 바로 업스트림으로 발견되는 서열들의 1100개의 염기 쌍들 또는 그 이하를 언급한다. β2m 및 MHC 클래스 I(MHC I) 업스트림 프로모터 서열들의 예들은 도 7에 도시된다. 여기에 사용되는 바에 있어서, "MHC 클래스 II(MHC II) 업스트림 프로모터 서열"은 도 8a-도 8b 및 도 9a-도 9c에 예시된 바와 같이 상기 자연 발생적 MHC 클래스 II 프로모터 내의 SXY 모듈의 바로 업스트림으로 발견되는 서열들의 1100개의 염기 쌍들 또는 그 이하를 언급한다.

다양한 실시예들에 있어서, 상기 업스트림 프로모터 서열은 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열의 1100개, 1000개, 900개, 800개, 700개, 600개, 550개, 500개, 450개, 400개, 또는 350개 이하의 뉴클레오티드들을 포함한다.

다양한 실시예들에 있어서, 상기 업스트림 프로모터 서열은 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열의 적어도 300개, 305개, 310개, 315개, 320개, 325개, 330개, 335개, 350개, 357개, 400개, 450개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 또는 1000개의 뉴클레오티드들을 포함한다.

다양한 실시예들에 있어서, 상기 업스트림 프로모터 서열은 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열의 300개, 305개, 310개, 315개, 320개, 325개, 330개, 335개, 350개, 357개, 400개, 450개, 또는 500개 내지 305개, 310개, 315개, 320개, 325, 330개, 335개, 350개, 357개, 400개, 450개, 550개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1000개, 또는 1100개의 뉴클레오티드들(범위들의 모든 가능한 결합들 내에서)을 포함한다. 바람직하게는, 상기 업스트림 프로모터 서열은 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열의 300개-400개, 300개-500개, 300개-600개, 300개-700개, 또는 300개-1100개의 뉴클레오티드들을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 업스트림 프로모터 서열은 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열의 300개-335개의 뉴클레오티드들을 포함한다.

바람직하게는, 상기 B2M 업스트림 프로모터 서열은 다음 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

AGAAGTTCTCCTTCTGCTAGGTAGCATTCAAAGATCTTAATCTTCTGGGTTTCCGTTTTCTCGAATGAAAAATGCAGGTCCGAGCAGTTAACTGGCGGGGGCACCATTAGCAAGTCACTTAGCATCTCTGGGGCCAGTCTGCAAAGCGAGGGGGCAGCCTTAATGTGCCTCCAGCCTGAAGTCCTAGAATGAGCGCCCGGTGTCCCAAGCTGGGGCGCGCACCCCAGATCGGAGGGCGCCGATGTACAGACAGCAAACTCACCCAGTCTAGTGCATGCCTTCTTAAACATCACGAGACTC(SEQ ID NO：1). 바람직하게는, 상기 B2M 업스트림 프로모터 서열은 상기 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO：27 또는 28을 포함한다.

바람직하게는, 상기 MHC 클래스 I 업스트림 프로모터 서열은 HLA-A2, HLA-B7, HLA-Cw5, HLA-E, 또는 HLA-G 업스트림 프로모터 서열을 포함한다.

바람직하게는, 상기 MHC 클래스 I 업스트림 프로모터 서열은 SEQ ID NOs：2-7 또는 SEQ ID NO：29-34 중의 임의의 것의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

바람직하게는, 상기 MHC 클래스 I 업스트림 프로모터 서열은 다음 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

CTGGAGGGCAATGGCACGATCTTGGCTCACCGCAACCTCCTCCTCCTGGGTTCAAGTGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCCAGGATTACAGCCATGCGCCACCACGCCGGCTAATTTTTTGGACTTTTAGTAGAGACAGGGTTTCTCCATATTGGTCGGGCTGGTCTCGAACTCCCAACCTCAGGTGATCAGCCCGCCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGAGATTACAGGCGTGAGCCACCGCGCCCAGCCAGGACTAATTTCTAAGAGTGTGCAGAGATACCGAAACCTAAAAGTT(SEQ ID NO：2).

바람직한 업스트림 프로모터 서열들은 다음을 포함한다.

업스트림 β2m(330bp):

업스트림 β2m(1058bp):

업스트림 HLA-A2(322bp):

업스트림 HLA-A2(531bp):

업스트림 HLA-B7(352bp):

업스트림 HLA-B7(511bp):

업스트림 HLA-E(328bp):

업스트림 HLA-E(1047bp):

업스트림 HLA-DRα(356bp):

업스트림 HLA-DRα(522bp):

일부 실시예들에 있어서, 상기 벡터들은 SEQ ID No. 37-No. 46 중의 임의의 것을 포함한다.

렌티바이러스 벡터들의 생산

일 실시예에 있어서, 본 발명은 렌티바이러스 벡터 내로 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열을 삽입하는 단계를 포함하는 방법을 포괄한다. 상기 방법은 DNA 플랩(flap) 서열과 같은 여기서 언급되는 다른 핵산 요소들의 임의의 것을 삽입하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명은 렌티바이러스 벡터 내로 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열의 적어도 300개, 305개, 310개, 315개, 320개, 325개, 330개, 335개, 350개, 357개, 400개, 450개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 또는 1000개의 뉴클레오티드들을 삽입하는 단계를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위한 방법들을 포괄한다.

다양한 실시예들에 있어서, 상기 업스트림 프로모터 서열은 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열의 1100개, 1000개, 900개, 800개, 700개, 600개, 550개, 500개, 450개, 400개, 또는 350개 이하의 뉴클레오티드들을 포함한다.

본 발명은 렌티바이러스 벡터 내로 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열의 300개, 305개, 310개, 315개, 320개, 325개, 330개, 335개, 350개, 357개, 400개, 450개, 또는 500개 내지 305개, 310개, 315개, 320개, 325개, 330개, 335개, 350개, 357개, 400개, 450개, 550개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1000개, 또는 1100개의 뉴클레오티드들(범위들의 모든 가능한 결합들 내에서)을 삽입하는 단계를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위한 방법들을 포괄한다. 바람직하게는, 상기 업스트림 프로모터 서열은 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열의 300개-400개, 300개-500개, 300개-600개, 300개-700개, 또는 300개-1100개의 뉴클레오티드들을 포함한다.

가장 바람직하게는, 상기 업스트림 프로모터 서열은 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열의 300개-335개의 뉴클레오티드들을 포함한다.

바람직하게는, 상기 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열은 MHC 클래스 I 또는 β2 마이크로글로불린 프로모터를 포함하는 렌티바이러스 벡터 내로 삽입된다. 상기 업스트림 프로모터 서열은 상기 프로모터와 동일하거나 역배향이 될 수 있다.

본 발명은 렌티바이러스 벡터 내로 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열의 적어도 300개, 305개, 310개, 315개, 320개, 325개, 330개, 335개, 350개, 357개, 400개, 450개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 또는 1000개의 뉴클레오티드들 그리고 MHC 클래스 I 또는 β2 마이크로글로불린 프로모터를 삽입하는 단계를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위한 방법을 포괄한다.

다양한 실시예들에 있어서, 상기 업스트림 프로모터 서열은 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열의 1100개, 1000개, 900개, 800개, 700개, 600개, 550개, 500개, 450개, 400개, 또는 350개 이하의 뉴클레오티드들을 포함한다.

본 발명은 렌티바이러스 벡터 내로 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열의 300개, 305개, 310개, 315개, 320개, 325개, 330개, 335개, 350개, 357개, 400개, 450개, 또는 500개 내지 305개, 310개, 315개, 320개, 325개, 330개, 335개, 350개, 357개, 400개, 450개, 550개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1000개, 또는 1100개의 뉴클레오티드들(범위들의 모든 가능한 결합들 내에서) 그리고 MHC 클래스 I 또는 β2 마이크로글로불린 프로모터를 삽입하는 단계를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위한 방법들을 포괄한다. 바람직하게는, 상기 업스트림 프로모터 서열은 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열의 300개-400개, 300개-500개, 300개-600개, 300개-700개, 또는 300개-1100개의 뉴클레오티드들을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 업스트림 프로모터 서열은 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열의 300개-335개의 뉴클레오티드들을 포함한다.

일 실시예에 있어서, 상기 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열은 MHC 클래스 I 또는 β2 마이크로글로불린 프로모터의 삽입 이전에 상기 렌티바이러스 벡터 내로 삽입된다.

일 실시예에 있어서, 상기 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열은 MHC 클래스 I 또는 β2 마이크로글로불린 프로모터의 삽입 후에 상기 렌티바이러스 벡터 내로 삽입된다.

일 실시예에 있어서, 상기 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열 그리고 MHC 클래스 I 또는 β2 마이크로글로불린 프로모터는 상기 렌티바이러스 벡터 내로 함께 삽입된다.

일 실시예에 있어서, β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열은 MHC 클래스 I 또는 β2 마이크로글로불린 프로모터와 동일한 배향으로 업스트림으로 삽입된다.

일 실시예에 있어서, MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 업스트림 프로모터 서열은 MHC 클래스 I 또는 β2 마이크로글로불린 프로모터와 동일한 배향으로 업스트림으로 삽입된다.

바람직하게는, 상기 업스트림 프로모터 서열은 β2 마이크로글로불린, HLA-A2, HLA-B7, HLA-Cw5, HLA-E 또는 HLA-G 업스트림 프로모터 서열을 포함하며, 상기 프로모터는 β2 마이크로글로불린, HLA-A2, HLA-B7, HLA-Cw5, HLA-E 또는 HLA-G 프로모터이다. 모든 결합들은 개별적으로 본 발명의 일부로 간주된다.

바람직하게는, 상기 업스트림 프로모터 서열은 SEQ ID NO：1 내지 SEQ ID NO：7 또는 SEQ ID NO：27 내지 SEQ ID NO：36 중의 임의의 것을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

렌티바이러스 입자 벡터의 생산

본 발명은 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열을 함유하는 렌티바이러스 입자 벡터를 생산하기 위한 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열을 포함하는 렌티바이러스 입자 벡터를 포괄한다. 렌티바이러스 입자 벡터(또는 렌티바이러스 벡터 입자)는 바이러스 단백질들과 연관되는 렌티바이러스 벡터를 포함한다.

상기 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열의 삽입은 상기 벡터의 역가(tilter)를 증가시킬 수 있다.

이러한 방법의 일 실시예에 따르면, 상기 입자 벡터가 DNA 플라스미드로 형질전환된 숙주세포 내에서 수득된다.

이와 같은 DNA 플라스미드는 다음을 포함할 수 있다.

- 복제의 박테리아 기원(예：pUC ori);

- 선택을 위한 항생제 내성 유전자(예：KanR); 그리고, 보다 상세하게는,

- MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터.

본 발명은 다음 단계들을 포함하는 재조합 벡터 입자들의 생산을 가능하게 한다.

i) 적합한 숙주 세포를 렌티바이러스 벡터로 감염시키거나 형질도입하는 단계;

ii) 상기 숙주 세포를 레트로바이러스(바람직하게는, 렌티바이러스)의 적어도 구조 및 인테그라아제(integrase) 단백질들을 인코딩하는 바이러스 DNA 서열들을 함유하는 포장(packaging) 플라스미드 벡터로 감염시키거나 형질 도입하는 단계- 이와 같은 포장 플라스미드들은 해당 기술 분야에 기재되어 있다(Dull 등의 "J Virol"(1998, 72(11))：8463-71; Zufferey 등의 "J Virol"(1998, 72(12)：9873-80));

iii) 렌티바이러스 벡터 입자들 내로의 상기 렌티바이러스 벡터의 발현 및 포장을 얻기 위해 상기 감염 숙주 세포를 배양하는 단계; 그리고

iv) 상기 배양된 숙주 세포들 내에서 단계 iii)의 발현 및 포장으로부터 상기 렌티바이러스 벡터 입자들을 수확하는 단계.

포장 플라스미드로 감염되거나 형질도입된 상기 숙주 세포는 안정한 포장 세포주가 될 수 있다. 따라서, 상기 방법은 다음 단계들을 포함할 수 있다.

i) 포장 세포주를 렌티바이러스 벡터로 감염시키거나 형질도입하는 단계;

ii) 렌티바이러스 벡터 입자들 내로 상기 렌티바이러스 벡터의 발현 및 포장을 수득하기 위해 상기 세포주를 배양하는 단계; 그리고

iii) 상기 배양된 세포주 내에 단계 ii)의 발현 및 포장의 결과로 야기되는 렌티바이러스 벡터 입자들을 수확하는 단계.

다른 이유들로 인하여, 상기 수득된 레트로바이러스 입자들을 위형화하는 것, 즉, 특정 입자 외피 단백질들을 첨가하거나 대체하는 것이 도움이 될 수 있다. 예를 들어, 이는 자연 입자들 또는 다른 재조합 입자들과 상기 재조합 입자를 구별하기 위해 다른 외피 단백질들을 가지는 것이 유리할 수 있다. 백신 접종 계획의 문제에 있어서, 위형화된 입자 벡터들은 환자가 이미 렌티바이러스들에 대한 면역을 진전시켰을 때에 상기 면역 시스템을 보다 벗어하는 경향이 있다. 이는 특히 유사한 입자 벡터들의 연속적인 주입들이 질병에 대해 환자가 면역력을 가지게 하기 위해 요구될 때에 유용하다.

본 발명의 레트로바이러스 입자들을 위형화하기 위하여, 상기 숙주 세포는 바이러스 외피 단백질(들), 바람직하게는 VSV-G 외피 단백질을 인코딩하는 하나 또는 몇몇의 외피 DNA 플라스미드(들)로 더 감염될 수 있다.

적절한 숙주 세포는 바람직하게는, 예를 들면, HEK 세포주와 같은 사람의 배양된 세포주이다.

상기 벡터 입자를 생산하기 위한 방법은 게놈이 다음 구성 요소들의 하나 또는 그 이상으로 형질전환되었던 숙주 세포 내에서 수행된다. 렌티바이러스 벡터 DNA 서열, 상기 포장 유전자들 및 상기 외피 유전자. 이와 같은 DNA 서열은 본 발명에 따른 프로바이러스 벡터와 유사한 것으로 간주될 수 있으며, 상기 벡터 서열의 전사를 가능하게 하고 입자 생산율을 개선하도록 추가적인 프로모터를 포함한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 숙주 세포는 전체 세포들의 종창(swelling) 이나 건조 없이 연속적인 방식으로 배양 배지 내에서 바이러스 입자를 생산할 수 있도록 더 변형된다. 바이러스 입자들을 생산하기 위한 이와 같은 기술들에 관한 하나는 Strang 등의 "J Virol"(2005, 79(3)：1165-71; Relander 등의 "Mol Ther"(2005, 11(3)：452-9; Stewart 등의 "Gene Ther"(2009, 16(6)：805-14); 및 Stuart 등의 "Hum gene Ther"(2011)(인쇄 중)로 언급될 수 있다.

본 발명의 목적은 렌티바이러스 입자 벡터로 형질전환된 숙주 세포로 이루어진다.

상기 렌티바이러스 입자 벡터들은 앞서 정의한 바와 같이 다음의 요소들을 포함할 수 있다.

- cPPT/CTS 폴리뉴클레오티드 서열; 및

- 프로모터의 조절 하의 전이유전자 서열,

- MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열,

그리고 선택적으로는 전술한 추가적인 요소들의 하나.

세포 내에 전이유전자를 발현시키기 위한 방법들

본 발명은 세포, 바람직하게는 분열하지 않는 세포 내에 전이유전자를 발현시키기 위한 방법들을 포괄한다. 상기 방법은 상기 전이유전자의 발현을 가능하게 하는 조건들 하에서 세포를 본 발명의 렌티바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 입자 벡터로 형질도입하는 단계를 포함한다.

상기 세포들은 바람직하게는 포유동물 세포들, 특히 사람 세포들이다. 특히 바람직한 것들은 사람의 분열하지 않는 세포들이다.

상기 전이유전자는 바람직하게는 면역원성 폴리펩티드를 인코딩한다. 상기 방법은 상기 폴리펩티드를 수확하거나 분리키는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 렌티바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 입자 벡터는 바람직하게는 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열을 포함한다. 바람직하게는 상기 벡터는 MHC 클래스 I 또는 β2 마이크로글로불린 프로모터를 더 포함한다.

일 실시예에 있어서, 본 발명은 렌티바이러스 벡터 내로 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열을 삽입하는 단계 및 세포를 상기 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열을 함유하는 벡터로 형질도입하는 단계를 포함하는 전이유전자를 발현시키기 위한 방법을 포괄한다.

렌티바이러스 벡터들의 치료적 사용

본 발명은 또한 항원결정부들에 대한 면역반응의 발생이나 개선을 유도할 수 있거나 기여할 수 있는 치료 조성물들 또는 백신들, 보다 상세하게는 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열을 포함하는 벡터 내에 존재하는 전이유전자에 의해 인코드되는 것들을 조제하기 위한 본 발명에 따른 렌티바이러스 벡터들, 특히 렌티바이러스 입자 벡터들의 형태로의 사용에 관한 것이다.

본 발명은 이에 따라 약제 또는 백신으로, 특히 유전자 치료를 위해 유용한 벡터들을 제공한다.

이들 벡터들은 감염증들, 특히 바이러스 감염과 연관되는, 보다 상세하게는, AIDS와 다른 면역결핍증들과 같은 레트로바이러스 감염과 연관되는 질병들의 치료 또는 예방을 위해 우선적으로 사용된다.

본 발명은 또한 종양들 및 암들에 대한 치료 프로토콜들에 이용될 수 있고, 특히 종양들에 대한 면역치료 또는 백신 치료를 위한 프로토콜들에 이용될 수 있었다.

본 발명의 벡터들이 보다 상세하게는 세포매개 면역반응 및 특히 이들 세포들 내의 전이유전자에 의해 발현되는 항원과 연관된 CTL 반응을 얻기 위해 수지상 세포들을 표적으로 하므로, 이들은 특히 마이코박테리아(Mycobacteria) 또는 HIV 바이러스와 같은 지연성 또는 내재성의 병원성 미생물들을 표적으로 하는 백신들로서 유용하다.

이에 따라, 본 발명은 앞서 정의된 렌티바이러스 벡터를 포함하는 면역원성 조성물을 인코드하는 것과 관련된다.

본 발명의 면역원성 조성물은 바람직하게는 상기 표적 세포들 내의 상기 벡터 게놈의 핵이동을 유도하거나 자극하기 위한 상기 벡터 및 벡터 입자들 내의 cPPT 및 CTS 서열들을 포함한다.

역전사 동안, cPPT 및 CTS 서열들은 DNA 벡터 서열의 핵이동을 자극하는 DNA 트리플렉스(triplex)로 언급되는 3중가닥 DNA 구조의 형성을 유도한다. 바람직하게는, 상기 벡터는 레트로바이러스 또는 레트로바이러스 유사 기원의 역전사, 발현 및 캡슐화(encapsidation)의 전이유전자 및 조절 신호들을 포함하며, 여기서 상기 조성물은 상기 벡터 내에 존재하는 상기 전이유전자 서열에 의해 인코드되는 하나 또는 몇몇 항원결정부들에 대한 CTL(세포독성 T 림프구) 또는 CD4 반응을 유도할 수 있거나 자극할 수 있다.

상기 렌티바이러스 벡터의 역가는 상기 벡터 내의 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터의 포함에 의해 개선된다.

따라서, 본 발명에 따른 렌티바이러스 벡터들은 기억 CTL 반응의 발생을 유도하거나, 향상시키거나, 일반적으로 연관되는 능력을 가진다. 달리 말하면, 이들은 세포매개 면역반응의 유도, 자극 또는 참여, 특히 CTL 반응 또는 기억 반응의 발생에 의해 종양 질병들이나 감염증들의 치료를 위한 치료 조성물의 조제를 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 렌티바이러스 벡터들은 상기 렌티바이러스 벡터를 숙주에 투여하는 단계 및 상기 숙주 내에 상기 전이유전자에 대한 특이적 면역반응을 발생시키는 단계를 포함하는 치료 방법들 및 면역반응을 유도하는 방법들에 사용될 수 있다. 상기 세포들 및 상기 숙주들 내에서 발생된 항체들은 진단 시약들로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 렌티바이러스 벡터들은 전신, 국소 또는 피부, 근육 내, 피부 내를 포함하는 투여의 알려진 루트들, 예를 들어, 종양 내의 투여 루트들을 통해 환자에게 직접 투여될 수 있다. 생체 외(ex vivo) 투여, 예를 들어 치료되는 환자에 대한 치료된 세포들의 투입을 수반하는 생체 외 표적 세포들의 형질도입 또한 본 발명에 포괄된다.

특정 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 면역원성 조성물은 세포매개 면역반응, 특히 CTL-매개 면역반응의 발생을 유도하거나, 향상시키거나, 생체 내로 참여하게 되는 방식으로 상기 환자에게 직접 투여될 수 있다.

다른 실시예에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 한 번 또는 반복적인 투여들에 사용될 수 있으므로, 이들은 장기 기억 세포매개 반응의 발생을 가능하게 할 수 있다.

본 발명의 면역원성 조성물들은 관심의 대상인 뉴클레오티드들 서열들 또는 상기 벡터 또는 벡터 입자들 내에 존재하는 전이유전자에 의해 인코드되는 다중 항원결정부들에 대한 세포매개 면역반응을 도출하거나 자극하는 데 사용될 수 있으며, 이들은 또한 유전자, 예를 들어 적어도 8개 내지 15개의 아미노산들, 바람직하게는 9개 내지 12개의 아미노산들을 인코드할 수 있는 병원체의 유전자 또는 상기 유전자의 조각들의 전체 서열의 생성물에 대해 세포매개 면역반응을 도출하거나 자극하는 데 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 세포 반응을 유도하는 아미노산 서열의 다중 반복(적어도 2개의 동일한 서열들) 및/또는 다른 병원균들이나 종양 항원들의 2개의 항원결정부들에 대응되는 적어도 2개의 다른 서열들을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 포괄한다.

그 결과, 본 발명은 종양들의 치료와 특히 항암 또는 항감염증 치료를 위한 예방 및/또는 치료 백신 접종 프로토콜들에 사용될 수 있는 조성물을 포괄한다.

특히, 이는 보조제들(adjuvants), 다른 면역원성 조성물들, 화학 요법(chemotherapy) 또는 임의의 다른 치료법과 결합될 수 있다. 본 발명의 다른 실시예들을 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련자에게는 여기에 개시된 내용들이 단지 예시적이고, 다양한 다른 선택적인 예들, 적용들 및 변형들이 본 발명의 범주 내에서 이루어질 수 있는 점이 이해되어야 할 것이다. 이에 따라, 본 발명이 여기에 예시되는 특정 실시예들에 한정되는 것은 아니다.

실험예들

실험예 1：세포주들

HEK 293T(사람 태아 신장 세포주인 ATCC CRL-11268(Graham 등의 1977)) 세포들이 10%의 소 태아 혈청(FBS, PAA), 1%의 L-글루타민(Glutamine)(유로비오(Eurobio)), 1%의 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)(라이프 테크놀로지즈(Life technologies)의 기브코(Gibco)) 그리고 1%의 피루빈산 나트륨(sodium pyruvate)(라이프 테크놀로지즈의 기브코)으로 보충된 두벨코(Dubelcco)의 변형 이글(Eagle) 배지(DMEM/고변형된 하이클론(Hyclone)) 내에 유지되었다. 상기 세포주는 37℃에서 5%의 CO₂의 가습한 분위기로 인큐베이터 내에서 유지되었다.

실험예 2：플라스미드들 구성

상기 프로모터들은 pFLAP-GFP 프로바이러스 플라스미드의 MluI 및 BamHI 부위들 사이에 복제되었다.

상기 프로모터들의 업스트림 복제된 β2m_업스트림 서열(β2m_US):

HLA-B7 및 HLA-E 프로모터들을 진아트(GeneArt)(라이프 테크놀로지즈)로부터 구입하였고, 이들은 최초 프로모터 서열의 5' 말단 업스트림인 상기 β2m 업스트림 프로모터 서열(β2m_US)을 포함하도록 설계되었다. 상기 HLA-B7 및 HLA-E 프로바이러스 플라스미드들을 생성하기 위하여, PCR 반응들이 야생형 프로모터 서열들을 단지 증식시키도록 수행되었고, 이들은 상기 pFlap-GFP 플라스미드의 MluI 및 BamHI 부위들 사이에 복제되었다.

상기 HLA-A2, HLA-DRα, CMV 및 UBC 프로모터들의 5' 말단 내에 상기 β2m-업스트림 서열(β2m_US)을 첨가하기 위하여, 본 발명자들은 융합 PCR 반응들을 수행하였다. 요약하면, 세 가지 별도의 PCR 반응들이 수행되었으며, 첫 번째 PCR은 상기 β2m_US를 증식시키고, 두 번째 PCR은 상기 β2m_US의 말단과 동종의 25bp 오버행(overhang)을 포함하여 상기 프로모터를 증식시킨다. 상기 PCR 1 및 2 생성물들은 이후에 아가로오스(agarose) 겔(퀴아퀵(QIAquick) 겔 추출 키트, 퀴아젠(QIAGEN)) 내에서 정제되었고, 최종 DNA 생성물(β2m_US-프로모터)을 발생키게 되는 세 번째 PCR을 위한 매트릭스들로 이용되었다. 각 프로모터의 세 PCR에 대해 사용되는 프라이머들은 표 1에 재개된다. 상기 PCR 3 생성물은 겔 정제되었고, pCR? 2.1-TOPO? (라이프 테크놀로지즈) 내에서 복제되었으며, 서열화되었고, MluI 및 BamHI 제한 효소들에 의해 소화되었으며, 상기 pFlap-GFP 내로 복제되었다.

역배향으로 프로모터들 업스트림 복제된 β2m_업스트림 서열:

역배향(β2m_USR) 내의 상기 β2m 업스트림 프로모터 서열이 전술한 바와 같은 융합 PCR을 이용하여 각 프로모터 업스트림으로 복제되었다. 상기 모든 USR_프로모터들은 AscI 및 BamHI 부위들 사이에 증식되었고, 이후에 MluI 및 BamHI 부위들을 이용하여 상기 pflap-GFP 내로 복제되었다. 각 프로모터의 세 PCR에 대해 사용되는 프라이머들은 표 2에 열거된다.

직접 배향으로 다운스트림 GFP를 복제하는 β2m_업스트림 서열:

β2m_US가 XhoI 및 KpnI 제한 부위들을 이용하여 상기 GFP 정보제공 유전자 다운스트림으로 복제되었다. 먼저, PCR이 상기 XhoI 및 KpnI 부위들을 상기 β2m_US의 5' 및 3'으로 각기 첨가하도록 수행되었다. PCR 을 위해 사용된 프라이머들은 순방향：5'-CTCGAGGAGAAACCCTGCAGGGAATTC-3'(SEQ ID NO：9), 역방향：5'-GGTACCGAGTCTCGTGATGTTTAAGAAGGCA-3'(SEQ ID NO：10)이다 상기 PCR 생성물들은 겔 정제되었고, pCR? 2.1-TOPO? (라이프 테크놀로지즈) 내에서 복제되었으며, 서열화되었고, XhoI 및 KpnI 제한 효소들에 의해 소화되었으며, 상상기 Flap-GFP의 XhoI 및 KpnI 부위들 사이에 복제되었다.

역배향으로 다운스트림 GFP 복제된 β2m_업스트림 서열:

역배향(β2m_USR)으로 상기 β2m 업스트림 프로모터 서열이 XhoI 및 KpnI 제한 부위들을 이용하여 상기 GFP 정보제공 유전자 다운스트림으로 복제되었다. 먼저, PCR이 상기 XhoI 및 KpnI 부위들을 상기 β2m_USR의 5' 및 3' 말단으로 각기 첨가하도록 구현되었다. 상기 PCR을 위해 사용된 프라이머들은 순방향：5'-GGTACCGAGAAACCCTGCAGGGAATTCCCCAG-3'(SEQ ID NO：11) 역방향：5'-CTCGAGGAGTCTCGTGATGTTTAAGAAGGCA-3'(SEQ ID NO：12)이다. 상기 PCR 생성물은 이후에 겔 정제되었고, pCR? 2.1-TOPO? (라이프 테크놀로지즈) 내에서 복제되었으며, 서열화되었고, XhoI 및 KpnI 제한 효소들에 의해 소화되었으며, 상기 pFlap의 XhoI 및 KpnI 사이에 복제되었다.

pUCori 및 KanR 사이에 복제된 β2m_업스트림 서열:

상기 pUCori 및 KanR 서열들 사이에 존재하는 제한 부위들의 숫자가 제한되기 때문에, 본 발명자들은 상기 β2m_US를 상기 PmlI 부위들 내로 복제하도록 선택하였다. PmlI 부위 또한 pFlap 골격의 5' LTR 내에 존재하기 때문에, 본 발명자들은 먼저 융합 PCR을 이용하여 상기 β2m_US 업스트림을 상기 pUCori에 첨가하였고, 이후에 상기 두 PmlI 부위들 사이에 전체 조각을 복제하였다. PCR1(β2m_US의 증식)을 위해 사용된 프라이머들은 F1_5'-CACGTGGAGAAACCCTGCAGGGAATTCCCCAG-3'(SEQ ID NO：13) 및 R1_5'-GAGTCTCGTGATGTTTAAGAAGGCA-3'(SEQ ID NO：14)이다. PCR2(pUCori 및 SV40의 증식)를 위해 사용된 프라이머들은 β2m_US의 말단(굵은 글씨)과 동종의 오버행을 함유하는 F2_5-TGCCTTCTTAAACATCACGAGACTCCTAAAACTTCATTTTTAATTT-3'(SEQ ID NO：15) 그리고 R2_5'-CACGTGATGAAATGCTAGGCGGCTGTC-3'(SEQ ID NO：16)이다. PCR 1 및 2 생성물들은 아가로오스 겔 상에서 정제되었고, 상기 세 번째 PCR을 위한 매트릭스들로 사용되었으며, 상기 F1 및 R2 프라이머들은 상기 증식을 위해 사용되었다. 상기 PCR 3 생성물은 겔 정제되었고, pCR? 2.1-TOPO? (라이프 테크놀로지즈) 내에서 복제되었으며, 서열화되었고, PmlI에 의해 소화되었으며, 상기 pFlap-GFP 내의 동일한 부위들 사이에 복제되었다. 복제되는 배향은 효소 소화에 의해 제어되었다.

역배향으로 pUCori 및 KanR 사이에 복제되는 β2m_업스트림 서열:

β2m_USR이 전술한 바와 같이 상기 PmlI 부위들 사이에 복제되었다.

PCR1(β2m_USR의 증식)을 위해 사용된 프라이머들은 F1_5'-CACGTGGAGTCTCGTGATGTTTAAGAAGGCATG-3'(SEQ ID NO：17) 및 R1_5'-GAGAAACCCTGCAGGGAATTCCCCAG-3'(SEQ ID NO：18)이다. PCR2(pUCori 및 SV40의 증식)를 위해 사용된 프라이머들은 β2m_USR의 말단(굵은 글씨)과 유사한 오버행을 함유하는 F2_5-TGGGGAATTCCCTGCAGGGTTTCTCCTAAAACTTCATTTTTAATTT-3'(SEQ ID NO：19) 그리고 R2_5'-CACGTGATGAAATGCTAGGCGGCTGTC-3'(SEQ ID NO：20)이다. PCR 1 및 2 생성물들은 겔 정제되었고, 상기 세 번째 PCR을 위한 매트릭스들로 사용되었으며, 상기 F1 및 R2 프라이머들은 상기 증식을 위해 사용되었다. 상기 PCR 3 생성물은 겔 정제되었고, pCR? 2.1-TOPO? (라이프 테크놀로지즈) 내에서 복제되었으며, 서열화되었고, PmlI에 의해 소화되었으며, 상기 pFlap-GFP 내의 동일한 부위들 사이에 복제되었다. 복제되는 배향은 효소 소화에 의해 제어되었다.

상기 프로모터들은 상기 MluI 및 BamHI 부위들을 이용하여 상기 pFlap-GFP 플라스미드 내로 복제되었다. β2m 및 HLA-B7 프로모터들이 이들의 서열 내에 MluI 부위를 포함하기 때문에, AscI 부위(MluI 부위와 경쟁하는)가 대치로서 사용되며, 이는 상기 MluI 부위를 사라지게 한다.

상기 프로모터들의 업스트림으로 복제된 짧은 업스트림 서열들.

HLA-A2, HLA-E 및 HLA-DRα 짧은 업스트림 서열들이 진아트로부터 구매되었고, MluI 제한 부위를 이용하여 이들의 각각의 프로모터들의 업스트림으로 복제되었다. 삽입된 서열들의 배향은 서열화에 의해 제어되었다. 상기 HLA-B7 짧은 업스트림 서열이 융합 PCR을 이용하여 상기 HLA-B7 프로모터의 업스트림으로 첨가되었다. PCR1(HLA-B7_US의 증식)을 위해 사용된 프라이머들은 F1_5'-GGCGCGCCCAGGTTTAAAGAGAAAACCCCTG-3'(SEQ ID NO：17) 및 R1_5'-ATTGCAGACGCGGCCCTCGGAGCCTGAGA-3'(SEQ ID NO：18)이다. PCR2(HLA-B7 프로모터의 증식)를 위해 사용된 프라이머들은 HLA-B7_US의 말단(굵은 글씨)과 동종의 오버행을 함유하는 F2_5-AGGCTCCGAGGGCCGCGTCTGCAATGGGGAGGCGCACGTTGGGGATTC-3'(SEQ ID NO：19) 그리고 R2_5'-CGGAAGGAAAGTGACGGGCGAA-3'(SEQ ID NO：20)이다. PCR 1 및 2 생성물들은 겔 정제되었고, 상기 세 번째 PCR을 위한 매트릭스들로 사용되었으며, 상기 F1 및 R2 프라이머들은 상기 증식을 위해 사용되었다. 상기 PCR3 생성물은 겔 정제되었고, pCR? 2.1-TOPO? (라이프 테크놀로지즈) 내에서 복제되었으며, 서열화되었고, MluI 및 BamHI 제한 효소들에 의해 소화되었으며, 상기 Flap-GFP 내로 복제되었다.

상기 프로모터들의 업스트림으로 복제된 긴 업스트림 서열들.

HLA-A2, HLA-E 및 HLA-DRα 긴 업스트림 서열들이 진아트로부터 구매되었고, MluI 제한 부위를 이용하여 이들의 각각의 프로모터들의 업스트림으로 복제되었다. 상기 삽입된 서열들의 배향은 서열화에 의해 제어되었다.

Β2m_Up 및 HLA-B7_Up 블록들(blocks)(프로모터들＋긴 업스트림 서열들)이 진아트로부터 구매되었고, 상기 MluI/BamHI 제한 부위들을 이용하여 상기 pFlap-GFP 내로 복제되었다.

이중 업스트림 서열들.

HLA-E_US가 XhoI 및 KpnI 제한 부위들을 이용하여 상기 GFP 유전자의 pFlap-ΔU3-β2m_E_US-GFP 업스트림 내로 복제되었다. 먼저, PCR이 상기 XhoI 및 KpnI 부위들을 각기 상기 HLA-E_US의 5' 및 3'으로 첨가하도록 구현되었다. 상기 PCR을 위해 사용된 프라이머들은, 순방향：5'-CTCGAGACTAATTTCTTTTTTCTTGTTGCC-3' 및 역방향：5'-GGTACCAACTTTTAGGTTTCGGTATCTCTGCACA-3이다. 상기 PCR 생성물은 이후에 겔 정제되었고, pCR? 2.1-TOPO? (라이프 테크놀로지즈) 내에서 복제되었으며, 서열화되었고, XhoI 및 KpnI 제한 효소들에 의해 소화되었으며, 상기 pFlap-ΔU3-β2m_E_US-GFP 내의 동일한 부위들 사이에 복제되었고, 상기 pFlap-ΔU3-β2m_E_US-GFP_E_US의 수득을 가능하게 하였다.

실험예 3：렌티바이러스 생산

상기 렌티바이러스 벡터들은 표준 인산칼슘 침전 프로토콜을 이용하여 HEK 293T 세포들의 일시적 형질전환에 의해 생산되었다. HEK 293T 세포들은 10mL의 완전 배양 배지 내의 10㎠의 조직 배양 접시(BD 팔콘(Falcon)) 내에 7x10⁶개의 세포들로 파종되었고, 부착되도록 37℃에서 5% CO₂의 가습한 분위기로 인큐베이터 내에서 24시간 유지되었다. 각각의 생산된 벡터를 위하여, 하나의 조직 배양 접시는 다음으로 감염된다. 상기 렌티바이러스 골격 플라스미드 pFlap(10㎍), 상기 외피 플라스미드를 인코딩하는 pThV-Env1(2㎍) 및 상기 pThV-GP 포장 플라스미드(10㎍)는 353㎕의 멸균 증류수(라이프 테크놀로지즈의 기브코) 및 125㎕의 CaCl₂(플루카(Fluka))로 혼합되었다. 상기 DNA 혼합은 이후에 500㎕의 37℃에서 미리 데워진 HBS 2X pH=7.3에 방울씩 첨가되었고, 얻어진 1mL의 침전물이 상기 세포들의 배양 배지에 첨가되었다. 상기 감염된 세포들은 이후에 5%의 CO₂ 하의 37℃에서 배양되었다. 상기 배지는 혈청 없이 7mL의 수확 배지에 의한 형질전환 후에 24시간 동안 대체되었고, 바이러스 상청액(supernatant)이 24시간의 첨가 후에 수확되었으며, 2500rpm에서 5분의 원심분리에 의해 분류되었고, -20℃에서 저장되었다.

실험예 4：유세포 분석기(Flow cytometry)에 의한 렌티바이러스 벡터들의 정량화

감염성 입자들의 정량화를 위하여, HEK 293T 세포들이 웰(well)당 1×10⁵개의 세포들의 밀도로 10%의 FBS를 함유하는 불완전 배지 내의 24-웰 플레이트들(BD 팔콘) 내에 파종되었고, 부착되도록 4시간 동안 배양되었다. 상기 세포들은 불완전 배지 내에서 상기 배지를 바이러스 샘플들의 1/100, 1/300 및 1/900의 300㎕ 희석으로 대체하여 형질도입되었고, 5%의 CO₂ 하의 37℃에서 2시간의 배양이 후속되었다. 흡착 후, 1mL의 완전 배지가 각 웰에 첨가되었다. 72시간의 후형질도입 이후, 상기 세포들은 트립신(trypsin)화되었고 300㎕의 완전 배지 내에 다시 현탁되었으며, GFP를 발현시키는 세포들의 퍼센티지가 FL1 채널을 이용하여 파스칼리버(FACScalibur) 유세포 분석기(BD 바이오사이언시즈(Biosciences))로 결정되었다. 세 희석들의 두 세트들이 테스트된 각 샘플에 대해 수행되었다. 30%보다 작은 형질도입 세포들의 퍼센티지에 대응되는 값들이 바이러스 서스펜션 내에 존재하는 형질도입 단위들(TU)의 대략적인 숫자를 계산하는 데 이용되었다.

실험예 5：ELISA p24에 의한 전체 생산된 입자들의 정량화

전체 입자들의 정량화는 제조자의 권고 사항들에 따라 상업용 키트(페르킨 엘머(Perkin Elmer))를 이용하여 각 생산 상청액의 10^-5, 10^-6 및 10^-7의 희석들에 대해 수행되었다.

실험예 6：qPCR에 의한 효율적인 생산된 입자들의 정량화

HEK 293T 세포들이 배양 배지 내의 6-웰 플레이트들(BD 팔콘) 내에 파종되었고, 습기가 있는 분위기 내에서 5%의 CO₂의 37℃에서 4시간 동안 배양되었다. 세포들은 렌티바이러스 벡터의 3가지의 연속적인 희석들(1/5, 1/10 및 1/20)로 형질도입되었다. 72시간의 후배양 이후, 세포들이 수확되었고 형질도입 HEK 293T 세포들의 펠릿들(pellets)이 구현되었으며. -20℃에서의 중간 저장 후, 형질도입 세포-플레이트들로부터의 전체 게놈 DNA가 단일 칼럼 및 마이크로원심분리를 이용하는 퀴아젠 퀴아앰프(QIAGEN QIAamp) DNA 미니 키트 핸드북에 기초하는 방법을 이용하여 추출되었다. 추출된 DNA는 qPCR에 사용될 때까지 -20℃에서 저장되었다. 상기 숙주 세포 게놈 내에 통합된 프로바이러스 DNA의 정량화가 5'-3' Taq 폴리메라아제(polymerase)의 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성에 기초하는 최적화된 테퀴맨(Taqman) qPCR을 이용하여 추출된 DNA에 대해 수행되었다.

프로브(probe)는 본 발명자의 렌티바이러스 벡터의 서열의 골격에 특이적인 올리고뉴클레오티드이다. 증식은 플랩(Flap) A 프라이머(CCCAAGAACCCAAGGAACA)(SEQ ID NO：21), 플랩 S 프라이머(AGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAAC)(SEQ ID NO：22), 그리고 렌티(Lenti) TM 프로브(6FAM-AACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGG-BBQ)(SEQ ID NO：23)를 이용하여 폴리메라아제 마스터 믹스(Master Mix)(페르멘타스 서모 사이언티픽(Fermentas Thermo Scientific))로 수행되었다. 수확된 세포들의 숫자에 대한 통합들을 정규화하기 위하여, 세포의 ACTIN 유전자의 특이적 증식이 동일한 마스터 믹스 및 액틴(Actine) A 프라이머(CGGTGAGGATCTTCATGAGGTAGT)(SEQ ID NO：24), 액틴 S 프라이머(AACACCCCAGCCATGTACGT)(SEQ ID NO：25) 그리고 후무라(Humura) ACT TM 프로브(6FAM-CCAGCCAGGTCCAGACGCAGGA-BBQ)(SEQ ID NO：26)를 이용하여 나란하게 적용된다. 양 반응들은 열 프로그램(50℃에서 2분, 95℃에서 10분 및 95℃에서 15초의 40 사이클들 그리고 63℃에서 1분)을 수반하는 마스터사이클러(MasterCycler) Ep 리얼플렉스(Realplex) S(에펜도르프(Eppendorf)) 상에서 구현된다. 상기 분석은 마스터사이클러 Ep 리얼플렉스 소프트웨어로 수행된다.

SEQUENCE LISTING <110> THERAVECTYS <120> LENTIVIRAL VECTORS CONTAINING AN MHC CLASS I, MHC CLASS II, OR B2 MICROGLOBULIN UPSTREAM PROMOTER SEQUENCE <130> P57997WO <150> EP 13305738.0 <151> 2013-06-03 <160> 46 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 300 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 agaagttctc cttctgctag gtagcattca aagatcttaa tcttctgggt ttccgttttc 60 tcgaatgaaa aatgcaggtc cgagcagtta actggcgggg gcaccattag caagtcactt 120 agcatctctg gggccagtct gcaaagcgag ggggcagcct taatgtgcct ccagcctgaa 180 gtcctagaat gagcgcccgg tgtcccaagc tggggcgcgc accccagatc ggagggcgcc 240 gatgtacaga cagcaaactc acccagtcta gtgcatgcct tcttaaacat cacgagactc 300 <210> 2 <211> 300 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ctggagggca atggcacgat cttggctcac cgcaacctcc tcctcctggg ttcaagtgat 60 tctcctgcct cagcctccca agtagccagg attacagcca tgcgccacca cgccggctaa 120 ttttttggac ttttagtaga gacagggttt ctccatattg gtcgggctgg tctcgaactc 180 ccaacctcag gtgatcagcc cgccttggcc tcccaaagtg ctgagattac aggcgtgagc 240 caccgcgccc agccaggact aatttctaag agtgtgcaga gataccgaaa cctaaaagtt 300 <210> 3 <211> 300 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 actctctggc atcaagttcc ccgtgctcag tttccctaca caagagtcca agaggagagg 60 taaggagtgg gaggcaggga gtccagttca gggacaggga ttccaggacg agaagtgaag 120 gggaaggggc tgggcgcagc ctgggggtct ctccctggtt tccacagaca gatccttgtc 180 caggactcag gcagacagtg tgacaaagag gcttggtgta ggagaagagg gatcaggacg 240 aagtcccagg tcccggacgg ggctctcagg gtctcaggct ccgagggccg cgtctgcaat 300 <210> 4 <211> 300 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 caaggggaga ggtaagtgtc ctttattttg ctggatgtag tttaatatta cctgaggtaa 60 ggtaaggcaa agagtgggag gcagggagtc cagttcaggg acggggattc caggagaagt 120 gaaggggaag gggctgggcg cagcctgggg gtctctccct ggtttccaca gacagatcct 180 tggccaggac tcaggcacac agtgtgacaa agatgcttgg tgtaggagaa gagggatcag 240 gacgaagtcc caggtcccgg gcggggttct cagggtctca ggctccaagg gccgtgtctg 300 <210> 5 <211> 300 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ttcattgtct ggcaccaagc tccttggggt gaattttctt ccaaaagagt ccggggagtc 60 caggtatgga atgggaggca gaaagttcaa tcaagggact gggatttcgg aatgaataat 120 gaagggagat ggactgggtc catgccgaag gtttctccct ggtttctcag cccccgggcg 180 aagactcagg gagacattga gacacaccct gcacaggagg gggaggggga gggggagggc 240 aaagtcccag ggccccagga gtggctctca agggctcagg ccccgaggcg gtgtctgggg 300 <210> 6 <211> 300 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 gctcactctc tggcaacaag ctccctgggg tgatttttct tctagaagag tacaggagga 60 caggcaagga gtgggaggca gggagtccag ttcagggaca gggattccgg gatgaaaagt 120 gaagggagag ggccagggac cttgccgagg gtttctccct ggtttctcag acagctcctg 180 ggccaagact cagggagaca ctgagacaga acgcttggca caagagtagc ggggtcaggg 240 cgaagtccca gggcctcaag cgtggctctc agggtctcag gccccacagg cggtgtatgg 300 <210> 7 <211> 300 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gcttactctc tggcaccaaa ctccatggga tgatttttct tctagaagag tccaggtgga 60 caggtaagga gtgggagtca gggagtccag ttccagggac agagattacg ggataaaaag 120 tgaaaggaga gggacggggc ccatgccgag ggtttctccc ttgtttctca gacagctctt 180 gggccaagac tcagggagac attgagacag agcgcttggc acagaagcag aggggtcagg 240 gcgaagtcca gggccccagg cgttggctct cagggtctca ggccccgaag gcggtgtatg 300 <210> 8 <211> 316 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus Sequence <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (55)..(55) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> 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cagggagtcc agttncnagg gnnacaggga ttccgggann 120 agaagtgaag ggnnagggnc tgggnccatn cngagggttt ctccctggtt tctncagaca 180 gnnctcctng gccaagactc aggnagacan tgngacanag cnnngcttgg ngcaggnagn 240 agaggggtca ggncgaagtc ccaggnccnc aggcgtnggc tctcagggtc tcnnnaggcn 300 ccgaaggcng tgtntg 316 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 9 ctcgaggaga aaccctgcag ggaattc 27 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 10 ggtaccgagt ctcgtgatgt ttaagaaggc a 31 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 11 ggtaccgaga aaccctgcag ggaattcccc ag 32 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 12 ctcgaggagt ctcgtgatgt ttaagaaggc a 31 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 13 cacgtggaga aaccctgcag ggaattcccc ag 32 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 14 gagtctcgtg atgtttaaga aggca 25 <210> 15 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 15 tgccttctta aacatcacga gactcctaaa acttcatttt taattt 46 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 16 cacgtgatga aatgctaggc ggctgtc 27 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 17 cacgtggagt ctcgtgatgt ttaagaaggc atg 33 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 18 gagaaaccct gcagggaatt ccccag 26 <210> 19 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 19 tggggaattc cctgcagggt ttctcctaaa acttcatttt taattt 46 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 20 cacgtgatga aatgctaggc ggctgtc 27 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 21 cccaagaacc caaggaaca 19 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 22 gatagaggaa gagcaaaac 19 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lenti TM probe <400> 23 aaccattagg agtagcaccc accaagg 27 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actine A primer <400> 24 cggtgaggat cttcatgagg tagt 24 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actine S primer <400> 25 aacaccccag ccatgtacgt 20 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humura ACT TM probe <400> 26 ccagccaggt ccagacgcag ga 22 <210> 27 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 gagaaaccct gcagggaatt ccccagctgt agttataaac agaagttctc cttctgctag 60 gtagcattca aagatcttaa tcttctgggt ttccgttttc tcgaatgaaa aatgcaggtc 120 cgagcagtta actggcgggg gcaccattag caagtcactt agcatctctg gggccagtct 180 gcaaagcgag ggggcagcct taatgtgcct ccagcctgaa gtcctagaat gagcgcccgg 240 tgtcccaagc tggggcgcgc accccagatc ggagggcgcc gatgtacaga cagcaaactc 300 acccagtcta gtgcatgcct tcttaaacat 330 <210> 28 <211> 1058 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 cttccaagat ctctgcccct ccccatcgcc atggtccact tcctcttctc actgttcctc 60 ttagaaaaga tctgtggact ccaccaccac gaaatggcgg caccttattt atggtcactt 120 tagagggtag gttttcttaa tgggtctgcc tgtcatgttt aacgtccttg gctgggtcca 180 aggcagatgc agtccaaact ctcactaaaa ttgccgagcc ctttgtcttc cagtgtctaa 240 aatattaatg tcaatggaat caggccagag tttgaattct agtctcttag cctttgtttc 300 ccctgtccat aaaatgaatg ggggtaattc tttcctccta cagtttattt atatattcac 360 taattcattc attcatccat ccattcgttc attcggttta ctgagtacct actatgtgcc 420 agcccctgtt ctagggtgga aactaagaga atgatgtacc tagagggcgc tggaagctct 480 aaagccctag cagttactgc ttttactatt agtggtcgtt tttttctccc ccccgccccc 540 cgacaaatca acagaacaaa gaaaattacc taaacagcaa ggacataggg aggaacttct 600 tggcacagaa ctttccaaac actttttcct gaagggatac aagaagcaag aaaggtactc 660 tttcactagg accttctctg agctgtcctc aggatgcttt tgggactatt tttcttaccc 720 agagaatgga gaaaccctgc agggaattcc caagctgtag ttataaacag aagttctcct 780 tctgctaggt agcattcaaa gatcttaatc ttctgggttt ccgttttctc gaatgaaaaa 840 tgcaggtccg agcagttaac tggctggggc accattagca agtcacttag catctctggg 900 gccagtctgc aaagcgaggg ggcagcctta atgtgcctcc agcctgaagt cctagaatga 960 gcgcccggtg tcccaagctg gggcgcgcac cccagatcgg agggcgccga tgtacagaca 1020 gcaaactcac ccagtctagt gcatgccttc ttaaacat 1058 <210> 29 <211> 322 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 tacacctcca ttcccagagc aagcttactc tctggcacca aactccatgg gatgattttt 60 cttctagaag agtccaggtg gacaggtaag gagtgggagt cagggagtcc agttccaggg 120 acagagatta cgggataaaa agtgaaagga gagggacggg gcccatgccg agggtttctc 180 ccttgtttct cagacagctc ttgggccaag actcagggag acattgagac agagcgcttg 240 gcacagaagc agaggggtca gggcgaagtc cagggcccca ggcgttggct ctcagggtct 300 caggccccga aggcggtgta tg 322 <210> 30 <211> 531 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 gagtcctgtt gtaatgcttt tggacacatt tatacattaa ggggccaaag tcacattttt 60 tacctattag attcctgatc attcaggggt taccaagatt ctgctaccca ctgtagttaa 120 taaacaaaga gcaaattggt ctctattctg tctcatgcac tcaggcacaa cttttccgga 180 ttaaaaacaa aaacaacaac aacaaaaatc tacacctcca ttcccagatc aagcttactc 240 tctggcacca aactccatgg ggtgattttt cttctagaag agtccaggtg gacaggtaag 300 gagtgggagt cagggagtcc agttcaggga cagagataat gggatgaaaa gtgaaaggag 360 agggacgggg cccatgccga gggtttctcc cttgtttctc agacagctcc tgggccaaga 420 ctcagggaga cattgagaca gagcgcttcg cacaggagca gaggggtcag ggcgaagtcc 480 cagggcccca ggcgtggctc tcagagtctc aggccccgaa ggcggtgtat g 531 <210> 31 <211> 352 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 aggtttaaag agaaaacccc tgtctctaca cctccattcc cagggcgagc tcactctctg 60 gcatcaagtt ccccgtgctc agtttcccta cacaagagtc caagaggaga ggtaaggagt 120 gggaggcagg gagtccagtt cagggacagg gattccagga cgagaagtga aggggaaggg 180 gctgggcgca gcctgggggt ctctccctgg tttccacaga cagatccttg tccaggactc 240 aggcagacag tgtgacaaag aggcttggtg taggagaaga gggatcagga cgaagtccca 300 ggtcccggac ggggctctca gggtctcagg ctccgagggc cgcgtctgca at 352 <210> 32 <211> 511 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 gagtttaatt gtaatgctgt tttgacacag gtcttttaca aattggaatt ctaatcattc 60 agggattacc aatattgtgc tacctactgt attaacaaac aaaaaggaaa ctggtctcta 120 tgagaatccc tatgcggtgc cttcagagaa aacttcacca ggtttaaaga gaaaacccct 180 gtctctacac ctccattccc agggcgagct cactctctgg catcaagttc cccgtgctca 240 gtttccctac acaagagtcc aagaggagag gtaaggagtg ggaggcaggg agtccagttc 300 agggacaggg attccaggac gagaagtgaa ggggaagggg ctgggcgcag cctgggggtc 360 tctccctggt ttccacagac agatccttgt ccaggactca ggcagacagt gtgacaaaga 420 ggcttggtgt aggagaagag ggatcaggac gaagtcccag gtcccggacg gggctctcag 480 ggtctcaggc tccgagggcc gcgtctgcaa t 511 <210> 33 <211> 328 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 actaatttct tttttcttgt tgcccaggct ggagggcaat ggcacgatct tggctcaccg 60 caacctcctc ctcctgggtt caagtgattc tcctgcctca gcctcccaag tagccaggat 120 tacagccatg cgccaccacg ccggctaatt ttttggactt ttagtagaga cagggtttct 180 ccatattggt cgggctggtc tcgaactccc aacctcaggt gatcagcccg ccttggcctc 240 ccaaagtgct gagattacag gcgtgagcca ccgcgcccag ccaggactaa tttctaagag 300 tgtgcagaga taccgaaacc taaaagtt 328 <210> 34 <211> 1047 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 ttttttcccc ctagacatct cactctgtcg cccaggctgg agtgcagtgg tgtgatctcg 60 gctcactgca accaccacct ctcgggttca agcaattctc ctatctcagc ctccagagtt 120 gctggaatta caggcgcgca ccaccacacc cggctaattt ttgtattgtt agtagagaca 180 gggtttcatc atgttggcca ggttagtctt gaactcctga cctcgtgatc tgcctgcctc 240 ggcctaccaa aatgctgcga ttacaggcgt gagccaccgt tcccggccta tacgttgttt 300 attttggaaa aattaaaaat taagtttttt ttcattaaag atatgttatt tccgatcaag 360 agatcaagac catcctggcc aacatggtga aaccccgtct ctactaaaaa cacaaaaatt 420 agctgggtgt ggtggcacac gcctgtagtt ccagttactg gggaggctga ggcaggagaa 480 tcgcttgaac ccgggagaag gaggttgcag tgagccgaga tcatgccact gcactccagc 540 ctggggacag agcaagactc tgactcaaaa aaaaaaaaag ttgtttctat taacatgtaa 600 tgggttatta atattctctt aaatgaatta atatttttaa tattttgttt taatatcttt 660 taatttatat atgataaaaa ttgatacaat ccacagaaac aaaatttatt tgggtcctca 720 ctaatttctt ttttcttgtt gcccaggctg gagggcaatg gcacgatctt ggctcaccgc 780 aacctcctcc tcctgggttc aagtgattct cctgcctcag cctcccaagt agccaggatt 840 acagccatgc gccaccacgc cggctaattt tttggacttt tagtagagac 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gatacaatgc cagccatccc aagctcttgg cctgagttgt tcatcttgaa gtctaggact 300 ccaagaagca tgaaagagct tctttagtga agctatgtcc tcagtactgc caaaattcag 360 acaatctcca tggcctgaca atttaccttc tatttgggta atttattgtc ccttacgcaa 420 actctccagc tgtcatggca cagacatatg atctgtattt agctctcact ttaggtgttt 480 ccattgattc tattctcact aatgtgcttc aggtatatcc ct 522 <210> 37 <211> 543 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 tacacctcca ttcccagagc aagcttactc tctggcacca aactccatgg gatgattttt 60 cttctagaag agtccaggtg gacaggtaag gagtgggagt cagggagtcc agttccaggg 120 acagagatta cgggataaaa agtgaaagga gagggacggg gcccatgccg agggtttctc 180 ccttgtttct cagacagctc ttgggccaag actcagggag acattgagac agagcgcttg 240 gcacagaagc agaggggtca gggcgaagtc cagggcccca ggcgttggct ctcagggtct 300 caggccccga aggcggtgta tggattgggg agtcccagcc ttggggattc cccaactccg 360 cagtttcttt tctccctctc ccaacctatg tagggtcctt cttcctggat actcacgacg 420 cggacccagt tctcactccc attgggtgtc gggtttccag agaagccaat cagtgtcgtc 480 gcggtcgcgg ttctaaagtc cgcacgcacc caccgggact cagattctcc ccagacgccg 540 agg 543 <210> 38 <211> 550 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 caggtttaaa gagaaaaccc ctgtctctac acctccattc ccagggcgag ctcactctct 60 ggcatcaagt tccccgtgct cagtttccct acacaagagt ccaagaggag aggtaaggag 120 tgggaggcag ggagtccagt tcagggacag ggattccagg acgagaagtg aaggggaagg 180 ggctgggcgc agcctggggg tctctccctg gtttccacag acagatcctt gtccaggact 240 caggcagaca gtgtgacaaa gaggcttggt gtaggagaag agggatcagg acgaagtccc 300 aggtcccgga cggggctctc agggtctcag gctccgaggg ccgcgtctgc aatggggagg 360 cgcagcgttg gggattcccc actcccctga gtttcacttc ttctcccaac ttgtgtcggg 420 tccttcttcc aggatactcg tgacgcgtcc ccacttccca ctcccattgg gtattggata 480 tctagagaag ccaatcagcg tcgccgcggt cccagttcta aagtccccac gcacccaccc 540 ggactcagag 550 <210> 39 <211> 533 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 actaatttct tttttcttgt tgcccaggct ggagggcaat ggcacgatct tggctcaccg 60 caacctcctc ctcctgggtt caagtgattc tcctgcctca gcctcccaag tagccaggat 120 tacagccatg cgccaccacg ccggctaatt ttttggactt ttagtagaga cagggtttct 180 ccatattggt cgggctggtc tcgaactccc aacctcaggt gatcagcccg ccttggcctc 240 ccaaagtgct gagattacag gcgtgagcca ccgcgcccag ccaggactaa tttctaagag 300 tgtgcagaga taccgaaacc taaaagttta agaactgctg attgctggga aactctgcag 360 tttcccgttc ctctcgtaac ctggtcatgt gtccttcttc ctggatactc atgacgcaga 420 ctcagttctc attcccaatg ggtgtcgggt ttctagagaa gccaatcagc gtcgccacga 480 ctcccgacta taaagtcccc atccggactc aagaagttct caggactcag agg 533 <210> 40 <211> 517 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 gagaaaccct gcagggaatt ccccagctgt agttataaac agaagttctc cttctgctag 60 gtagcattca aagatcttaa tcttctgggt ttccgttttc tcgaatgaaa aatgcaggtc 120 cgagcagtta actggcgggg gcaccattag caagtcactt agcatctctg gggccagtct 180 gcaaagcgag ggggcagcct taatgtgcct ccagcctgaa gtcctagaat gagcgcccgg 240 tgtcccaagc tggggcgcgc accccagatc ggagggcgcc gatgtacaga cagcaaactc 300 acccagtcta gtgcatgcct tcttaaacat cacgagactc taagaaaagg aaactgaaaa 360 cgggaaagtc cctctctcta acctggcact gcgtcgctgg cttggagaca ggtgacggtc 420 cctgcgggcc ttgtcctgat tggctgggca cgcgtttaat ataagtggag gcgtcgcgct 480 ggcgggcatt cctgaagctg acagcattcg ggccgag 517 <210> 41 <211> 655 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 atacagcctt tcatccttct ccagtgttga gagtgttgaa cctcagagtt tctcctctca 60 ttttctctaa atgagataca atgccagcca tcccaagctc ttggcctgag ttgatcatct 120 tgaagtctag gactccaaga agcatgaaag agcttcttta gtgaagctat gtcctcagta 180 ctgccaaaat tcagacaatc tccatggcct gacaatttac cttctatttg ggtaatttat 240 tgtcccttac gcaaactctc caactgtcat tgcacagaca tatgatctgt atttagctct 300 cactttaggt gtttccattg attctattct cactaatgtg cttcaggtat atccctgtct 360 agaagtcaga ttggggttaa agagtctgtc cgtgattgac taacagtctt aaatacttga 420 tttgttgttg ttgttgtcct gtttgtttaa gaactttact tctttatcca atgaacggag 480 tatcttgtgt cctggaccct ttgcaagaac ccttccccta gcaacagatg cgtcatctca 540 aaatattttt ctgattggcc aaagagtaat tgatttgcat tttaatggtc agactctatt 600 acaccccaca ttctcttttc ttttattctt gtctgttctg cctcactccc gagct 655 <210> 42 <211> 752 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 gagtcctgtt gtaatgcttt tggacacatt tatacattaa ggggccaaag tcacattttt 60 tacctattag attcctgatc attcaggggt taccaagatt ctgctaccca ctgtagttaa 120 taaacaaaga gcaaattggt ctctattctg tctcatgcac tcaggcacaa cttttccgga 180 ttaaaaacaa aaacaacaac aacaaaaatc tacacctcca ttcccagatc aagcttactc 240 tctggcacca aactccatgg ggtgattttt cttctagaag agtccaggtg gacaggtaag 300 gagtgggagt cagggagtcc agttcaggga cagagataat gggatgaaaa gtgaaaggag 360 agggacgggg cccatgccga gggtttctcc cttgtttctc agacagctcc tgggccaaga 420 ctcagggaga cattgagaca gagcgcttcg cacaggagca gaggggtcag ggcgaagtcc 480 cagggcccca ggcgtggctc tcagagtctc aggccccgaa ggcggtgtat ggattgggga 540 gtcccagcct tggggattcc ccaactccgc agtttctttt ctccctctcc caacctatgt 600 agggtccttc ttcctggata ctcacgacgc ggacccagtt ctcactccca ttgggtgtcg 660 ggtttccaga gaagccaatc agtgtcgtcg cggtcgcggt tctaaagtcc gcacgcaccc 720 accgggactc agattctccc cagacgccga gg 752 <210> 43 <211> 707 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 gagtttaatt gtaatgctgt tttgacacag gtcttttaca aattggaatt ctaatcattc 60 agggattacc aatattgtgc tacctactgt attaacaaac aaaaaggaaa ctggtctcta 120 tgagaatccc tatgcggtgc cttcagagaa aacttcacca ggtttaaaga gaaaacccct 180 gtctctacac ctccattccc agggcgagct cactctctgg catcaagttc cccgtgctca 240 gtttccctac acaagagtcc aagaggagag gtaaggagtg ggaggcaggg agtccagttc 300 agggacaggg attccaggac gagaagtgaa ggggaagggg ctgggcgcag cctgggggtc 360 tctccctggt ttccacagac agatccttgt ccaggactca ggcagacagt gtgacaaaga 420 ggcttggtgt aggagaagag ggatcaggac gaagtcccag gtcccggacg gggctctcag 480 ggtctcaggc tccgagggcc gcgtctgcaa tggggaggcg cacgttgggg attccccact 540 cccctgagtt tcacttcttc tcccaacttg tgtcgggtcc ttcttccagg atactcgtga 600 cgcgtcccca cttcccactc ccattgggta ttggatatct agagaagcca atcagcgtcg 660 ccgcggtccc agttctaaag tccccacgca cccacccgga ctcagag 707 <210> 44 <211> 1248 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 ttttttcccc ctagacatct cactctgtcg cccaggctgg agtgcagtgg tgtgatctcg 60 gctcactgca accaccacct ctcgggttca agcaattctc ctatctcagc ctccagagtt 120 gctggaatta caggcgcgca ccaccacacc cggctaattt ttgtattgtt agtagagaca 180 gggtttcatc atgttggcca ggttagtctt gaactcctga cctcgtgatc tgcctgcctc 240 ggcctaccaa aatgctgcga ttacaggcgt gagccaccgt tcccggccta tacgttgttt 300 attttggaaa aattaaaaat taagtttttt ttcattaaag atatgttatt tccgatcaag 360 agatcaagac catcctggcc aacatggtga aaccccgtct ctactaaaaa cacaaaaatt 420 agctgggtgt ggtggcacac gcctgtagtt ccagttactg gggaggctga ggcaggagaa 480 tcgcttgaac ccgggagaag gaggttgcag tgagccgaga tcatgccact gcactccagc 540 ctggggacag agcaagactc tgactcaaaa aaaaaaaaag ttgtttctat taacatgtaa 600 tgggttatta atattctctt aaatgaatta atatttttaa tattttgttt taatatcttt 660 taatttatat atgataaaaa ttgatacaat ccacagaaac aaaatttatt tgggtcctca 720 ctaatttctt ttttcttgtt gcccaggctg gagggcaatg gcacgatctt ggctcaccgc 780 aacctcctcc tcctgggttc aagtgattct cctgcctcag cctcccaagt agccaggatt 840 acagccatgc gccaccacgc cggctaattt tttggacttt tagtagagac agggtttctc 900 catattggtc gggctggtct cgaactccca acctcaggtg atcagcccgc cttggcctcc 960 caaagtgctg agattacagg cgtgagccac cgcgcccagc caggactaat ttctaagagt 1020 gtgcagagat accgaaacct aaaagtttaa gaactgctga ttgctgggaa actctgcagt 1080 ttcccgttcc tctcgtaacc tggtcatgtg tccttcttcc tggatactca tgacgcagac 1140 tcagttctca ttcccaatgg gtgtcgggtt tctagagaag ccaatcagcg tcgccacgac 1200 tcccgactat aaagtcccca tccggactca agaagttctc aggactca 1248 <210> 45 <211> 1245 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 cttccaagat ctctgcccct ccccatcgcc atggtccact tcctcttctc actgttcctc 60 ttagaaaaga tctgtggact ccaccaccac gaaatggcgg caccttattt atggtcactt 120 tagagggtag gttttcttaa tgggtctgcc tgtcatgttt aacgtccttg gctgggtcca 180 aggcagatgc agtccaaact ctcactaaaa ttgccgagcc ctttgtcttc cagtgtctaa 240 aatattaatg tcaatggaat caggccagag tttgaattct agtctcttag cctttgtttc 300 ccctgtccat aaaatgaatg ggggtaattc tttcctccta cagtttattt atatattcac 360 taattcattc attcatccat ccattcgttc attcggttta ctgagtacct actatgtgcc 420 agcccctgtt ctagggtgga aactaagaga atgatgtacc tagagggcgc tggaagctct 480 aaagccctag cagttactgc ttttactatt agtggtcgtt tttttctccc ccccgccccc 540 cgacaaatca acagaacaaa gaaaattacc taaacagcaa ggacataggg aggaacttct 600 tggcacagaa ctttccaaac actttttcct gaagggatac aagaagcaag aaaggtactc 660 tttcactagg accttctctg agctgtcctc aggatgcttt tgggactatt tttcttaccc 720 agagaatgga gaaaccctgc agggaattcc caagctgtag ttataaacag aagttctcct 780 tctgctaggt agcattcaaa gatcttaatc ttctgggttt ccgttttctc gaatgaaaaa 840 tgcaggtccg agcagttaac tggctggggc accattagca agtcacttag catctctggg 900 gccagtctgc aaagcgaggg ggcagcctta atgtgcctcc agcctgaagt cctagaatga 960 gcgcccggtg tcccaagctg gggcgcgcac cccagatcgg agggcgccga tgtacagaca 1020 gcaaactcac ccagtctagt gcatgccttc ttaaacatca cgagactcta agaaaaggaa 1080 actgaaaacg ggaaagtccc tctctctaac ctggcactgc gtcgctggct tggagacagg 1140 tgacggtccc tgcgggcctt gtcctgattg gctgggcacg cgtttaatat aagtggaggc 1200 gtcgcgctgg cgggcattcc tgaagctgac agcattcggg ccgag 1245 <210> 46 <211> 822 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 46 taggctttgc ccattatact ctctcatatt cattgacctg aatcctcaaa tgaggtgtgt 60 ccattagtca actccaatct cttgtcatat ataagatggt agagatgaga agaaggtagc 120 tcctttacag cccactattt ccactaacta ctacctgtgt ttcaagatac agcctttcat 180 ccttctccag tgttgagagt gttgaacctc agagtttctc ctctcatttt ctctaaatga 240 gatacaatgc cagccatccc aagctcttgg cctgagttgt tcatcttgaa gtctaggact 300 ccaagaagca tgaaagagct tctttagtga agctatgtcc tcagtactgc caaaattcag 360 acaatctcca tggcctgaca atttaccttc tatttgggta atttattgtc ccttacgcaa 420 actctccagc tgtcatggca cagacatatg atctgtattt agctctcact ttaggtgttt 480 ccattgattc tattctcact aatgtgcttc aggtatatcc ctgtctagaa gtcagattgg 540 ggttaaagag tctgtccgtg attgactaac agtcttaaat acttgatttg ttgttgttgt 600 tgtcctgttt gtttaagaac tttacttctt tatccaatga acggagtatc ttgtgtcctg 660 gaccctttgc aagaaccctt cccctagcaa cagatgcgtc atctcaaaat atttttctga 720 ttggccaaag agtaattgat ttgcatttta atggtcagac tctattacac cccacattct 780 cttttctttt attcttgtct gttctgcctc actcccgagc tc 822

Claims (30)

1. 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector) 내로 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린(microglobulin) 업스트림 프로모터(upstream promoter) 서열의 300개-1100개 뉴클레오티드들을 삽입하는 단계를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위한 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터 내로 MHC 클래스 I 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열의 300개-600개의 뉴클레오티드들을 삽입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터 내로 MHC 클래스 I 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열의 300개-400개의 뉴클레오티드들을 삽입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 업스트림 프로모터 서열은 MHC 클래스 I 또는 β2 마이크로글로불린 프로모터의 업스트립으로 삽입되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 업스트림 프로모터 서열은 상기 MHC 클래스 I 또는 β2 마이크로글로불린 프로모터와 동일한 배향으로 삽입되는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 업스트림 프로모터 서열은 MHC 클래스 I 업스트림 프로모터 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 업스트림 프로모터 서열은 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 업스트림 프로모터 서열은 SEQ ID NO：1 또는 SEQ ID NO：27의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 MHC 클래스 I 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 β2 마이크로글로불린 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
11. MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열의 300개-1100개의 뉴클레오티드들을 포함하는 렌티바이러스 벡터.
12. 제 11 항에 있어서, MHC 클래스 I 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열의 300개-600개의 뉴클레오티드들을 포함하는 것을 특징으로 하는 렌티바이러스 벡터.
13. 제 11 항에 있어서, MHC 클래스 I 또는 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열의 300개-400개의 뉴클레오티드들을 포함하는 것을 특징으로 하는 렌티바이러스 벡터.
14. 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 업스트림 프로모터 서열은 MHC 클래스 I 또는 β2 마이크로글로불린 프로모터의 업스트림인 것을 특징으로 하는 렌티바이러스 벡터.
15. 제 14 항에 있어서, 상기 업스트림 프로모터 서열은 상기 MHC 클래스 I 또는 β2 마이크로글로불린 프로모터과 동일한 배향인 것을 특징으로 하는 렌티바이러스 벡터.
16. 제 11 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 업스트림 프로모터 서열은 MHC 클래스 I 업스트림 프로모터 서열인 것을 특징으로 하는 렌티바이러스 벡터.
17. 제 11 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 업스트림 프로모터 서열은 β2 마이크로글로불린 업스트림 프로모터 서열인 것을 특징으로 하는 렌티바이러스 벡터.
18. 제 17 항에 있어서, 상기 업스트림 프로모터 서열은 SEQ ID NO：1 또는 SEQ ID NO：27의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 렌티바이러스 벡터.
19. 제 11 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터 MHC 클래스 I 프로모터인 것을 특징으로 하는 렌티바이러스 벡터.
20. 제 11 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터 β2 마이크로글로불린 프로모터인 것을 특징으로 하는 렌티바이러스 벡터.
21. 제 19 항에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 프로모터는 HLA-A2 프로모터인 것을 특징으로 하는 렌티바이러스 벡터.
22. 제 19 항에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 프로모터는 HLA-B7 프로모터인 것을 특징으로 하는 렌티바이러스 벡터.
23. 제 19 항에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 프로모터는 HLA-E 프로모터인 것을 특징으로 하는 렌티바이러스 벡터.
24. 제 19 항에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 프로모터는 HLA-E 프로모터인 것을 특징으로 하는 렌티바이러스 벡터.
25. 제 11 항 내지 제 16 항 또는 제 19 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 업스트림 프로모터 서열은 HLA-E 업스트림 프로모터 서열인 것을 특징으로 하는 렌티바이러스 벡터.
26. 제 11 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 cPPT/CTS 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 렌티바이러스 벡터.
27. 제 11 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 Ψ(프사이) 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 렌티바이러스 벡터.
28. 제 11 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 따른 렌티바이러스 백터를 포함하는 분리된 숙주 세포(isolated host cell).
29. 약제 또는 백신으로 사용을 위한 제 17 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 따른 렌티바이러스 벡터.
30. 제 1 항 내지 제 6 항, 제 9 항 내지 제 16 항 또는 제 19 항 내지 제 29 항의 어느 한 항의 렌티바이러스 벡터 또는 숙주 세포를 생산하는 방법에 있어서, 상기 업스트림 프로모터 서열은 SEQ ID NO：2, SEQ ID NO：3, SEQ ID NO：4, SEQ ID NO：5, SEQ ID NO：6, SEQ ID NO：7, SEQ ID NO：27, SEQ ID NO：28, SEQ ID NO：29, SEQ ID NO：30, SEQ ID NO：31, SEQ ID NO：32, SEQ ID NO：33, SEQ ID NO：34, SEQ ID NO：35, 또는 SEQ ID NO：36의 임의의 것의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

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