KR100710112B1 - 세포내에서의 단일 가닥 ｄｎａ의 제조 - Google Patents

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Abstract

진핵세포에서 단일 가닥의 cDNA (ss-cDNA)를 제조하기 위한 방법 및 조성물, 구체적으로 생체내에서 ss-cDNA를 제조하는 DNA 카세트가 개시된다. 상기 카세트는 몰로니 설치류 백혈병 바이러스 역전사효소/RNAse H 코딩 유전자, 세균 제한효소 유전자, 및 역전사효소가 특정 서열의 ss-cDNA를 합성하는 RNA 주형을 생산하는 원하는 서열을 함유한다. 그 후 상기 ss-cDNA는 ss-cDNA 그 자체가 폴딩되어 도립 텐덤 반복부의 포함된 결과로 형성되며, 원하는 서열에서 이중 가닥 DNA 스템을 형성하는 ss-cDNA의 스템-루프 구조를 이용하여 모든 측면 벡터 서열을 제거하도록 변형된다. 이중 가닥 스템은 제한효소 인식 부위 및 ss-DNA로 남아 있는 루프와 같은 하나 이상의 기능적 요소를 함유하며, 임의의 목적의 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 이러한 고안은 스템-루프 중간체의 이중 가닥 스템이 스템의 부위에 특이적인 해당 제한효소에 의해 절단되도록 하고, 그 후 루프 부분 또는 원하는 서열이 선형화된 단일 가닥의 DNA 조각으로 방출된다. 이러한 방출된 (또는 절단된) ss-DNA 조각은 제한효소 절단 부위를 함유하는 앞서의 이중 가닥 스템 부분으로부터 상류 5' 또는 하류 3'에서 있다면 최소한의 서열 정보를 함유한다. 본원에서 설명된 DNA 벡터 시스템을 사용하는 생체내 형질감염은 이러한 시스템이 숙주 세포에서 ss-DNA를 제조하는 데 사용됨을 입중한다.
단일 가닥 DNA, 스템-루프 구조, 역전사효소, 유전자 발현의 조절, 저해 핵산 분자

Description

세포내에서의 단일 가닥 ＤＮＡ의 제조 {Production of ssDNA inside a cell}
본 발명은 핵산 서열이 그 서열을 원핵 또는 진핵 세포에서 제조하기 위한 주형으로서 사용하기 위하여 혼입된, 용이하게는 카세트로서 간주되는 안정한 DNA 구축물, 및 진핵 숙주 세포내에서 플랭킹 (flanking) 서열 없이 (또는 최소한인) 그 서열을 발현하기 위한 벡터 시스템에 관한 것이다. 상기 카세트는 원하는 서열로서 간주되는 단일 가닥 DNA (ssDNA) 서열로서 서열의 발현을 생체내에서 일으키는 기능을 하는 스템-루프 중간체의 스템을 형성하는 도립 텐덤 반복부를 포함한다. 본 발명의 벡터 시스템은, 스템-루프가 형성된 후 스템에 의한 역전사 반응의 종결 또는 스템-루프 중간체의 절단에 의해 원하는 ssDNA 서열로부터 인접한 플라스미드 (또는 다른 벡터 서열)을 제거한다. 이러한 방법에 의하여 제조된 ssDNA는 임의의 내생 핵산 서열 표적에 상보적인 것으로 고안될 수 있다.
지금까지 알려진 바로는 진핵세포에서 개재 (intervening) 및(또는) 플랭킹 벡터 서열을 함유하지 않는 단일 가닥의 데옥시리보핵산 (ssDNA)을 제조하는 데 이용될 수 있는 방법은 없었다. 과학 및 특허 문헌은 cDNA 제조 벡터의 내용을 포함하고 있지만 (참조. A. Ohshima, et al., 89 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1016-1020 (1992); S. Inouye, et al., 3 Current Opin. Genet. Develop. 713-718 (1993); O Mirochnichenko, et al., 269 J. Biol. Chem. 2380-2383 (1994); J.R. Mao, et al., 270 J. Biol. Chem. 19684-19687 (1995); 및 미국특허 제5,436,141호 및 제5,714,323호), 이러한 참고 문헌에 개시된 시스템은 ssDNA 산물의 의도된 기능을 방해할 수 있는 개재 벡터 서열없이 진핵세포에서 ssDNA를 제조할 수 있는 능력을 입증하지 못하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 바람직하지 않은 개재 또는 플랭킹 뉴클레오티드 염기없이 생체내에서 임의의 목적의 뉴클레오티드 서열의 ssDNA의 합성을 유도하는 방법 및 DNA 구축물을 제공함으로써 이러한 제한을 극복하는, 효모, 원핵 및(또는) 진핵세포에서 단일 가닥 핵산을 제조하는 방법을 제공하는 것이다. ssDNA는 원하는 유전자 산물 또는 바이러스 유전자 산물을 하향 조절하도록 안티센스 방식으로 mRNA에 결합하거나 또는 정상적인 유전자 전사 및 조절을 방해할 수 있는 삼중체 구조를 형성하도록 이중체 (천연 DNA)에 결합하는 안티센스 서열과 같은 저해 핵산일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 이러한 방식으로 제조된 ssDNA는 또한 하나 이상의 많은 고 조절된 세포 기능을 중단할 수 있는 기능을 할 수 있다. 예를 들면, 텔로머 반복물의 ssDNA 꼬리는 텔로머 반복물 또는 다른 조절 서열에서 천연 DNA 서열과 동일한 또는 상보적인 뉴클레오티드 염기 조성을 갖는 ssDNA의 제조에 의해 변경될 수 있다.
이러한 목적 및 본 발명의 여러 구현예에 관한 하기 설명에 의해 당업계의 숙련자에게 명백해지는 많은 다른 목적은 도립 텐덤 반복부에 의해 플랭킹된 원하는 서열, RNA-의존성 DNA 폴리머라제를 코딩하는 유전자 및 제한효소를 코딩하는 유전자로 이루어진 핵산 서열로 이루어진 카세트 또는 핵산 구축물을 제공함으로써 달성될 수 있다. 또한, 상기 카세트는 바람직하게는 RNase H를 코딩하는 유전자 및 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 및 제한효소 유전자에 대한 구성적 또는 유도적 진핵 프로모터/인핸서를 포함한다. 본 발명은 또한 상기 카세트가 플라스미드에 도입되고, 상기 플라스미드가 적절한 숙주 세포에 도입되는 것도 고려한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 유전자 및 원하는 서열을 포함하는 카세트를 진핵세포에서 전사 및 번역하는 단계 및 원하는 서열의 mRNA 전사체를 RNase H 발현된 효소로 mRNA 성분 주형의 동시 절단과 함께 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 유전자에 의하여 제조된 폴리머라제로 cDNA로 전환시키는 것을 포함하는 생체내에서 단일 가닥 DNA를 제조하는 방법을 포함한다. 또한, 원하는 서열은 도립 텐덤 반복부를 포함한다. 또한, 상기 카세트는, 전사 및 번역되는 경우, 도립 텐덤 반복부에 의해 전사체가 스템-루프 중간체를 형성할 때 형성된 제한효소 부위에서 ssDNA를 절단함으로써 원하는 서열의 전사체를 선형화하는 제한효소를 제조하는 제한효소 유전자를 포함할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 표적 세포에서 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법을 포함한다. 한 구현예에서, 이 방법은 안티센스 서열을 전달하는 것을 의도한다. 다른 구현예에서, 본 방법은 삼중체 형성 서열 또는 특정 DNA 결합 단백질 또는 세포 대사 및(또는) 복제에 작용을 하는 다른 핵산 및(또는) 단백질에 의하여 인식되고 결합되는 서열을 전달하는 데 사용된다.
본 방법은 바람직하게는 RNase H 유전자 및 폴리머라제/RNase H 유전자에 적합한 유도성 또는 구성적 진핵 프로모터/인핸서를 포함하는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제를 코딩하는 유전자를 포함하는 카세트에서 원하는 상보성 서열로의 올리고뉴클레오티드의 코딩을 포함한다. 상기 카세트는 제한효소 (RE)를 코딩하는 유전자, 및 바람직한 구현예에서 RE 유전자에 대한 적합한 프로모터/인핸서를 포함한다. 또한 상기 카세트는 도립 텐덤 반복부를 포함하며, 표적 세포에 동화될 때 상기 카세트 (원하는 서열 및 도립 텐덤 반복부 포함)는 프로모터/인핸서의 조절하에서 세포에 의해 전사된다. 표적 세포의 정상적인 기능은 원하는 서열의 mRNA 전사체로부터 ssDNA의 제조에 필요한 모든 것을 제공함으로써 생성된 폴리머라제 및 RE 유전자의 mRNA 전사체가 번역되도록 하는 것이다. 구체적으로, 카세트로부터 제조된 RNA-의존성 DNA 폴리머라제는 원하는 서열 및 도립 텐덤 반복부의 mRNA 전사체를 ss-cDNA 전환시키고, ss-cDNA는 도립 텐덤 반복부 염기쌍을 포함하는 뉴클레오티드 염기로써 스템-루프 중간체를 형성하고, 카세트에서의 RE 유전자로부터 제조된 제한효소는 스템-루프 중간체의 이중 가닥 부분을 절단하여 스템-루프 중간체의 루프 부분으로부터 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 방출한다.
세포 내에서의 ssDNA의 합성을 지배하도록 표적 세포에 카세트를 전달하기 위하여 플라스미드 또는 플라스미드 기초 벡터 시스템 또는 바이러스성 벡터 시스템을 비롯한 많은 시스템이 사용될 수 있으며, 이들 시스템은 현재 숙련된 실무자에게 공지된 표준 전달 기술에 따라 이 목적을 위하여 개조된다. 이러한 시스템에는 아데노바이러스와 같은 바이러스 기초 시스템, 아데노관련 바이러스, 레트로바이러스 벡터, 및 이중 가닥 플라즈마 DNA를 기초로 한 형질감염 시스템을 사용하는 접합 벡터가 포함되나 이들에 제한되지 않는다. 세포내에서 카세트가 정상적인 세포 대사 과정에서 전사되면, 원하는 서열의 mRNA 전사체가 제조되고, 이어서 프로모터의 조절하에 카세트내에 포함된 역전사효소/RNase H 유전자로부터 세포에 의하여 제조된 역전사효소에 의해 cDNA로 전환된다.
본 발명에 따라, 도립 텐덤 반복부, 도립 텐덤 반복부에 대해 3' 위치에 위치한 역전사효소에 대한 프라이머 결합 부위, 및 도립 텐덤 반복부 사이 또는 도립 텐덤 반복부와 3' 프라이머 결합 부위 사이에 위치한 원하는 서열을 포함하는 핵산 구축물이 제공된다.
본 발명의 핵산 구축물은 단일 가닥 핵산이 표적 세포에서 쉽고 안정하게 제조되도록 한다. 특히, 도립 텐덤 반복부는 생체내에서 ssDNA를 제조하고(거나) 생산을 조절하는, 인접 뉴클레오티드 서열이 감소되거나 제거된 핵산 스템-루프 중간체를 생성하기 위하여 사용될 수 있다.
원하는 서열의 3'인 위치에서의 프라이머 결합 부위를 갖는 핵산 구축물의 배열 때문에, 본 발명의 핵산 구축물을 사용하여 제조될 수 있는 원하는 서열의 크기 또는 유형에는 어떠한 제한도 없으며, 상기 구축물은 임의의 소망되는 경로에 의해 표적 세포로 전달하기 위한 벡터에 용이하게 혼입될 수 있다.
원하는 서열이 도립 텐덤 반복부 사이에 위치할 때, 도립 텐덤 반복부는 바람직하게는 루프에서의 상기 원하는 서열과 함께 스템-루프 중간체를 형성할 수 있으며, 상기 도립 텐덤 반복부는 스템을 형성한다.
이러한 스템-루프 구조물의 이점은 스템에 연결된 루프를 절단함으로써 플랭킹 및(또는) 개재 벡터 서열이 감소되거나 제거된 단일 가닥 cDNA로서 원하는 서열이 루프로부터 방출될 수 있다는 것이다. 따라서, 수득된 ssDNA에 임의의 개재 및(또는) 플랭킹 뉴클레오티드 서열, 예를 들면 ssDNA 산물의 의도된 기능을 방해할 수 있는 벡터 뉴클레오티드 서열이 없거나 또는 실질적으로 없다.
원하는 서열이 도립 텐덤 반복부 사이에 위치할 때, 원하는 제2 서열이 도립 텐덤 반복부와 3' 프라이머 결합 부위 사이에 더 제공될 수 있다.
본 발명의 이러한 구현예는 상이한 안정성의 스템-루프를 제조하도록 도립 텐덤 반복부가 선택되어 mRNA 전사체의 전체 해독의 다양한 양 또는 전사의 초기 종결이 달성될 수 있으며, 이로써 중간체 mRNA 전사체의 2차 폴딩에 의해 둘 이상의 원하는 서열의 제조를 조절하는 방법을 제공하는 이점이 있다.
바람직하게는 도립 텐덤 반복부는 하나 이상의 특정 효소 인식 서열을 포함한다.
더욱 바람직하게는 특정 효소 인식 서열은 제한효소 부위를 포함한다. 제한효소 부위는 내생의 제한효소에 의하여 인식되거나 또는 본 발명의 핵산 구축물이 상기 제한효소 부위에 대한 제한효소를 코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있다. 핵산 구축물이 제한효소 유전자를 더 포함하는 경우에, 제한효소 유전자는 바람직하게는 도립 텐덤 반복부에 대해 5' 위치에 위치한다.
특정 효소 인식 서열은 예를 들면 HindIII와 NotI, HindIII 또는 NotI 제한효소 부위를 포함할 수 있다. 사실상, 특정 효소 인식 서열은 제한효소 유형 I, 제한효소 유형 II, 제한효소 유형 III, 진핵세포 수용체 인식, 원핵세포 수용체 인식, 프로모터, 프로모터/인핸서 및 T-돌출 PCR 부위 또는 이들 조합중 임의의 하나 일 수 있다.
원하는 서열이 도립 텐덤 반복부와 3' 프라이머 결합 부위 사이에 위치하거나, 또는 원하는 제1 서열이 도립 텐덤 반복부 사이에 위치하고 원하는 제2 서열이 도립 텐덤 반복부와 3' 프라이머 결합 부위 사이에 위치하는 경우, 도립 텐덤 반복부는 바람직하게는 안정한 스템-루프, 불안정한 스템-루프 또는 중간 안정도의 스템-루프를 형성할 수 있다.
상기 도립 텐덤 반복부는 역전사의 조기 종결을 일으키는 수단으로서 mRNA 전사체에서 안정한 스템-루프를 형성하도록 선택되어, 원하는 서열이 역전사의 출발 부위와 스템-루프 구조 사이의 mRNA 전사체에 위치하면, 인접 벡터 서열이 실질적으로 없는 ssDNA가 제조될 수 있다.
본 발명의 도립 텐덤 반복부는 예를 들면 mRNA 전사체로부터 역전사의 조기 종결을 일으키거나 또는 도립 텐덤 반복부에서의 제한효소 부위를 통하여 cDNA로부터 원하지 않는 서열을 절단함으로써 원하지 않는 인접 뉴클레오티드 서열을 제거하기 위한 비히클로서의 스템-루프 구조물의 사용을 허용한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 따라, 도립 텐덤 반복부는 하나 이상의 진핵세포, 원핵세포 및(또는) 바이러스성 단백질 DNA 결합 부위를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 스템-루프 구조물은 예를 들면 루프의 ssDNA를 세포내 뉴클레아제에 의한 분해로부터 보호하거나 또는 도립 텐덤 반복부에서 기능적 요소 (예를 들면, 단백질 결합 부위)를 통한 특정 용도를 수행하기 위한 기능적 독립체로서 제공될 수 있다는 이점을 갖는다.
바람직하게는, 도립 텐덤 반복부는 시스-배향 방식으로 작용한다.
프라이머 결합 부위는 내생의 역전사효소에 특이적일 수 있다 (예를 들면, 인간 면역결핍 바이러스 또는 유인원 면역결핍 바이러스에 의해 감염된 세포의 경우에서처럼).
별법으로, 상기 핵산 구축물은 역전사효소를 코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있다. 상기 역전사효소 유전자는 도립 텐덤 반복부에 대해 5' 위치에 위치하는 것이 바람직하다.
별법으로, 상기 핵산 구축물은 역전사효소/RNAse H 다중단백질을 코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있다. 역전사효소/RNAse H 다중단백질 유전자는 바람직하게는 도립 텐덤 반복부에 대해 5' 위치에 위치한다. 역전사효소/RNAse H 다중단백질 유전자는 몰로니 뮤린 (Moloney murine) 백혈병 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 또는 유인원 면역결핍 바이러스 유래의 것일 수 있다.
본 발명의 핵산 구축물에 역전사효소 또는 역전사효소/RNAse H 다중단백질 유전자가 제공되는 경우에, 프라이머 결합 부위는 바람직하게는 이들 각각의 유전자에 의하여 코딩되는 역전사효소 또는 역전사효소/RNAse H 다중단백질에 특이적이다.
바람직하게는, 본 발명의 핵산은 프로모터 및 선택적으로 상기 제1 또는 제2의 원하는 서열에 대한 인핸서, 상기 제한효소, 상기 역전사효소 및(또는) 상기 역전사효소/RNAse H 유전자를 더 포함한다.
더욱 바람직하게는, 프로모터 및(또는) 인핸서는 진핵세포의 프로모터/인핸 서이다.
프로모터는 구성적, 유도성의 넓은 범위 또는 조직-특이적인 프로모터일 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 핵산 구축물은 3' 프라이머 결합 부위에 대해 3' 위치에 위치한 폴리아데닐화 꼬리 서열을 더 포함한다. 폴리 A 꼬리는 mRNA 전사체의 안정화를 제공한다.
바람직하게는 원하는 제1 또는 제2 서열은 효소 활성을 갖는 단일 가닥 DNA를 코딩하는 서열을 포함한다. 이러한 효소 활성을 갖는 단일 가닥 DNA의 한 예에는 RNAse 활성을 갖는 서열 5'-GGCTAGCTACAACGA-3'가 포함된다. 이 서열은 5' 및 3' 방향 모두에는 표적 mRNA 종 (예를 들면, h-ras, c-raf 키나제, 플레이오트로핀 맥관형성 성장 인자에 대한 안티센스 서열 또는 유인원 면역결핍 바이러스의 tat 부위)에 대해 상보적인 서열이 하나 이상 플랭킹되어 있다.
바람직하게는, 프라이머 결합 부위는 전달 RNA (tRNA)에 상보적이다.
바람직하게는 핵산 구축물은 DNA이다.
따라서, 본 발명의 핵산 구축물은 생체내 및 시험관내 모두에서 안정한 단일 가닥 핵산 서열의 합성을 지배하는 효과적인 시스템을 제공한다. 단일 가닥 핵산 서열은 세포, 조직 또는 유기체에서 목적의 효과를 제공하기 위하여 사용될 수 있다. 원하는 단일 가닥 핵산 서열의 제조가 세포내에서 일어나기 때문에, 단일 가닥 핵산 서열을 세포내로 전달함으로써 제기되는 선행 기술의 문제는 극복되거나, 또는 적어도 완화된다.
또한, 본 발명의 핵산 구축물의 mRNA 전사체가 제공된다.
본 발명의 또 다른 관점에 따라, 도립 텐덤 반복부에 의해 플랭킹된 원하는 서열을 포함하며, 또한 도립 텐덤 반복부에 대하여 3'에 위치한 프라이머 결합 부위를 포함하는 mRNA 전사체가 제공된다.
본 발명의 이러한 관점에 따라, 또한 도립 텐덤 반복부 및 도립 텐덤 반복부에 대하여 3'에 위치한 프라이머 결합 부위와, 도립 텐덤 반복부와 3' 프라이머 결합 부위 사이에 위치한 원하는 서열을 포함하는 mRNA 전사체가 제공된다.
본 발명의 이러한 관점에 따라, 도립 텐덤 반복부에 의해 플랭킹된 원하는 제1 서열, 도립 텐덤 반복부에 대해 3'에 위치한 프라이머 결합 부위, 및 도립 텐덤 반복부와 3' 프라이머 결합 부위 사이에 위치한 원하는 제2 서열을 포함하는 mRNA 전사체가 추가로 제공된다.
또한, 본 발명의 mRNA의 단일 가닥 DNA 전사체가 제공된다.
또한, 본 발명에 따른 핵산 구축물을 포함하는 벡터가 제공된다.
본 발명의 핵산 구축물은 포유류 및 인간 치료 목적을 위해 상업적으로 시판되는 전달 벡터에 혼입될 수 있으며 표적 세포에 따라 임의의 가능한 경로로 투여될 수 있는 것이다.
본 발명에 따라, 도립 텐덤 반복부, 도립 텐덤 반복부에 대해 3' 위치에 위치한 역전사효소에 대한 프라이머 결합 부위, 및 도립 텐덤 반복부 사이 또는 도립 텐덤 반복부와 프라이머 결합 부위 사이의 원하는 서열을 위한 삽입 부위를 포함하는 벡터가 추가로 제공된다.
바람직하게는, 상기 벡터는 도립 텐덤 반복부 사이의 제1 삽입 부위 및 도립 텐덤 반복부와 3' 프라이머 결합 부위 사이의 제2 삽입 부위를 포함한다. 이것은 사용자가 임의의 목적의 원하는 서열을 한 삽입 부위 또는 이 둘 모두에 삽입할 수 있도록 한다. 도립 텐덤 반복부에 대한 3' 위치인 위치의 프라이머 결합 부위와 함께 핵산 구축물의 배열에 의해, 삽입 부위에 삽입될 수 있는 원하는 서열의 크기 또는 유형에 대한 제한은 없다.
바람직하게는, 상기 벡터는 역전사효소를 코딩하는 유전자 또는 역전사효소/RNAse H 다중단백질을 코딩하는 유전자를 더 포함한다. 바람직하게는, 역전사효소 또는 역전사효소/RNAse H 다중단백질 유전자는 도립 텐덤 반복부에 대해 5' 위치에 위치한다.
본 발명에 따라, 본 발명에 따른 제1 벡터 (즉, 도립 텐덤 반복부, 도립 텐덤 반복부에 대해 3' 위치에 위치하는 역전사효소에 대한 프라이머 결합 부위, 및 도립 텐덤 반복부 사이 또는 도립 텐덤 반복부와 프라이머 결합 부위 사이의 원하는 서열에 대한 삽입 부위를 포함하는 벡터), 및 역전사효소, 역전사효소/RNAse H 다중단백질 또는 프롤린 풍부 링커를 통해 제한효소에 연결된 역전사효소/RNAse H 다중단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 제2 벡터를 포함하는 벡터 시스템이 추가로 제공된다.
본 발명의 벡터 또는 벡터 시스템은 또한 사용자의 필요 및 사용되는 역전사효소의 특이성에 따라 상이한 프라이머 결합 부위가 사용될 수 있도록, 프라이머 결합 부위가 제거되고, 변화되도록 고안될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 벡터 또는 벡터 시스템은 플라스미드 또는 변형된 바이러스 구축물이다.
바람직하게는, 역전사효소, 역전사효소/RNAse H 다중단백질 또는 역전사효소/RNAse H/제한효소 유전자는 발현 조절 서열에 기능적으로 연결된다.
본 발명의 벡터 또는 벡터 시스템은 이롭게는 벡터내로 원하는 서열을 스플라이싱 하기 위한 공지된 절단 및 라이게이션 기술을 사용하여 원하는 안티센스, 센스, 삼중체 또는 임의의 다른 단일 가닥 뉴클레오티드 서열을 세포로 전달하는 데 사용될 수 있다. 본원에서 설명된 벡터 또는 벡터 시스템은 숙주 세포가 목적의 서열을 갖는 단일 가닥 핵산 분자를 제조하도록 하는 모든 필요한 신호 지령 및 효소 기능을 제공한다.
또한, 본 발명에 따른 벡터 또는 벡터 시스템으로 안정하게 형질전환된 또는 형질감염된 숙주 세포가 제공된다. 특히, 숙주 세포는 진핵세포 또는 원핵세포일 수 있다. 진핵세포에는 효모, 식물 및 포유류 세포가 포함된다. 원핵세포에는 세균 세포가 포함된다.
본 발명에 따라, 또한 본 발명에 따른 벡터 또는 벡터 시스템과 각 삽입 부위에 대한 제한효소를 포함하는 단일 가닥 핵산 서열을 제조하기 위한 키트가 제공된다.
본 발명의 또 다른 관점에 따라, 본 발명에 따른 벡터 또는 벡터 시스템, 벡터 또는 벡터 시스템을 위한 용기 및 벡터/벡터 시스템의 사용을 위한 지시문을 포함하는 단일 가닥 핵산 서열을 제조하기 위한 키트가 제공된다.
본 발명에 따라, 본 발명에 따른 핵산 구축물을 표적 세포로 도입하는 단계, 핵산 구축물을 mRNA로 전사하는 단계 및 mRNA 전사체를 cDNA로 역전사하는 단계를 포함하는, 원하는 단일 가닥 핵산 서열을 제조하기 위한 생체내 또는 시험관내 방법이 추가로 제공된다.
바람직하게는, 상기 방법은 mRNA의 역전사에 의해 형성된 mRNA/cDNA 이종이중나선가닥로부터 mRNA 전사체를 제거하는 단계를 더 포함한다.
역전사는 표적 세포에 내생인 역전사효소에 의해 수행되거나, 또는 본 발명의 방법은 역전사효소를 코딩하는 유전자 또는 역전사효소/RNAse H 다중단백질을 코딩하는 유전자를 표적 세포로 도입하는 단계를 더 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 도립 텐덤 반복부에 의하여 형성된 cDNA 스템-루프 구조물을 루프 구조물이 스템에 연결된 부분에서 절단함으로써 원하는 서열의 cDNA 전사체를 선형화하는 단계를 더 포함한다.
이러한 본 발명의 후자의 바람직한 구현예에 따라, 상기 방법은 제한효소를 코딩하는 유전자를 표적 세포에 도입하는 단계를 더 포함한다. 도립 텐덤 반복부에 하나 이상의 제한효소 부위를 제공함으로써 제한효소 유전자에 의하여 발현된 제한효소가 사용되어 cDNA 스템-루프 구조를 절단할 수 있다. 이외에, cDNA 스템-루프 구조의 절단은 표적 세포에 내생인 제한효소에 의존할 수 있다.
상기 제한효소는 또한 프롤린 풍부 링커에 의해 제한효소에 연결된 역전사효소/RNAse H 다중단백질을 코딩하는 유전자를 표적 세포에 도입하는 단계에 의하여 제공될 수 있다.
단일 가닥 핵산 서열이 본 발명의 시험관내 방법에 의하여 제조되는 경우, 상기 방법은 표적 세포로부터 mRNA 전사체, mRNA/cDNA 이종이중나선가닥 및(또는) 단일 가닥 cDNA를 단리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에 의하여 제조된 단일 가닥 cDNA 전사체, 저해 핵산 분자 (예를 들면, 안티센스 서열 또는 앱타머), 효소 활성을 갖는 단일 가닥 DNA (예를 들면, RNAse 활성), mRNA 전사체 및(또는) 이종이중나선가닥 분자가 제공된다.
저해 핵산 분자는 상보적인 핵산 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 mRNA 전사체로부터 합성된 단일 가닥 DNA 또는 mRNA 전사체 그 자체일 수 있다. 이러한 저해 핵산 분자는 "센스" 또는 "안티센스" 서열일 수 있으며, 특히 유전자 기능을 조절하는 데 유용하다. 또한, 저해 핵산 분자는 RNA 또는 DNA-결합 단백질에 특이적으로 결합하는 올리고-뉴클레오티드, 또는 생분자, 예를 들면 트롬빈, 브래디키닌 또는 PGF2α에 결합하며, RNA 또는 DNA에 정상적으로 결합하지 않는 올리고-뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점에 따라, 제약상 허용되는 보강제, 희석제 또는 담체와 함께 본 발명에 따른 핵산 구축물, 벡터 또는 벡터 시스템, 또는 숙주 세포를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
본 발명에 따라, 치료법, 특히 저해 핵산 분자를 표적 세포에 전달하는 데 사용하기 위한 본 발명에 따른 핵산 구축물, 벡터 또는 벡터 시스템, 또는 숙주 세포가 제공된다. 본 발명의 핵산 구축물, 벡터 또는 벡터 시스템 및 숙주 세포는 유전자 발현의 조절에 의한 병리학적 질환의 완화에 특히 유용하다.
본 발명의 또 다른 관점에 따라, 유전자 발현의 조절에 의한 병리학적 질환의 완화, 특히 표적 세포로 저해 핵산 분자의 전달에 의한 병리학적 질환의 완화를 위한 의약의 제조를 위한 본 발명에 따른 핵산 구축물, 벡터 또는 벡터 시스템 또는 숙주 세포의 용도가 제공된다. 다른 용도도 또한 개시된다.
본 발명의 유전 요소, 벡터, 벡터 시스템 및 숙주 세포의 세트는 넓은 범위의 질환 또는 질병, 구체적으로 비정상의 또는 변경된 유전자 발현에 의해 초래된 질환 또는 질병, 또는 유전자 발현을 조절함으로써 완화될 수 있는 질환 또는 질병의 예방적 또는 치료적 처리에 사용될 수 있다.
상기 본 발명의 유전 요소, 벡터, 숙주 세포, 키트 및 방법의 세트는 숙주 세포에서 단일 가닥 핵산 분자 또는 사실상 미리 지정된 또는 목적의 뉴클레오티드 염기 조성을 제조하기 위하여 사용될 수 있으며, 개조를 통해 임의의 생체내 또는 시험관내 시스템에 적용될 수 있다.
바람직한 구현예에 따라, 본 발명의 핵산 구축물은 인공적으로 합성된, 재조합된, 키메릭의, 및(또는) 이종의 산물일 수 있으며, 원하는 서열은 제조되는 세포에 대해 외부의 것일 수 있다.
본 발명의 실시태양들은 하기 도면들에 도시되어 있다.
도 1은 숙주 세포에서 ss-cDNA를 제조하는 2가지 메카니즘을 보여준다. 즉, (1) SOI(원하는 서열)가 루프 위치내로 클로닝되고, 전사된 후, 역전사되고, cDNA가 폴딩된 후, RE(제한효소)에 의해 절단된다. (2) SOI는 IR-R의 3'에서 클로닝되고, 전사된 후, mRNA가 폴딩되어 이후의 역전사 반응을 조기 종결시킨다.
도 2는 도 1에서 실시태양 (1)의 폴딩된 cDNA 중간체를 도시한다.
도 3A는 표적 mRNA에 대한 "10-23 DNA 효소" 결합 및 표적 mRNA의 후속의 절단이 도입되는 본 발명에 따라 제조된 안티센스 서열의 결합에 대한 개략도이다. 도 3B는 10-23 DNA 효소 (일반화된 저해 핵산 서열에 포함됨)와 표적 mRNA의 절단 부위와의 상호작용을 나타내는 표적 mRNA에 대한 도 3A의 안티센스 서열의 결합을 설명하는 확대도이다.
도 4는 본 발명에 따라 구축된 플라스미드 pssDNA-Express A의 개략적인 지도이다.
도 5A, 5B 및 5C는 각각 본 발명에 따라 구축된 플라스미드 pssDNA-Express B의 개략적인 지도, 플라스미드 pssDNA-Express B의 확대된 부위 및 플라스미드 pssDNA-Express B의 삽입 부위 서열을 나타낸다.
도 6A 및 6B는 본 발명에 따른 플라스미드 pssDNA-Express B로부터 구축된 플라스미드 pTest와 pTelo의 ApaI 및 NheI 부위 사이의 삽입 부위의 서열을 나타낸다.
도 7A는 본 발명에 따라 구축된 플라스미드 pcDNA3.1Zeo+/NM-link2-gag/pssDNA-Express-4B에 대한 출발 플라스미드 pcDNA3.1Zeo+ (인비트로겐, 인크.)의 개략적인 지도이다. 도 7B는 pcDNA3.1Zeo+/NM-link2-gag (또한, pssDNA-Express-4B로 표시)의 개략적인 지도이다. 도 7C는 pcDNA3.1Zeo+/NM-link2- gag/pssDNA-Express-4B에 대한 클로닝 부위, 도립 텐덤 반복부 및 PBS 부위 (화살표)의 개략적인 대표도이다. 도 7D는 pcDNA3.1Zeo+/NM-link2-gag/pssDNA-Express-4B에 대한 클로닝 부위, 도립 텐덤 반복부 및 PBS 부위 (화살표)의 서열 지도이다.
도 8A는 본 발명에 따라 구축된 플라스미드 pssDNA-Express A의 개략적인 지도이다. 도 8B는 플라스미드 pBK-RSV-RT-(del)-Hind/Xba(XmaI 및 SacII를 사용한 절단에 의한 MboII 유전자의 결실 후의 pssDNA-Express A)의 개략적인 지도이다.
도 9A는 본 발명에 따라 구축된 플라스미드 pssDNA-Express C의 개략적인 지도이다. 도 9B는 플라스미드 pssDNA-Express C에 대한 클로닝 부위, 도립 텐덤 반복부 및 PBS 부위 (화살표)의 개략적인 대표도이다. 도 9C는 플라스미드 pssDNA-Express C의 클로닝 부위, 도립 텐덤 반복부 및 PBS 부위 (화살표)의 서열 지도이다.
도 10A는 5' 및 3' 상보성 서열 사이에 삽입된 10-23 DNA 효소 서열을 갖는 h-ras 안티센스 결합 서열의 23번째 코돈의 부분 서열을 나타낸다. 도 10B는 5' 및 3' 상보성 서열 사이에 삽입된 10-23 DNA 효소 서열을 갖는 c-raf 키나제 안티센스 결합 서열의 부분 서열을 나타낸다. 도 10C는 5' 및 3' 상보성 서열 사이에 삽입된 10-23 DNA 효소 서열을 갖는 플레이오트로핀 안티센스 결합 서열의 부분 서열을 나타낸다. 도 10D는 5' 및 3' 상보성 서열 사이에 삽입된 10-23 DNA 효소 서열을 갖는 SIV 서열의 tat 안티센스 결합 부위의 부분 서열을 나타낸다.
도 11A 및 도 11B는 본 발명에 따라 구축된 플라스미드 pTest로 형질전환된 HeLa 세포주 유래의 RNA/ssDNA 추출물 상에서의 PCR 역전사효소 분석법 (J. Silver, et al., 21 Nucleic Acids Res. 3593-3594 (1993))의 결과를 나타내는 겔이다. 도 11A에서 레인 (1): 크기 마커, (2) 미형질전환된 HeLa 세포, (3) 벡터 pcDNA3.1Zeo+로 형질전환된 HeLa 세포, (4) pssXA로 형질전환된 HeLa 세포, (5) 2 mU의 MoMuLV 역전사효소를 함유하는 양성 대조군 및 (6) 단백질 추출물을 함유하지 않는 음성 대조군. 레인 5에서의 밝은 밴드 대조군(화살표)은 150 bp의 증폭 산물을 가리킨다. 도 11B, 레인 (1) 클론 A12, (2) B8, (3) B12, (4) D7, (5) 2 mU의 MoMuLV 역전사효소를 함유하는 양성 대조군, 및 (6) 단백질 추출물을 함유하지 않는 음성 대조군.
도 12는 본 발명에 따라 구축된 플라스미드 pTest로 형질전환된 HeLa 세포주의 추출물로부터 단일 가닥 DNA의 PCR 증폭을 나타내는 겔이다. 기대되는 ssDNA 산물에 특이적인 프라이머를 사용하는 PCR 반응에서 주형으로서 RNA/ssDNA 제조물을 사용하였다. 왼쪽 패널에서, 레인 1-3: 안정하게 형질전환된 콜로니 A12 (플라스미드 pssDNA-Express A로 안정하게 형질감염된 HeLa 세포주)로부터 단리된 총 RNA/ssDNA PCR 주형 (1): 선행 처리없이 사용, (2) S1 뉴클레아제로 처리, (3) RNAse A로 처리, (4) pcDNA3.1Zeo+ 벡터 만으로 안정하게 형질전환된 콜로니 유래의 총 RNA/ssDNA. 오른쪽 패널, 레인 1-3: 안정하게 형질전환된 콜로니 B12 (플라스미드 pssDNA-Express A로 안정하게 형질감염된 HeLa 세포주)로부터 단리된 총 RNA/ssDNA PCR 주형 (1): 선행 처리없이 사용, (2) S1 뉴클레아제로 처리, (3) RNAse A로 처리, (4) pcDNA3.1Zeo+ 벡터 만으로 안정하게 형질전환된 콜로니 유래의 총 RNA/ssDNA. 레인 (5), 양성 대조군 주형, 플라스미드 pTest.
도 13은 본 발명에 따라 구축된 플라스미드 pTelo로 형질전환된 세포 추출물 유래의 단일 가닥 DNA의 PCR 증폭을 나타내는 겔이다. RNA/ssDNA를 형질감염 36 시간 후 형질감염된 세포 배양물로부터 수확하여 기대되는 ssDNA 산물에 특이적인 프라이머를 사용하는 PCR 반응의 주형으로 사용하였다. 25 bp 레인 마커가 사용되었다. HeLa 세포주 A12에서 단리한 레인 1-5, (1): 총 RNA/ssDNA 분획, (2) S1 뉴클레아제로 처리된 총 RNA, (3) RNAse A로 처리된 총 RNA, (4) 음성 대조군 (5) 양성 대조군 텔로미어 DNA 플라스미드. 레인 6-9 B12 세포주로부터 단리된 RNA (6) 총 RNA 분획, (7) S1 뉴클레아제로 처리된 총 RNA, (8) RNAse A로 처리된 총 RNA, (9) 음성 대조군, (10) 양성 대조군 텔로미어 DNA 플라스미드. 음성 대조군은 도시되지 않음. 45 V에서 20 분 동안 8% 아크릴아미드 겔.
도 14는 시험관내 역전사 반응에 의한 ss-cDNA 해독 산물의 조기 절단을 나타내는 겔이다. 레인 1-5는 본 발명에 따라 구축된 스템-루프 구조 및 루프 부위 내에 클로닝된 다양한 원하는 서열을 갖는 플라스미드 구축물을 나타낸다. 표준 조건하에서 T7 RNA 폴리머라제를 사용한 시험관내 전사에 의해 RNA 주형을 제조한 후 DNAse로 처리하여 플라스미드 주형을 제거하였다. 페놀/클로로포름 추출된 RNA를 생쥐 몰로니 역전사효소로 역전사하고, RNAse로 15 분 동안 처리한 후 45 V에서 30분 동안 6% 아크릴아미드 겔에서 분리하였다. 경계에서 25 bp 마커. (1) 본 발명에 따라 구축된 원 플라스미드 pssDNA-Express-B 유래의 10 ㎕의 RT 반응물, (2) 본 발명에 따라 구축된 원 플라스미드 pTest 유래의 10 ㎕ RT 반응물, (3) 본 발명에 따라 구축된 원 플라스미드 pTelo 유래의 10 ㎕ RT 반응물, (4) 음성 대조군 플라스미드 pcDNA-Zeo (인비트로겐), (5) 3 ㎕의 반복유전자 pssDNA-Express-B.
도 15는 c-raf 키나제 (도 10B)에 대한 안티센스 서열을 생성하며, 이 서열을 포함하는 플라스미드 pssDNA-Express C (도 9)를 시험관내에서 폐 종양 세포주에 형질감염 시킨 후의 "10-23 DNA 효소"를 포함하는, 본 발명에 따라 구축된 안티센스 제조 벡터의 노던 블로팅을 나타낸다.
본 발명의 바람직한 구현예에 대한 본 설명에서, 방법들 및 핵산 구축물은 플랭킹 뉴클레오티드 서열의 존재 또는 부재하에 효모, 원핵세포 및(또는) 진핵세포에서 사실상 미리 정의된 또는 목적의 뉴클레오티드 염기 조성물의 단일 가닥 데옥시리보핵산 (ss-cDNA) 올리고뉴클레오티드를 제조하는 데 사용하기 위하여 설명된다. 뉴클레오티드 염기 조성의 ss-cDNA를 합성하는, 시험관내 방법이 아닌 생물학적 방법, 또는 인공적인 방법을 이용하는 방법들 및 구축물이 설명된다. 생물학적, 즉 효소 반응이 이들 방법에 사용되기 때문에 이들은 임의의 생체내 시스템에 적용될 수 있다.
효모, 원핵세포 및(또는) 진핵세포 내에서 대부분의 인접 벡터 서열 없는 ss-cDNA로서 임의의 DNA 서열을 제조하기 위하여 벡터 (본원에서 사용된 용어 "벡터"는 원하는 DNA 세그먼트를 전달하고 조작하기 위하여 사용되는 플라스미드 또는 변형된 바이러스 구축물을 의미함) 시스템이 고안되었다. 벡터 시스템은 벡터가 전달될 숙주 세포가 ss-cDNA를 제조할 수 있도록 모든 필요한 효소 작용과 신호 지 령을 함유한다. 본 발명의 벡터가 전달된 세포는 상기 설명된 효소가 진핵 프로모터에 의해 작동하는 것처럼 진핵 프로모터에 의하여 작동되어 RNA 전사체를 제조하며 (도 1), 임의의 목적의 단일 가닥 DNA 서열 ("원하는 서열")의 합성을 지배하는 주형으로서 사용된다. 더욱 자세히, 벡터가 효모 또는 임의의 원핵 또는 진핵세포일 수 있는 적합한 숙주 세포로 공형질감염되어 세포내에서 원하는 서열을 포함하는 ssDNA를 제조하는 두 플라스미드를 포함하는 제1 시스템이 본원에서 설명된다. 벡터 시스템이 원하는 서열로부터 안티센스 서열과 같은 저해 핵산의 제조를 위하여 적합한 숙주 세포로 형질감염되는 원하는 서열을 함유하는 단일 플라스미드를 포함하는 제2 시스템이 설명된다.
저해 핵산은 mRNA 주형으로부터 합성된 ssDNA 또는 mRNA 주형 그 자체일 수 있으며, 이들은 상보성 핵산 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. 적절한 표적 서열에 결합함으로써 RNA-RNA, DNA-DNA 또는 RNA-DNA 이중체 또는 삼중체가 형성된다. 이들 핵산은 일반적으로 유전자의 센스 또는 코딩 가닥에 상보적이기 때문에 때때로 "안티센스"로 불리우지만, "센스" 서열도 치료적 목적으로 세포에 이용될 수 있다. 예를 들면, 정상적으로 RNA 또는 DNA에 결합하지 않는 생분자에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드의 동정이 크기, 구조 및 조성이 매우 다양한 많은 생분자에 대하여 입증되었다. 이러한 분자의 예에는 (여기에 제한되지 않음) (1) 트롬빈, 응혈 형성 과정에서 피브리노겐을 피브린으로 전환하는 다기능성 조절 단백질, (2) 브래디키닌, 혈압 조절 및 저혈압에 관련된 노나펩티드 키닌, (3) PGF2 알파, 호르몬 활성을 나타내는 프로스타글란딘 또는 지방산 유도체. 이외에, 올리고뉴클레오티드와 자연적인 생물학적 기능이 기본적으로 세포외인 생분자의 상호작용이 입증되었다 (참조. 예를 들면, 미국특허 제5,840,867호). 따라서, 본원에서 사용된 용어 "저해 핵산"은 "센스" 및 "안티센스" 핵산 모두를 의미한다.
저해 핵산은 표적 핵산에 결합함으로써 표적 핵산의 기능을 저해한다. 이러한 저해 효과는 예를 들면 DNA 전사, mRNA에 대한 프로세싱 또는 폴리 (A) 첨가, DNA 복제, 번역의 차단으로부터 또는 세포의 저해 기작 (RNA 분해의 촉진과 같은)을 촉진함으로써 초래된다. 따라서, 저해 핵산 방법은 유전자 발현을 변경하기 위한 많은 상이한 접근법을 포함한다. 이들 상이한 유형의 저해 핵산은 문헌 (Helene, C. and J. Toulme, 1049 Biochim. Biophys. Acta. 99-125 (1990))에서 설명된다.
요약하면, 저해 핵산 치료 접근법은 (1) DNA 서열을 표적으로 하는 것, (2) RNA 서열 (전구 mRNA 및 mRNA 포함)을 표적으로 하는 것, (3) 단백질을 표적으로 하는 것 (센스 가닥 접근법), 및 (4) 이른바 본원에서 설명된 "10-23 효소"를 포함하여 ssDNA 효소와 같은 표적 핵산의 절단 또는 화학적 변형을 일으키는 것으로 분류될 수 있다. 첫 번째 접근법은 여러 범주로 고려된다. 핵산은 이중체 DNA의 주요 그루브에 결합하여 삼중 헬릭스 또는 "삼중체" 구조를 형성하도록 고안된다. 이외에, 저해 핵산은 복제 또는 전사 동안 이중체 DNA의 개방으로부터 초래되는 단일 가닥 DNA의 부위에 결합하도록 고안된다. 더욱 일반적으로, 저해 핵산은 mRNA 또는 mRNA 전구체에 결합하도록 고안된다. 저해 핵산은 전구-mRNA의 성숙을 방지하는데 사용된다. 저해 핵산은 RNA 프로세싱, 스플라이싱 또는 번역을 방해하도록 고안된다. 두 번째 접근법에서, 저해 핵산은 mRNA를 표적으로 한다. 이러한 접근법에서, 저해 핵산은 코딩된 단백질의 번역을 특이적으로 차단하도록 고안된다. 이러한 두 번째 접근법을 사용하여, 저해 핵산은 중요한 단백질을 코딩하는 mRNA의 번역을 저해하여 특정 세포내 작용을 선택적으로 저해하기 위하여 사용된다. mRNA를 표적으로 하는 저해 핵산은 여러 상이한 기작에 의하여 코딩되는 단백질의 번역을 저해하는 것으로 나타났다. 이러한 저해 핵산의 예는 c-myc 원종양유전자를 과발현하는 인간 전골수구성 백혈병 세포주, HL60에서 c-myc 단백질 발현을 저해하는 c-myc mRNA의 부위에 상보적인 서열이다 (Wickstrom E. L., et al., 85 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1028-1032 (1998); Harel-Bellan, A. et al., 168 Exp. Med. 2309-2318 (1988)).
상기 세포에서 제조된 저해 핵산은 또한 mRNA 번역에 관련된 효소 또는 결합 단백질과 경쟁하거나 포획하도록 유전자 또는 mRNA의 "센스" 가닥을 고안하는 세 번째 접근법을 이용할 수 있다. 마지막으로, 저해 핵산은 표적 유전자 또는 mRNA의 화학적 불활성화 또는 절단을 유도하는 데 사용된다. 화학적 불활성화는 예를 들면 세포 내에서 저해 핵산과 표적 핵산 사이의 가교결합을 유도하고, 본원에서 고려된 방법, 즉 본 발명의 카세트에 도입된 mRNA에 대한 효소 활성을 갖는 서열로 표적 mRNA를 절단함으로써 발생한다.
요약하면, 첫 번째 관점에서 본 발명은 시험관 또는 생체내에서 ss-DNA를 제조하기 위하여 세포내로 전달하기 위하여 개조된 유전 요소 세트를 포함한다. 유전 요소 세트는 세포내로 전달하기 위한 하나 이상의 벡터에 혼입되며,
(a) RNA 의존성 DNA 폴리머라제 (역전사효소) 유전자, 및
(b) (1) 도립 텐덤 반복부 (IR), (2) 도립 텐덤 반복부 (IR) 사이 또는 도립 텐덤 반복부에 대하여 3'에 위치한 원하는 서열, 및 (3) 도립 텐덤 반복부에 대하여 3'에 위치한 역전사효소에 대한 프라이머 결합 부위 (PBS)를 포함하는 카세트를 포함한다.
또한, 벡터 시스템은 바람직하게는 이들 요소를 생체내에서 전사하기 위한 기능 및 신호 지령과 역전사효소 (RT) 유전자의 번역을 위한 기능 및 신호 지령을 포함한다. 본 발명의 유전 요소의 세트에 포함될 수 있는 추가의 요소에는 하기 설명되는 목적상 포함될 수 있는 제한효소 (RE) 유전자, 및 선형화된 ss-DNA가 서열에 효소 활성을 부여하는 2차 형상으로 폴딩될 때 효소 활성을 갖는 서열을 포함한다. 효소 서열은 바람직하게는 원하는 서열이 도립 텐덤 반복부 사이 또는 도립 텐덤 반복부의 3' 측과 PBS 사이에 위치하는 지에 상관없이 원하는 서열 내에 위치한다.
본원에서 설명된 벡터 시스템의 첫 번째 구현예에서, 벡터는 두 플라스미드 시스템을 포함하며, 제1 플라스미드는 제한효소 유전자에 히스티딘-프롤린 링커로 연결된 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 (역전사효소) 유전자 및 RNAse H 유전자를 포함한다. 이들 유전자가 삽입된 플라스미드는 폴리아데닐화 꼬리 서열과 함께 이들 유전자에 필요한 전사 및 번역 조절 요소를 함유한다. 이러한 플라스미드를 본원에서 "A" 플라스미드 (본원에서 설명된 바람직한 구현예 중 하나로 도 4에서 설명된 pssDNA-Express A)로 언급한다. 본원에서 설명된 구현예에서 상기 열거된 요소 중 3가지, 즉 역전사효소에 부합되는 프라이머 결합 서열 (PBS), 원하는 서열 및 도립 텐덤 반복부로 이루어진 카세트를 포함하는 두 번째 "B" 플라스미드가 구축된다. 본원에서 설명된 두 구현예 (pMN-new-link 및 pssDNA-Express-4B, 후자는 도 7B에 나타냄)에서, 원하는 서열은 도립 텐덤 반복부 사이 또는 프라이머 결합 서열 (PBS)에 대하여 5' 위치 (mRNA 전사체에 대해)에 위치하고, PBS는 mRNA 전사체의 가장 3' 측에 위치한다. 달리 말하면, 원하는 서열은 (1) 도립 텐덤 반복부 사이, (2) 도립 텐덤 반복부 및 PBS 사이, 및(또는) (3) 도립 텐덤 반복부 사이와 도립 텐덤 반복부와 PBS 사이 모두에 위치한다. 플라스미드 A 처럼, 플라스미드 B도 또한 전사 조절 요소의 조합물을 포함한다. 그러나, 본원에서 설명된 하나 이상의 바람직한 구현예에서, B 플라스미드는 이러한 구축물로부터 단백질 산물이 생성되지 않기 때문에 전사 조절 요소를 포함 (또는 요구)하지 않는다.
본원에서 설명된 또 다른 구현예에서, 본 발명의 벡터 시스템은 상기 열거된 유전 요소 세트중 하기 논의에서 분명해지는 이유로 포함되지 않는 RE 유전자를 제외한 모든 요소가 혼입된 플라스미드 C로 지정된 단일 플라스미드를 포함한다. 이외에, 상기 설명된 두 플라스미드 시스템의 B 플라스미드에 포함된 카세트의 성분, 예를 들면 프라이머 결합 서열 (PBS), 원하는 서열 및 도립 텐덤 반복부는 C 플라스미드에서 역전사효소 다중단백질의 미번역된 3' 부위에 존재한다. 다른 말로, C 플라스미드의 RT-RNAse H 성분이 적절한 프로모터 (본원에서 설명된 바람직한 구현예에서, RSV 프로모터가 사용되었다)의 조절하에 전사될 때, 생성된 mRNA 전사체는 역전사효소-RNAse H 다중단백질의 코딩 부위를 함유하고, 정지 신호에서의 번역 말단에 추가의 mRNA 전사체는 (이러한 번역된 단백질의 3'에) RT-RNAse H 성분으로부터 온전하게 남아있는 폴리아데닐화 신호에 대한 3' 하류의 신호 사건을 갖는 B 플라스미드 유래의 요소들을 함유한다.
본원에서 설명된 특정 단일 플라스미드 벡터 시스템 (도 9에서 나타낸 pssDNA-Express C)은 제한효소 유전자를 함유하지 않으며 따라서, 도립 텐덤 반복부에 의하여 형성된 스템-루프 중간체의 스템을 절단할 수 있는 능력을 포함하지 않는다. 결과적으로, 원하는 서열 (DNA 효소 포함)은 C 플라스미드에 도립 텐덤 반복부에 대하여 단지 3' 위치로만 삽입되고, 원하지 않는 벡터 서열은 전사체가 상대적으로 안정한 스템과 만나면서 ss-cDNA 산물의 조기 절단에 의하여 제거되어 mRNA 전사체로부터 ss-cDNA를 전사하는 것을 계속할 수 없다. 더욱 구체적으로, 하기 설명에서 명백해지는 것처럼, 원하는 서열 각각은 단지 pssDNA-Express C 플라스미드의 BamHI-PacI 제한 부위 내에만 삽입된다.
B 및 C 플라스미드에 대한 하기 설명으로부터 명백해지는 바와 같이, 플라스미드는 원하는서열의 삽입을 위한 클로닝 부위를 포함한다. 본원에서 설명된 B 플라스미드의 바람직한 구현예에서 NotI 부위 (도립 텐덤 반복부 사이에 위치) 및 PacI/BamHI (도립 텐덤 반복부에 대하여 3', 즉 도립 텐덤 반복부 및 PBS 사이) 부위 모두가 제공된다. 본원에서 설명된 바람직한 C 플라스미드는 단지 이러한 목적의 PacI/BamHI 부위를 포함한다. 그러나, 이러한 개시의 이점을 갖는 당업자는 이들 특정 클로닝 부위가 본원에서 설명된 특정 시스템을 위하여 선택되며, 다른 클로닝 부위가 이러한 동일 목적으로 동일하게 유용할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 본원에서 설명된 두 플라스미드 벡터 시스템을 포함하는 특정의 A 플라스미드는 원하는 서열을 포함하는 것을 의도하는 것은 아니지만, 이러한 개시의 이점을 갖는 당업자는 두 플라스미드 벡터 시스템이 사용된다면 본 발명의 유전 요소 세트의 요소, 및 구체적으로 원하는 서열이 편리함에 따라 한 플라스미드에 삽입될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
본원에서 카세트로서 언급된 핵산 서열은 표적 세포에서 ss-cDNA의 합성을 위한 주형을 제공한다. 이것은 원하는 서열, 도립 텐덤 반복부 및 프라이머 결합 부위를 포함하는 요소이다. 본 발명의 유전 요소 세트의 다른 요소의 경우에서처럼, 이러한 유전 요소는 유전 요소의 상류에 위치한 바람직하게는 CMV 프로모터와 같은 적절히 넓은 범위 또는 조직-특이적 프로모터/인핸서, 또는 프로모터/인핸서의 조합물에 의해 조절된다. 또한, 다른 유전 요소의 경우에서 처럼, 프로모터/인핸서는 구성적 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 이러한 개시의 이점을 갖는 당업자는 SV-40, RSV (비세포 유형 특이적) 또는 조직 특이적 신경교원섬유 산 단백질 (GFAP)을 포함하는 원하는 서열의 발현을 이롭게 조절하기 위하여 많은 다른 진핵세포의 프로모터가 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
도 1에서 나타낸 것처럼, 진핵 세포에서의 발현의 경우, 상기 카세트는 또한 원하는 서열에 의하여 제조된 mRNA가 폴리(A) 꼬리를 갖도록 하류의 폴리아데닐화 신호 서열을 포함할 수 있다. cDNA 합성의 개시를 위한 프라이머 결합 부위 (PBS)는 3' 도립 텐덤 반복부 및 폴리아데닐화 신호 사이에 위치한다. 상기 PBS는 진핵 표적세포 내에 존재하는 전달 RNA (tRNA)에 상보적인 서열이다. 본원에서 설명된 생쥐 몰로니 역전사효소가 본 발명과 관련하여 이용되는 경우에, PBS는 프롤린 tRNA를 이용한다. 본원에서 설명된 제시된 본 발명의 바람직한 구현예와 관련하여 이용되는 PBS는 생쥐 몰로니 바이러스의 실제 18 뉴클레오티드 서열 부위로부터 취하였다 (참조. 293 Nature 81). 상기 논의된 것처럼 실험된 인간 면역결핍 바이러스 유래의 역전사효소 유전자의 경우에, 사용되는 PBS는 HIV의 뉴클레오티드 서열로부터 취하였다 (Y. Li, et al., 66 J. Virology 6587-6600 (1992)). 요약하면, 본 발명의 방법과 관련하여 이용되는 역전사효소에 부합하는 임의의 PBS가 이러한 목적으로 이용된다.
또한, 본 발명의 카세트는 한 쌍의 도립 텐덤 반복부를 포함한다. RNAse H에 의하여 mRNA-cDNA 이종이중나선가닥로부터 mRNA를 절단하여 ss-cDNA를 방출한 후에, 도립 텐덤 반복부는 ss-cDNA를 그 자체로 폴딩하여 스템-루프 구조의 스템을 형성하며, 이 스템은 이중 가닥의 반 평행의 DNA로 이루어진다. 제조된 ss-cDNA는 (도립 텐덤 반복부로 이루어진) 스템 및 원하는 서열을 함유하는 루프에 플랭킹된 5' 및 3' 코딩 부위로 전사된다. 하나 이상의 기능성 유전 요소가 이중 가닥 부분, 즉 스템-루프 중간체의 스템을 형성하는 도립 텐덤 반복부로 고안될 수 있다. 본원에서 설명된 실시예에서, 기능적 유전 요소는 상기 설명된 제한효소 유전자로부터 제조된 제한효소에 의해 절단되는 하나 이상의 제한효소 부위이지만 (RE 유전자를 포함하는 플라스미드의 경우), 당 분야의 숙련자는 도립 텐덤 반복부가 (제한효소 부위 이외의) 특정 효소 인식 서열, 진핵 및(또는) 원핵세포 수용체 인식 부위, 단리된 시스-배향 방식으로 표적 서열 (스템으로 고안되거나 고안될 수 없는)의 발현을 작동시키기 위한 프로모터 또는 프로모터/인핸서 부위와 같은 다른 기능적 유전 요소를 포함하도록 고안될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 기능적 유전 요소가 제한효소 부위와 같은 특정 효소 인식 서열을 포함하는 경우, 스템은 스템으로 고안된 절단 부위를 인식하는 임의의 많은 제한효소 (본 발명의 벡터 시스템에 RE 유전자가 포함되지 않는 경우에 조차 제한효소 인식 부위가 스템으로 고안될 수 있음에 주의)에 의해 절단되어 (또한 분해 또는 분열로 명명함), ss-cDNA 루프를 방출한다. 임의의 명백한 이중체 DNA를 형성하지 않는 ss-cDNA의 루프 부분은 제한효소가 표적 기질로서 단지 이중 가닥 DNA를 인식하기 때문에 제한효소 활성에 면역성이다.
본 발명의 제2 관점이 이용된다면, 스템-루프 중간체의 스템을 형성하는 도립 텐덤 반복부에 제한효소 부위가 고안될 필요가 없다는 것은 당 분야의 숙련자는 인식할 것이다. 달리 말하면, 카세트의 전사가 도립 텐덤 반복부에 의하여 형성된 스템에서 종결되면서 프라이머 결합 부위와 도립 텐덤 반복부 사이에 위치한 제2의 원하는 서열로부터 ssDNA를 제조하는 것이 소망된다면, 스템에 제한효소 부위가 필요하지 않다. 도립 텐덤 반복부가 선택된 세포내 단백질에 경쟁적으로 작용할 수 있는 진핵, 원핵 또는 바이러스 단백질 DNA 결합 부위를 함유하도록 고안하는 것도 또 다른 선택 조건이다. 선형의 또는 명백히 절단된 스템-루프 중간체 형태의 ss-DNA가 제조되도록, 도립 텐덤 반복부의 구축물을 위하여 선택된 염기쌍 조성에 따라 제한효소 부위 또는 다른 서열 특이 요소의 조합이 도립 텐덤 반복부에 포함될 수 있다. 일반적으로, (기능적 유전 요소가 제한효소 부위라면) 자연적으로 발생 하는 도립 텐덤 반복부가 적절히 배열된 제한부위를 갖지 않기 때문에, 도립 텐덤 반복부에 합성적으로 구축된 기능적 유전 요소를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 논의한 것처럼, 본 발명의 유전 요소의 세트의 요소 중 하나를 포함하는 카세트는 또한 선택적으로 촉매적 활성을 갖는 DNA 서열을 포함한다. 이른바 카세트 내에 "DNA 효소"가 포함되고, 구체적으로 DNA 효소는 원하는 서열 내에 위치하는 것으로 고려되기 때문에, 본 발명은 원하는 서열이 안티센스 서열인 저해 핵산의 합성을 우한 주형으로서 제공될 때 특정의 이점을 제공한다. 이러한 이유로, 본원에 기재된 실시예는 도 10에 나타낸 것과 같은 4개의 안티센스 서열의 제조를 설명하며, 이들 각각은 c-raf 키나제, h-ras 안티센스 서열, 플레이오트로핀 맥관형성 성장 인자에 대한 안티센스 서열 및 유인원 면역결핍 바이러스 (SIV)의 tat 부위를 포함하여, mRNA에 대해 효소 활성을 갖는 서열을 포함한다. 그러나, 당 분야의 숙련자들은 본 발명이 안티센스 서열에만 제한되는 것이 아니며, 저해 핵산 서열은 또한 상기 설명된 임의의 다른 유형의 저해 핵산 서열일 수 있다는 것을 인식할 것이다.
본 발명의 카세트를 포함하는 효소 활성을 갖는 핵산 서열은 임의의 이러한 효소적 서열일 수 있다. 목적의 촉매 활성을 갖는 서열이 두 위치, 즉 (a) 도립 텐덤 반복부 사이와 원하는 서열 내 또는 (b) 도립 텐덤 반복부에 대하여 3' 및 PBS에 대하여 5'에 위치한 원하는 제2 서열 내 중 하나 또는 모두에서 카세트에 삽입될 수 있다. 어떤 방식이든지, 생성된 앱타머는 원하는 서열의 표적에 특이적이며, 따라서 다른 DNA 서열, mRNA 서열, 및 임의의 적합한 기질을 표적으로 하여 DNA 또는 mRNA 스플라이싱 기작을 저해하거나 또는 변화시키기 위하여, 또는 심지어는 특이적 방식으로 세포내 게놈을 직접 변경하기 위하여 사용된다.
본 발명과 관련하여 사용하기에 적합한 효소 활성을 갖는 핵산 서열은 하기 서열을 포함하나 이들에 제한되지 않는다.
- 이른바 "10-23" 및 "8-17 효소" (Santoro, S.W. and G.F. Joyce, 상기 문헌 (1997)) 및 다른 금속-의존성 RNAse (Breaker, R.R. and G.F. Joyce, 1 Biol. Chem. 223-229 (1994); Breaker, R.R. and G.F. Joyce, 2 Biol. Chem. 655-660 (1995)) 및 히스티딘-의존성 RNAse (Roth, A. and R.R. Breaker, 95 Proc. Natl Acad. Sci. USA 6027-6031 (1998))과 같은 RNAse 활성을 갖는 서열;
- 구리-의존성 DNAse (Carmi, N., et al., 3 Chem. Biol. 1039-1046 (1996); Carmi, N., et al., 95 Proc. Natl Acad. Ser. USA 2233-2237 (1998); Sen, D. and C. R. Geyer, 2 Curr. Opin. Chem. Biol. 680-687 (1998)) 및 파울하머 및 파물록 (269 J. Molec. Bio. 18-203 (1997))에 의하여 보고된 것처럼 조인자로서 이가 금속 이온을 필요로 하며 이가 금속 이온과 독립적으로 기질을 가수분해하는 DNAse와 같은 DNAse 활성을 갖는 서열;
- 구리-의존성 DNAse (Breaker, R.R. 97 Chem. Rev. 371-390 (1997)) 및 아연-의존성 E47 리가제 (Cuenoud, B. and J.W. Szostak, 375 Nature 611-613 (1995))와 같은 DNA 리가제 활성을 갖는 서열;
- 칼슘-의존성 DNA 키나제 (Li, Y. and R.R. Breaker, 96 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2746-2751 (1999))와 같은 DNA 키나제 활성을 갖는 서열; 및
- 칼슘-의존성 DNA 키나제 (Li, Y., 상기 문헌)와 같은 RNA 키나제 활성을 갖는 서열.
본원에서 설명된 실시예에서 이용된 효소 활성을 갖는 특정의 핵산 서열은 "10-23 효소" (Santro, S.W. and G.F. Joyce, 상기 문헌 (1997))이며, 이러한 효소 서열은 도 3A 및 3B에서 개략적으로 제시된다. 그러나, 당 분야의 숙련자들은 본 개시로부터 상기 열거된 문헌에 보고된 임의의 서열이 본 발명의 카세트에 삽입될 때 의도된 목적을 위한 기능을 할 것이라는 것을 이해할 것이다.
상기 논의한 것처럼, RNA-의존성 DNA 폴리머라제 또는 본 발명의 유전 요소 세트의 한 요소를 포함하는 역전사효소 (RT) 유전자와 관련하여, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 유래의 역전사효소/RNAse H 유전자가 본원에서 설명되는 실시예에서 이롭게 사용되었다. 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 유래의 역전사효소/RNAse H 유전자도 또한 실험되었다. SIV, 간염 B, 간염 C 균주, 세균성 레트론 요소 및 각종 효모 및 세균 종으로부터 단리된 레트론을 포함하여 많은 다른 레트로바이러스 역전사효소/RNAse H 유전자가 본 발명과 관련하여 이롭게 사용될 수 있으며, 역전사효소/RNAse H 유전자가 진핵세포에서 발현하기 위한 사이토메갈로바이러스 (CMV) 또는 로우스 사코마 바이러스 (RSV) 프로모터와 같이 적절한 상류 프로모터/인핸서에 의해 조절되는 역전사효소/RNAse H 유전자인 것이 바람직하다.
자연상에서 발견된 것처럼, 이들 RNA-의존성 DNA 폴리머라제는 일반적으로 동일한 코딩 전사체내에서 관련 RNase H 성분 효소를 갖는다. 그러나, 본 발명은 특정 역전사효소를 위한 자연적으로 발생하는 RNase H 유전자를 필요로 하지 않는다. 달리 말하면, 당 분야의 숙련자는 이러한 개시로부터 역전사효소 및 RNase H 유전자의 여러 조합이 본 발명과 관련하여 사용하기 위하여 함께 스플라이싱되어 이러한 기능을 수행할 수 있으며, 이들 두 효소 시스템의 변형 및(또는) 혼성 형태가 의도된 방식으로 기능하도록 당업자에게 이용될 수 있고(거나) 공지된 것이라는 것을 인식할 것이다. 또한, 당 분야의 숙련자들은 표적 세포 그 자체가 이러한 기능을 수행하기에 충분한 내생의 RNase H를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 유사하게, 당 분야의 숙련자들은 표적 세포 그 자체가 예를 들면 선행의 레트로바이러스 감염에 앞서 이러한 기능을 수행하기에 충분한 내생의 역전사효소 활성을 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
또한, 역전사효소/RNAse H 유전자는 바람직하게는 역전사효소/RNAse H 유전자로부터 제조된 mRNA가 mRNA 안정성을 위한 3' 폴리(A) 꼬리를 포함하도록 하류의 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다. 당 분야의 숙련자에게 공지된 것처럼, 다중 폴리(A) 꼬리는 발현된 진핵세포 유전자의 제조를 위하여 이용가능하며, 일반적으로 사용된다.
상기 세포에서 제조된 역전사효소는 주형으로서 하기 설명되는 원하는 서열을 포함하는 유전 요소를 사용하여 상보성 DNA (cDNA)를 합성한다. 세포 내에서 내생의 RNAse 활성과 함께 역전사효소의 RNase H 활성은 생체내에서 RNA/cDNA 하이브리드의 mRNA 주형 성분을 분해하여 ss-DNA를 제조한다.
제한효소를 코딩하는 유전자 (단지 두 플라스미드 시스템, 및 이러한 시스템의 요구되는 성분이 아닐 때 조차 사용됨)는 제한효소를 코딩하는 임의의 여러 유 전자일 수 있으며, 바람직하게는 하기 설명되는 하나 이상의 구성적 또는 유도성의 넓은 범위 및(또는) 조직-특이적 프로모터/인핸서에 의해 조절되는 것이다. 본원에서 이용되는 특정 제한효소는 MboII 및 FokI이었지만, 이러한 개시의 이점을 알고있는 당 분야의 숙련자들은 임의의 제한효소 (유형 I, II, IIS 또는 III) 부위가 도립 텐덤 반복부에 포함될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이들 효소는 스템-루프 중간체의 스템을 "자르거나" 또는 절단하여 원하는 서열을 단일 가닥 DNA 서열로 선형화한다.
RE 유전자의 발현이 인간 세포에서의 발현을 위한 CMV 또는 RSV 프로모터와 같은 제한효소 유전자로부터 상류에 위치한 적절한 구성적 또는 유도성 프로모터/인핸서에 의해 조절될 수 있지만, 본원에 개시된 플라스미드 pssDNA-Express A에서 RE 유전자 (MboII)는 RT-RNAse H 폴리펩티드에 연결된다. 또한, RE 유전자는 바람직하게는 제한효소 유전자로부터의 mRNA 전사체가 3' 폴리(A) 꼬리를 갖도록 하류 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다.
이러한 개시의 이점을 알고 있는 당 분야의 숙련자들은 또한 많은 조직-특이적 또는 넓은 범위의 프로모터/인핸서 또는 상기 열거된 것 이외의 프로모터/인핸서의 조합이 역전사효소/RNAse H 유전자, RE 유전자 (이용된다면), 및 원하는 서열을 조절하는 데 이롭게 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 상기 논의된 것처럼, 본 발명을 예시하기 위하여 모든 이용가능한 프로모터/인핸서의 목록이 필요하지는 않지만, 상기 프로모터/인핸서는 구성적 또는 유도성일 수 있으며, CMV 또는 RSV (비세포 유형 특이적) 또는 GFAP (조직 특이적) 프로모터/인핸서 및 많은 다른 바이러스성 또는 포유류 프로모터를 포함할 수 있다. 본 발명의 요소와 관련하여 사용하기에 적합한 대표적인 프로모터/인핸서에는 HSVtk (S.L. McKnight, et al., 217 Science 316 (1982)), 인간 β-글로불린 프로모터 (R. Breathnach, et al., 50 Ann. Rev. of Biochem. 349 (1981)), β-액틴 (T. Kawamoto, et al., 8 Mol. Cell Biol. 267 (1988)), 쥐 성장 호르몬 (P.R. Larsen, et al., 83 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8283 (1986)), MMTV (A.L. Huang, et al., 27 Cell 245 (1981)), 아데노바이러스 5 E2 (M.J. Imperiale, et al., 4 Mol. Cell. Biol. 875 (1984)), SV40 (P. Angel, et al., 49 Cell 729 (1987)), α-2-마크로글로불린 (D. Kunz, et al., 17 Nucl. Acids Res. 1121 (1989)), MHC 유형 I 유전자 H-2kb (M.A. Blanar, et al., 8 EMBO J. 1139 (1989)) 및 흉선 자극 호르몬 (V.K. Chatterjee, et al., 86 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9114 (1989))가 포함되나 이들에 제한되지 않는다.
본 발명의 유전 요소 세트를 포함하는 요소가 벡터에 혼입될 때, 벡터를 운반하는 세포의 동정을 촉진하고(거나) 카세트 발현 수준을 증가시키기 위하여 상기 벡터가 다른 특정 유전 요소를 함유하는 것이 바람직하다. 특정 유전 요소에는 벡터가 원핵세포 시스템에서 형질전환되고 증폭될 수 있도록 선별 마커 유전자를 포함한다. 예를 들면, 대부분 일반적으로 사용되는 선별 마커는 세균 (예를 들면, 이. 콜라이 (E. coli))에게 암피실린, 클로람페니콜, 카나마이신 (네오마이신) 또는 테트라사이클린과 같은 항생물질에 대한 내성을 부여하는 유전자이다. 또한, 상기 벡터가 진핵세포 시스템에서 후속의 형질감염, 동정 및 발현을 위한 특정 유전 요소를 함유하는 것이 바람직하다. 진핵세포(예를 들면, 차이니스 햄스터 난소: CHO)에서의 발현을 위하여, 세포에게 항생물질 또는 다른 약물에 대한 내성을 부여하거나 또는 형태학적 변화, 접촉 저해의 손실 또는 성장률의 증가와 같이 세포의 표현형을 변경하는 다중 선별 전략이 사용될 수 있다. 진핵세포 시스템에서 사용되는 선별 마커에는 제오신에 대한 내성 마커, G418에 대한 내성, 아미노글리코시드 항생물질에 대한 내성 또는 β-gal 또는 녹색 형광 단백질과 같은 표현형 선별 마커가 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
적절한 벡터로의 이들 성분의 혼입은 ssDNA의 제조 후에 소정의 벡터 서열을 제거하기 위한 편리한 두 방법을 허용한다. 첫 번째 방법에서, 제조된 ssDNA 스템-루프 중간체의 루프 부분은 원하는 핵산서열로 이루어지며, 제한효소를 사용한 절단 후에 플랭킹 서열없이 선형화된 단일 가닥 cDNA로서 루프가 방출된다. 원하는 제2 서열이 도립 텐덤 반복부에 대하여 3'으로 카세트에 포함된 두 번째 방법에서, 역전사는 생성된 ssDNA가 플랭킹 서열없이 제조되도록 스템-루프 구조의 스템에서 종결된다. 두 번째 방법을 이용하여 ssDNA를 제조하는 것이 소망된다면, 상기 카세트는 본 발명의 첫 번째 관점에 따라 스템의 절단에 의하여 ssDNA가 제조되는 스템-루프 중간체의 스템보다 더욱 안정한 스템을 형성하는 도립 텐덤 반복부를 갖도록 고안된다. 본 발명의 첫 번째 관점에 따라 쉽게 변성되는 스템을 형성하는 도립 텐덤 반복부를 갖도록 카세트를 고안함으로써, 역전사 반응은 원하는 제2 서열 (카세트로 고안되었을 때 조차)을 통하여 도립 텐덤 반복부 사이에 위치한 원하는 서열까지 진행한다. 안정성이 중간 정도인 스템은 원하는 제1 및 제2 서열 모두의 제조를 허용한다.
29 염기쌍을 포함하는 스템을 갖는 벡터를 시험관 실험에 사용하였을 때 이러한 스템 구조물의 3' 측에서 역전사효소 cDNA 전사체의 "조기 종결"이 발견되었으며, 스템에 포함된 추가의 염기쌍은 원하는 제1 및 제2 서열 모두의 제조를 초래하는 추가의 안정성을 제공한다. 제1 (도립 텐덤 반복부 사이) 또는 제2 (도립 텐덤 반복부의 3' 측과 PBS 사이)를 제조하기 위하여 목적의 안정성의 스템을 갖는 스템-루프 중간체의 고안은 본 개시의 이점을 갖는 당 분야의 숙련자의 인식내에 있다. 요약하면, 도립 텐덤 반복부의 길이 (예를 들면, 반복유전자를 포함하는 뉴클레오티드의 수) 및 반복유전자를 포함하는 염기의 동정과 같은 요인이 조작되어 (예를 들면 본원에서 설명된 시험관 시스템을 사용) 원하는 제1 또는 제2 서열 또는 이들 서열의 혼합물을 제조하기 위하여 필요할 수 있는 안정성을 갖는 스템을 얻을 수 있다.
또한, 이러한 설명은 당 분야의 숙련자에게 온전한 스템-루프 ss-cDNA 구조가 선형화된 ss-cDNA 형태와 유사하게 많은 용도에서 기능할 수 있다는 것을 증거한다. 결과적으로, 카세트는 또한 제한효소 유전자 및 관련 조절 요소없이 및(또는) 해당 제한효소 부위과 없는 원하는 서열에 이롭게 사용된다.
본 발명의 바람직한 구현예의 이러한 설명으로부터 "정돈된 (trimmed)" 스템-루프 구조를 갖는 ss-cDNA를 코딩하는 카세트가 제조될 수 있다는 것이 당분야의 숙련자에게 증거된다. 원하는 서열에 플랭킹된 도립 텐덤 반복부에서 코딩되는 제한효소 부위는 스템 부분 (이중체 형성 후)이 전사체가 상기 설명된 스템-루프 구조를 유지하기에 충분한 이중체 DNA를 남기면서 스템 및 관련 플랭킹 서열의 부분을 제거하는 방식으로 스템을 포함하는 dsDNA가 절단되도록 해당 제한효소로 절단되도록 고안된다. 이러한 ss-cDNA 구조는 이중 가닥 형태에 ss-DNA 말단을 보유함으로써 세포내 뉴클레아제에 더욱 내성일 수 있다.
또한, 당 분야의 숙련자에게는 스템 (이중체 DNA)가 특정 DNA-결합 단백질에 인식되고 결합되는 지정된 서열 (또는 서열들), 즉 앱타머를 함유하도록 고안될 수 있다. 다른 용도 중에서, 이러한 스템 구조는 세포내에서 특정 유전자 기능을 조절하는 선택된 단백질의 역가에 대한 경쟁자로서 사용된다. 예를 들면, ss-cDNA 스템-루프는 본 발명에 따라 아데노바이러스 E1a와 같은 선택된 양성 전사 인자에 대한 결합 부위를 함유하는 세포에서 제조된다. 다른 종양유전자와 같이 아데노바이러스 E1a는 세포 코딩된 전사 인자의 활성에 영향을 미쳐 여러 아데노바이러스 및 세포 유전자의 발현을 조절하여 정상 세포를 형질전환된 세포로 변화시킨다 (Jones, et al., 2 Gene Dev. 267-281 (1988)). 따라서, 본 발명에 따라 제조된 스템-루프 중간체의 이중체 스템은 이러한 전사 인자를 결합하는 작용을 하고, 단백질이 프로모터에 결합하는 것을 방지하고, 따라서 특정 해로운 유전자의 발현을 저해하도록 고안된다. 당 분야의 숙련자에게 이중체 스템 구조는 선택적으로 다중 결합 부위, 예를 들면 특정 유전자의 발현을 활성적으로 조절하는 각종 전사 인자에 의해 인식되는 부위를 함유할 수 있다는 것은 명백하다. 예를 들면, 아데노바이러스 E1a가 포르볼 에스테르 반응성 요소, 12-O-테트라데카노일포르볼 13-아세테이트 (TPA), 많은 다른 분열촉진 인자 및 ras, mos, src 및 trk 종양유전자에 의한 전사 유도를 담당하는 프로모터 요소를 통하여 콜라게나제 유전자의 전사를 저해하는 것이 발견되었다. 상기 기작은 전사 인자 패밀리 AP-1 기능의 저해와 관련된다 (Offringa, et al., 62 Cell 527-538 (1990)). 임의의 소망되는 뉴클레오티드 서열이 스템-루프 중간체의 "루프" 부분을 코딩하는 유전 요소에 삽입되어 궁극적으로 소망되는 저해 기능, 예를 들면 본원에서 설명된 안티센스 결합, 유전자의 하향 조절 등을 수행할 수 있다.
당 분야의 숙련자에게 인식되는 또 다른 관점에서, 본 발명은 형태적 2차 구조 폴딩을 기초로 하는 cDNA 전사체에 생물학적 반응을 부여하는 복합 2차 ssDNA 구조물을 구축하는 데 사용된다. 이러한 2차 구조는 임의의 여러 기능을 제공하도록 가공될 수 있다. 예를 들면, 원하는 서열은 아데노 관련 바이러스의 긴 말단 반복유전자 또는 레트로트랜스포존에서 발견되는 것과 같은 이른바 "클로버 잎" 또는 "원뿔"형 유사 구조를 형성하는 단일 가닥 cDNA 전사체의 루프 부분에 도입되는 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 정확한 환경하에서, 이러한 구조는 부위-특이적인 방식으로 숙주 게놈에 통합된다.
본 발명의 유전 요소 세트가 포유류 및 인간 치료 목적을 위해 다수의 상업적으로 시판되는 전달 벡터로의 혼입용으로 개조될 수 있기 때문에, 특정의 표적 세포를 위하여 선택된 벡터에 따라 다수의 전달 경로가 가능하다. 예를 들면, 환자의 세포를 형질전환하고 DNA를 게놈내에 도입하기 위하여 가장 빈번하게 사용되는 수단으로는 바이러스 벡터가 제시된다. 한 간접적인 방법에서, 새로운 유전 정보를 수반하는 바이러스 벡터를 사용하여 신체로부터 제거된 표적 세포를 감염시키고, 그 후 감염된 세포를 재이식한다 (즉, 생체외). 리포좀 내에 캡슐화된 DNA 및 바이러스성 외피 수용체 단백질을 함유하는 프로테오리포좀에 포획된 DNA의 제형을 위하여 생후 동물로의 직접적인 생체내 유전자 전달이 보고되었다 (Nicolau, et al., 80 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1068-1072 (1983); Kaneda, et al., 243 Science 375-378 (1989); Mannino, et al., 6 Biotechniques 682-690 (1988)). 칼슘 포스페이트 공침전된 DNA를 사용한 긍정적인 결과가 설명된다 (Benvensity and Reshef, 83 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9551-9555 (1986)). 이롭게 사용될 수 있는 다른 시스템에는 정맥내, 근육내 및 피하 주입뿐만 아니라 직접 종양내 및 강내 주입이 포함된다. 선택된 벡터에 혼입될 때 유전 요소 세트는 또한 국소, 점막, 직장, 경구, 또는 흡입형 전달 방법을 통하여 이롭게 투여된다.
본 발명의 유전 요소의 세트를 포함하는 벡터는 원하는 특정 서열을 카세트 (도립 텐덤 반복부 사이 또는 PBS와 도립 텐덤 반복부 사이)에 스플라이싱하기 위한 공지된 절단 및 라이게이션 기술을 사용하여 안티센스, 삼중체 또는 원하는 임의의 다른 저해 핵산 또는 단일 가닥 뉴클레오티드 서열을 전달하는 데 이롭게 사용된다. 본 개시의 이점을 갖는 당 분야의 숙련자들은 진핵세포에서 발현하기 위하여 사용되는 상기 설명된 신호가 특정의 원하는 서열에 따라 당분야에 공지된 방식으로 변형될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들면, 원하는 서열을 발현하는 것이 기대되는 시스템에서 카세트에 이로운 발현 특성을 부여할 수 있도록 프로모터를 변화하기 쉽다. 많은 가능한 프로모터 및 다른 신호들이 있으며, 이들은 원하는 서열이 선별되는 특정 표적 서열에 의존하며, 특정 표적 세포 및 원하는 서열에 바람직할 수 있는 이들 모든 가능한 인핸서, 유도성 및 구성적 프로모터 시스 템, 및(또는) 폴리(A) 꼬리 시스템을 열거하는 것은 불가능하다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 상기 설명된 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 및 그에 클로닝된 제한효소 유전자뿐만 아니라 키트의 사용자가 원하는 특정 서열을 삽입하는 다중 클로닝 부위를 갖는 플라스미드로 이루어진 키트 형태를 취한다. 원하는 서열이 삽입되는 클로닝 부위는 상기 설명된 도립 텐덤 반복부의 사이, 예를 들면 프라이머 결합 부위를 코딩하는 유전 요소의 상류에 위치한다. 생성된 플라스미드는 세포 배양액으로부터 정제되어, 유지되고, 동결건조되거나 또는 패키징 및 포장을 위하여 보존되어 사용자에게 보내진다. 상기 키트는 바람직하게는 원하는 서열이 클로닝되는 클로닝 부위에 대한 제한효소, 리가제 및 기타 효소와 함께 원하는 서열을 플라스미드에 라이게이션하기 위한 적합한 완충액 및 사용자를 위한 플라스미드 지도 및(또는) 기타 사용자를 위한 지시문을 포함한다.
본원에서 설명된 구현예에서, 원하는 서열은 세포와 상기 열거된 하나 이상의 유전 요소를 포함하도록 고안되고 구축된 A 및 B로 지정된 두 플라스미드, 또는 단일의 C 플라스미드와 함께 공감염시켜 숙주 세포에 전달된다. 요약하면, 두 플라스미드 시스템에서, B 플라스미드는 도립 텐덤 반복부를 포함하는 플랭킹 서열 내에 네스트된 원하는 서열 및 mRNA의 단일 가닥 DNA로의 전환을 매개하는 후 전사 프로세싱 신호를 제공하는 1차 결합 부위를 코딩한다. 또한, B 플라스미드는 본 발명의 두 번째 관점이 이용될 때 원하는 제2 서열을 포함한다 (상기 기재한 것처럼, RE 유전자가 본 발명의 구축물, 예를 들면 본원에서 설명된 단일 "C" 플라스미드로부터 생략될 때, 이러한 원하는 제2 서열은 목적의 활성을 갖는 특정의 저해 핵산 서열을 코딩한다). 벡터 서열 및 프로세싱 신호, 구체적으로 역전사효소/RNAse H 및 제한효소의 제거와 함께, 단일 가닥 DNA로 B 플라스미드의 1차 유전자 산물을 프로세싱하는 데 필요한 활성은 A 플라스미드로부터 발현된다. 생체내에서 이러한 성분의 전사 산물의 상호작용에 의하여 방출되는 단일 가닥 DNA 서열은 안티센스 및 삼중체 전략에서 mRNA 종 및 DNA 프로모터와 같은 세포내 목표물에 자유롭게 결합한다.
본원에서 설명된 상기 논의한 것처럼, B 플라스미드는 원하는 임의의 DNA 서열이 위치한 사이에 클로닝 부위 (본원에서 설명된 B 플라스미드의 한 구현예에서 NotI 부위가 이용되었다)를 포함한다 (상기 논의한 것처럼, 본원에서 설명된 실시예에서 상기 서열은 "스터퍼 (stuffer)", 또는 실험, 서열, 텔로머 반복유전자, h-ras, c-raf 키나제, 맥관형성 성장 인자 플레오트로핀을 코딩하는 부위, 및 SIV 유래의 tat를 코딩하는 부위를 포함한다). 클로닝 부위의 플랭킹은 프로모터 (본원에서 설명된 바람직한 B 플라스미드에서 CMV 프로모터가 이용되었다)로부터 제조된 1차 mRNA 전사체를 목적의 단일 가닥 저해 핵산으로의 프로세싱을 지배하는 신호이다. 목적의 원하는 서열을 B 플라스미드에 클로닝한 후, A 및 B 플라스미드를 ssDNA의 구성적 발현을 위하여 선택된 세포주에 공형질감염시킨다. 유사하게, 본원에서 설명된 단일 ("C") 플라스미드에서 원하는 서열은 플라스미드에 클로닝되어 추가의 프로세싱을 위한 세포주에 형질감염된다. 두 플라스미드 사이의 유전 요소의 상기 설명된 세트의 요소의 분포에 상관없이, 또는 상기 요소들이 모두 단일 플라스미드에 함유된다면, 이러한 프로세싱은 단일 가닥 DNA 부위 (즉, 원하는 서열, 도립 텐덤 반복부 및 PBS)의 전사에 이어 세 단계를 진행한다.
(1) 본원에서 설명된 바람직한 구현예에서, 원하는 서열에 대하여 3'에 위치한 프라이머 결합 부위 (효소 활성을 갖는 서열 포함), 도립 텐덤 반복부 및 도 1에 나타낸 프라이머 결합 부위로부터 진행되는 A 또는 C 플라스미드에 의해 발현된 역전사효소 (본원에서 설명된 바람직한 구현예에서, 역전사효소는 몰로니 생쥐 백혈병 바이러스 (MoMuLV) 역전사효소임)에 의한 B 또는 C 플라스미드 RNA 전사체의 역전사,
(2) 역전사효소 다중 단백질의 RNAse H 활성, 또는 내생의 RNAse H 활성에 의하여 생성된 이종이중나선가닥의 RNAse H 절단으로 그 RNA 상보체로부터 단일 가닥 DNA 전구체의 방출,
(3) 도립 텐덤 반복부를 포함하는 왓슨-크릭 염기쌍에 의해 형성된 스템-루프 중간체의 스템의 제한효소 절단, 또는 자가-상보적 도립 텐덤 반복부에 의한 스템-루프 2차 구조의 형성에 의한 cDNA 전사체의 조기 종결에 의한 플랭킹 서열의 제거.
당 분야의 숙련자들은 이러한 개시로부터 원하는 서열에 플링캥된 특정 클로닝 부위가 특정 역전사효소, 제한효소 (이용된다면), 프로모터, 프라이머 결합 부위 및 본 발명의 유전 요소 세트의 다른 요소 모두가 원하는 특정 서열 및(또는) ssDNA가 발현될 시스템에 따라 선택된다.
다르게 지시된 경우를 제외하고는 본원에 그 전체가 구체적인 참조로 도입되는 삼부르크 등 (1989) (J. Sambrook, et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.), Cold spring Harbor press (1989), 이하 마니아티스 등 (1989)로 칭함) 및 아우수벨 등 (1987) (F.M. Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, New York: John Wiley & Sons (1987))에 의해 설명된 표준 기술이 하기 기재된 실시예에서 이용되었다. 자연적인 방법 및 상이한 효소 산물 또는 시스템을 사용하는 고안된 인공 방법 모두에 의해 ssDNA를 제조하는 다른 방법도 또한 본 발명의 방법과 관련하여 이용될 수 있으며, 본원에 기재된 실시예는 예시적인 목적으로 기재된 것이며, 본 개시 범위 또는 본원에 설명된 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니라는 것을 이해하여야 한다.
플라스미드 pcDNA3.1/Zeo(+)를 인비트로겐 코포레이션 (캘리포니아주 칼스배드)로부터 구입하고 플라스미드 pBK-RSV는 스트라타겐 (캘리포니아주 라졸라)에서 구입하였다. 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)은 미드랜드 서티파이드 리에이젼트 코포레이션 (텍사스주 미드랜드)에 의해 합성하였다. 폴리머라제 연쇄 중합반응 (PCR)은 베링거 맨하임 코포레이션 (인디아나주 인디아나폴리스)로부터 구입한 Taq DNA 폴리머라제를 사용하여 로보-구배 가열 사이클러 (스트라타겐 (캘리포니아주 라졸라))에서 수행하였다. 제한효소 및 T4 DNA 리가제는 베링거 맨하임 코포레이션 (인디아나주 인디아나폴리스)에서 얻었다. 사용된 ODN은 첨부된 서열목록에 열거하였다.
<실시예 1>
시험관내에서의 ssDNA의 합성
도립 텐덤 반복부 사이에 원하는 서열로서 삽입된 랜덤 뉴클레오티드 서열 조성의 이른바 스터퍼 부위를 갖는 도립 텐덤 반복부 구조를 함유하도록 4개의 합성의 단일 가닥 ODN (각각 길이가 129, 121, 111 및 103 염기, 서열번호 4, 5, 15 및 16)을 고안하였다. 이러한 방식으로 (도 2) 반복유전자 내에 한 쌍의 제한효소 인식 부위를 갖도록 도립 텐덤 반복부를 고안하였다. NotI 및 FokI에 대한 고안된 절단 부위 (각각, 유형 II 및 유형 IIS 제한효소 인식 부위)는 111 (서열번호 15) 및 103 (서열번호 16) 염기 길이의 올리고뉴클레오티드이며, NotI 및 MboII에 대한 고안된 제한효소 절단 부위는 길이 129 (서열번호 4) 및 121 (서열번호 5) 염기의 올리고뉴클레오티드였다. 이외에, 역전사효소에 대한 프라이머에 의한 인식하기 위한 tRNA 프라이머 결합 서열 (PBS)가 올리고뉴클레오티드에 고안되었다. PBS는 도립 텐덤 반복부의 3' 하류에 위치하였다.
합성 올리고뉴클레오티드 각각에 대하여, 1 ㎕ (5 ㎍/㎕ 물) 할당량을 4 개의 별도의 튜브에 첨가하고 70 ℃에서 5 분 동안 가열하고 실온에서 15 분에 걸쳐 자가 어닐링시켰다. 이러한 과정은 스템-루프 구조의 형성에 대한 최적의 혼성화를 허용하며, 상보성 서열의 신장을 갖지 않는 루프 부분은 현저한 자가 어닐링을 진행하지 않고, 지배적으로 단일 가닥로 남아 있는다. 그 후, 표준 제한효소 절단은 NotI, FokI, MboII (제한효소 절단 부위가 존재하는 각 올리고뉴클레오티드에 적합) 및 EcoRI (음성 대조군으로)으로 총 반응 부피 15 ㎕에서 10 Unit 효소와 적합한 반응 완충액을 사용하여 수행하였다. 절단은 전기영동 겔 분석법에 의하여 확인하였다.
이 실험의 결과는 도립 텐덤 반복부를 갖는 합성 ss-DNA가 이중체 DNA를 형성함을 보여주었다. 이중체 DNA, 아마도 스템-루프 구조의 스템은 도립 텐덤 반복부를 포함하는 염기의 왓슨-크릭 염기쌍에 의하여 NotI 및 FokI 제한효소 부위를 형성하도록 고안된 도립 텐덤 반복부에서의 서열로부터 특이적인 인식가능한 제한효소 부위를 형성하였다 (ss-DNA를 NotI 및 FokI과 반응시켰을 때, DNA는 절단되었다. EcoRI (음성 대조군)과 함께 반응시켰을 때, 동일한 DNA는 절단되지 않았다.
<실시예 2>
시험관내에서 카세트 전사체로부터 ssDNA의 형성
본 실험을 수행하기 위하여 두 시험 플라스미드를 구축하였다. pcDNA3.1/Zeo(+)를 표준 조건하에서 NheI 및 ApaI으로 절단하였다. 서로에 대하여 상보적으로 고안된 두 세트 (A 및 B)의 5' 인산화 올리고뉴클레오티드 (참조. 첨부된 서열목록)를 혼성화하였다. 혼성화는 95 ℃에서 상보적인 올리고뉴클레오티드를 가열하고 그 후 15 분 동안 실온으로 냉각하여 수행하였다. 적합한 점착성 말단을 갖는 생성된 이중체 올리고뉴클레오티드 링커를 표준 조건하에서 앞서 제조된 pcDNA3.1/Zeo(+) 벡터에 라이게이션하였다.
마니아티스 등의 문헌 (1989) 및 첨부된 지시문에 의해 설명된 것처럼 수용성 (competent) XL1-Blue MRF 세포 (스트라타겐)에 형질전환시킨 후, 암피실린 플레이트 상의 양성 클론을 선별하였다. 양성 클론을 선택한 후, 상업적으로 이용가능한 플라스미드 단리 키트 (퀴아겐, 인크, 캘리포니아주, 발렌시아)를 사용하여 플라스미드 DNA를 단리하였다. DNA 라이게이션의 확인은 DNA 서열분석으로 수행하였다.
양성의 환상 시험 플라스미드를 PmeI으로 절단하여 선형화하고, 표준 역전사 반응을 하기와 같이 수행하였다. 각 튜브에 0.1 ㎍의 선형 플라스미드 DNA, 25 Unit의 T7 폴리머라제 (즉, DNA-의존성 RNA 폴리머라제), 2.5 mM의 rNTP (리보뉴클레오티드 트리포스페이트 rUTP, rCTP, rGTP, rATP) 및 적합한 완충액을 첨가하였다. 반응 튜브를 37 ℃에서 90 분 동안 반응시켰다. 반응 후, 10 Unit의 DNAse를 첨가하고 37 ℃에서 15 분 동안 반응시켰다. 70 ℃에서 10분 동안 반응시켜 반응을 종결하였다.
상기 반응을 이용하여 표준 cDNA 합성 반응을 수행하였다. 새로운 튜브에 5 ㎕의 상기 역전사효소 반응물, PBS 부위 (도립 텐덤 반복부의 하류)에 대하여 상보적인 0.2 ㎍의 프라이머 (참조. 서열목록)를 첨가하였다. 이 혼합물에 25 Unit의 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 유래의 역전사효소, 2.5 mM의 dNTP (데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 dTTP, dCTP, dGTP, dATP) 및 적합한 완충액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 37 ℃에서 1.5 시간 동안 반응시켰다. 반응 기간 후에, 100 Unit의 RNase H를 첨가하고 상기 튜브를 15 분 동안 37 ℃에서 반응시켰다. 반응 튜브를 70 ℃에서 반응시키고, 실온으로 15 분에 걸쳐 냉각하여 어닐링하였다. 이 혼합물을 균등하게 4개의 튜브에 나누고, 적절한 반응 완충액과 함께 각 10 Unit의 제한효소 NotI, FokI, MboII 또는 EcoRI을 첨가하였다. 이 튜브들을 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 복제 반응물에 S1 뉴클레아제 (ssDNA에 특이적)를 처리하였다. 상기 반응물 유래의 DNA를 겔 전기영동으로 분리하였다.
본 실험은 T7 RNA 폴리머라제, 역전사효소, 및 RNase H의 순차적인 효소 활성에 의해 시험관내에서 ssDNA가 제조되었음을 입증하였다. 상기 링커는 제한효소 부위 NotI, FokI 및 MboII를 갖는 도립 텐덤 반복부, 스터퍼 부위 (스템-루프 중간체의 루프를 포함함) 및 tRNA PBS를 함유하였다. 플라스미드는 링커 부위의 바로 상류에 T7 프로모터를 함유하였다. 아가로스 겔 전기영동 분석은 (1) 지정된 길이의 mRNA 중간체, (2) 지정된 길이의 cDNA, 및 (3) 해당 제한효소 NotI, FokI 및 MboII에 의한 ssDNA의 후속의 절단의 단계적 제조임을 보여주었다. EcoRI이 사용된 음성 대조군은 ss-cDNA를 절단하지 않았다.
<실시예 3>
생체내에서 진핵세포에서의 ss-cDNA의 합성
도립 텐덤 반복부 사이에 삽입된 상이한 "스터퍼" 부위를 함유하는 실시예 2에서 만들어진 플라스미드를 실험하기 위하여 하기 생체내 실험을 고안하였다. 본 실험에 사용된 조직 배양 세포는 상기 실시예 1에서 설명된 링커/스터퍼 세그먼트인 클로닝된 유전 요소의 상류에 위치한 RSV 프로모터를 이용하여 진핵세포의 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 II를 코딩하고 내생적으로 발현하였다. 본 개시의 이점을 갖는 당 분야의 숙련자는 이러한 목적으로 임의의 진핵세포 프로모터가 이용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 또한, 당업자는 벡터 코딩된 DNA-의존성 RNA 폴리머라제가 또한 이러한 능력을 발휘할 것이라는 것을 인식할 것이다.
플라스미드 구축물
4개의 별도의 튜브를 70 ℃에서 5 분 동안 반응시키고, 실온에서 15 분 동안 혼성화시킴으로써 ODN을 1 ㎕ (5 ㎍/㎕ 물)로 혼성화하였다. 표준 제한효소 절단은 총 반응 부피 15 ㎕에서 10 Unit 효소와 적합한 반응 완충액을 사용하여 수행하였다 (음성 대조군으로 EcoRI 사용). DNA 단편을 아가로스 겔에서 분리하여 단리하였다. 마니아티스 등의 문헌 (1989)에 의해 설명된 것처럼 수용성 XL1-Blue MRF 세포 (스트라타겐)에 형질전환시킨 후, 암피실린 플레이트 상의 양성 클론을 선별하였다. 양성 클론을 선별한 후, 상기 설명된 퀴아겐 플라스미드 단리 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 단리하였다.
세 발현 플라스미드의 구축물을 설명한다. 제1 "B" 플라스미드는 다중 클로닝 부위 (MCS)에 위치한 제한효소 NheI 및 ApaI으로 절단하여 pcDNA3.1/Zeo(+) (도 7A)로부터 유래되었다. 합성의 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드 서열번호 4/ODN-PMMV(+) 및 서열번호 5/ODN-PMMV(-)를 어닐링하여 형성된 상용성 NheI 및 ApaI 말단을 갖는 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드를 절단된 pcDNA3.1/Zeo(+)에 라이게이션하여 pPMMV를 생성하였다. 이러한 삽입물은 몰로니 생쥐 백혈병 바이러스 역전사효소 (MoMuLV-RT) 프로모터 부위/프라이머 결합 부위 (PBS 서열)을 함유한다. 또한 이것은 pMMV에 독특한 두 NotI 부위 및 MboII 부위를 함유한다. 이러한 플라스미드, 및 이러한 구축물 유래의 플라스미드에서, (+) 표시된 가닥는 pcDNA3.1/Zeo(+)의 사이토메갈로바이러스 프로모터 유래의 RNA로 전사되도록 위치한다. 생체내에서 ssDNA로 발현될 삽입물의 서열의 편리한 삽입을 위한 부위를 함유하는 B 플라스미드 pssDNA-Express B는 NotI 상용성 돌출을 갖는 ODN-XB(+) 및 ODN-XB(-)를 어닐링함으로써 형성된 이중 사슬 서열을 pMMV의 NotI 부위 사이에 라이게이션함으로써 수득되었다.
pssDNA-Express B의 구조는 도 5에 나타낸다. 상기 플라스미드를 함유하는 포유류 세포는 항생물질 제오신으로 선별할 수 있다. 삽입물의 중요 부위의 위치 및 일반적인 배열을 도 5A에 나타내며, 삽입물의 서열의 특정 배열은 도 5B에 나타낸다. 구조적 특징부의 정확한 위치는 도 5C에 나타낸다. 삽입 부위의 전사는 사이토메갈로바이러스 프로모터에 의하여 작동되어 BGH 폴리A 부위에서 종결된다. RNA 전사체는 MoMuLV 코어 프로모터를 이러한 프로모터의 몇몇 플랭킹 부위와 함께 함유하며, 이 위치는 도 5B에서 제시된다. 역전사효소는 프라이머로서 tRNA 프로를 사용하고 코어 프로모터의 위치에서 시작하여 (+) (상부) 가닥의 카피를 합성한다. RNAse H에 의한 RNA 가닥의 절단은 상보성 도립 텐덤 반복부 IR-L 및 IR-R의 일부를 함유하는 단일 가닥 DNA 서열 (도 1)을 방출한다. 도 2에 나타낸 이들 반복유전자에 의한 이중체 형성은 루프에 원하는 서열을 갖는 스템-루프를 생성한다. 상기 스템은 GAAGA 인식 부위에 대하여 3'의 8/7 염기를 절단하는 효소가 플랭킹 벡터 서열로부터 원하는 서열을 방출하도록 위치한 MboII에 대한 인식/절단 부위 GAAGA(N)8ˇ를 함유한다.
조절 서열로서 제공되는 원하는 서열이 발현되는 B 플라스미드 pTest를 수득하기 위하여, 상용성 NotI 말단을 갖는 어닐링된 합성의 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드 서열번호 11/ODN-Test(+) 및 서열번호 12/ODN-Test(-)에 의하여 형성된 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드를 pMMV의 NotI 부위 사이에 삽입하였다. 어닐링된 NotI 사용성 올리고데옥시뉴클레오티드 서열번호 13/ODN-Telo(+) 및 서열번호 14/ODN-Telo(-)를 pMMV의 NotI 부위 사이에 삽입하는 유사한 방식으로 원하는 서열로서 텔로버 반복 서열 pTelo를 발현하는 B 플라스미드를 수득하였다 (도 6A). 후자의 링커 서열은 척추동물 텔로미어 서열 5'-AGGGTT-3'의 9개의 반복유전자를 함유한다 (도 6B) (Blackburn, E.H., 350 Nature 569-573 (1991)). 29 염기쌍의 스템이 스템-루프 중간체에서 pMNV의 27 염기쌍 스템 부위 보다는 더욱 안정한 스템-루프 구조를 생성하기 때문에 스템이 (pMNV의 27 염기쌍 스템 부위보다는) 29 염기쌍으로 이루어진 pMN-new-link로 명명된 세 번째 B 플라스미드가 구축되었다. pNM-new-link는 pMNV내의 두 NotI 부위 사이에 두 자가 상보성 ODN, ODN-NM-new-link(+)와 ODN-NM-new-link(-)를 라이게이션함으로써 형성되었다.
A 플라스미드 pssDNA-Express A (도 4)를 숙주 세포로서 XL-1 Blue MRF'를 사용하여 pBK-RSV (스트라타겐)로부터 제조하였다. 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스를 발현하는 생쥐 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (#CRL-1858)로부터 얻었다. 역전사효소-PCR (RT-PCR)을 위하여 바이러스 RNA를 단리하고, 준비하였다. MoMuLV-RT의 코딩 서열을 함유하는 2.4 kb 단편을 서열번호 1/ODN-RT(-) (뉴클레오티드 #2545에 프라이머 위치) 및 서열번호 2/ODN-RT(+) (뉴클레오티드 #4908에 프라이머 위치)에 기재된 것처럼 프라이머를 사용하여 PCR-증폭하여 5'-SacI 및 3'-HindIII 상용성 말단을 갖는 DNA 단편을 제조하였다. 수득된 2.4 kb 단편은 위치 2546과 4908 사이에 MoMuLV 게놈 서열을 포함한다. 성숙 바이러스 역전사효소 펩티드는 위치 2337과 4349 사이의 서열에 의하여 코딩되지만 (Petropoulos, C.J., Retroviral taxonomy, protein structure, sequence and genetic maps, in J.M Coffin (Ed.), Retroviruses, 757, Appendix 2, New York: Cold Spring Harbor Press (1997)), 아미노 말단이 절단된 펩티드는 완전한 활성을 유지한다 (N. Tanese, et al., 85 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1777-1781 (1998)). 이러한 구축물에 의하여 코딩되는 펩티드는 MoMuLV 다중단백질의 역전사효소 앞쪽에 인테그라제 유전자의 일부를 포함하지만 이는 본원과 관련없으며, 구축물의 길이는 클로닝을 위한 편리한 제한효소 부위의 이용성 때문에 선택되었다.
제한효소 MboII를 코딩하는 세균 모락셀라 보비스 (Moraxella bovis) (Bocklage, H. et al., 19 Nucleic Acids Res. 1007-1013 (1991))을 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC#10900)으로부터 얻었다. 게놈 DNA를 엠. 보비스로부터 단리하고 PCR에서 주형 DNA로 사용하였다. MboII 유전자를 함유하는 1.2 kb 단편을 프라이머로서 서열번호 3/ODN-Mbo(+) (뉴클레오티드 #887에 프라이머 위치) 및 서열번호 8/ODN-Mbo(-) (뉴클레오티드 #2206에 프라이머 위치)를 사용하는 PCR에 의하여 증폭하였다. 이들 프라이머는 HindIII 부위를 5' 프라이머에 도입하고 XbaI 부위를 3' 하류 프라이머에 도입하도록 고안된 부정합 (mismatch)을 함유한다. 따라서, 위치 888과 2206 사이에서 엠. 보비스 게놈을 카피한 1.2 kb DNA 증폭 산물은 MboII 단백질의 코딩 부위를 함유한다. 증폭 산물을 HindIII 및 XbaI으로 절단하였다.
pBK-RSV를 XbaI 및 NheI으로 절단하여 프로모터 부위를 제거하였다. NheI 말단을 올리고데옥시뉴클레오티드 서열번호 6/ODN-N>S(+)와 서열번호 7/ODN-N>S(-)를 어닐링하여 형성된 링커를 사용하여 SacI 말단으로 전환하였다. 역전사효소 및 MboII 증폭물을 HindIII 부위를 통하여 라이게이션하고, 이어서 이 구축물을 pBK-RSV의 SacI과 XbaI 부위 사이에서 라이게이션하여 pBK-RSV-RT/Mbo를 제조하였다.
다중 단백질의 역전사효소와 MboII 영역 사이에 유연한 링커를 삽입하고, 단 백질의 정제에 유용한 태그를 제공하기 위하여, 히스티딘과 프롤린 아미노산을 교대로 코딩하는 올리고데옥시뉴클레오티드 서열번호 9/ODN-HisPro(+)와 서열번호 10/ODN-HisPro(-)를 어닐링하여 형성된 이중 가닥 서열을 HindIII으로 절단하여 pBK-RSV-RT/Mbo에 삽입하였다. 상용성 HindIII 말단과 함께 his-pro 링커를 HindIII 부위에 삽입하여 플라스미드 pBK-RSV-RT/Mbo-L을 제조하고, 그 배향을 서열분석하여 확인하였다. 그러나, pBK-RSV-RT/Mbo-L의 서열분석은 MboII 영역의 5'-말단에 프레임 쉬프트 돌연변이를 보여주었다. MboII 유전자의 5'-말단, his-pro 링커 부위 및 인터기라제 유전자 단편을 코딩하는 AseI과 BglII 부위 사이에 놓여있는 플라스미드 단편을 제거하고, 변형된 his-pro 링커 및 5'-MboII 유전자 단편을 함유하는 삽입물로 대체함으로써 이러한 돌연변이를 교정하고, 동시에 MoMuLV의 인터기라제 유전자의 외부 부분을 제거하였다. 변형된 his-pro 링커는 히스티딘의 수를 1 내지 6으로 증가시키고, 5'-말단에 많은 독특한 제한효소 부위를 포함하였다. MboII 유전자의 5'-말단을 변형하여 PCR 프라이머에서 부정합으로 도입된 N-말단의 루이신을 원래의 메티오닌으로 대체하고 포유류 세포에서의 이러한 유전자 세그먼트의 발현을 위한 코돈 이용을 최적화하였다. 3' 말단에서 16 염기의 상보적 서열을 갖는 두 주형, ODN-Rep(+) 및 ODN-Rep(-)로부터 상호 프라임된 DNA 합성법에 의하여 복구 구축물을 얻었다. 이들 올리고데옥시뉴클레오티드를 어닐링하고, 변형된 SEQUENASE (등록상표) DNA 폴리머라제 효소 (유나이티드 스테이츠 바이오케미칼 코포레이션)으로 연장하였다. 이중 가닥 산물을 AseI 및 BglII로 절단하고 플라스미드에 삽입하여 pssDNA-Express A (플라스미드 A)를 수득하였다.
pssDNA-Express A의 구조를 도 8A에 나타내었다. 상기 기술한 것처럼, 이러한 플라스미드를 구축하기 위하여, MoMuLV 역전사효소 및 엠. 보비스 MboII 제한효소의 활성 단편을 코딩하는 서열을 진핵세포 발현 벡터 pBK-RSV의 NheI과 XmaI 부위 사이에 클로닝하였다. 클로닝된 부위의 전사는 RSV 프로모터에 의하여 작동되며, 형질전환된 세포의 선별은 항생물질 G418 (네오마이신)의 존재하에서 수행한다. 역전사효소 및 MboII는 짧은 히스티딘 및 프롤린 풍부 링커에 의하여 분리되는 두 기능성 영역을 갖는 단일의 이기능 단백질 사슬로서 발현된다.
조직 배양 연구
리포펙턴트 (베링거 맨하임 코포레이션)를 사용하여 제조자의 첨부된 지시에 따라 안정하고 일시적인 형질감염을 수행하였다. 모든 플라스미드 구축물을 HeLa 세포주에 형질감염시켰다. ssDNA에 대한 분석은 형질감염 24 내지 48 시간 후, PCR과 점 블로팅 분석법에 의하여 수행하였다. 역전사효소 활성은 pssDNA-Express A 플라스미드의 감염 후에 실버 등 (Silver, J., et al., 21 Nucleic Acids Res. 3593-3594 (1993))에 의하여 개발된 RT-PCR 분석법을 사용하여 분석하였다 (도 11, 패널 A). 안정하게 치환된 HeLa 세포주의 개별적인 콜로니 단리물 (A12 및 B12)를 RT 활성에 대하여 추가로 분석하였다 (도 11B). 48 내지 72 시간 먼저 형질감염된 세포로부터 ss-cDNA를 단리하였다. 상기 설명한 것처럼, RNA와 함께 편재된 ss-cDNA를 트리졸 시약 (깁코 라이프 테크놀로지스, 매릴랜드주 게이스버그)을 사용하여 단리하였다. 특이 ss-cDNA 종에 대한 분석은 내부 단편에 대하여 모두 PCR 기초 분석법 (pTest의 경우 도 12 및 pTelo의 경우 도 13)과 변성된 단일 가닥 겔 전기영동과 후속의 나일론 블로팅 및 내부 바이오틴-표지된 프로브로 추적하여 수행하였다.
이러한 실험은 A 및 B 플라스미드와 공형질감염된 인간 조직 배양 세포 (HeLa 및 Cos-7 세포주)가 예정된 크기의 ss-cDNA를 제조함을 보여주었다. 그러나, 당 분야의 숙련자들은 스템-루프 중간체에 대한 RNA 주형을 포함하는 단일 플라스미드와 역전사효소 및 제한효소의 유전자가 본원에 기재된 다른 실시예에서 설명된 것처럼 이러한 목적을 위하여 사용될 수 있음을 인식할 것이다.
스템 구조의 3' 측에서 역전사효소 cDNA 전사체의 조기 종결을 입증하기 위한 시험관내 실험에 벡터 pNM-New-Link (단일 가닥 전환 후에 더욱 안정한 29 염기쌍 스템 구조를 함유함)를 사용하였다. 도 14에 나타낸 것처럼, 스템 구조를 통해서도 이러한 전사체의 일부 "전체 해독"이 있었다 (참조. 도 14에서의 큰 밴드). 이러한 조기 종결로부터 제조된 원하는 서열은 본원에서 언급된 원하는 제2 서열이다.
<실시예 4>
진핵세포에서 DNA 효소를 포함하는 ss-cDNA의 생체내 합성
본 발명의 벡터 시스템이 진핵세포 조직배양 세포에서 DNA 효소 서열을 포함하는 ssDNA를 제조하는 데 이용될 수 있는 지를 실험하기 위하여 하기 생체내 실험을 고안하였다.
플라스미드 구축물
상기 실시예 3에서 설명한 것처럼 동일한 방식으로 ODN을 제조하고 플라스미 드를 구축하였다.
B 플라스미드의 구축
본 발명의 벡터 시스템의 두 플라스미드 구현예를 포함하는 두 플라스미드 중 제1의 제2 구현예는 "4B" 플라스미이다. 실시예 3에서 설명된 플라스미드 pssDNA-Express B와 유사하게 4B 플라스미드는 도 7A에 나타낸 pcDNA3.1/Zeo(+) (인비트로겐 코포레이션)으로부터 구입하였다. pssDNA-Express 4B는 각각 911 및 978 위치에서 제한효소 HindIII 및 NotI으로 절단하여 구축하였다. 합성의 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드 ODN-5'-N/M(링크)2-H/N 및 ODN-3'-N/M(링크)2-H/N을 어닐링하여 형성된 상용성 HindIII 및 NotI 말단을 갖는 이중 가닥 링커 부위를 표준 조건하에서 절단된 pcDNA3.1/Zeo(+)에 라이게이션하고 Sure II 세포 (스트라타겐, 인크.)로 형질전환하였다. ODN을 1 ㎕ (5 ㎍/㎕ 물)로 에펜도르프 튜브에서 70 ℃에서 5 분 동안 반응시키고, 실온에서 15 분 동안 혼성화하였다. 적절한 클론을 선별하고, 서열분석하여 링커 부위의 적절한 삽입을 확인하였다. 생성된 플라스미드를 pcDNA3.1/Zeo(+)/NM-link2-gag로 명명하고, pssDNA-Express 4B로 재명명하였다. pssDNA-Express-4B를 도 7B에 나타내었으며, 원하는 서열이 클로닝된 플라스미드이다. 도립 텐덤 반복부 사이에 원하는 서열을 클로닝하기 위하여, 위치 935 및 978로서 두 NotI 부위 (참조. 도 7B)로 사용하였다. 이들 두 부위는 도립 텐덤 반복부내에 함유된다. 도립 텐덤 반복부와 프라이머 결합 부위 사이에 원하는 서열을 삽입하기 위하여, 위치 1004 및 1021의 두 편리한 제한효소 부위, PacI 및 BamHI을 각각 사용하였다.
A 플라스미드의 구축
본 발명의 벡터의 이러한 두 번째 구현예를 포함하는 두 플라스미드 시스템의 제2 플라스미드는 실시예 3에서 설명된 것처럼 제조된 도 8A에 나타낸 A 플라스미드, pssDNA-Express A이다.
C 플라스미드의 구축
상기 논의한 것처럼, 본 발명의 벡터 시스템은 단일 플라스미드 형태를 취할 수 있다. 단일 "C" 플라스미드 벡터 시스템을 제조하기 위하여, 플라스미드 pssDNA-Express A를 SacI 및 XmaI으로 절단하여 MboII 유전자 (도 8B)를 제거함으로써, pBK-RSV-RT-(del)-Hind/Xba를 형성하였다. 표준 조건하에서 절단한 후 올리고뉴클레오티드 5'-(링크)2-Hind/Xba 및 3'-(링크)2-Hind/Xba (표 1)로 이루어진 링커 부위를 70 ℃에서 15 분 동안 어닐링하고, 실온으로 천천히 냉각하여 플라스미드에 라이게이션하였다. 양성 클론을 수확하고, 서열분석하여 링커 배치를 확인하고, 이 플라스미드를 XbaI 및 BamHIII로 절단하였다. 플라스미드 pssDNA-Express B를 HindIII 및 Xba로 절단하고, 앞서 설명된 도립 텐덤 반복부, 다중 클로닝 부위 및 PBS를 함유하는 해당 300 염기쌍의 DNA 단편을 절단된 플라스미드에 클로닝하여 pssDNA-Express C를 생성하였다 (도 9A). 표준 라이게이션 반응을 수행하고, Sure II 세포 (스트라타겐, 인크)로 형질전환하였다. 형질전환된 양성 콜로니를 수확하고, 양성 클론을 제한효소 분석법으로 동정하였다.
원하는 서열을 다중 클로닝 부위에서 BamHI 및 PacI 부위를 사용하여 pssDNA-Express C의 다중 클로닝 부위로 클로닝하였다 (도 9B). 각각 안티센스 서열 (도 9C)에 대해 5' 및 3' 측 사이에 삽입된 "10-23 DNA 효소"를 포함하며, 도 10A 내지 도 10D에 나타낸 표 1에 열거된 4개의 상이한 원하는 서열을 이들 구축물을 위하여 합성하고, 4개의 원하는 서열 각각을 삽입하기 위하여 유사한 절차를 이용하였다. 쌍을 이룬 올리고뉴클레오티드를 70 ℃에서 15 분 동안 어닐링하고 실온으로 냉각한 후, 이어서 표준 조건하에서 플라스미드에 라이게이션하여 각 구축물을 제조하였다. Sure II 세포로 형질전환한 후, 적절한 콜로니를 선별하고 각 삽입물에 대한 서열분석으로 확인하였다. 각 플라스미드를 표준 조건하에서 리포펙탄트 시약 (베링거 맨하임)을 사용하여 동일한 길이의 랜덤 서열을 함유하며 안티센스 삽입물 또는 "10-23 DNA 효소"를 함유하지 않는 적절한 대조군과 함께 HeLa 세포로 형질감염시켜 이들 플라스미드 각각의 안티센스 능력을 실험하였다. 트리졸 시약을 사용하여 세포 및 RNA 분획을 수확하고, 이어서 노던 블로팅 분석을 수행하여 특정 안티센스 발현을 입증하였다.
조직 배양 연구
리포펙턴트 (베링거 맨하임 코포레이션)를 사용하여 제조자의 첨부된 지시에 따라 안정하고 일시적인 형질감염을 수행하였다. 모든 플라스미드 구축물을 HeLa 세포주에 형질감염시켰다. ssDNA에 대한 분석은 형질감염 24 내지 48 시간 후, PCR과 점 블로팅 분석법에 의하여 수행하였다. 역전사효소 활성은 pssDNA-Express A 플라스미드의 형질감염 후에 실버 등 (Silver, J., et al., 상기 문헌)에 의하여 개발된 RT-PCR을 사용하여 분석하였다. 안정하게 치환된 HeLa 세포주의 개별적인 콜로니 단리물 (A12 및 B12)를 RT 활성에 대하여 추가로 분석하였다. 트리졸 시약 을 사용하여 48 내지 72 시간 먼저 형질감염된 세포로부터 ss-cDNA를 단리하였다. 특정 ss-cDNA 종에 대한 분석은 내부 단편에 대한 PCR 기초 분석법과 변성된 단일 가닥 겔 전기영동과 후속의 나일론 블로팅 및 내부 바이오틴-표지된 프로브로 추적하여 수행하였다.
이러한 실험은 프로세싱된 ss-cDNA를 합성하도록 고안된 플라스미드로 형질감염된 인간 조직 배양 세포 (HeLa 세포주)가 예정된 크기의 ss-cDNA를 제조함을 보여주었다. 실시예 3에서 설명한 것처럼, 본 발명의 방법에 따라 제조된 원하는 ssDNA 서열은 스템 구조의 3' 측에서 역전사효소 cDNA 전사체의 조기 종결에 의해 스템-루프 중간체의 스템을 절단한 후 도립 텐덤 반복부 사이의 위치로부터 또는 도립 텐덤 반복부와 프라이머 결합 부위 사이의 위치로부터 제조된다. 이러한 조기 종결로부터 제조된 원하는 서열이 본원에서 언급한 원하는 제2 서열이다. 도 15는 원하는 서열로서 이용되는 c-raf 키나제에 대한 안티센스 서열에 포함된 10-23 효소를 갖는 플라스미드 pssDNA-Express-4B로 형질감염된 세포가 도립 텐덤 반복부와 프라이머 결합 부위 사이의 위치로부터 10-23 DNA 효소를 포함하는 c-raf 키나제에 대한 안티센스 서열을 제조함을 보여준다.
상기 설명된 실험은 진핵세포 역전사효소 반응과 다양한 cDNA 프라이밍 반응을 이용하여 다중 단계의 반응에 의해 시험관내 및 생체내에서 ssDNA를 제조하는 방법을 입증한다. 이러한 반응에 이어, 제한효소에 의한 절단 이후에, 고안된 (및 형성된) "스템"으로부터 상류 5' 또는 하류 3'의 임의의 원하지 않는 서열을 제거하는 데 사용될 수 있는 "스템-루프" 중간체의 형성이 진행된다.
이러한 방법에 의해 임의의 원하는 뉴클레오티드 서열이 진핵세포에서 제조될 수 있다. 이러한 원하는 서열은 지정된 도립 텐덤 반복부 사이에 클로닝 (또는 합성)되며, ssDNA 제조 및 후속의 스템-루프 형성 후에 "루프"에서의 서열을 나타낸다. 제조되는 원하는 서열은 그 서열이 안정한 스템-루프 중간체의 형성을 방해하지 않는 한 임의의 염기 (즉, A, T, G, C) 조성일 수 있으며, 선택적으로 특정 효소 인식 서열과 같은 기능적 유전 요소, 예를 들면, 특정 제한효소의 기질로서 작용하는 부위를 포함할 수 있다. 또한, 특정 제한효소의 인식 부위가 도립 텐덤 반복부내로 고안된 경우인 한 임의의 제한효소가 스템-루프 중간체의 스템 부분을 절단 (또는 분열)시키기 위하여 사용될 수 있다.
본원에 기술된 도면 및 특정 실시예를 참고로 하여 설명되었지만, 당 분야의 숙련자들은 이들 요소가 의도된 각 결과를 달성하도록 작용하는 방식을 변경하지 않고 본원에 기술된 특정 요소에 임의의 변경이 이루어질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들면, 본원에서 설명된 카세트는 3개의 유전 요소, 원하는 서열, 도립 텐덤 반복부 및 프라이머 결합 부위로 이루어진다. 다른 유전 요소에 선택적인 제한효소 유전자 및 역전사효소 유전자가 포함되며, 이들 유전자 각각은 본원에서 설명된 것처럼 적절한 프로모터와 함께 제공된다. 당 분야의 숙련자들은 예를 들면 카세트의 역전사효소 유전자로서 사용하기 위하여 설명된 생쥐 몰로니 백혈병 바이러스 역전사효소 유전자를 다른 역전사효소 (인간 면역결핍 바이러스 유래의 역전사효소 유전자가 상기 논의된 그러한 유전자 중 하나임)로 대체할 수 있으며, CMV 프로모터 이외의 프로모터가 이롭게 사용될 수 있다. 더욱이, 여러 제한효소 유전자가 상기 열거되었지만, 당 분야의 숙련자들은 이러한 설명으로부터 상기 기술된 목록이 전부가 아니며, 많은 다른 제한효소 유전자가 본 발명과 관련하여 이롭게 작용할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 유사하게, 본원에서 기술된 제한효소 유전자와 관련하여 사용되는 것으로 설명된 RSV 프로모터가 이롭게 사용될 수 있는 유일한 프로모터가 아니다. 본 발명의 취지를 벗어나지 않는 이러한 모든 변경 및 변형도 하기의 비제한적인 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
<표 1>
Figure 112001007967161-pct00001
Figure 112001007967161-pct00002
Figure 112001007967161-pct00003
Figure 112001007967161-pct00004
SEQUENCE LISTING <110> INGENE, INC. <120> PRODUCTION OF ssDNA IN VIVO <130> INGA,004/PCT <140> PCT/US99/23936 <141> 1999-10-12 <160> 45 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 cttgtgcaca agctttgcag gtct 24 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 gggatcagga gctcagatca tgggaccaat gg 32 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 caattaagga aagctttgaa aaattatgtc 30 <210> 4 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 4 ctaggtcggc ggccgcgaag attggtgcgc acacacacaa cgcgcaccaa tcttcgcggc 60 cgccgacccg tcagcggggg tctttcattt gggggctcgt ccgggatcgg gagacccctg 120 cccagggcc 129 <210> 5 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 5 ctgggcaggg gtctcccgat cccggacgag cccccaaatg aaagaccccc gctgacgggt 60 cggcggccgc gaagattggt gcgcgttgtg tgtgtgcgca ccaatcttcg cggccgccga 120 c 121 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 6 ctagcggcaa gcgtagct 18 <210> 7 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 7 acgcttgccg 10 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 8 taatggcccg ggcatagtcg ggtaggg 27 <210> 9 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 9 agctggatcc cccgctcccc accaccacca ccaccctgcc cct 43 <210> 10 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 10 agcaggggca gggtggtggt ggtggtgggg agcgggggat cc 42 <210> 11 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 11 ggccggaaga ttggggcgcc aaagagtaac tctcaaaggc acgcgcccca atcttcc 57 <210> 12 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 12 ggccggaaga ttggggcgcg tgcctttgag agttactctt tggcgcccca atcttcc 57 <210> 13 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 13 ggccggaaga ttggggcgtt agggttaggg ttagggttag ggttagggtt agggttaggg 60 ttagggttag ggttagggcg ccccaatctt cc 92 <210> 14 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 14 ggccggaaga ttggggcgcc ctaaccctaa ccctaaccct aaccctaacc ctaaccctaa 60 ccctaaccct aaccctaacg ccccaatctt cc 92 <210> 15 <211> 111 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 15 ctagtcggat caggccgctg cacaacaaca cacaacacag cggccgcatc cgatcagcgg 60 gggtctttca tttgggggct cgtccggatc gggagacccc tgcccagcgc c 111 <210> 16 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 16 ctgggcaggg gtctcccgat ccggacgagc ccccaaatga aagacccccg ctgatcggat 60 gcggccgctg tgttgtttgt tgttgtgcag cggccgcatc cga 103 <210> 17 <211> 149 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 17 agcttggtcg gcggccttga agagcggccg cactcacgat agagtgggag atgggcgcga 60 gaaagtgcgg ccgctcttca aggccgccga ccttaattaa gtcagcgggg gatccttttt 120 gggggctcgt ccgggatcgg gagacccct 149 <210> 18 <211> 149 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 18 ggccaggggt ctcccgatcc cggacgagcc cccaaaaagg atcccccgct gacttaatta 60 aggtcggcgg ccttgaagag cggccgcact ttctcgcgcc catctcccac tctatcgtga 120 gtgcggccgc tcttcaaggc cgccgacca 149 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 19 gatgtaagtc gttgtagcta gcctcccctg 30 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 20 gatccagggg aggctagcta caacgactta catcat 36 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 21 ggtgggcgcc tcgttgtagc tagcctcggt gtggg 35 <210> 22 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 22 gatccccaca ccgaggctag ctacaacgag gcgcccacca t 41 <210> 23 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 23 aatgcatgtc tcgttgtagc tagcccaggc ggga 34 <210> 24 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 24 gatctcccgc ctgggctagc tacaacgaga catgcattat 40 <210> 25 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 25 agatggagac tcgttgtagc tagccccctt gagggcagat tggcgcccga acagggactt 60 gaagga 66 <210> 26 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 26 gatctccttc aagtccctgt tcgggcgcca atctgccctc aagggggcta gctacaacga 60 gtctccatct at 72 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 27 ccggatctag accgcaagct tcaccgc 27 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 28 ggtgaagctt 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 33 ggtcggcggc cttgaagagc ggccgcact 29 <210> 34 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> "n" bases represent variable nucleotides <400> 34 nnnnnnnnnn nnnrggctag ctacaacgan nnnnnnnnnn nn 42 <210> 35 <211> 193 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 35 taatacgact cactataggg agacccaagc tggctagcgt ttaaacttaa gcttggtcgg 60 cggccttgaa gagcggccgc actcacgata gagtgggaga tgggcgcgag aaagtgcggc 120 cgctcttcaa cctggccgct cgagtctaga gggcccgttt aaacccgctg atcagcctcg 180 actgtgcctt cta 193 <210> 36 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 36 ctaggtcggc ggccttgaag agcggccgca ctaacaccac cacagtgcgg ccgctcttca 60 aggccgccga cccgtcagcg ggggtctttc atttgggggc tcgtccggga tcgggagacc 120 cctgcccag 129 <210> 37 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 37 ttagggttag ggttagggtt agggttaggg ttagggttag ggttagggtt agggttaggg 60 c 61 <210> 38 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 38 ctaggtcggc ggccggaaga ttggggcgcc aaagagtaac tctcaaaggc acgcgcccca 60 atcttccggc cgccgacccg tcagcggggg tctttcattt gggggctcgt ccgggatcgg 120 gagacccctg cccagggcc 139 <210> 39 <211> 174 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 39 ctaggtcggc ggccggaaga ttggggcgtt agggttaggg ttagggttag ggttagggtt 60 agggttaggg ttagggttag ggttagggcg ccccaatctt ccggccgccg acccgtcagc 120 gggggtcttt catttggggg ctcgtccggg atcgggagac ccctgcccag ggcc 174 <210> 40 <211> 252 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 40 ccccacccgg atctagactc gagcggccag gggtctcccg atcccggacg agcccccaaa 60 aaggatcccc cgctgactta attaaggtcg gcggccttga agagcggccg cactttctcg 120 cgcccatctc ccactctatc gtgagtgcgg ccgctcttca aggccgccga ccaagcttca 180 ccgcggggca gggtggtggt ggtggtggtg gggagcgggg gatccgaatt ctcgagaatt 240 cctggaggag at 252 <210> 41 <211> 250 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 41 ggctagcgtt taaacttaag cttggtcggc ggccttgaag agcggccgca ctcacgatag 60 agtgggagat gggcgcgaga aagtgcggcc gctcttcaag gccgccgacc ttaatggtgg 120 gcgcctcgtt gtagctagcc tcggtgtggg gatccttttt gggggctcgt ccgggatcgg 180 gagacccctg gccgctcgag tctagagggc ccgtttaaac ccgctgatca gcctcgactg 240 tgccttctag 250 <210> 42 <211> 249 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 42 ggctagcgtt taaacttaag cttggtcggc ggccttgaag agcggccgca ctcacgatag 60 agtgggagat gggcgcgaga aagtgcggcc gctcttcaag gccgccgacc ttaataatgc 120 atgtctcgtt gtagctagcc caggcgggag atcctttttg ggggctcgtc cgggatcggg 180 agacccctgg ccgctcgagt ctagagggcc cgtttaaacc cgctgatcag cctcgactgt 240 gccttctag 249 <210> 43 <211> 245 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 43 ggctagcgtt taaacttaag cttggtcggc ggccttgaag agcggccgca ctcacgatag 60 agtgggagat gggcgcgaga aagtgcggcc gctcttcaag gccgccgacc ttaatgatgt 120 aagtcgttgt agctagcctc ccctggatcc tttttggggg ctcgtccggg atcgggagac 180 ccctggccgc tcgagtctag agggcccgtt taaacccgct gatcagcctc gactgtgcct 240 tctag 245 <210> 44 <211> 281 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 44 ggctagcgtt taaacttaag cttggtcggc ggccttgaag agcggccgca ctcacgatag 60 agtgggagat gggcgcgaga aagtgcggcc gctcttcaag gccgccgacc ttaatagatg 120 gagactcgtt gtagctagcc cccttgaggg cagattggcg cccgaacagg gacttgaagg 180 agatcctttt tgggggctcg tccgggatcg ggagacccct ggccgctcga gtctagaggg 240 cccgtttaaa cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta g 281 <210> 45 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 45 ggctagctac aacga 15

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  19. 도립 텐덤 반복부(inverted tandem repeat)를 포함하는 3' 및 5' 상보 서열,
    상기 도립 텐덤 반복부에 대해 3' 위치에 위치하고 전달 RNA(tRNA)에 상보적인, 역전사효소에 대한 프라이머 결합 부위를 코딩하는 서열, 및
    상기 도립 텐덤 반복부의 3' 상보 서열과 5' 상보 서열 사이, 또는 상기 도립 텐덤 반복부와 3' 프라이머 결합 부위 코딩 서열 사이에 위치한 원하는 서열을 코딩하는 서열
    을 포함하고, 이때 상기 서열들이 동일한 플라스미드에 위치하는 것인, 세포내로 전달하기 위한 핵산 구축물.
  20. 제19항에 있어서, 원하는 서열을 코딩하는 서열이 도립 텐덤 반복부의 3' 상보 서열과 5' 상보 서열 사이에 위치하는 것인 핵산 구축물.
  21. 제19항에 있어서, 원하는 서열을 코딩하는 서열이 도립 텐덤 반복부와 3' 프라이머 결합 부위 코딩 서열 사이에 위치하는 것인 핵산 구축물.
  22. 제20항에 있어서, 도립 텐덤 반복부와 3' 프라이머 결합 부위 코딩 서열 사이에 위치한 원하는 서열을 코딩하는 제2 서열을 포함하는 핵산 구축물.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 도립 텐덤 반복부가 하나 이상의 특정 효소 인식 서열을 코딩하는 서열을 포함하는 것인 핵산 구축물.
  24. 제23항에 있어서, 특정 효소 인식 서열이 제한효소 부위를 포함하는 것인 핵산 구축물.
  25. 제24항에 있어서, 제한효소를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 핵산 구축물.
  26. 제25항에 있어서, 제한효소 유전자가 도립 텐덤 반복부에 대해 5' 위치에 위치하는 것인 핵산 구축물.
  27. 제23항에 있어서, 특정 효소 인식 서열이 HindIII 제한효소 부위; NotI 제한효소 부위; 또는 제한효소 유형 I, 제한효소 유형 II 및 제한효소 유형 III으로 이루어진 군으로부터 선택된 제한효소 인식 서열을 포함하는 것인 핵산 구축물.
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  31. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 도립 텐덤 반복부가 하나 이상의 진핵세포성, 원핵세포성 또는 바이러스성 단백질 DNA 결합 부위를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 핵산 구축물.
  32. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 도립 텐덤 반복부가 시스(cis)-배향 방식으로 작용하는 것인 핵산 구축물.
  33. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 프라이머 결합 부위가 내생 역전사효소에 대해 특이적인 것인 핵산 구축물.
  34. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 역전사효소 또는 역전사효소/RNase H 다중단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 핵산 구축물.
  35. 제34항에 있어서, 역전사효소 또는 역전사효소/RNase H 다중단백질을 코딩하는 유전자가 도립 텐덤 반복부에 대해 5' 위치에 위치하는 것인 핵산 구축물.
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  38. 제34항에 있어서, 역전사효소/RNase H 다중단백질을 코딩하는 유전자가 몰로니 뮤린(Moloney murine) 백혈병 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 또는 유인원 면역결핍 바이러스로부터 유래한 것인 핵산 구축물.
  39. 제34항에 있어서, 프라이머 결합 부위가 역전사효소 또는 역전사효소/RNase H 다중단백질 유전자에 의하여 코딩되는 역전사효소에 대해 특이적인 것인 핵산 구축물.
  40. 제22항에 있어서, 제한효소 코딩 서열, 역전사효소 코딩 서열 또는 역전사효소/RNase H 다중단백질 코딩 서열; 및 원하는 서열을 코딩하는 제1 또는 제2 서열, 상기 제한효소 코딩 서열, 상기 역전사효소 코딩 서열 또는 상기 역전사효소/RNase H 다중단백질 코딩 서열 각각에 대한 프로모터를 추가로 포함하는 핵산 구축물.
  41. 제40항에 있어서, 프로모터가 진핵세포 프로모터인 핵산 구축물.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 프로모터가 구성적, 유도성, 넓은 범위(wide-spectrum) 또는 조직 특이적 프로모터인 핵산 구축물.
  43. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 3' 프라이머 결합 부위에 대해 3' 위치에 위치하는, 폴리아데닐화 꼬리 서열을 코딩하는 서열을 추가로 포함하는 핵산 구축물.
  44. 제22항에 있어서, 원하는 서열을 코딩하는 제1 또는 제2 서열이 효소 활성을 갖는 ssDNA(단일 가닥 DNA)를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 핵산 구축물.
  45. 제44항에 있어서, 원하는 서열을 코딩하는 제1 또는 제2 서열이 표적 mRNA 종에 상보적인 하나 이상의 서열을 코딩하는 서열에 의해 5' 및 3' 방향 모두에서 플랭킹(flanking)되어 있는 서열 5'-GGCTAGCTACAACGA-3'을 포함하는 것인 핵산 구축물.
  46. 제45항에 있어서, 표적 mRNA 종이,
    (i) h-ras,
    (ii) c-raf 키나제,
    (iii) 플레이오트로핀(pleiotrophin) 맥관형성 성장 인자, 또는
    (iv) 유인원 면역결핍 바이러스 (SIV)의 tat 영역
    에 대한 것인 핵산 구축물.
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  48. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 원하는 서열이 단일 가닥 핵산 분자인 핵산 구축물.
  49. 제48항에 있어서, 단일 가닥 핵산 분자가 cDNA 또는 mRNA인 핵산 구축물.
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  51. 제48항에 있어서, 단일 가닥 핵산 분자가 저해 핵산 분자인 핵산 구축물.
  52. 제51항에 있어서, 저해 핵산 분자가 안티센스 서열 또는 앱타머(aptamer)인 핵산 구축물.
  53. 제19항에 있어서, 핵산이 DNA인 핵산 구축물.
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  56. (a) 도립 텐덤 반복부를 포함하는 3' 및 5' 상보 서열,
    (b) 상기 도립 텐덤 반복부에 대해 3'에 위치하고 전달 RNA(tRNA)에 상보적인, 역전사효소에 대한 프라이머 결합 부위, 및
    (c) 상기 도립 텐덤 반복부의 3' 상보 서열과 5' 상보 서열 사이, 또는 상기 도립 텐덤 반복부와 3' 프라이머 결합 부위 사이에 위치한 원하는 서열을 코딩하는 서열
    을 포함하는 mRNA 전사체.
  57. 제56항에 있어서, 원하는 서열을 코딩하는 서열이 도립 텐덤 반복부와 3' 프라이머 결합 부위 사이에 위치하는 것인 mRNA 전사체.
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  59. 제56항 또는 제57항에 있어서, 원하는 서열을 코딩하는 서열이 효소 활성을 갖는 ssDNA를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 mRNA 전사체.
  60. 제56항에 따른 mRNA 전사체의 ssDNA 전사체.
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  62. (a) 도립 텐덤 반복부를 포함하는 3' 및 5' 상보 서열,
    (b) 상기 도립 텐덤 반복부에 대해 3' 위치에 위치하고 전달 RNA(tRNA)에 상보적인, 역전사효소에 대한 프라이머 결합 부위를 코딩하는 서열, 및
    (c) 상기 도립 텐덤 반복부의 3' 상보 서열과 5' 상보 서열 사이, 또는 상기 도립 텐덤 반복부와 3' 프라이머 결합 부위 코딩 서열 사이에 위치한 원하는 서열을 코딩하는 서열에 대한 삽입 부위
    를 포함하는 벡터.
  63. 제62항에 있어서, 도립 텐덤 반복부의 3' 상보 서열과 5' 상보 서열 사이의 제1 삽입 부위, 및 도립 텐덤 반복부와 3' 프라이머 결합 부위 코딩 서열 사이의 제2 삽입 부위를 포함하는 벡터.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 역전사효소 또는 역전사효소/RNase H 다중단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 벡터.
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  66. 제64항에 있어서, 역전사효소 또는 역전사효소/RNase H 다중단백질 유전자가 도립 텐덤 반복부에 대해 5' 위치에 위치하는 것인 벡터.
  67. 제62항에 따른 제1 벡터, 및 역전사효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 제2 벡터를 포함하는 벡터.
  68. 제62항 또는 제67항에 있어서, 플라스미드 또는 변형된 바이러스 구축물인 벡터.
  69. 제62항 또는 제67항에 있어서, 유전자가 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 것인 벡터.
  70. 제62항 또는 제67항에 따른 벡터로 안정하게 형질전환 또는 형질감염되거나, 또는 제56항, 제57항 및 제60항 중 어느 한 항에 따른 전사체를 포함하는 숙주 세포.
  71. 제70항에 있어서, 진핵세포 또는 박테리아 세포인 숙주 세포.
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  99. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 도립 텐덤 반복부가 핵산 구축물에 의해 코딩된 단일 가닥 핵산 생성물에서 스템-루프(stem-loop) 중간체를 형성할 수 있고, 상기 도립 텐덤 반복부가 상기 스템-루프 중간체의 스템을 형성하는 것인 핵산 구축물.
  100. (i) 제19항에 따른 핵산 구축물을 포함하는 카세트(cassette); 및
    (ii) 역전사효소를 코딩하는 유전자
    를 동일 플라스미드에서 함께 포함하거나 또는 상이한 플라스미드들에서 개별적으로 포함하는, 세포에 전달하기 위해 벡터내로의 혼입용으로 개조된 유전 요소 세트.
  101. 제100항에 있어서, 역전사효소 유전자가 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 및 인간 면역결핍 바이러스 유래의 역전사효소 유전자들로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 유전 요소 세트.
  102. 제100항에 있어서, (a) 도립 텐덤 반복부를 포함하는 3' 및 5' 상보 서열들에 의해 플랭킹되어 있는 원하는 서열을 코딩하는 서열,
    (b) 상기 도립 텐덤 반복부에 대해 3' 위치에 위치하는, 역전사효소에 대한 프라이머 결합 부위(PBS)를 코딩하는 서열, 및
    (c) 역전사효소/RNase H 및 제한효소를 코딩하는 유전자
    를 포함하고, 이때 상기 PBS가 표적 진핵세포내에 내재하는 전달 RNA(tRNA) 서열에 상보적인 핵산 서열로 이루어진 것인 유전 요소 세트.
  103. 제100항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 원하는 서열이 단일 가닥 핵산 분자인 유전 요소 세트.
  104. 제103항에 있어서, 단일 가닥 핵산 분자가 cDNA 또는 mRNA인 유전 요소 세트.
  105. 제103항에 있어서, 단일 가닥 핵산 분자가 저해 핵산 분자인 유전 요소 세트.
  106. 제105항에 있어서, 저해 핵산 분자가 안티센스 서열 또는 앱타머(aptamer)인 유전 요소 세트.
  107. 제100항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 DNA인 유전 요소 세트.
  108. 제56항에 있어서, 제19항의 핵산 구축물의 전사체인 mRNA 전사체.
  109. 제62항에 있어서, 제19항의 핵산 구축물 또는 제100항의 유전 요소 세트를 포함하는 벡터.
  110. 제19항에 따른 핵산 구축물 또는 제100항에 따른 유전 요소 세트를 표적 세포내로 도입하는 단계;
    상기 핵산 구축물 또는 유전 요소 세트를 mRNA로 전사하는 단계; 및
    상기 mRNA 전사체를 cDNA로 역전사하는 단계
    를 포함하고, 인체내에서는 수행되지 않는, 원하는 서열을 갖는 단일 가닥 핵산 분자의 시험관내 제조 방법.
  111. 제110항에 있어서, 역전사가 표적 세포에 내생인 역전사효소에 의하여 일어나는 것인 방법.
  112. 제110항에 있어서, 역전사효소 또는 역전사효소/RNase H 다중단백질을 코딩하는 유전자를 표적 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  113. 제110항에 있어서, 도립 텐덤 반복부에 의해 형성된 cDNA 스템-루프 구조 중 루프 구조가 스템과 연결되는 부분을 절단하여 cDNA 전사체를 선형화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  114. 제113항에 있어서, 도립 텐덤 반복부의 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍에 의해 스템-루프 중간체를 형성하는 cDNA를, 상기 도립 텐덤 반복부에 제한효소 부위를 포함시키고 상기 스템-루프 중간체의 스템을 제한효소로 절단함으로써 선형화하는 것인 방법.
  115. 제114항에 있어서, 제한효소를 코딩하는 유전자, 또는 프롤린 풍부 링커를 통해 제한효소에 연결된 역전사효소/RNase H 다중단백질을 코딩하는 유전자를 표적 세포내로 도입하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  116. 제110항에 있어서, 역전사효소 유전자의 전사를 유도적으로 촉진시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  117. 제110항에 있어서, 제102항의 유전 요소 세트를 표적 세포내로 도입하는 단계;
    상기 유전 요소 세트를 mRNA로 전사하는 단계;
    카세트의 mRNA 전사체를 인간 조직 배양 세포의 핵에서 역전사효소로 역전사하는 단계;
    생성된 이종이중나선가닥(heteroduplex)을 RNase H로 분해하는 단계; 및
    (a) 스템-루프 중간체를 제한효소로 분해하거나 또는 (b) 자가-상보적 도립 텐덤 반복부에 의해 스템-루프 2차 구조를 형성하여 cDNA 전사체를 조기 종결시킴으로써, 플랭킹 서열들을 제거하는 단계
    를 포함하는 방법.
KR1020017004508A 1998-10-09 1999-10-12 세포내에서의 단일 가닥 ｄｎａ의 제조 KR100710112B1 (ko)

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