KR20230037586A - Mapt 유전자를 표적으로 하는 알츠하이머병의 치료 방법 - Google Patents

Mapt 유전자를 표적으로 하는 알츠하이머병의 치료 방법 Download PDF

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이언 로버트 톰슨
데쓰야 야마가타
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Abstract

이하의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 알츠하이머병을 포함하는 타우병증을 치료 또는 예방하기 위해 유용할 것으로 기대된다: (a) 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질과 전사 리프레서의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열, 및 (b) 인간 MAPT 유전자의 발현 조절 영역에 있어서 서열 번호: 54, 55, 56, 57, 68, 153 또는 97에 기재된 영역 중의 18 내지 24뉴클레오티드 길이의 연속 영역을 표적으로 하는 가이드 RNA를 코딩하는 염기 서열.

Description

MAPT 유전자를 표적으로 하는 알츠하이머병의 치료 방법
본 발명은, 인간 미소관 관련 단백질 타우(microtuble-associated protein tau; MAPT) 유전자를 표적으로 하는 알츠하이머병의 치료 방법 등에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은, 인간 MAPT 유전자의 특정의 서열을 표적으로 하는 가이드 RNA와 전사 저해제 및 CRISPR 이펙터 단백질의 융합 단백질을 이용하여, 인간 MAPT 유전자의 발현을 억제하는 것에 의해, 알츠하이머병을 치료 또는 예방하기 위한 방법 및 약제 등에 관한 것이다.
타우 단백질은, 주로 신경계에서 발현하는 미소관 결합 단백질이다. 그것은 튜뷸린의 중합을 촉진하고, 미소관을 안정화시켜, 신경 축삭의 구축 및 유지에 기여한다. 타우 단백질은, 인간에 있어서의 염색체 17 상에 위치하는 MAPT라고 명명된 단일 유전자의 산물이며, 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 인간의 뇌에서 6종류의 아이소폼이 발현된다. 이들 아이소폼 모두는, 과도하게 인산화되었을 때에 미소관 및 자기 응집체에 대한 결합능을 상실함이 알려져 있다. 타우 단백질의 자체 조직화는, 알츠하이머병(이하, AD라고 칭한다), 및 염색체 관련 파킨슨병을 갖는 전두측두엽치매(이하, FTDP-17이라고 부른다) 등의 병태에 수반된다. 인산화 타우의 응집체는, 뇌 내의 신경 세포에서 생성되어 많은 신경퇴행성 질환에 일조한다.
따라서, 타우의 응집 및 세포내 축적을 동반하고 질환의 발병에 타우 응집 과정이 관련된다고 생각되는 신경퇴행성 질환은, 타우병증(Tauopathy)이라 불린다.
AD를 치료하기 위해서 다수의 치료 전략이 제안되어 있고(비특허문헌 1), 이들 전략 중 하나로서 유전자 치료 접근법이 주목받고 있다.
MAPT를 표적으로 하는 유전자 치료로서, 예를 들어, WO 2018/102665 A1에는, MAPT 유전자 중의 12개 이상의 뉴클레오티드의 표적 부위에 결합하는 DNA 결합 도메인; 및 전사 조절 도메인 또는 뉴클레아제 도메인을 포함하는, MAPT 유전자의 유전자 조절 인자를 지향하는 발명이 개시되어 있다.
한편, 근년에는, 유전자의 DNA 서열을 절출하지 않고서 가이드 RNA를 이용하는 것에 의한 유전자에의 단백질의 표적화를 통해 표적 유전자의 발현을 제어하는, 실활된 뉴클레아제 활성을 갖는 Cas9(dCas9)와 전사 활성화 도메인 또는 전사 억제 도메인의 조합을 이용한 시스템이 개발되고 있고(참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 원용되는 특허문헌 1), 그 임상적인 응용이 기대되고 있다(참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 원용되는 비특허문헌 2). 그렇지만, dCas9, 가이드 RNA 및 공전사 리프레서의 복합체를 코딩하는 서열이, 인비보(in vivo)에 있어서의 유전자 송달의 가장 유망한 방법을 대표하는 가장 일반적인 바이러스 벡터(예를 들어, AAV)의 용량(capacity)을 초과한다고 하는 점에서 문제가 존재한다(참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 원용되는 비특허문헌 3).
WO 2013/176772
Ballard C. et al., Lancet 2011; 377:1019-31 Dominguez A. et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 2016 Jan; 17(1): 5-15 Liao H. et al., Cell. 2017 Dec 14; 171(7): 1495-507
따라서, 본 발명의 하나의 목적은, 타우병증(특히, AD)에 대한 신규한 치료적 접근법을 제공하는 것이다.
이것 및 이하의 상세한 설명 중에 명확해질 그 외의 목적은, 인간 MAPT 유전자의 특정의 서열을 표적으로 하는 가이드 RNA, 및 전사 리프레서와 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질의 융합 단백질을 이용하는 것에 의해, 인간 MAPT 유전자(유전자 ID: 4137)의 발현이 강력히 억제될 수 있다는 본 발명자들의 지견에 의해 달성되었다.
본 발명자들은, 컴팩트한 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질 및 컴팩트한 전사 억제제를 이용하는, 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열 및 가이드 RNA를 코딩하는 염기 서열을 담지하는 단일 AAV 벡터에 의해, 인간 MAPT 유전자의 발현을 강력하게 억제할 수 있음을 발견했다.
따라서, 본 발명은, 이하를 제공한다:
[1] 이하의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드:
(a) 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질과 전사 리프레서의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열, 및
(b) 인간 MAPT 유전자의 발현 조절 영역에 있어서 서열 번호: 54, 55, 56, 57, 68, 153 또는 97에 기재된 영역 중의 18 내지 24뉴클레오티드 길이의 연속 영역을 표적으로 하는 가이드 RNA를 코딩하는 염기 서열.
[2] 가이드 RNA를 코딩하는 염기 서열이, 서열 번호: 54, 55, 56, 57, 68, 153 또는 97에 기재된 염기 서열, 또는 서열 번호: 54, 55, 56, 57, 68, 153 또는 97에 기재된 염기 서열에 있어서 1 내지 3염기가 결실, 치환, 삽입, 및/또는 부가되어 있는 염기 서열을 포함하는, [1]의 폴리뉴클레오티드.
[3] 가이드 RNA를 코딩하는 적어도 2개의 상이한 염기 서열을 포함하는, [1] 또는 [2]의 폴리뉴클레오티드.
[4] 전사 리프레서가, KRAB, MeCP2, SIN3A, HDT1, MBD2B, NIPP1, 및 HP1A의 군으로부터 선택되는, [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드.
[5] 전사 리프레서가 KRAB인, [4]의 폴리뉴클레오티드.
[6] 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질이 dCas9인, [1] 내지 [5] 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드.
[7] dCas9가 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus) 유래인, [6]의 폴리뉴클레오티드.
[8] 가이드 RNA를 코딩하는 염기 서열에 대한 프로모터 서열 및/또는 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질과 전사 리프레서의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열에 대한 프로모터 서열을 추가로 포함하는, [1] 내지 [7] 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드.
[9] 가이드 RNA를 코딩하는 염기 서열에 대한 프로모터 서열이, U6 프로모터, SNR6 프로모터, SNR52 프로모터, SCR1 프로모터, RPR1 프로모터, U3 프로모터, 및 H1 프로모터의 군으로부터 선택되는, [8]의 폴리뉴클레오티드.
[10] 가이드 RNA를 코딩하는 염기 서열에 대한 프로모터 서열이 U6 프로모터인, [9]의 폴리뉴클레오티드.
[11] 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질과 전사 리프레서의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열에 대한 프로모터 서열이 유비쿼터스 프로모터 또는 뉴런 특이적 프로모터인, [8] 내지 [10] 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드.
[12] 유비쿼터스 프로모터가, EFS 프로모터, CMV 프로모터, 및 CAG 프로모터의 군으로부터 선택되는, [11]의 폴리뉴클레오티드.
[13] [1] 내지 [12] 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
[14] 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터인, [13]의 벡터.
[15] 바이러스 벡터가, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 렌티바이러스 벡터의 군으로부터 선택되는, [14]의 벡터.
[16] AAV 벡터가, AAV1, AV2, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, Anc80, AAV587MTP, AAV588MTP, AAV-B1, AAVM41, 및 AAVrh74의 군으로부터 선택되는, [15]의 벡터.
[17] AAV 벡터가, AAV9인, [16]의 벡터.
[18] [1] 내지 [12] 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드, 또는 [13] 내지 [17] 중 어느 하나의 벡터를 포함하는 의약 조성물.
[19] 알츠하이머병을 치료 또는 예방하기 위한, [18]의 의약 조성물.
[20] [1] 내지 [12] 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드, 또는 [13] 내지 [17] 중 어느 하나의 벡터를, 그것을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 알츠하이머병의 치료 또는 예방 방법.
본 발명에 따르면, 인간 MAPT 유전자의 발현을 억제할 수 있고, 그 결과로서, 본 발명은 AD를 포함하는 타우병증을 치료할 수 있을 것이 기대된다.
본 발명의 보다 완전한 이해 및 그에 부수하는 많은 이점은, 첨부된 도면과 아울러 고려하는 경우에 이하의 상세한 설명을 참조하는 것에 의해 보다 잘 이해되게 되기 때문에, 용이하게 얻을 수 있을 것이다.
[도 1] 도 1은, 'UCSC Genome Browser on Human Dec. 2013 (GRCh38/hg38) Assembly; chromosome 17: 45,887,381- 45,962,898'에 대한 상대적인 sa sgRNA 위치를 나타낸다.
[도 2] 도 2는, 도 1에서 정의된 영역 내에서, 염색체 17: 45,887,381-4,962,898(UCSC Genome Browser on Human Dec. 2013 (GRCh38/hg38) Assembly) 사이의 MAPT mRNA 레벨을 저하시키기 위한 sa sgRNA의 평가 결과를 나타낸다.
[도 3] 도 3은, 도 1에서 정의된 영역 내에서, 염색체 17: 45,887,381-45,962,898(UCSC Genome Browser on Human Dec. 2013 (GRCh38/hg38) Assembly) 사이의 MAPT mRNA 레벨을 저하시키기 위한 sa sgRNA 유효성을 평가한 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명의 실시형태에 대해 상세히 설명한다.
1. 폴리뉴클레오티드
본 발명은, 이하의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드(본 명세서에서 이하, "본 발명의 폴리뉴클레오티드"라고도 한다)를 제공한다:
(a) 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질과 전사 리프레서의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열, 및
(b) 인간 MAPT 유전자의 발현 조절 영역에 있어서 서열 번호: 54, 55, 56, 57, 68 또는 153, 또는 97에 기재된 영역 중의 18 내지 24뉴클레오티드 길이의 연속 영역(즉, 18 내지 24 연속 뉴클레오티드)을 표적으로 하는 가이드 RNA를 코딩하는 염기 서열. 서열 번호: 97에 기재된 영역(CAGCTCCGGCACCAACAGCAGCGCCGCTGCCACCGCCCACCTTCTGCCGCCGCCACCACAGCCACCTTCTCCTCCTCCGCTGTCCTCTCCCGTCCTCGCCTCTGTCGACTATCAGGTAAGCGCCGCGGCTCCGAAATCTGCCTCGCCGTCCGCCTCTGTGCACCCCTGCGCCGCCGCCCCTCGCCCTCCCTCTCCGCAGACTGGGGCTTCGTGCGCCGGGCATCGGTCGGGGCCACCGCAGGGCCCCTCCCTGCCTCCCCTGCTCGGGGGCTGGGGCCAGGGCGGCCTGGAAAGGGACCTGAGCAAGGGATGCACGCACGC)은, 서열 번호: 54, 55, 56 및 57에 기재된 영역을 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 소망의 세포에 도입되고 전사되어, 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질과 전사 리프레서의 융합 단백질, 및 인간 MAPT 유전자의 발현 조절 영역의 특정의 영역을 표적으로 하는 가이드 RNA를 산생한다. 이들 융합 단백질 및 가이드 RNA는, 복합체(이하, "리보뉴클레오프로틴(ribonucleoprotein); RNP"라고 칭하는 경우도 있다)를 형성하고, 상기 특정의 영역 상에서 협력적으로 작용함으로써, 인간 MAPT 유전자의 전사를 억제한다. 본 발명의 일 실시형태에 있어서, 인간 MAPT 유전자의 발현은, 예를 들어, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 억제될 수 있다.
(1) 정의
본 명세서에 있어서, "인간 미소관 관련 단백질 타우(MAPT) 유전자의 발현 조절 영역"이란, RNP를 그 영역에 결합시키는 것에 의해 인간 MAPT 유전자의 발현을 억제할 수 있는 임의의 영역을 의미한다. 즉, 인간 MAPT 유전자의 발현 조절 영역은, 인간 MAPT 유전자의 발현이 RNP의 결합에 의해 억제되는 한, 인간 MAPT 유전자의 프로모터 영역, 인핸서 영역, 인트론, 엑손 등의 임의의 영역에 존재해도 된다. 본 명세서에 있어서, 발현 조절 영역이 특정의 서열에 의해 나타나는 경우, 발현 조절 영역은, 센스쇄 서열 및 안티센스쇄 서열의 양쪽을 개념적으로 포함한다.
본 발명에 있어서, 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질과 전사 리프레서의 융합 단백질은, 가이드 RNA에 의해, 인간 MAPT 유전자의 발현 조절 영역의 특정의 영역에 리크루트된다. 본 명세서에 있어서, "...을 표적으로 하는 가이드 RNA"란, "융합 단백질을 ...에 리크루트하는 가이드 RNA"를 의미한다.
본 명세서에서는, "가이드 RNA('gRNA'라고도 칭한다)"는, 게놈 특이적 CRISPR-RNA를 포함하는 RNA("crRNA"라고도 칭한다)이다. crRNA는, 표적 서열의 상보적 서열에 결합하는 RNA이다(후술). Cpf1을 CRISPR 이펙터 단백질로서 이용할 경우, "가이드 RNA"는, crRNA로 이루어지는 RNA 및 그 5'말단에 부착된 특정의 서열(예를 들어, FnCpf 1의 경우, 서열 번호: 101에 기재된 RNA 서열)을 포함하는 RNA를 지칭한다. Cas9를 CRISPR 이펙터 단백질로서 이용할 경우, "가이드 RNA"는, crRNA 및 그 3'말단에 부착된 트랜스-활성화 crRNA("tracrRNA"라고 칭한다)를 포함하는 키메라 RNA(이하, "싱글 가이드 RNA(sgRNA)"라고 칭한다)를 지칭한다(예를 들어, 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 원용되는 Zhang F. et al., Hum Mol Genet. 2014 Sep 15; 23(R1): R40-6 및 Zetsche B. et al., Cell. 2015 Oct 22; 163(3): 759-71을 참조할 것).
본 명세서에서는, 인간 MAPT 유전자의 발현 조절 영역에 있어서 crRNA가 결합하고 있는 서열과 상보적인 서열을, "표적화 서열"이라고 칭한다. 즉, 본 명세서에 있어서, "표적화 서열"은, 인간 MAPT 유전자의 발현 조절 영역 중에 존재하고, PAM(protospacer adjacent motif)에 인접하는 DNA 서열이다. PAM은, Cpf1을 CRISPR 이펙터 단백질로서 이용할 경우, 표적화 서열의 5'측에 인접한다. PAM은, Cas9를 CRISPR 이펙터 단백질로서 이용할 경우, 표적 서열의 3'측에 인접한다. 표적화 서열은, 인간 MAPT 유전자의 발현 조절 영역의 센스쇄 서열측 또는 안티센스쇄 서열측의 어느 쪽에 존재해도 된다(예를 들어, 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 원용되는 전술한 Zhang F. et al., Hum Mol Genet 2014 Sep 15; 23(R1): R40-6 및 Zetsche B. et al., Cell. 2015 Oct 22; 163(3): 759-71을 참조할 것).
(2) 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질
본 발명에서는, 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질을 이용하여, 거기에 융합된 전사 리프레서를 인간 MAPT 유전자의 발현 조절 영역에 리크루트한다. 본 발명에서 이용하는 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질(이하, 간단히 "CRISPR 이펙터 단백질"이라고도 칭한다)은, gRNA와 복합체를 형성하여, 인간 MAPT 유전자의 발현 조절 영역에 리크루트되는 것인 한, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 뉴클레아제 결손 Cas9(이하, "dCas9"라고도 칭하는 경우가 있다) 또는 뉴클레아제 결손 Cpf1(이하, "dCpf1"이라고도 칭하는 경우가 있다)을 들 수 있다.
상기 dCas9로서는, 예를 들어, 화농성 연쇄상구균(Streptococcus pyogenes) 유래 Cas9(SpCas9; PAM 서열: NGG(N은, G, T 또는 C이다. 이하 동일)), 스트렙토코커스 서모필러스(Streptococcus thermophilus) 유래 Cas9(StCas9; PAM 서열: NNAGAAW(W는, A 또는 T이다. 이하 동일)), 수막염균(Neisseria meningitidis) 유래 Cas9(NmCas9; PAM 서열: NNNNGATT), 또는 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus) 유래 Cas9(SaCas9; PAM 서열: NNGRRT(R은, A 또는 G이다. 이하 동일) 등의 뉴클레아제 결손 배리언트를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다(예를 들어, 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 원용되는 Nishasu et al., Cell. 2014 Feb 27; 156(5): 935-49, Evert KM et al., Nat Methods. 2013 Nov; 10(11): 1116-21, Zhang Y. Mol Cell. 2015 Oct 15; 60(2):242-55; Friedland AE et al., Genome Biol. 2015 Nov 24; 16:257을 참조할 것). 예를 들어, SpCas9의 경우에는, 10번째의 Asp 잔기가 Ala 잔기로 전환되고 840번째의 His 잔기가 Ala 잔기로 전환된 이중 변이체(경우에 따라서는, "dSpCas9"라고도 칭한다)를 이용할 수 있다(예를 들어, 전술한 Nishasu et al., Cell. 2014를 참조할 것). 혹은, SaCas9의 경우, 10번째의 Asp 잔기가 Ala 잔기로 전환되고 580번째의 Asn 잔기가 Ala 잔기로 전환된 이중 변이체(서열 번호: 102), 또는 10번째의 Asp 잔기가 Ala 잔기로 전환되고 557번째의 His 잔기가 Ala 잔기로 전환된 이중 변이체(서열 번호: 103)(이하, 이들 이중 변이체의 어느 것을 "dSaCas9"라고 칭하는 경우가 있다)를 이용할 수 있다(예를 들어, 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 원용되는 전술한 Friedland AE et al., Genome Biol. 2015를 참조할 것).
더욱이, 본 발명의 일 실시형태에 있어서, dCas9로서, 전술한 dCas9의 아미노산 서열의 일부를 개변하는 것에 의해 얻어지고, gRNA와 복합체를 형성하여 인간 MAPT 유전자의 발현 조절 영역에 리크루트되는 배리언트를 이용해도 된다. 그와 같은 배리언트의 예로서, 부분적으로 삭제된 아미노산 서열을 갖는 절단형(truncated) 배리언트를 들 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에 있어서, dCas9로서, 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 원용되는 WO 2019/235627 및 WO 2020/085441에 개시된 배리언트를 이용할 수 있다. 구체적으로는, 10번째 Asp 잔기가 Ala 잔기로 전환되고 580번째의 Asn 잔기가 Ala 잔기로 전환된 이중 변이체인 dSaCas9(서열 번호: 104)로부터 721번째 내지 745번째의 아미노산을 결실시키는 것에 의해 얻은 dSaCas9, 또는 결실된 부분이 펩티드 링커로 치환된 dSaCas9(예를 들어, 결실된 부분이 GGSGGS 링커(서열 번호: 105)에 의해 치환된 것이 서열 번호: 106에 기재되어 있고, 결실된 부분이 SGGGS 링커(서열 번호: 107)에 의해 치환된 것이 서열 번호: 108 등에 기재되어 있다)(이하, 이들 이중 변이체 모두, "dSaCas9[-25]"라고 칭하는 경우가 있다), 또는 상기 이중 변이체(서열 번호: 109)인 dSaCas9로부터 482번째 내지 648번째 아미노산을 결실시키는 것에 의해 얻은 dSaCas9, 또는 결실된 부분이 펩티드 링커로 치환된 dSaCas9(결실된 부분이 GGSGGS 링커로 치환된 것이 서열 번호: 110에 기재되어 있다)를 이용해도 된다.
전술한 dCpf1의 예로서는, 한정되는 것은 아니지만, 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) 유래의 Cpf1(FnCpf1; PAM 서열: NTT), 아시다미노코커스(Acidaminococcus) sp. 유래의 Cpf1(AsCpf1; PAM 서열: NTTT), 또는 라크노스피아세아이 박테리움(Lachnospiaceae baterium) 유래의 Cpf1(LbCpf 1; PAM 서열: NTTT) 등(예를 들어, 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 원용되는 Zetsche B. et al., Cell. 2015 Oct 22; 163(3): 759-71, Yamano T. et al., Cell. 2016-5; 165(4): 949-62; Yamano T. et al., Mol Cell 2017Aug 17; 67(4): 633-45를 참조할 것) 등을 들 수 있다. 예를 들어, FnCpf1의 경우, 917번째의 Asp 잔기가 Ala 잔기로 전환되고 1006번째의 Glu 잔기가 Ala 잔기로 전환된 이중 변이체를 이용할 수 있다(예를 들어, 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 원용되는 상기 Zetsche B. et al., Cell. 2015를 참조할 것). 본 발명의 일 실시형태에 있어서, dCpf1로서, gRNA와 복합체를 형성하여, 인간 MAPT 유전자의 발현 조절 영역에 리크루트되는 상기 dCpf1의 아미노산 서열의 일부를 개변하는 것에 의해 얻은 배리언트를 이용해도 된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, dCas9는, 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질로서 사용된다. 일 실시형태에 있어서, dCas9는 dSaCas9이며, 특정의 실시형태에 있어서, dSaCas9는 dSaCas9[-25]이다.
CRISPR 이펙터 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 그 cDNA 서열 정보에 기초하여 단백질의 소망의 부분을 코딩하는 영역을 커버하는 올리고DNA 프라이머를 합성하고, 주형으로서 단백질을 산생하는 세포로부터 조제된 전체 RNA 또는 mRNA 분획을 사용하는 PCT법에 의해 폴리뉴클레오타이드를 증폭하는 것에 의해 클로닝할 수 있다. 더욱이, 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 클로닝된 CRISPR 이펙터 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에, 공지된 부위-지향적 변이 유발법에 의해 변이를 도입하여, 다른 아미노산으로의 DNA 절출 활성에 중요한 부위에서 아미노산 잔기(예를 들어, SaCas9의 경우는 10번째의 Asp 잔기, 557번째의 His 잔기, 및 580번째의 Asn 잔기; FnCpf1의 경우는 917번째의 Asp 잔기 및 1006번째의 Glu 잔기 등을 들 수 있으나, 이들로 한정되지 않는다)를 변환하는 것에 의해 얻을 수 있다.
혹은, 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 그 cDNA 서열 정보에 기초하여, 화학 합성법 또는 화학 합성법과 PCR법 또는 깁슨 어셈블리(Gibson Assembly)법의 조합에 의해 얻을 수 있고, 추가로 인간에 있어서의 발현에 적합한 코돈을 제공하는 코돈 최적화가 행해진 염기 서열로서 구축할 수도 있다.
(3) 전사 리프레서
본 발명에서는, 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질과 융합한 전사 리프레서의 작용에 의해, 인간 MAPT 유전자 발현이 억제된다. 본 명세서에 있어서, "전사 리프레서"란, 인간 MAPT 유전자의 유전자 전사를 억제하는 능력을 갖는 단백질, 또는 그 기능을 유지하는 펩티드 프래그먼트를 의미한다. 본 발명에서 이용하는 전사 리프레서는, 인간 MAPT 유전자의 발현을 억제할 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, Kruppel-관련 복스(KRAB), MBD2B, v-ErbA, SID(SID의 쇄 상태 포함(SID4X)), MBD2, MBD3, DNMT 패밀리(예를 들어, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B), Rb, MeCP2, ROM2, LSD1, AtHD2A, SET1, HDAC11, SETD8, EZH2, SUV39H1, PHF19, SALI, NUE, SUVR4, KYP, DIM5, HDAC8, SIRT3, SIRT6, MESOLO4, SET8, HST2, COBB, SET-TAF1B, NCOR, SIN3A, HDT1, NIPP1, HP1A, ERF 리프레서 도메인(ERD), 및 전사 억제능을 갖는 그의 배리언트, 그들의 융합체 등을 들 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에 있어서, 전사 리프레서로서 KRAB가 이용된다.
전사 리프레서를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 화학 합성법 또는 화학 합성법과 PCR법 또는 깁슨 어셈블리법의 조합에 의해 구축할 수 있다. 더욱이, 전사 리프레서를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를, 인간에 있어서의 발현에 적합한 코돈이 되는 코돈 최적화 DNA 서열로서 구축할 수도 있다.
전사 리프레서와 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는, CRISPR 이펙터 단백질을 코딩하는 염기 서열을 전사 리프레서를 인코딩하는 염기 서열에 직접, 또는 링커, NLS(핵 국재화 시그널)(예를 들어, 서열 번호: 111 또는 서열 번호: 112에 기재된 염기 서열), 태그 및/또는 그 외를 코딩하는 염기 서열을 부가한 후에 라이게이팅하는 것에 의해 조제할 수 있다. 본 발명에 있어서, 전사 리프레서는, 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질의 N말단 또는 C말단의 어느 것에 융합해도 된다. 링커로서는, 아미노산 수 약 2 내지 50의 링커를 이용할 수 있고, 구체적으로는, 글리신(G)과 세린(S)이 교대로 연결된 G-S-G-S 링커 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 본 발명의 일 실시형태에 있어서, 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질과 전사 리프레서의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, SV40 NLS, dSaCas9, NLS 및 KRAB를 융합 단백질로서 코딩하는 서열 번호: 113에 기재된 염기 서열을 이용할 수 있다.
(4) 가이드 RNA
본 발명에 있어서, 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질과 전사 리프레서의 융합 단백질은, 가이드 RNA에 의해 인간 MAPT 유전자의 발현 조절 영역에 리크루트할 수 있다. 전술한 "(1) 정의"에 기재되어 있는 바와 같이, 가이드 RNA는 crRNA를 포함하고, crRNA는 표적 서열의 상보 서열에 결합한다. crRNA는, 표적 영역에 융합 단백질을 리트루트할 수 있는 한, 표적 서열의 상보 서열과 완전히 상보적이지 않아도 되고, 적어도 1 내지 3개의 염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되어 있는 표적 서열의 염기 서열을 포함해도 된다.
dCas9를 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질로서 사용하는 경우, 예를 들어, 표적 서열은, 공개된 gRNA 설계 웹사이트(CRISPR Design Tool, CRISPR direct 등)를 이용하여 결정할 수 있다. 구체적으로는, 표적 유전자의 서열(즉, 인간 MAPT 유전자)로부터, PAM(예를 들어, SaCas9의 경우는 NNGRRT)이 그의 3'측에 인접하는 약 20뉴클레오티드 길이의 후보 표적 서열이 열거되고, 이들 후보 표적 서열 중에서 인간 게놈 중의 소수의 오프타겟 부위를 갖는 것을 표적 서열로서 이용할 수 있다. 표적 서열의 염기 길이는, 18 내지 24뉴클레오티드 길이이고, 바람직하게는 20 내지 23뉴클레오티드 길이이며, 보다 바람직하게는 21 내지 23뉴클레오티드 길이이다. 오프타겟 부위의 수를 예측하기 위한 1차 스크리닝으로서, 다수의 생물정보 툴이 공지되어 있고 공적으로 이용가능하며, 최저 오프타겟 효과를 갖는 표적 서열을 예측하기 위해 이용할 수 있다. 그 예로는, Benchling(https://benchling.com), 및 COSMID(CRISPR Off-target Sites with Mismatches, Insertions, and Deletions)(인터넷 상의 https://crispring.bme.gatech.edu에서 이용가능) 등의 생물정보 툴을 들 수 있다. 이들을 이용하여, gRNA에 의해 표적이 되는 염기 서열에 대한 유사성을 정리할 수 있다. 이용하는 gRNA 설계 소프트웨어가, 표적 게놈의 오프타겟 부위를 탐색하는 기능을 갖지 않는 경우, 예를 들어, 표적 게놈을, 후보 표적 서열(표적 뉴클레오티드 서열의 고식별능을 갖는 시드(seed) 서열)의 3'측 상의 8 내지 12뉴클레오티드에 대해 Blast 탐색하는 것에 의해, 오프타겟 부위를 탐색할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 인간 염색체 17(Chr 17)의 GRCh38/hg38 중에 존재하는 영역에서는, "4,887,381-45,962,898"의 영역은, 인간 MAPT 유전자의 발현 조절 영역일 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 실시형태에 있어서, 표적 서열은, 인간 염색체 17(Chr 17)의 GRCh38/hg38에 존재하는 "45,887,381-45,962,898"의 영역 중의 18 내지 24뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 20 내지 23뉴클레오티드 길이, 보다 바람직하게는 21 내지 23뉴클레오티드 길이일 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, crRNA를 코딩하는 염기 서열은, 표적 서열과 동일한 염기 서열이어도 된다. 예를 들어, 서열 번호: 57에 기재된 표적 서열(GAGCAAGGGATGCACGCACG)을 crRNA를 코딩하는 염기 서열로서 세포에 도입했을 경우, 서열로부터 전사된 crRNA는 GAGCAAGGGAUGCACGCACG(서열 번호: 114)이며, CGTGCGTGCATCCCTTGCTC(서열 번호: 115)에 결합하고 있고, 이것은 서열 번호: 57에 기재된 염기 서열과 상보적인 서열이며, 인간 MAPT 유전자의 발현 조절 영역에 존재한다. 다른 실시형태에 있어서, 적어도 1 내지 3염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되어 있는 표적 서열인 염기 서열은, 가이드 RNA가 표적 영역에 융합 단백질을 리크루트할 수 있는 한, crRNA를 코딩하는 염기 서열로서 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 실시형태에 있어서, crRNA를 코딩하는 염기 서열로서, 서열 번호: 54, 55, 56, 57, 68, 153 또는 97에 기재된 염기 서열, 또는 서열 번호: 54, 55, 56, 57, 68, 153 또는 97에 기재된 염기 서열에 있어서 1 내지 3염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되어 있는 염기 서열을 사용할 수 있다.
dCpf1을 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질로서 사용하는 경우, gRNA를 코딩하는 염기 서열은, 5'말단에 부착된 특정의 RNA를 갖는 crRNA를 코딩하는 DNA 서열로서 설계할 수 있다. crRNA의 5'말단에 부착된 이와 같은 RNA 및 해당 RNA를 코딩하는 DNA 서열은, 사용하는 dCpf1에 따라서 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, dFnCpf1을 사용하는 경우, 서열 번호: 116; AATTTCTACTGTTGTAGAT가 표적 서열의 5'측에 부착되어 있는 염기 서열은, gRNA를 코딩하는 염기 서열로서 사용할 수 있다(RNA에 전사되는 경우, 밑줄친 부분의 서열은 염기쌍을 형성하여 스템-루프 구조를 형성한다). 5'말단에 부가되는 서열은, gRNA가 전사 후에 발현 조절 영역에 융합 단백질을 리크루트할 수 있는 한, 적어도 1 내지 6염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되어 있는 다양한 Cpf1 단백질에 일반적으로 사용되는 서열일 수 있다.
dCas9를 CRISPR 이펙터 단백질로서 사용하는 경우, gRNA를 코딩하는 DNA 서열은 공지된 tracrRNA를 코딩하는 DNA 서열이 crRNA를 코딩하는 DNA 서열의 3'말단에 연결된 DNA 서열로서 설계될 수 있다. 이와 같은 tracrRNA 및 tracrRNA를 코딩하는 DNA 서열은, 사용하는 dCas9에 따라서 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, dSaCas9를 사용하는 경우, tracrRNA를 코딩하는 DNA 서열로서 서열 번호: 117에 기재된 염기 서열이 사용된다. tracrRNA를 코딩하는 DNA 서열은, gRNA가 전사 후에 발현 조절 영역에 융합 단백질을 리크루트할 수 있는 한, 적어도 1 내지 6염기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되어 있는 다양한 Cas9 단백질에 일반적으로 사용되는 trarRNA를 코딩하는 염기 서열이어도 된다.
이와 같은 방식으로 설계된 gRNA를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 공지된 DNA 합성법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, gRNA를 코딩하는 적어도 2개의 상이한 염기 서열을 포함해도 된다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는, 가이드 RNA를 코딩하는 적어도 2개의 상이한 염기 서열을 포함할 수 있고, 상기 적어도 2개의 상이한 염기 서열은, 서열 번호: 54, 55, 56, 57, 68, 153 또는 97에 기재된 서열을 포함하는 염기 서열로부터 선택된다.
(5) 프로모터 서열
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 프로모터 서열은, 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질 및 전사 리프레서의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열 및/또는 gRNA를 코딩하는 염기 서열의 각각의 상류에 작동 가능하게 연결되어도 된다. 연결될 가능성이 있는 프로모터는, 표적 세포에 있어서의 프로모터 활성을 나타내는 한 특별히 한정되지 않는다. gRNA를 코딩하는 염기 서열의 상류에 연결될 가능성이 있는 프로모터 서열로서는, 예를 들어, U6 프로모터, SNR6 프로모터, SNR52 프로모터, SCR1 프로모터, RPR1 프로모터, U3 프로모터, H1 프로모터, pol III 프로모터인 tRNA 프로모터 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 본 발명의 일 실시형태에 있어서, U6 프로모터는, 가이드 RNA를 코딩하는 염기 서열에 대한 프로모터 서열로서 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에 있어서, 폴리뉴클레오티드가, 가이드 RNA를 각각 코딩하는 2개 이상의 염기 서열을 포함하는 경우, 단일한 프로모터 서열은, 해당 2개 이상의 염기 서열의 상류에 작동 가능하게 연결되어도 된다. 다른 실시형태에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 가이드 RNA를 각각 코딩하는 2개 이상의 염기 서열을 포함하는 경우, 프로모터 서열은, 해당 2개 이상의 염기 서열의 각각의 상류에 작동 가능하게 연결되어도 되고, 각 염기 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 서열은, 동일해도 상이해도 된다.
융합 단백질을 코딩하는 염기 서열의 상류에 연결될 가능성이 있는 상기 프로모터 서열로서는, 유비쿼터스 프로모터 또는 뉴런 특이적 프로모터를 사용할 수 있다. 유비쿼터스 프로모터로서는, EF-1a 프로모터, EFS 프로모터, CMV(사이토메갈로바이러스) 프로모터, hTERT 프로모터, SRa 프로모터, SV40 프로모터, LTR 프로모터, CAG 프로모터, RSV(라우스 육종 바이러스) 프로모터 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 본 발명의 일 실시형태에 있어서, EFS 프로모터, CMV 프로모터, 또는 CAG 프로모터를 유비쿼터스 프로모터로서 사용할 수 있다. 뉴런 특이적 프로모터로서는, 뉴런 특이적 엔올라제(NSE) 프로모터, 인간 신경필라멘트 경쇄(NEFL) 프로모터 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 상기 프로모터는, 표적 세포 중에서 프로모터 활성을 갖는 한, 임의의 개변 및/또는 변경을 갖고 있어도 된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, U6이 가이드 RNA를 코딩하는 염기 서열에 대한 프로모터로서 사용되고, CMV 프로모터가 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열에 대한 프로모터 서열로서 사용될 수 있다.
(6) 그 외의 염기 서열
더욱이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질과 전사 리프레서의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열의 전사에 의해 산생 되는 mRNA의 번역 효율을 향상시키는 것을 목적으로 하여, 전술한 것들 이외에, 폴리아데닐화(polyA) 시그널, Kozak 컨센서스 서열 등의 공지된 서열을 추가로 포함해도 된다. 예를 들어, 본 발명에 있어서의 폴리아데닐화 시그널은, hGH polyA, bGH polyA, 2x sNRP-1 polyA 등을 포함할 수 있다(참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 원용되는 US7557197B2 참조). 더하여, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 링커 서열을 코딩하는 염기 서열, NLS를 코딩하는 염기 서열 및/또는 태그를 코딩하는 염기 서열을 포함해도 된다. 더욱이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 개재(intervening) 서열을 포함해도 된다. 개재 서열의 바람직한 예는, IRES(내부 리보솜 진입 부위; Internal ribosome entry site), 2A 펩티드를 코딩하는 서열이다. 2A 펩티드는, 바이러스 유래의 대략 20아미노산 잔기의 펩티드 서열이며, 세포 중에 존재하는 프로테아제(2A 펩티다제)에 의해 인식되어, C말단으로부터 1잔기의 위치에서 절출된다. 2A 펩티드에 의해 1단위로서 연결된 복수의 유전자를 1단위로서 전사 및 번역한 후, 2A 펩티다제로 절출한다. 2A 펩티다제의 예로서는, F2A(구제역 바이러스 유래), E2A(말 비염 A 바이러스 유래), T2A(토세아 아시그니아(Thosea asignia) 바이러스 유래), P2A(돼지 테스코바이러스-1 유래)를 들 수 있다.
(7) 본 발명의 예시적인 실시형태
본 발명의 일 실시형태에 있어서,
뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질과 전사 리프레서의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열,
뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질과 전사 리프레서의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열에 대한 프로모터 서열,
서열 번호: 54, 55, 56, 57, 68, 153 또는 97에 기재된 서열을 포함하는 염기 서열, 또는 서열 번호: 54, 55, 56, 57, 68, 153 또는 97에 기재된 서열을 포함하고 1 내지 3개의 염기가 결실, 치환, 삽입, 및/또는 부가되어 있는 염기 서열로부터 선택되고, 각각이 가이드 RNA를 코딩하는 1 또는 2개의 염기 서열, 및
상기 gRNA를 코딩하는 염기 서열에 대한 프로모터 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서,
여기에서 상기 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질은, dSaCas9 또는 dSaCas9[-25]이고,
상기 전사 리프레서는, KRAB, MeCP2, SIN3A, HDT1, MBD2B, NIPP1, 및 HP1A로부터 선택되고,
상기 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열에 대한 프로모터 서열은, EFS 프로모터, CMV 프로모터, 및 CAG 프로모터의 군으로부터 선택되고,
상기 gRNA를 코딩하는 염기 서열에 대한 프로모터 서열은, U6 프로모터, SNR6 프로모터, SNR52 프로모터, SCR1 프로모터, RPR1 프로모터, U3 프로모터, 및 H1 프로모터의 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드가 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서,
뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질과 전사 리프레서의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열,
뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질과 전사 리프레서의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열에 대한 CMV 프로모터,
서열 번호: 54, 55, 56, 57, 68, 153 또는 97에 기재된 서열을 포함하는 염기 서열, 또는 서열 번호: 54, 55, 56, 57, 68, 153 또는 97에 기재된 서열을 포함하고 1 내지 3개의 염기가 결실, 치환, 삽입, 및/또는 부가되어 있는 염기 서열로부터 선택되고, 각각이 가이드 RNA를 코딩하는 1 또는 2개의 염기 서열, 및
상기 가이드 RNA를 코딩하는 염기 서열에 대한 U6 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서,
여기에서 상기 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질은, dSaCas9이고,
상기 전사 리프레서는 KRAB인, 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
2. 벡터
본 발명은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터(이하, "본 발명의 벡터"라고도 칭한다)를 제공한다. 본 발명의 벡터는, 플라스미드 벡터이거나 바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명의 벡터가 플라스미드 벡터인 경우, 사용하는 플라스미드 벡터는 특별히 한정되지 않고, 클로닝 플라스미드 벡터나 발현 플라스미드 벡터 등의 임의의 플라스미드 벡터여도 된다. 플라스미드 벡터는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를, 공지된 방법으로 플라스미드 벡터에 삽입하는 것에 의해 조제된다.
본 발명의 벡터가 바이러스 벡터인 경우, 사용하는 바이러스 벡터는 특별히 한정되지 않지만, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 센다이바이러스 벡터 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 본 명세서에 있어서, "바이러스 벡터" 또는 "바이러스성 벡터"는 그의 유도체도 포함한다. 유전자 치료에 있어서의 사용을 고려하면, 전이유전자를 장시간 발현시킬 수 있고, 비병원성 바이러스 유래이며, 안전성이 높다는 이유에서 AAV 벡터가 바람직하게 사용된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는, 공지된 방법에 의해 조제할 수 있다. 간략히 말하면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 삽입된 바이러스 발현용 플라스미드 벡터를 조제하고, 해당 벡터를 적절한 숙주 세포에 트랜스펙트하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 일과적으로 산생시키고, 바이러스 벡터를 수집한다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, AAV 벡터가 사용되는 경우, AAV 벡터의 항원형은, 표적 중의 인간 MAPT 유전자의 발현이 활성화될 수 있는 한 특별히 한정되지 않고, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.10 등의 어느 것을 사용해도 된다(AAV의 다양한 항원형에 대해서는, 예를 들어, 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 원용되는 WO 2005/033321 및 EP 2341068(A1)을 참조할 것). AAV의 배리언트의 예로서는, 개변된 캡시드를 갖는 신규한 항원형(예를 들어 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 원용되는 WO 2012/057363) 등을 들 수 있지만, 이것으로 한정되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 일 실시형태에 있어서, AAV587MTP, AAV588MTP, AAV-B1, AAVM41, AAVS1_P1, 및 AAVS10_P1 등의, 근육 세포에 대한 감염성을 개선하는, 개변된 캡시드를 갖는 신규한 항원형을 사용할 수 있다(참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 원용되는 Yu et al., Gene Ther. 2009 Aug;16(8):953-62, Choudhury et al., Mol Ther. 2016 Aug;24(7):1247-57, Yang et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Mar 10;106(10):3946-51, 및 WO 2019/207132를 참조할 것).
AAV 벡터를 조제할 때에는, (1) 플라스미드를 이용하는 방법, (2) 바큘로바이러스를 이용하는 방법, (3) 단순 포진 바이러스를 이용하는 방법, (4) 아데노바이러스를 이용하는 방법, 또는 (5) 효모를 이용하는 방법과 같은 공지된 방법을 이용할 수 있다(예를 들어, 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 원용되는 Appl Microbiol Biotechnol. 2018; 102(3): 1045-1054 등). 예를 들어, 플라스미드를 이용하는 방법에 의해 AAV 벡터를 조제하는 경우, 먼저, 야생형 AAV 게놈 서열의 양단에 반전 말단 반복(ITR), 및 Rep 단백질 및 캡시드 단백질을 코딩하는 DNA 대신에 삽입된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 플라스미드를 조제한다. 한편, 바이러스 입자의 형성을 위해 필요한 Rep 단백질 및 캡시드 단백질을 코딩하는 DNA는 다른 플라스미드에 삽입된다. 더욱이, 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드로서, AAV의 증식을 위해 필요한 아데노바이러스의 헬퍼 작용을 담당하는 유전자(E1A, E1B, E2A, VA 및 E4orf6)를 포함하는 플라스미드를 조제한다. 이들 3종의 플라스미드의 숙주 세포에의 코-트랜스펙션은, 재조합 AAV(즉 AAV 벡터)의 세포 내에서의 산생을 야기한다. 숙주 세포로서는, 전술한 헬퍼 작용을 담당하는 유전자의 유전자 산물(단백질)의 일부를 공급 가능한 세포(예를 들어, 293 세포 등)가 바람직하게 사용된다. 이와 같은 세포를 사용하는 경우에는, 전술한 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드 중에 숙주 세포로부터 공급될 수 있는 단백질을 코딩하는 유전자를 담지할 필요가 없다. 산생된 AAV 벡터는 핵 중에 존재한다. 따라서, 소망의 AAV 벡터는 동결융해법으로 숙주 세포를 파괴하고, 바이러스를 수집한 후 바이러스 분획을 염화 세슘을 사용하는 밀도 구배 초원심분리법, 칼럼법 등에 의해 분리 및 정제하여 조제된다.
AAV 벡터는, 안전성, 유전자 형질도입 효율 등의 점에서 큰 이점을 가져, 유전자 치료에 사용된다. 그렇지만, AAV 벡터에 패키징될 수 있는 폴리뉴클레오티드의 사이즈는 제한되어 있음이 알려져 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 실시형태에 있어서, dSaCas9와 miniVR 또는 microVR의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열, 인간 MAPT 유전자의 발현 조절 영역을 표적으로 하는 gRNA를 코딩하는 염기 서열, 및 프로모터 서열로서의 EFS 프로모터 서열 또는 CK8 프로모터 서열 및 U6 프로모터 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 염기 길이, 및 ITR 부분을 포함하는 전체 길이는 약 4.85kb이며, 이들은 단일한 AAV 벡터 중에 패키징될 수 있다.
3. 의약 조성물
본 발명은 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 벡터를 포함하는 의약 조성물(이하, "본 발명의 의약 조성물"이라고도 한다)을 제공한다. 본 발명의 의약 조성물은, AD를 포함하는 타우병증의 치료 또는 예방에 이용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 벡터를 활성 성분으로서 포함하고, 이와 같은 활성 성분(즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 벡터) 및, 일반적으로 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제형으로서 조제할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 비경구적으로 투여되고, 국소적 또는 전신적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은, 예를 들어, 정맥내 투여, 동맥내 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 또는 근육내 투여에 의해 투여될 수 있지만 이들로 한정되지 않는다.
본 발명의 의약 조성물의 대상물에 대한 투여량은, 치료 및/또는 예방에 유효한 양이면 특별히 한정되지 않는다. 활성 성분, 투약 형태, 대상의 연령 및 체중, 투여 스케줄, 투여 방법 등에 따라서 적절히 최적화할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, AD를 포함하는 타우병증으로 이환하는 대상에게 투여될 수 있을 뿐만 아니라, 유전자 배경 분석 등에 기초하여, 장래, AD를 포함하는 타우병증을 발증할 수 있는 대상에게 예방적으로 투여될 수 있다. 본 명세서에 있어서의 용어 "치료"는, 질환의 치유에 더하여, 질환의 관해도 포함한다. 더욱이, 용어 "예방"은, 질환의 발증의 예방에 더하여, 질환의 발증의 지연도 포함한다. 본 발명의 의약 조성물은, "본 발명의 약제" 등이라고도 칭할 수 있다.
4. DMD 또는 BMD의 치료 또는 예방 방법
본 발명은 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 벡터를 그것을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, AD를 포함하는 타우병증의 치료 또는 예방 방법을 제공한다(이하, "본 발명의 방법"이라고 칭하는 경우가 있다). 더하여, 본 발명은, AD를 포함하는 타우병증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 벡터를 포함한다. 더욱이, 본 발명은, AD를 포함하는 타우병증의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물의 제조에 있어서의 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 벡터의 사용을 포함한다.
본 발명의 방법은, 전술한 본 발명의 의약 조성물을, AD를 포함하는 타우병증으로 이환하는 대상에게 투여하는 것에 의해 실시할 수 있고, 투여량, 투여 경로, 대상 등은 전술한 바와 같다.
증상의 측정은, 본 발명의 방법을 이용한 치료 개시 전 및 치료 후의 임의의 타이밍에 행하여 치료에 대한 대상의 응답을 판정할 수 있다.
본 발명의 방법은 대상의 골격근 및/또는 심근의 기능을 향상시킬 수 있다. 기능이 향상되는 근육은, 특별히 한정되지는 않고, 임의의 근육이나 근육군을 예시할 수 있다.
5. 리보뉴클레오프로틴
본 발명은, 이하를 포함하는 리보뉴클레오프로틴(이하, "본 발명의 RNP"라고 하는 경우가 있다)을 제공한다:
(c) 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질과 전사 리프레서의 융합 단백질, 및
(d) 인간 MAPT 유전자의 발현 조절 영역에 있어서 서열 번호: 54, 55, 56, 57, 68, 153 또는 97에 기재된 영역 중의 18 내지 24뉴클레오티드 길이의 연속 영역을 표적으로 하는 가이드 RNA.
본 발명의 RNP 중에 포함되는 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질, 전사 리프레서, 및 가이드 RNA로서는, 전술한 "1. 폴리뉴클레오타이드"란에서 상세히 설명한 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질, 전사 리프레서, 및 가이드 RNA를 사용할 수 있다. 본 발명의 RNP 중에 포함되는 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질과 전사 리프레서의 융합 단백질은, 예를 들어, 세포, 세균, 또는 다른 생물에 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하여 발현시키는 것, 또는 해당 폴리뉴클레오티드를 이용하는 것에 의한 인비트로(in vitro) 번역계에 의해 제조할 수 있다. 더하여, 본 발명의 RNP 중에 포함되는 가이드 RNA는, 예를 들어, 가이드 RNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 이용하는 것에 의해, 화학 합성법이나 인비트로 전사계에 의해 제조할 수 있다. 이와 같이 조제된 융합 단백질과 가이드 RNA를 혼합하여, 본 발명의 RNP를 조제한다. 필요에 따라서, 금 입자 등의 다른 물질을 혼합해도 된다. 본 발명의 RNP를 표적 세포, 조직 등에 직접 송달하기 위해서, RNP를 공지된 방법에 의해 지질 나노입자(LNP)에 캡슐화할 수 있다. 본 발명의 RNP는, 공지된 방법에 의해 표적 세포, 조직 등에 도입할 수 있다. 예를 들어, 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 원용되는 Lee K., et al., Nat Biomed Eng. 2017; 1: 889-901, WO 2016/153012 등을, LNP의 캡슐화 및 도입 방법을 위해 참조할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 RNP 중에 포함되는 가이드 RNA는, 인간 염색체 17(Chr 17)의 GRCh38/hg38에 존재하는 "45,887,381-45,962,898"의 영역 중의 연속하는 18 내지 24뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 20 내지 23뉴클레오티드 길이, 보다 바람직하게는 21 내지 23뉴클레오티드 길이를 표적으로 한다.
6. 그 외
본 발명은 또한, 인간 MAPT 유전자의 발현을 억제하기 위해서 이하를 포함하는 조성물 또는 키트를 제공한다:
(e) 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질과 전사 리프레서의 융합 단백질, 또는 해당 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및
(f) 인간 MATP 유전자의 발현 조절 영역에 있어서 서열 번호: 54, 55, 56, 57, 68, 153 또는 97에 기재된 영역 중의 18 내지 24뉴클레오티드 길이의 연속 영역을 표적으로 하는 가이드 RNA, 또는 해당 가이드 RNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
본 발명은 또한, 이하의 (e) 및 (f)을 투여하는 것을 포함하는, AD를 포함하는 타우병증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다:
(e) 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질과 전사 리프레서의 융합 단백질, 또는 해당 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및
(f) 인간 MATP 유전자의 발현 조절 영역에 있어서 서열 번호: 54, 55, 56, 57, 68, 153 또는 97에 기재된 영역 중의 18 내지 24뉴클레오티드 길이의 연속 영역을 표적으로 하는 가이드 RNA, 또는 해당 가이드 RNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
본 발명은 또한, AD를 포함하는 타우병증의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물의 제조에 있어서의, 이하의 (e) 및 (f)의 사용을 제공한다:
(e) 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질과 전사 리프레서의 융합 단백질, 또는 해당 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및
(f) 인간 MATP 유전자의 발현 조절 영역에 있어서 서열 번호: 54, 55, 56, 57, 68, 153 또는 97에 기재된 영역 중의 18 내지 24뉴클레오티드 길이의 연속 영역을 표적으로 하는 가이드 RNA, 또는 해당 가이드 RNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
이들 발명에 있어서 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질, 전사 리프레서, 가이드 RNA, 및 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 이들이 담지된 벡터로서, 전술한 "1. 폴리뉴클레오티드", "2. 벡터" 및 "5. 리보뉴클레오프로틴"란에서 상술한 것들을 사용할 수 있다. 전술한 (e) 및 (f)의 투여량, 투여 경로, 대상, 제형 등은, "3. 의약 조성물"란에서 설명한 바와 동일하다.
본 발명의 다른 특징들은, 본 발명을 설명하기 위해서 주어지고 그 한정을 의도하는 것은 아닌 예시적인 실시형태의 이하의 설명 과정에서 명확해질 것이다.
실시예
본 실시예는, 인간 MAPT 유전자 발현의 선택적 억제를 유도하는 인간 MAPT 유전자의 소정의 발현 조절 영역에 있어서의, 유전자의 발현을 억제하기 위한 dCas9와 전사 리프레서의 융합 단백질의 사용을 기술한다. 또한, 본 실시예는, 다른 유전자의 발현에 최소한의 영향을 주지 않고 인간 MAPT 유전자를 선택적으로 억제하는 특정의 게놈 영역의 정의도 기술한다. 인간 MAPT 유전자 발현을 억제하는 본 발명의 방법은, 본 명세서에 기재되고 설명되는 바와 같이 AD를 포함하는 타우병증에 대한 신규한 치료적 또는 예방적 전략을 제공한다.
실시예 1
(1) 실험 방법
세포 배양 및 트랜스펙션
SK-N-AS(American Type Culture Collection) 세포를, 트랜스펙션하기 24시간 전에 10% FBS 및 2mM 신선한 L-글루타민, 1mM 피루브산 나트륨 및 비필수 아미노산을 보충한 DMEM 배지 중에 웰당 100,000세포의 밀도로 12웰 플레이트에 파종했다. 세포를, 제조자의 지시에 따라, 3.0μl의 TransIT-VirusGEN(Miraus Bio)을 사용하여 px601-CMV-dSaCas9-KRAB-P2A-Puro(GenScript로부터 개변) 플라스미드 함유 1000ng sgRNA로 트랜스펙트했다.
유전자 발현 분석을 위해서, 트랜스펙트된 세포를, 트랜스펙션 72시간 후에 수확하고 RLT 버퍼(Qiagen)에 용해시켜, RNeasy 키트(Qiagen)를 이용하여 전RNA를 추출했다.
유전자 발현 분석
Tqman 분석을 위해서, 1.5μg의 전RNA를 사용하여, TaqMan High-Capacity RNA-to-cDNA Kit(Applied Biosystems)를 이용하여 20μl의 체적으로 cDNA를 생성했다. 생성된 cDNA를 10배 희석하고, 3.33μl를 Taqman 반응마다 사용했다. Taqman 프라이머, 및 MAPT 및 HPRT 유전자에 대한 프로브는, Applied Biosystems로부터 얻었다. Taqman 반응을, ThermoFisher QuantStudio 5 Real-Time PCR System에 있어서의 taqman 유전자 발현 마스터 믹스(ThermoFisher)를 사용하여 행하고, QuantStudio 5 분석 소프트웨어를 이용하여 분석했다.
Taqman 프로브 제품 ID:
MAPT: Hs00902193_m1(FAM-MGB)
HPRT: Hs99999909_m1(VIC PL)
Taqman qPCR 조건:
단계 1; 50℃ 2분
단계 2; 95℃ 2분
단계 3; 95℃ 1초
단계 4; 60℃ 20초
단계 3 및 4의 반복; 45회
sgRNA 서열의 선택
MAPT 유전자에 대한 상대적인 가이드 RNA 표적 부위의 위치를 도 1에 나타낸다. 선택된 가이드 RNA 서열(표 1) 또는 대조 sgRNA 가이드 서열(표 2)을 트레이서 RNA 서열과 융합시켜 단분자 가이드 RNA(sgRNA) 서열을 형성하고, px601-CMV-dSaCas9-KRAB-P2A-Puro(GenScript로부터 개변)에 클로닝했다. sgRNA 발현은 hU6 프로모터에 의해 구동되고, 벡터는 CMV/P2A 프로모터하에서 퓨로마이신 유전자를 발현하여, sgRNA 발현 세포의 추적 및 선택을 용이하게 한다. 3개의 대조 sgRNA 가이드(표 2)를, Human CRISPR Knockout Pooled Library(Sanjana N. E. et al., Nature Methods, 11(8), 783, 2014)로부터 선택했다.
(2) 결과
RNP에 의한 MAPT 유전자 발현의 억제
MAPT 전사 발현을 HPRT 유전자의 mRNA 레벨에 정규화시킨 96개 sgRNA에 의한 MAPT 전사의 억제를 나타낸다(도 2). 대조 sgRNA 가이드로 트랜스펙션한 후의 검출된 MAPT 발현 레벨은, 1.0으로 설정했다. sgRNA# 54, 55, 56, 57 및 68은 ≥90% 억제를 나타냈다(도 2). 상세한 실험은 적어도 3회 행해지고, 평균-배수 억제치 및 표준 편차를 나타낸다.
표 1 'UCSC Genome Browser on Human Dec. 2013(GRCh38/hg38) Assembly; chromosome 17: 45,887,381-45,962,898' 내의 sa sgRNA 가이드(NNGRRT PAM 서열을 가짐)의 목록
[표 1-1]
Figure pct00001
[표 1-2]
Figure pct00002
[표 1-3]
Figure pct00003
[표 1-4]
Figure pct00004
[표 1-5]
Figure pct00005
표 2 대조 sgRNA 가이드 서열의 목록
[표 2]
Figure pct00006
실시예 2
(1) 실험 방법
세포 배양 및 트랜스펙션
SK-N-AS(American Type Culture Collection) 세포를, 트랜스펙션하기 24-72시간 전에 웰당 75,000-200,000세포의 밀도로 12웰 플레이트를 파종하고, 10% FBS 및 2mM 신선한 L-글루타민, 1mM 피루브산 나트륨 및 비필수 아미노산을 보충한 DMEM 배지에서 배양했다. 세포를, 제조자의 지시에 따라, 3.0μl의 TransIT-VirusGEN(Miraus Bio)를 사용하여, px601-CMV-dSaCas9-KRAB-P2A-Puro(GenScript로부터 개변) 플라스미드 함유 1000ng sgRNA로 트랜스펙트했다. 트랜스펙션 24-36시간 후에 트랜스펙트된 세포를 퓨로마이신 선택(DMEM 중 1.5μg/ml)에 의해 부화(富化)시켰다. 트랜스펙션 72시간 후에 세포를 수확하고 RLT 버퍼(Qiagen)에 용해시켜, RNeasy 키트(Qiagen)을 이용하여 전RNA를 추출했다.
유전자 발현 분석
Taqman 분석을 위해서, 최대 1.5μg의 전RNA를 사용하여, TaqMan High-Capacity RNA-to-cDNA Kit(Applied Biosystems)를 이용하여 10μl의 용량으로 cDNA를 생성했다. 생성된 cDNA를 10배 희석하고, 3.33μl를 Taqman 반응마다 사용했다. Taqman 프라이머, 및 MAPT 및 HPRT 유전자에 대한 프로브는 Applied Biosystems로부터 얻었다. Taqman 반응을, ThermoFisher QuantStudio 5 Real-Time PCR System에 있어서의 Taqman 유전자 발현 마스터 믹스(ThermoFisher)를 이용하여 행하고, QuantStudio 5 분석 소프트웨어를 이용하여 분석했다.
Taqman 프로브 제품 ID:
MAPT: Hs00902193_m1(FAM-MGB)
HPRT: Hs99999909_m1(VIC PL)
Taqman qPCR 조건:
단계 1; 50℃ 2분
단계 2; 95℃ 2분
단계 3; 95℃ 1초
단계 4; 60℃ 20초
공정 3 및 4의 반복; 45회
sgRNA 서열의 선택
MAPT 유전자에 대한 상대적인 가이드 RNA 표적 부위의 위치를 도 1에 나타낸다. 선택된 가이드 RNA 서열(표 3)을 트레이서 RNA 서열과 융합하여 단분자 가이드 RNA(sgRNA) 서열을 형성하고, px601-CMV-dSaCas9-KRAB-P2A-Puro(GenScript로부터 개변)로 클로닝했다. sgRNA 발현은 hU6 프로모터에 의해 구동되고, 벡터는 CMV/P2A 프로모터 기구하에서 퓨로마이신 유전자를 발현하여, sgRNA 발현 세포의 추적 및 선택을 용이하게 한다. 3개의 대조 sgRNA 가이드(표 2)를 인간 CRISPR Knockout Pooled Library(Sanjana N. E. et al., Nature Methods, 11(8), 783, 2014)로부터 선택했다.
(2) 결과
RNP에 의한 MAPT 유전자 발현의 억제
MAPT 전사 발현을 HPRT 유전자의 mRNA 레벨에 정규화한 추가의 38개의 sgRNA에 의한 MAPT 전사의 억제를 도시한다(도 3). 대조 sgRNA 가이드를 이용한 트랜스펙션 후의 검출된 MAPT 발현 레벨은, 1.0으로 설정했다. sgRNA# 123, 127 및 132는 80%에 가까운 억제를 나타냈고, 113 및 106은 70%의 억제를 나타냈다. 상세한 실험은 적어도 3회 행했고, 평균 배수 억제치 및 표준 편차를 나타낸다.
표 3 'UCSC Genome Browser on Human Dec. 2013(GRCh38/hg38) Assembly; chromosome 17: 45,887,381-45,962,898' 내의 sa sgRNA 가이드(NNGRRT PAM 서열을 가짐)의 목록
[표 3-1]
Figure pct00007
[표 3-2]
Figure pct00008
본 발명에 의하면, 인간 세포에 있어서의 MAPT 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명은, AD의 치료 및/또는 예방에 극히 유용할 것이 기대된다.
본 명세서에 수치 한계 또는 범위가 기재되어 있는 경우, 종점은 포함된다. 또한, 수치 한계 또는 범위 내의 모든 값 및 하위범위는, 명시적으로 기재된 바와 같이 구체적으로 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "하나의(a, an)"는, "1개 이상"의 의미를 포함한다.
분명하게, 본 발명의 많은 개변 및 변형이, 상기의 교시에 비추어 가능하다. 따라서, 첨부된 특허청구범위의 범위 내에서, 본 발명은, 본 명세서에서 구체적으로 설명되는 것과는 다르게 실시될 수 있음이 이해되어야 한다.
전술한 모든 특허 및 다른 참고문헌은, 본 명세서에서는, 상세히 기재되어 있는 경우와 동일하게 원용된다.
본 출원은, 미국에서 출원되고 그 내용이 본 명세서에 전체적으로 원용되는 미국 가특허출원 제63/049,736호(출원일: 2020년 7월 9일), 및 미국 가특허출원 제63/212,429호(출원일: 2021년 6월 18일)에 기초하고 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Modalis Therapeutics Corporation <120> METHOD FOR TREATING ALZHEIMER'S DISEASE BY TARGETING MAPT GENE <130> 093172 <150> US63/049,736 <151> 2020-07-09 <150> US63/212,429 <151> 2021-06-18 <160> 155 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 actgcactcc agcctgggtg a 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gtttcaccct gtcacccagg c 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 attacaccac tgcactccag c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ctactgggga ggctgaggca g 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 tgcctcagcc tccccagtag c 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ttattgtatt tttagtagag a 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 tgggtggatc acctgaggtc a 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 cactttggga ggccgaggtg g 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 tcagcacttt gggaggccga g 21 <210> 10 <211> 21 <212> 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<213> Staphylococcus aureus <220> <221> misc_feature <223> sequence encoding tracrRNA <400> 117 gttttagtac tctggaaaca gaatctacta aaacaaggca aaatgccgtg tttatctcgt 60 <210> 118 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 118 aggtgcaggg aggggcgtgc a 21 <210> 119 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 119 caggggcagt gaaggccctg t 21 <210> 120 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 120 cccagccccc aaatgtcccc t 21 <210> 121 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 121 ggagaaatcg aggagatggg g 21 <210> 122 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 122 cgccgtgcct gagaacagtg c 21 <210> 123 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 123 tgcctttgcg agcgtgcaca g 21 <210> 124 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 124 cactgtgcac gctcgcaaag g 21 <210> 125 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 125 gcgaacgggg accagcggcc g 21 <210> 126 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 126 cacgcacagc cgcagccacg c 21 <210> 127 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 127 gggctgcagg tgcatctcgg g 21 <210> 128 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 128 ggctcgcccc tcactgcggc a 21 <210> 129 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 129 tcctccccct tcctcgccca c 21 <210> 130 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 130 ccctggtggg cgaggaaggg g 21 <210> 131 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 131 aaaaaaaggg gggctggggg c 21 <210> 132 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 132 tctttacggt gccatgccaa a 21 <210> 133 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 133 ctggtttctg gcttttattc t 21 <210> 134 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 134 gggaggttga ctgaacaccc t 21 <210> 135 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 135 tcctcatttc cgagcccatt g 21 <210> 136 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 136 attgttggat ctcgaggctt g 21 <210> 137 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 137 ggcttgctgg gttcgatgaa c 21 <210> 138 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 138 gccgggggtc ggggggttga c 21 <210> 139 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 139 ttccatgcgt gccgggggtc g 21 <210> 140 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 140 cacgcccgtt ccatgcgtgc c 21 <210> 141 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 141 tactgatcta actaggggtt g 21 <210> 142 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 142 accaagatag aggtcttgaa c 21 <210> 143 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 143 caacaaaaag tcaattccag g 21 <210> 144 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 144 catgagccac tgcactcagc c 21 <210> 145 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 145 cacctcagcc tcccaaagcg t 21 <210> 146 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 146 aacgctttgg gaggctgagg t 21 <210> 147 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 147 caatcttccc acctcagcct t 21 <210> 148 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 148 tgggaagatt gcttgagccc c 21 <210> 149 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 149 gagacaaggt cttgctcagg c 21 <210> 150 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 150 tgtacacctt agaaaagtca g 21 <210> 151 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 151 tctgccctag ccttctgact a 21 <210> 152 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 152 gtggttctca ctcctacttc t 21 <210> 153 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 153 ggggcatata cccaaagaag t 21 <210> 154 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 154 aaggtcagtt ccagaaactg t 21 <210> 155 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 155 aacatatgtt gattttttaa a 21

Claims (20)

  1. 이하의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드:
    (a) 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질과 전사 리프레서의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열, 및
    (b) 인간 MAPT 유전자의 발현 조절 영역에 있어서 서열 번호: 54, 55, 56, 57, 68, 153 또는 97에 기재된 영역 중의 18 내지 24뉴클레오티드 길이의 연속 영역을 표적으로 하는 가이드 RNA를 코딩하는 염기 서열.
  2. 제 1 항에 있어서,
    가이드 RNA를 코딩하는 염기 서열이, 서열 번호: 54, 55, 56, 57, 68, 153 또는 97에 기재된 염기 서열, 또는 서열 번호: 54, 55, 56, 57, 68, 153 또는 97에 기재된 염기 서열에 있어서 1 내지 3염기가 결실, 치환, 삽입, 및/또는 부가되어 있는 염기 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    가이드 RNA를 코딩하는 적어도 2개의 상이한 염기 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    전사 리프레서가, KRAB, MeCP2, SIN3A, HDT1, MBD2B, NIPP1, 및 HP1A의 군으로부터 선택되는, 폴리뉴클레오티드.
  5. 제 4 항에 있어서,
    전사 리프레서가 KRAB인, 폴리뉴클레오티드.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질이 dCas9인, 폴리뉴클레오티드.
  7. 제 6 항에 있어서,
    dCas9가 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus) 유래인, 폴리뉴클레오티드.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    가이드 RNA를 코딩하는 염기 서열에 대한 프로모터 서열 및/또는 뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질과 전사 리프레서의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열에 대한 프로모터 서열을 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  9. 제 8 항에 있어서,
    가이드 RNA를 코딩하는 염기 서열에 대한 프로모터 서열이, U6 프로모터, SNR6 프로모터, SNR52 프로모터, SCR1 프로모터, RPR1 프로모터, U3 프로모터, 및 H1 프로모터의 군으로부터 선택되는, 폴리뉴클레오티드.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 가이드 RNA를 코딩하는 염기 서열에 대한 프로모터 서열이 U6 프로모터인, 폴리뉴클레오티드.
  11. 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    뉴클레아제 결손 CRISPR 이펙터 단백질과 전사 리프레서의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열에 대한 프로모터 서열이 유비쿼터스 프로모터 또는 뉴런 특이적 프로모터인, 폴리뉴클레오티드.
  12. 제 11 항에 있어서,
    유비쿼터스 프로모터가, EFS 프로모터, CMV 프로모터, 및 CAG 프로모터의 군으로부터 선택되는, 폴리뉴클레오티드.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  14. 제 13 항에 있어서,
    벡터가 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터인, 벡터.
  15. 제 14 항에 있어서,
    바이러스 벡터가, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 렌티바이러스 벡터의 군으로부터 선택되는, 벡터.
  16. 제 15 항에 있어서,
    AAV 벡터가, AAV1, AAV2, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, Anc80, AAV587MTP, AAV588MTP, AAV-B1, AAVM41, 및 AAVrh74의 군으로부터 선택되는, 벡터.
  17. 제 16 항에 있어서,
    AAV 벡터가 AAV9인, 벡터.
  18. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는 제 13 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는 의약 조성물.
  19. 제 18 항에 있어서,
    알츠하이머병을 치료 또는 예방하기 위한, 의약 조성물.
  20. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는 제 13 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 벡터를, 그것을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 알츠하이머병의 치료 또는 예방 방법.
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013176772A1 (en) 2012-05-25 2013-11-28 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3152319A4 (en) * 2014-06-05 2017-12-27 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for nuclease design
WO2017180915A2 (en) * 2016-04-13 2017-10-19 Duke University Crispr/cas9-based repressors for silencing gene targets in vivo and methods of use
WO2018102665A1 (en) * 2016-12-01 2018-06-07 Sangamo Therapeutics, Inc. Tau modulators and methods and compositions for delivery thereof
SG11201909203WA (en) * 2017-04-03 2019-11-28 Encoded Therapeutics Inc Tissue selective transgene expression
CN113226333A (zh) * 2018-10-02 2021-08-06 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于调控Tau蛋白的方法和组合物
JP2022504075A (ja) * 2018-10-02 2022-01-13 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 操作された遺伝子モジュレーター

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013176772A1 (en) 2012-05-25 2013-11-28 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ballard C. et al., Lancet 2011; 377:1019-31
Dominguez A. et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 2016 Jan; 17(1): 5-15
Liao H. et al., Cell. 2017 Dec 14; 171(7): 1495-507

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