JP2004321195A - 効率的遺伝的抑制要素のための方法および用途 - Google Patents

効率的遺伝的抑制要素のための方法および用途 Download PDF

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Abstract

【課題】
遺伝子機能を抑制しうる遺伝子要素を分離する。
【解決手段】（ａ）抑制すべき遺伝子と相同のｃＤＮＡをランダムに断片化してｃＤＮＡ断片を生成させるステップと、（ｂ）上記ｃＤＮＡ断片を発現ベクターに移行させて保存物を作製するステップであって、ここで発現ベクターは遺伝子抑制を選択またはスクリーニングしうる生細胞にて該ｃＤＮＡ断片を発現することができるステップと、（ｃ）上記保存物を生細胞に導入することにより該生細胞を遺伝子的に改変するステップと、（ｄ）遺伝子的に改変された遺伝的抑制要素を含有する生細胞を遺伝子抑制に関する選択またはスクリーニングによって単離または濃縮するステップと、（ｅ）上記遺伝子的に改変された細胞から遺伝的抑制要素を得るステップと、を含んで成る遺伝的抑制要素（ＧＳＥ）を得る方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、真核性もしくは原核性細胞における特定の遺伝子機能を抑制する手段に関する。より詳細には本発明は、特定の遺伝子機能を抑制する目的で遺伝的抑制要素(genetic suppressor elements)として知られたDNA配列の発現の使用に関する。本発明は、この種の遺伝的抑制要素を得る方法、これら遺伝的抑制要素自身、および遺伝子抑制表現型を持った生細胞を得る方法を提供する。
関連技術の要約
失活させるべき遺伝子の全体もしくは1部からなる特定の遺伝子要素の発現を介し、遺伝子を機能的に失活させることが当業界で知られている。この種の特定遺伝子要素の発現がその対応遺伝子の失活をもたらしうる少なくとも4種のメカニズムが存在する。これらは、抑制すべき蛋白の非官能性もしくは部分非官能性同族体またはその1部からなるポリペプチドによる蛋白機能の阻害、相補的アンチセンスRNAもしくはDNAによるmRNA翻訳の阻害、リボチームと結合したアンチセンスRNAによるmRNAの破壊、および重要な調節配列を示すmRNAの1部と相同のRNA配列によるmRNAの阻害である。
ヘルスコウィッ[ネイチャー、第329巻、第219〜222頁(1987)]は蛋白レベルでの阻害による遺伝子の不活性化を検討しており、これは野生型蛋白の完全かつ機能的領域と、同じ野生型蛋白の非機能性領域との両者からなるポリペプチドをコードする特定の遺伝子要素の発現により達成される。この種の蛋白は優性ネガティブ突然変異蛋白として知られる。
フリードマン等[ネイチャー、第335巻、第452〜454頁(1988)]は、VP16コード配列の3'切断によりHSV-1 VP16蛋白から誘導された優性ネガティブ突然変異体を用いてヘルペスウィルス感染に耐性の細胞を生産することを開示している。バルチモア[ネイチャー、第335巻、第395〜396頁(1988)]は、この方法をHSV一感染した個人の(処置につき治療手段として適用しうることを示唆している。
グリーン等[セル、第58巻、第215〜223頁(1989)]は、HIV LTRにより生ずる遺伝子発現を化学ペプチド合成によるHIV-1 Tat蛋白配列から誘導された優性ネガティブ突然変異体の使用を介し抑制することを開示している。
リムスキー等[ネイチャー、第341巻、第453〜456頁(1989)]は、人工的プラスミド系におけるHTLV-1およびHIV-1遺伝子発現の抑制を開示しており、rex遺伝子のオリゴヌクレオチド媒介突然変異によりHTLV-1 Rexトランスアクチベータ蛋白から誘導された優性ネガティブ突然変異体(dominant negative mntants)を使用する。
トロノ等[セル、第59巻、第113〜120頁(1989)]は細胞培養系におけるHIV-1複製の抑制を示しており、gag遺伝子のリンカー挿入および欠失突然変異によりHIV-1 Gag蛋白から誘導された優性ネガティブ突然変異体を使用する。
ランソン等[プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、USA、第87巻、第3806〜3810頁(1990)]は細胞Fos-Jun蛋白複合体によるDNA結合の抑制およびJun−媒介の転写活性化(transactivation)の抑制を開示しており、fosおよびjun遺伝子のオリゴヌクレオチド指向の置換的もしくは欠失的突然変異によりFaxおよびJun蛋白から誘導された優性ネガティブ突然変異体を使用する。
ホワイタカー・ダウリング等[バイロロジー、第175巻、第358〜364頁(1990)]は混合感染における野生型インフルエンザAウィルスの発生を阻害するインフルエンザAウィルスの低温株を開示しており、この阻害は明かに優性ネガティブ突然変異蛋白メカニズムによって生ずる。
リー等[ジャーナル・バクテリオロジー、第171巻、第3002〜3007頁(1989)]は、rpoB遺伝子のヒドロキシアミン突然変異により得られたイー・コリRNAポリメラーゼのβサブ単位における優性ネガティブ突然変異体を分離するための遺伝子系を開示している。
チェヤノウスキー等[ジャーナル・バイロロジー、第64巻、第1764〜1770頁(1990)]は、Rep蛋白機能に対し臨界的であることが知られたアミノ酸をコードする位置にてrep遺伝子のオリゴヌクレオチド指向の置換突然変異によりAAV Rep蛋白から誘導された優性ネガティブ突然変異蛋白によるアデノ関連ウィルス(AAV)複製の阻止を開示している。
相補的RNAもしくはDNA配列を用いRNAレベルでの阻害により特定の遺伝子機能を抑制することも当業界で知られている。ファン・デル・クロール等[バイオテクニークス、第6巻、第958〜976頁(1988)]は、この種の「アンチセンス」遺伝子もしくはヌクレオチド配列を昆虫、鳥類、哺乳動物、植物、原生動物、両生動物および細菌の細胞における遺伝子機能の抑制に使用することを検討している。
チング等[プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、USA、第86巻、第10006〜10010頁(1989)]は、クレアチンキナーゼ遺伝子の3'コード化および非コード化配列に対し相補的なアンチセンスRNAがレトロウィルスベクターから発現されるとクレアチンキナーゼmRNAのインビボ翻訳を阻止したのに対し、クレアチンキナーゼmRNAに対し相補的であるが最後の17個のコドンもしくは3'非コード化配列を持たないアンチセンスRNAが全て非抑制的であったことを開示している。
ダウアティー等[ジーン・アナリチカル・テクノロジー、第6巻、第1〜16頁(1989)]は、イー・コリにおけるβガラクトシダーゼ(β一gal)遺伝子機能のアンチセンスRNA抑制にっき、リボソーム結合部位を有するプラスミドを用いると共にβ−ga1遺伝子の5'末端に対応する短RNA配列を発現させることにより最良の抑制が得られることを開示している。
パウエル等[プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、USA、第86巻、第6949〜6952頁(1989)]は、植物がレプリカーゼ結合部位に相補的な配列を発現した際にはトランスジェニック植物をタバコモザイク病ウィルス(TMV)から保護するが、TMVコート蛋白にのみ相補的な配列を発現した場合には保護しないことを開示している。
サーバー等[サイエンス、第247巻、第1222〜1225頁(1990)]は、相補的RNA結合に続く結合mRNAのリボヂーム切断により特定mRNAを分解するためのアンチセンスRNA−リボチーム結合体の使用を開示している。
ケール等[ヨーロピアン・ジャーナル・バイオケミストリー、第175巻、第65〜73頁(1988)]は、全長アンチセンスRNAでさえ遺伝子発現を抑制するには必ずしも充分でないことを報告している。
遺伝子機能の抑制は、mRNA分子における重要な調節配列に対し相補的でなく相同であって恐らく発現に対し重要な調節要素を結合すべくmRNAと競合しうるようなRNAのサブ領域を発現させることによっても達成できる。
ブンネル等[Somat．Cell．Mo1．Genet．、第16巻、第151〜162頁(1990)]は、gta遺伝子の3'未翻訳領域におけるAU−リッチ要素(ARE)(これは重要な調節配列であると思われる)に対し相同であるRNAの転写によるガラクトシルトランスフェラーゼ関連(GTA)蛋白発現の阻止を開示している。
遺伝子抑制は遺伝子機能の科学研究に関し極めて有用であると共に病気治療、並びに植物および動物の遺伝子改変における或る種の用途に極めて有望であるが、効果的な遺伝的抑制要素(GSE)を同定する現在の方法は時間がかかり、かつ労力を要する。たとえば優性ネガティブ突然変異蛋白による阻止は、有望な突然変異蛋白の候補を作成するには蛋白における機能領域の構造に関し広範な知識を必要とし、或いは多数の突然変異蛋白の候補を個々に作成しかっスクリーニングすることを必要とする。同様に、アンチセンスRNAおよび競合的な相同RNAは抑制配列候補の個々の広範な作成およびスクリ一ニングを必要とし、RNA内の重要な特定配列に関し殆ど知識が存在しない。したがって、過度の実験または広範な構造一機能の知識なしに効果的要素を簡単に決定しうるような一般化されたGSEの同定および分離方法が必要とされる。理想的方法は、その作用メカニズムとは関係なく、多数の可能なGSE候補の同時的分析を可能にする。
発明の要点
本発明は、真核性もしくは原核性細胞における特定遺伝子機能の抑制に関する。より詳細には本発明は、生細胞で発現される際に遺伝子機能を抑制しうるヌクレオチド配列に関するものである。これらヌクレオチド配列は遺伝的抑制要素(genetic suppressor element)として知られる。生細胞にて遺伝子機能を抑制する現存の方法は遺伝子物質、すなわち特定RNA配列もしくは特定蛋白領域の構造および機能に関する相当な情報を必要とする。或いは、遺伝子機能を抑制する現存の方法は詳細な構造/機能の情報が存在しなくても用いうるが、多くの個々の突然変異蛋白または多くの相補的もしくは相同のRNAもしくはDNA配列を産生させるには相当な時間と努力とを必要とする。これに対し本発明は、広範な構造/機能の情報なしに簡単な選択もしくはスクリーニング過程にて、クローン化遺伝子もしくはウィルスにつき効果的な遺伝的抑制要素(GSE)を得る一般的方法を提供する。
本発明は2っの知見によって可能となる。第1に、本発明者等は蛋白の微小部分のみに対応する小ペプチド断片がこれら断片の突然変異なしにもインビボにて蛋白の機能を抑制しうることを突き止めた。第2に、本発明者等は特定遺伝子もしくはウィルスから誘導された或る種のDNAのランダム小断片が生細胞で発現される際に特定遺伝子もしくはウィルスをインビボで抑制しうること並びにこれら断片を遺伝子もしくはウィルスの抑制に関する機能的選択により分離しうることを示した。
GSEを得るための本発明の方法においては、失活させるべき遺伝子もしくはウィルスからのDNA配列に対応したランダム断片化DNAを、生細胞にてDNAのランダム断片を発現しうる発現保存物に移行させる。次いで所望の生細胞をこれらに標準法でGSE発現保存物を導入することにより遺伝子的に改変させ、遺伝子抑制につき選択またはスクリーニングすることによりGSE含有の細胞を分離または濃縮する。次いで遺伝子抑制表現型を示すGSEを生細胞から得る。
本発明の方法により得られるGSEは、細胞中にGSEを導入することにより細胞を遺伝子改変すべく使用することができ、かくして遺伝子改変された細胞にて発現させると共に遺伝子機能を抑制することができる。或いは、或る種の細胞については、最初にGSEを分離する必要なしにGSE保存物の導入結果として遺伝子抑制表現型を有する遺伝子改変細胞を得ることもできる。
本発明による遺伝子改変細胞は、生細胞を用いるバイオテクノロジー法およびウィルス耐性細胞から誘導される食品または農業上重要なトランスジェニック動物にて産業上重要である、たとえばウィルス耐性のような利点を与えうる。さらに、改良された農業植物および動物を望ましくない性質(たとえば育種植物の他家受粉)の原因となる遺伝子の抑制による遺伝子改変で生産することができる。最後に、本発明による遺伝子改変は、たとえば抗ウィルス治療のようなヒト治療用途にも有用である。
特定実施態様の詳細な説明
遺伝子特異性の抑制物質を発現させるよう細胞を改変することによる特定遺伝子の機能の抑制は、バイオテクノロジーおよび医薬における各種の目標に対する重要な手段である。これら目標の1つは、遺伝子改変細胞における病原性ウィルスの複製阻止である。
他の抑制の目標は、たとえば腫瘍発生性に関連した遺伝子(腫瘍遺伝子)、並びに農業植物もしくは動物の或る種の望ましくない性質の原因となる遺伝子を包含する。
標的遺伝子の特異的抑制は、標的遺伝子から誘導された改変DNA配列を一般的に包含する特殊に作成された遺伝子要素の発現を必要とする。遺伝子抑制に対する現在用いられている手段の1っにおいては、標的遺伝子におけるcDNAの全部もしくは1部を、強力な転写プロモータを有する発現ベクターに逆配向で挿入して、アンチセンスRNAを転写させる。この種のアンチセンスRNAは標的mRNA分子の機能を抑制することができる。
さらに、或る種の遣伝子をmRNAにおける調節配列と相同のRNA配列の発現により機能的に抑制することもできる。他の極く最近の手段においては、アンチセンス配向におけるmRNA配列を、標的mRNA分子を切断しうるリボチームと呼ばれる特定の酵素活性RNA配列と組合せる。遺伝子発現を抑制する他の方法は、野生型(正常型)の同じ蛋白の機能を阻害することにより優性ネガティブ的に作用しうる突然変異型の標的蛋白を使用することである。
遺伝子を抑制する手段は当業界で知られているが、RNAもしくは蛋白に関する広範な構造/機能の情報なしに或いは過剰の実験なしに遺伝子機能を効率的に抑制しうるDNA要素(遺伝的抑制要素、すなわちGSE)をどのように誘導するかにつき指針を与えるような一般的原理は存在しない。
本発明はGSEを得るための一般的方法を提供する。本発明の方法はゲノムDNA、すなわち全細胞RNAまたはクローン化遺伝子もしくはDNAを、抑制を目標とした病原性ウィルスもしくは細胞内寄生微生物から入手すると共に、選択自在な表現型に関する知識を目標遺伝子の失活と関連させることのみを必要とする。この方法は、標的遺伝子によりコードされる蛋白の構造/機能の構成または標的ウィルスもしくは微生物の遺伝子構造に関する知識に依存しない。
一面において本発明は、GSEを得るための便利な一般的方法を提供する。この方法においては最初に、抑制すべき遺伝子もしくはゲノムに対応した精製DNAを酵素的、化学的もしくは物理的方法によってランダムに断片化する。好適具体例において、DNAのランダム断片は、DNAをたとえばDNアーゼ1のようなヌクレアーゼで処理して生成される。ランダムDNA断片は、遺伝子抑制が所望される種類の細胞にて挿入断片を発現しうる発現ベクターを用い、遺伝的抑制要素保存物に挿入体として組込まれる。DNアーゼ1の部分的切断および保存物作成に関する一般的原理については、モレキュラ・クローニング・ラボラトリー・マニュアル、サムブルック等編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク(1989)が参照される。或る種の具体例においては、挿入断片を融合蛋白の1部として発現させることもできる。他の具体例においては、挿入断片のみを発現させることができる。他の具体例においては、リボチームコード化配列を挿入体に直接隣接して挿入し、最も効率的なリボチームーアンチセンスクローンを選択することができる。さらに他の具体例においては、遺伝的抑制要素保存物を当業界で知られたランダム突然変異法によりさらに改変することもできる。挿入断片は、構成的もしくは誘発性のプロモータから発現させることができる。
次いでGSE保存物を使用して、遺伝子抑制が所望される種類の生細胞をこれら細胞中に保存物を当業界で周知された方法(たとえば細菌もしくは酵母菌形質転換または植物もしくは哺乳動物細胞のトランスフェクション)により導入して遺伝子的に改変させる[たとえばケオウン等、メソッズ・エンチモロジー、第185巻、第527〜536頁(1990)、参照]。哺乳動物細胞にて特に興味あることは、たとえばLNCX[ミラー・アンド・ロスマン、バイオテクニークス、第7巻、第980〜986頁(1989)];λZD35[マーフィー・アンド・エフスタチアジス、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、USA、第84巻、第8277〜8281頁]のようなレトロウィルスベクタ一;またはたとえばλZapIIＴＭ[ストラタジーン、ラジョーラ、カリホルニア州]のようなレトロウィルス遺伝子発現を可能にする配列を挿入した便利な現存するベクターの誘導体の使用である。有効GSEを含有する遺伝改変された細胞は、種々の方法にてスクリーニングし或いは選択することができる。たとえば抑制を細胞溶解性ウィルスに指向させる場合、有効GSEを含有する細胞をウィルス感染および細胞病理作用の発生の際の細胞生存に基づいて選択することができる。他の具体例において、抑制は非細胞溶解性ウィルスに対し或いは細胞表面抗原をコードする遺伝子に対し指向される。この具体例において、選択はウィルスもしくは細胞表面抗原の存在に対して行なわれる。これは、遺伝子改変細胞をウィルスもしくは細胞表面抗原に対する特異的第1抗体と反応させて達成される。次いで「非抑制」細胞を補体の添加により除去することができ、或いは第1抗体に対する蛍光性第2抗体の添加に続く蛍光活性化された細胞の選別より「抑制」細胞から分離することができる。免疫学的選択およびスクリーニング技術の一般的説明については、デービス等、マイクロバイオロジー、ハーパーおよびロウ、フィラデルフィア、ペンシルバニア州(1980)が参照される。他の具体例において、抑制は特定過程で増殖する細胞にっき順次に発現させねばならない遺伝子に向けられる。この具体例において、有効GSEを含有する細胞は、選択培地にて増殖しえない細胞につき選択する「自滅選択」法によって選択することができる[パターソン等、メソッズ・エンチモロジー、第151巻、第121頁(1982)、参照]。
さらに他の具体例において、抑制はたとえば腫瘍抑制遺伝子のような成長抑制遺伝子に向けられる。この具体例において、有効GSEを含有する細胞は細胞コロニーの形態学的形質転換に基づいてスクリーニングすることができる。
最終的にGSEが、当業界で知られた手順により選択細胞から得られる。1具体例において、GSEは選択細胞から得られたDNAとの或いは挿入体に整列するベクター上の部位に相同のプライマーとのポリメラーゼ連鎖反応を用いて分離される。他の具体例において、GSE発現保存物をシャトルベクターで作成して、GSEを含有するシャトルベクターを効率的に回収することもできる[たとえばグロガー等、ジーン、第81巻、第285〜294頁(1989)];リオ等、サイエンス、第227巻、第23〜28頁(1985)、たとえばシャトルベクター参照]。勿論、細菌においては単純なプラスミド分離法を、遺伝子抑制表現型を発現する細菌クローンにつき直接用いることができる。最後に、GSEはベクター特異性プローブを用いて当業界で周知された標準クローン化技術により分離しうるが、これはここに説明した他の具体例よりも面倒である。
第二面において本発明は、現存するGSEよりもずっと効果的であると思われるGSEを提供する。何故なら、本発明の方法により得られるGSEは極めて多数の可能なDNA配列から選択しうるのに対し、現存のGSEは極く僅かな設計の試行錯誤の分析結果であったからである。本発明の方法により得られるGSEは、現存する遺伝子抑制法における原理とは異なる原理にしたがって作用することができる。何故なら、これは遺伝子抑制表現型であって、選択されるメカニズムでないからである。
本発明の方法により得られるGSEは科学的研究、バイオテクノロジー法、農業目的、並びにヒトおよび動物の治療目的につき生細胞の遺伝子改変に有用である。さらに、本発明の方法により得られるGSEのヌクレオチドもしくはアミノ酸配列に対応したオリゴヌクレオチドもしくはオリゴペプチドGSEを容易に作成することができる。標準的オリゴヌクレオチド、標準的オリゴデオキシヌクレオチドまたは化学改変されたオリゴヌクレオチドもしくはオリゴデオキシヌクレオチドの誘導体としうるこれらオリゴヌクレオチドは、同定されたGSEと相同であるため特定遺伝子機能を抑制することができる。
この種のオリゴヌクレオチド抑制剤は医薬目的に特に有用である。
第三の面において本発明は、有効GSEを含有して特定の遺伝子そGSEの発現により抑制する遺伝子改変された生細胞を提供する。好適具体例において、この種の遺伝子改変細胞は標準法により、本発明の方法で得られかつ細胞中にGSEを発現しうる特定GSEを含有した発現ベクターを細胞巾に導入することにより作成される。
他の具体例において遺伝子改変細胞は、GSE保存物が導入された細胞を遺伝子改変細胞に含有されたGSEの事前の分離なしに選択して直接得られる。
第四の面において本発明は、特定公知の遺伝子でなく特定の表現型に関連したGSEを見出す便利な方法を提供する。この面において本方法は、失活された際に選択可能もしくはスクリーニング可能な表現型をこの種の不活性遺伝子を有する細胞に付与する劣性遺伝子に対応したGSEを提供する。この方法は、前記したようなランダム断片発現系を用いる。この場合GSEは、ゲノムDNAもしくは全細胞cDNAから作成されたランダム断片発現保存物から分離される。細菌もしくは低級の真核性GSEを得るべく使用する場合、便利さのためゲノムDNAが好適である。これに対し、高級真核性物質からのGSEについては、その複雑性が低いためcDNAが好適である。
第五面において本発明は、特定遺伝子生産物の機能を抑制しうる合成ペプチドおよびオリゴヌクレオチドを提供する。本発明による合成ペプチドは、本発明のGSEによりコードされるアミノ酸配列に対応したアミノ酸配列を有する。本発明による合成オリゴヌクレオチドは、本発明によるGSEのヌクレオチド配列に対応したヌクレオチド配列を有する。GSEが見出されかつ配列決定されると共にその配向が決定されれば、GSE(たとえばアンチセンス配向のGSE)の配列に対応したオリゴヌクレオチドを作成し或いはGSE(たとえばセンス配向のGSE)によりコードされたアミノ酸配列に対応するペプチドを作成するのが簡明である。或る種の具体例において、この種の合成ペプチドもしくはオリゴヌクレオチドは、GSEによりコードされ或いはGSEに存在する完成配列をそれぞれ有する。他の或る種の具体例において、ペプチドもしくはオリゴヌクレオチドはGSEコードされた或いはGSE配列の1部のみを有することもできる。後者の具体例において、特定遺伝子に対応する多くの独立GSEクローンが同じ5'もしくは3'末端を有するが一般に両者を持たないと言う観察により、不当な実験が回避される。これは、多くのGSEが1つの重要な終点を有し、それに基づき簡単な実験で遺伝子機能を抑制するのに必要なペプチドもしくはオリゴヌクレオチドの最小寸法が決定されることを示唆する。ペプチドについては、6〜8個のアミノ酸の程度に小さい機能領域が免疫グロブリン結合領域につき同定されている。
アンチセンスオリゴヌクレオチドについては、遺伝子機能の抑制をその対応mRNAに対し生理学的条件下でハイブリッダイズするのに充分な長さを持ったオリゴヌクレオチドにより媒介することができる。一般に、約12個もしくはそれ以上の塩基を有するオリゴヌクレオチドがこの説明に適合する。当業者が認識するように、ペプチド類似物および改変オリゴヌクレオチドは本発明によるペプチドおよびオリゴヌクレオチドと均等である。何故なら、これら両者は抑制に必要な配列が知られれば標準法によって作成しうるからである。以下、限定はしないが実施例により本発明をさらに説明する。
実施例1
小ポリペプチドをコードするDNA
配列の発現による遺伝子機能の抑制
P一糖蛋白、すなわちヒトmdr1遺伝子の生産物はマルチ薬物輸送体であって、これら薬物を細胞からポンピングすることにより哺乳動物細胞を各種の親油性薬物に対し耐性にする[チェン等、セル、第47巻、第381頁(1986)、参照]。mdr1遺伝子のエクソン7に対応すると共に長さ57アミノ酸のペプチドをコードするmdrlcDNAの短セグメントを標準法によりG418一耐性遺伝子neoを選択自在な標識として含有する発現ベクター(pneoMLV)に挿入した。作成物の1種(作成物1)を、mdr1誘導配列の前に翻訳開始コドンが5'末端に存在するよう作成した。3'末端にて、この配列はベクター配列に存在する開放読枠に隣接し、mdr1誘導配列は得られる融合ペプチドのN一末端部分を形成する。他の作成物(作成物2)においてmdr1誘導配列の前には開始コドンが存在し、それに続き停止コドンが存在してmdr1誘導58アミノ酸蛋白の全体(開始メチオニンを包含する)をもたらした。作成物1および2、並びに制御pSV2neoプラスミドを、mdr1発現に基づき中程度のマルチ薬物耐性を示すヒトKB-8-5細胞にトランスフェクトさせた。トランスフェクト体をG418で選択すると共にP一糖蛋白機能における可能な変化を、細胞毒性薬物ビンブラスチンおよびコルチシンに対する個々のトランスフェクト体の耐性レベルを決定することにより試験した。
pSV2neoで得られた全部で10種の制御をトランスフェクト体は受容体KB-8-5細胞ラインと同レベルの薬物耐性を有した。これに対し、作成物1で得られた15種のトランスフェクト体のうち12種は顕著に減少したレベルの薬物耐性を有した(幾つかの場合、KB-8-5の耐性の半分以下であった)。作成物2で得られた8種のトランスフェクト体のうち5種も、制御KB-8-5細胞と対比し薬物耐性における顕著な減少を示した。これらの結果が示すように、蛋白長さの僅か4.5%からなるP一糖蛋白の短セグメントはP一糖蛋白機能のための遺伝的抑制要素として作用することができる。
このP一糖蛋白のセグメントに現在関連する特定機能は存在しないが、このセグメントはP一糖蛋白一薬物相互作用の特異性に関する決定子もであることが知られたアミノ酸残基185を含む。
これらの結果が示すように、既知機能を持たない短い蛋白断片は野生型蛋白の優性ネガティブ制御剤として作用することができ、優性ネガティブ抑制剤を標的蛋白のランダム短断片を発現する保存物から選択しうることを示唆する。
実施例2
抗ウィルス遺伝的抑制要素保存物の作成
Mn++イオンの存在下にDNアーゼ1での部分切断によりλファージDNAを断片化させ、Ncolリンカーを得られた断片の末端に鈍端(blunt-end)結合により付加させ、その前にT4DNAポリダーゼとDNAポリメラーゼ1のクレノー断片とを末端に充填した。次いで350〜450bp寸法の断片をNcol切断およびアガロースゲル電気泳動の後に分離した。断片混合物をプラスミド発現ベクターpKK233-2に挿入し、このベクターはアンピシリン耐性の遺伝子を有すると共に1PTG一誘発性trcプロモータと特定翻訳開始領域とを用いて挿入配列を発現した[アマン等、ジーン、第40巻、第183頁(1985)、参照]。このベクターを改変させてDNA配列5'CATGGTGACTGACTGAAGCT3’をポリリンカのNcoIおよびHindIII部位に挿入することにより挿入断片の翻訳を適当に停止させた。結合混合物を用いてイー・コリ菌株PLK-F'(λに対し感受性)を形質転換させると共に約80,000個のアンピシリン耐性クローンの保存物を得た。
実施例3
遺伝的抑制要素の同定および分離
実施例2に記載したよう作成した保存物にて遺伝的抑制要素を同定すると共に分離するため、拡大保存物をバクテリオファージλによる感染に対し耐性のクローンの存在にっき試験した。挿入体フリーのpKK233-2ベクターで形質転換された細胞からなる保存物を比較として用いた。IPTG誘発の後、拡大保存物および比較からの106個の細胞にλファージを感染させて、アンピシリン含有プレートに塗沫した。感染の多重性を、感染比較細菌の1〜3%の生存を可能にするよう選択した。
第1感染の後、保存物と比較細胞との間には生存細胞の個数に主たる相違が存在しなかった。次いでプラスミドDNAを、ファージ感染から生き残った約3×104個の保存物由来コロニーの混合物から抽出し、このDNAを用いてプラスミドフリーの細菌を形質転換させた。新たな保存物に再びλを感染させ、今回は保存物における細胞の約10%が比較細胞の3%もしくは0.02%を生存させうる感染の条件下で耐性であることが判明した。次いで、プラスミドを30個の生存コロニーから分離し、これらを個々に用いて新たなイー・コリ細胞を形質転換させた。λを感染させた後、30種の選択プラスミドのうち28種で形質転換させた細胞は溶解に対し耐性を示した。
比較プラスミドを用いる並行試験は3回の選択後に耐性コロニーの個数増加を示さず、免疫性コロニーがλ断片保存物に対し特異性であることを示した。制限酵素分析はほぼ全部のプラスミドが予想寸法(350〜450bp)のNcol挿入体を有することを示した。耐性細胞の観察された頻度に基づき、初期断片保存物におけるクローンの約0.3%がGSEを有した。抑制性かつ感染された細菌コロニーの極く少数が感染後にλ配列の染色体組込みを示し、溶原性の誘発が抑制性クローンによる保護の主たるメカニズムでないことを示した。
実施例2に記載したように他の保存物を作成したが、ただし挿入体断片は600〜700bpの平均寸法とした。この保存物も抑制性クローンを含有したが、その頻度は350〜450bp保存物におけるよりも低い程度であった。
これらの結果は、機能を抑制すべき遺伝子と相同のDNAのランダム断片化と、それに続く保存物作成および生物学的選択もしくはスクリーニングとが遺伝的抑制要素の分離につき可能な一般的手段であることを示す。
実施例4
遺伝的抑制要素の特性化
分離したGSEクローンの51種をDNA配列決定により特性化した。配列決定したGSEは11種類に分類され、各種類はλゲノムの異なる領域を示した(第1図参照)。異なる分類のGSEの抑制効率を次の試験により評価した。(a)形質転換細菌の塗沫効率を高m.o.i.におけるλ感染の後に測定した。任意のGSEで形質転換させた細菌は、塗沫効率における僅かな減少(<2倍)を示し或いは全く示さなかった。(b)比較細菌にて109プラークを生成する量のファージを用いて、プラーク分析によりファージタイターを決定した。殆どの種類のGSEではプラークが識別できなかったが、或る種のGSEは10-5〜10-7の発生率にてファージプラークを形成させ、明かにGSE一非感受性突然変異ファージの出現を反映した。(c)プロファージ誘発に対するGSEの効果を決定するため、各種類の代表的クローンをイー・コリの溶原性菌株に導入し、ファージタイターを誘発後に決定した。8種類のGSEは誘発ファージのタイターを3倍もしくはそれ以上の程度に減少させたが、他の3種類のGSEはプロファージ誘発に対し作用を示さなかった。
センス配向のGSE8種類のGSEは、プロモータに対比しセンス配向で挿入されたλ遺伝子断片を含有した。挿入断片は部分的または完全なλ蛋白をコードした。原開始コドンから或いはコード配列と整列したリンカ誘導開始コドンから或いは断片内の開始コドンから翻訳を開始させた。2種もしくはそれ以上の同一コピーが、8種の異なるGSEにっき存在した。最も豊富な種類のGSEは、従来未知の機能を有する遺伝子Ea8.5の配列を有した。この種類のGSEを実施例5で説明する。
それぞれ単一クローンにより代表される2種のセンス配向のGSEは、未知機能を有するλ遺伝子からの切断配列を有した。これらのうち第1のものは、全長Ea31遺伝子によりコードされる296個のアミノ酸のうちC一末端の216個をコードした。第2のGSEは、全長Ea47遺伝子によりコードされる410個のアミノ酸のうちC一末端の88個をコードした。各GSEのコード化配列は、リンカーからの翻訳開始コドンと整列した。これらGSEは、λファージによる形質転換細菌の感染を抑制したが、溶原誘発を抑制しなかった。
2種のクローンにより代表される他のGSE種類は完全cro遺伝子をセンス配向で有した。croはλ早期遺伝子の発現を抑制する調節蛋白をコードするので、そのGSE作用が予想される。
4種類のGSEは切断型のファージ粒子構造蛋白をコ一ドした。1種のGSEは、全長FI遺伝子によりコードされる117個のアミノ酸のうちC−末端の80個および全長FII遺伝子によりコードされる117個のアミノ酸のうちN−末端の40個をコードした。FIおよびFII遺伝子はλ頭部蛋白をコードする。他のGSEはFII長さK遺伝子によりコードされる198個のアミノ酸のうちC−末端の159個と全長1遺伝子によりコードされる223個のアミノ酸のうちN−末端の121個をコードした。Kおよび1遺伝子はλ尾部蛋白をコードする。
他の2種のGSEは切断型の尾部蛋白VもしくはGをコードした。最初の種類のうち2種のクローンは同一のアミノ酸配列(V蛋白の256個のアミノ酸における最初の145個)をコードし、第2種類のうち2種のクローンも同様であった(G蛋白の140個のアミノ酸における最初の113個)。しかしながら、いずれの場合にも、2種のクローンはそのヌクレオチド配列が同一でないため姉妹細胞でなかった。蛋白阻害メカニズムを確認するため、V蛋白GSEを突然変異させて第4コドンにノンセンス突然変異を導入した。この突然変異の導入はGSE活性を喪失させた。
アンチセンス配向のGSE3種類のGSEは、プロモータに対しアンチセンス配向で挿入されたλ遺伝子配列を有した。1種のクローンはDNAパッケージに含まれるλ遺伝子A(位置1050〜1470)の内部セグメントを有した。他の2種類のアンチセンスGSEは複数のクローンによって示された。最初の種類は、λ遺伝子Qの5’部分に相補的なRNAをコードする12種の同一でないクローンを包含し、λ後期転写を積極的に調節する。この種類における全GSEは、Q発現を下方調節する天然λアンチセンス転写物PaQに重なる・これらGSEはいずれも正常PaQプロモータから70bp以上の上流で開始しなかったが、これらは種々の長さの下流整列配列を有した。これらGSEのうち7種は16bp領域内で開始した。
他の種類のアンチセンスGSEは4種の異なるGSEを含んでλ遺伝CIIの3'末端に対応するほぼ同一のアンチセンスRNA配列をコードし、溶原性を調節すると共に、λ遺伝子0の5'半分をコードしてλ複製蛋白をコードする。第2図に示したように、これらGSEのそれぞれはλ遺伝子Oの中間に位置する複製のλオリジ^ンを含むと共に、CIIに対し相補的であって一般にCIIを抑制する天然λアンチセンス転写物oopをも含む。これらGSEは溶解性感染を抑制するが、oopの過剰発現は一般にλ溶解性感染を増大させる。これらGSEの2種の切断変種を作成して、oop配列以外のGSEの部分が抑制の原因になるかどうかにっき決定した。
1変種はoop配列の大部分をコードする93bpセグメントを欠如したが、λ遺伝子0の5'部分を保持し、複製のλオリジンを含んだ。他の変種は複製のλオリジンからなるλ遺伝子0の158bpセグメントを欠如したが、oop配列と残余のλ遺伝子0の5'部分とを保持した。いずれの変種もλ感染を抑制せず、複製のλオリジンを含むoopおよび遺伝子0の両配列が抑制に必要とされることを示した。
結果の解釈
これら試験で特性化されたGSEは種々のメカニズムによって作用する。第1に、多数のGSEは切断型のλ構造蛋白をコードし、したがって明らかにファージ粒子組立を阻害する優性ネガティブ突然変異体として作用する。第2に、或る種のGSEは所要のλ遺伝子転写物に対し相補的なアンチセンスRNAをコードする。これらGSEはλの天然調節アンチセンス転写物を有するので、これはGSEのλ断片選択を用いて遺伝子抑制の天然メカニズムを同定しうることを示す。これは、λの完全調節蛋白をコードする第3種類のGSEにより確認される。
第4に、或る種のGSEは、構造遺伝子機能を単に阻害する従来のアンチセンスRNAメカニズムとは異なる抑制メカニズムによって作用するアンチセンスRNAをコードする。oop/0遺伝子アンチセンスRNAをコードするこれらGSEは、恐らくDNA複製を直接に阻害すると思われる。何故なら、これらは複製のλオリジンと一致するからである。この種の阻害は、λDNA複製の開始に関与するRNAアニールの阻害から生ずる。
センス配向およびアンチセンス配向の両GSEは、異なるクローンにおける末端の一致性またはほぼ一致性を示し、GSEにっき厳密な配列限界を示した。この知見は、本発明により与えられるランダム断片選択手段がGSEを好適に得るのに重要であることを示す。さらに、これら試験で用いた300〜500bp断片よりも大きい或いは小さいGSEに関するランダム断片選択は追加種類のGSEを現すことができる。化学的に合成して生物活性分子を生産しうるアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはペプチド配列を同定するために使用しうる極めて短いGSEの選択にっき特に興味が持たれる。
実施例5
新規な遺伝子機能を同定するためのGSEのランダム断片選択の使用実施例4に記載した特性化試験において、最も豊富な種類のGSEは、センス配向で挿入されたλ遺伝子Ea8.5の配列を有した。Ea8.5遺伝子の機能は従来知られていない。これは溶解感染の遅延早期段階で転写されるが、溶解性感染にも溶原性感染に必要とされない。
この遺伝子は93アミノ酸蛋白をコードする。GSEの幾種かは完全Ea8.5蛋白をコードしたのに対し他のGSEは7〜38個のC−末端または3〜10個のN−末端アミノ酸を欠失した切断蛋白をコードした。抑制効果は第2コドンにフレームシフト突然変異が導入されて喪失し、Ea8.5蛋白自身が完全型または切断型にて抑制に必要とされることを示した。溶原株におけるEa8.5の発現はプロファージ誘発を抑制せず、Ea8.5が感染の初期段階で、たとえば宿主細胞中へのファージ突入のように作用することを示した。Ea8.5を発現する細菌はマルトーズを含むマッコンキー培地で分析した際にマルトース代謝を欠如したが、ガラクトース、ラクトース、マンノースおよびアラビノースの代謝にて優性であった。イー・コリの3個のマルトースオペロンのうち1種から得られるmalK-lamB RNAはEa8.5蛋白を発現する細菌には存在せず、抑制が1amBλリセプタをコードするマルトースオペロンの抑制に関連することを示す。切断Ea8.5蛋白をコードするGSEは、ma1K-1amB RNA産生およびマルトース代謝の不完全であるがまだ有意の抑制を示した。さらに、ファージλの組立体であるimmλh80に対する耐性およびLamBとは異なるリセプタを介し細胞中に突入するφ80に対する耐性につきEa8.5形質転換細菌を試験した。これら形質転換体はこのファージに対し感受性であることが判明し、したがってEa8.5GSEによるリセプタ媒介の保護メカニズムが確認された。これらの結果は、GSEのランダム断片選択を用いて従来未知の遺伝子機能を同定しうることを示す。
実施例6
ヒトトポイソメラーゼIIに関するGSEの発生トポイソメラーゼIIは、DNA巻戻酵素であってエトポシド、ドキソルビシンおよびアムサクリンを包含する多くの抗癌剤のための標的として作用する。この酵素は一般に、二本鎖DNA断片に続くストランド通過および破断部の再結合によって作用する。抗癌剤は、酵素により合体された二本鎖破断部を有した複合体に酵素を捕獲することにより複製細胞における致命的損傷をもたらす。トポイソメラーゼIIと相互作用する抗癌剤に対し耐性である或る種の細胞ラインは、この酵素の発現を減少させる。
GSEのランダム断片選択は、極めて多数の受容体細胞への発現保存物の移行を必要とする。したがって、トポイソメラーゼIIに関するGSEを有するランダム断片保存物を作成するため、効率的なレトロウィルスベクター系を選択した。トポイソメラーゼIIに関する全コード化配列を備えたcDNAクローンを重ね合せて混合し、実施例2に記載したようにDNアーゼにより250〜350bp断片にランダムに断片化させた。合成アダプタで結合して翻訳開始および停止コドンを供給した後、断片混合物をアダプタ誘導プライマを用いてPCRにより拡大させた。拡大混合物を、neo遺伝子を有するLNCXレトロウィルスベクターにクローン化させた[ミラー・アンド・ロスマン、バイオテクニークス、第7巻、第980〜986頁(1989)]。20,000種の独立したクローンを含有する断片保存物が得られ、これを用いてNIH 3T3細胞から誘導されたアンホトロピックおよびエコトロピックのウィルスパッケージ細胞
ラインにトランスフェクトさせて、ウィルスのピンポン複製媒介の拡大を行なった[コザク・アンド・カバト、ジャーナル・バイロロジー、第64巻、第3500〜3508頁(1990)、参照]。
この結果、ランダム断片発現保存物(RFEL)、すなわちトポイソメラーゼII遺伝子配列から誘導された挿入体の代表的混合物を含む1群の組換レトロウィルスが得られた。
PFELにおける配列表示の均一性を次のように監視した。
NIH3T3細胞にウィルス含有上澄液を感染させ、次いで24時間後に組込プロウィルス挿入体配列を[P32]α−dNTPの存在下にPCR拡大させた。
PCR拡大した混合物の1部をゲル電気泳動にかけて、主たるバンドの不存在を確認した。他の1部を、数種のしばしば切断する制限酵素で切断させるトポイソメラーゼIIcDNAのサウザンブロットのプローブとして使用した。
第1試験における主たるバンドの不存在および(第2試験における全断片への均一なハイブリッド化により証明されるように、代表的な配列混合物が得られた。
次いでPFELを用いてヘラ細胞に感染させ、感染体をG418で選択した。次いで、それぞれ約50〜70個の細胞を有するG418耐性細胞のコロニーを200ng/mlの濃度のエトポシドに露出させた。
10,000個のG418耐性コロニーのうち約50個が、挿入体のないレトロウィルスを比較として用いた場合の<10-4の頻度と対比して、エトポシド耐性であった。
これら細胞ラインをエトポシド耐性コロニーから分離した。
RFELを産生するアンホトロピックおよびエコトロピックのパッケージ細胞ラインもエトポシド耐性にっき選択した。
エトポシト耐性パッケージ細胞ラインからのウィルスを用いてヘラ細胞に感染させ、次いでこれをG418で選択した。
G418耐性の感染体に3種のトポイソメラーゼII−相互作用性抗癌剤(すなわちエトポシド、テニポシドおよびアムサクリン)を添加した。
高比率の感染細胞がこれら3種の薬剤全てに耐性であり、したがってマウスパッケージ細胞ラインのエトポシド選択がヒトおよびマウスの両細胞にて活性なGSEを発生させたことを示した。
これら感染体を用いて細胞ラインを確立させた。
RFEL誘導の挿入体をPCRによりエトポシド耐性細胞ラインから回収すると共に、LNCXベクターに再クローン化させた。
新たに誘導したクローンを次いで個々にエトポシド耐性をヘラ細胞へのトランス(フェクションに際し付与する能力につき試験して、対応挿入体のGSE活性を確認した。
26種の異なる分離クローンの配列分析は、これらのうち16種がアンチセンス配向にて挿入されかつ10種がセンス配向で挿入されることを示した。
現在まで確認された10種のGSEのうち、5種が第1表に示すようにセンス配向であり、5種がアンチセンス配向であった。
確認されたGSEの配列を第3図に示す。確認されたGSEのセンス配向の挿入体は長さ37〜/99アミノ酸のトポイソメラーゼII誘導ペプチドをコードし、アダプタにより与えられたATGコドンから或いは翻訳開始にっき適する意味で挿入体の5'末端近くに位置するトポイソメラーゼIIの開放読枠内にて内部ATGコドンから開始する。
確認されたアンチセンスGSEの4種はcDNAの3'末端から生ずると共に、1種は翻訳開始部位を含むcDNA断片の5'末端から生ずる。確認されたセンス配向GSEのうち、3種はDNAに共有結合する活性部位チロシンー804とトポイソメラーゼIIの2量化に関与する「ロイシン・ジッパー」領域とを含む蛋白の中心部分から誘導される。
1種のGSEペプチドはN−末端近くの領域から誘導され、他の1種は蛋白のC−末端近くの領域から誘導される。既知の機能部位はいずれのセグメンにも関連しない。
これらの結果は、原核系(イー・コリにおけるλファージ)にてGSEを産生する原理をアンホトロピックレ(トロウィルスベクター系の使用を介し哺乳動物もしくは人間の系に拡大しうることを確認する。原核系におけると同様に、得られたGSEは複数メカニズムによって作用する。
さらに、これらの結果は、哺乳動物の1種類から産生されたGSEが他の哺乳動物の種類においても活性であることを示す。
最後に、これらの結果は、トポイソメラーゼIIに関するGSEがランダム断片発現保存物を用いて得られることをも示す。
この種のGSEは、インビトロにおける遺伝子改変された哺乳動物細胞の積極的選択および骨髄をトポイソメラーゼIIと相互作用する抗癌剤に対し耐性にするヒト遺伝子治療につき有用である。
Figure 2004321195

註:(a)トポイソメラーゼIIのcDNA配列における位置;ツサイープフルークフェルダー等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、USA、第85巻、第7177〜7181頁(1988)におけると同様に計数した残基。
(b)トポイソメラーゼIIのアミノ酸配列におけるセンス配向GSEによりコードされたペプチドの位置;翻訳は正確な開放読枠における第1ATGコドンから開始すると思われる。
実施例7
HLA抗原の発現を喪失させるGSEの作成
細胞毒性丁リンパ球による標的細胞の破壊は、付着および抗原特異性丁細胞反応の開始にっき標的細胞上における主たる組織適合性(MHC、HLA)分類1の抗原の存在を必要とする。
MHC分類1の抗原の遮蔽は、マウス受容体におけるヒトドナー細胞のゼノグラフト排斥
を防止する。
したがって標的細胞は、この種の細胞の表面におけるMHC分類1抗原の故意の減少によって免疫破壊から防止することができる。
細胞毒性丁リンパ球に一よる破壊に対し耐性の標的細胞は各種の目的に有用である。
たとえば、これらは免疫競合性マウスにおける抗癌剤試験のためインビボのモデルとして作用しうるヒト腫瘍ゼノグラフトとして使用することができる。
さらに、或る種のヒト組織培養細胞(たとえば膵臓細胞)を用いて、非適合の受容体患者に組織移植することができる。
細胞表面におけるMHC分類1抗原の発現はβ2一マイクログロブリン、すなわち高度保持された蛋白の同時発現を必要とする。
すなわちβ2一マイクログロブリンとMHC分類1蛋白との両者は、免疫破壊に対し耐性を
もたらす抑制の標的である。
β2一マイクログロブリン生成を欠如したマウスは、細胞表面上にMHC分類1の
抗原が存在したとしても僅かしか発現せず、しかもCD4−8+T細胞が存在しない以外は増殖性でありかつ明らかに健全である。
免疫破壊に対し耐性である組織培養細胞は、β2−マイクログロブリンから誘導されたGSEにっきランダム断片発現保存物を感染させて作成される・ヒトβ2−マイクログロブリンのためのヌクレオチド配列はグソー等、ジャーナル・イミュノロジー、第139巻、第3132〜3138頁(1987)に記載されている。
完成ヒトβ2−マイクログロブリンcDNA配列を実施例6に記載したようにRFELを作成すべく用い、感染細胞をG418耐性にっき選択する。
次いで感染細胞を、免疫競合性マウスヘの注入により免疫破壊に対する耐性につき選択する。選択された細胞を用いて、実施例6に記載したようにGSEを分離する。次いで分離されたGSEを用いて、他の種類の細胞を免疫破壊に対し耐性にする。或いは、GSE保存物は全MHC分類1遺伝子のcDNAからも作成される。
実施例8
全ヒトcDNAのための標準化した
ランダム断片保存物の作成
遺伝子構造もしくは機能の特殊な知識を必要とせずに、抑制が所望の効果を示す任意の遺伝子にっきGSEを得ることが望ましい。
この種の遺伝子の例は、現在未知の腫瘍抑制遺伝子または抗癌剤の細胞毒性作用を強化する
遺伝子を包含する。
中庸レベルもしくは高レベルにて発現される哺乳動物遺伝子に対応したGSEを分離するには、全cDNAのRFELを使用することができる。
しかしながら、低レベルで発現される遺伝子に対応したGSEを分離するには、標準化したcDNA保存物の使用が望ましい。
標準化したcDNA集団の作成はパタンジャリ等によりプロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、USA、第88巻、第1943〜1947頁(1991)に記載されている。ポリ(A)+RNAをヘラ細胞から抽出し、ランダム処理した短断片cDNAを作成する。
ランダム断片保存物を作成する目的で、翻訳開始コドンおよび停止コドンを与える合成アダプタにcDNA断片一を結合させ、次いで実施例6に記載したようにPCR拡大を行なうことにより手順を改変する。
PCRは別々の多くの反応で行なわれ、その後にこれら反応を組合わせて特定配列のランダムな過剰もしくは不足拡大を最小化させると共に、生成物の収率を増大させる。
次いで、PCR拡大混合物をゲル電気泳動により寸法分画し、300〜500bp断片を採取する。
異なるmRNA配列の表示は、異なる存在程度のmRNAに対応する一連の6〜8個のプローブを用い、混合物のサウザンブロットハイブリッド化により監視される。
リボソームDNAおよびβ一アクチンが良好な高濃度プローブであるのに対し、c-mycおよびdhfrは中濃度プローブとして作用し、h-rasおよびk-rasは低濃度プローブとして作用する。
標準化は変性および再アニーリングのための24、48、72、96および120時間の時点を用いるPCR拡大cDNAの再アニーリングによって達成される。
次いで一本鎖および二本鎖DNAを、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより、それぞれの再アニール混合物から分離する。
各時点からの一本鎖DNAフラクションをアダクタ由来のプライマを用いてPCR拡大すると共に、異なる配列の相対的濃度にっきサウザンハイブリッド化により分析する。
最も豊富な種類の選択的な不足表示は、異なる時点で再アニールされた2種の保存物を、最も均一な表示を与えるよう計算した比で混合して回避することができる。
次いで標準化されたcDNA集団を、実施例6に記載したようにLNCXレトロウィルスベクターにクローン化させる。
次いで保存物をピンポン拡大により拡大させ、その際エコトロピックパッケージ細胞ラインGP+E86とアンホトロピックパッケージ細胞ラインGP+envAm12との1:1混合物[マルコウィッツ等、バイロロジー、第167巻、第400〜406頁(1988)]を10〜15個の別々のバッチにて用い、約106個の独立クローンを1バッチ当りに生成させる。
単一の100mmプレートから、10ml上澄につき>106のアンホトロピックウィルスの収率を注入の11〜12日後に得た。
これらアンホトロピックウィルスは異なる断片のかなり均一な表示を有するが、その後の段階では個々のウィルス生成クローンが主体となり始め、配列表示を不均一にする。
均一な配列表示は、パッケージ細胞上澄を感染させた細胞からDNAを急速に抽出し、次いで
リンカー特異性のPCR拡大を行ないかつ異なるプローブでサウザンハイブリッド化することにより監視される。
実施例9
劣性遺伝子を同定するための標準化
ランダム断片GSE保存物の使用
全mRNAを代表する保存物から任意特定の遺伝子につきGSEを得るには、極めて大きい保存物を発生させうることが必要である。
高級真核性細胞の体組織は約10,000個の遺伝子につきmRNAを発現する。
約2.5kbの平均mRNA長さにつき、所定の組織に関する全mRNAもしくはcDNA複雑性は約25,000kbである。
ヒトトポイソメラーゼIIをコードする6kbのcDNAから作成された保存物にて、200種のクローンのうち約1種がGSEを有することを突き止めた。
これは保存物複雑性の各キロベースにっき33種のクローン毎に約1個のGSEの頻度に相当する。
すなわち25,000kbの複雑性の保存物につき、特定遺伝子に関するGSEの頻度は825,000クローンにて約1個、すなわち約10-6である。
少なくとも1個のGSEが各遺伝子につき存在することを確認するため、約107の独立クローンの保存物を実施例7に記載したように作成する。
それぞれ約50,000コロニーを有する20枚の150mmプレートにて、約106個の感染ヘラ細胞をスクリーニングするのに充分である。
すなわち20枚のプレート選択よりなる10〜15バッチにて、マイナス選択が可能である任意
所望の劣性遺伝子につきGSEを分離するのに充分である(たとえばトポイソメラーゼIIGSEにつき200ng/mlのエトポシド)。
実施例6におけると同様に、G418選択に続き50〜70個の細胞を有するコロニーにてマイナス選択する。
マイナス選択に対する耐性のバックグランドに基づき、耐性コロニーを個々に処理し或いは混合して次回の再クローン化およびGSE選択にかける。
次いでGSEの挿入体を用いて配列決定およびデータベース比較によりオリジンの遺伝子を同定し、その際慣用のcDNAクローン化にてプローブとして使用し、或いは「固定PCR」法によるcDNAクローン化にて使用する[オハラ等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、USA、第86巻、第5673〜5677頁(1989)、参照]。
実施例10
抗−HIV-1遺伝的抑制要素の誘導化
クローン化したヒト免疫不全症ウィルス−1(HIV-1)cDNAをDNアーゼ1で切断し、充填し、リンカーを付着させ、次いで実施例2に記載したように寸法選択する。
断片混合物を、優性の選択自在な標識を有してヒト丁細胞に感染しうるレトロウィルス発現ベクターに移行させる。
このHIV断片/レトロウィルスベクター保存物を用いて、HIV-1による死滅に対し感受性
であるヒト丁細胞ラインに感染させ、次いで感染細胞を優性標識の存在にっき選択する。選択細胞の混合物をHIV-1に露呈させ、細胞病理作用を完結させる。
生存細胞を増殖させると共に、そのDNAを分離する。
HIV-1断片に対応するDNA配列を分離細胞DNAの拡大により得、その際挿入体の各側におけるレトロウィルスベクターに特異性のプライマーに対するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いる。
PCR発生したDNA断片にリンカーを付着させて同じレトロウィルスベクターに移行させ、これを用いて第2保存物を形成するための第1保存物を作成した。
初期保存物につき使用したと同じT細胞ラインに、次いで第2保存物を感染させる。
感染細胞を優性標識の存在につき選択し、個々の選択クローンをHIV-1による死滅に対する耐性につき試験する。
推定の抗−HIV-1GSEを含有する耐性クローンを用いて、上記したようにポリメラーゼ連鎖反応により推定GSEを分離する。
次いでGSE候補を個々に同じレトロウィルスベクターに挿入し、HIV-1の細胞病理作用に対しT−細胞を保護する能力につき試験する。
実施例11
抗一タバコモザイク病ウィルス(TMV)
遺伝的抑制要素の誘導化
全TMVcDNAを実施例2に記載したようにランダムに断片化する。次いで断片混合物を、ネエマイシンホスホトランスフェラーゼII遺伝子を含有する発現ベクターに移行させて、カリフラワーモザイク病35Sプロモータから開始すると共にノパリンシンセターゼ遺伝子からポリアデニル化信号で停止する逆転断片を転写する。
タバコ葉円盤に、発現保存物を含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)細胞を接種する。形質転換細胞をカナマイシン耐性につき培養して選択する。次いでカナマイシン耐性細胞をTMVに対し培養で露出させ、細胞病理作用を発生させる。
DNAを形質転換TMV耐性細胞から集め、挿入断片を挿入部位に隣接したDNA配列と相同のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応により拡大させる。
増大配列を初期保存物の作成に用いたと同じ発現ベクターに移行させ、再びA・ツメファシエンスを形質転換させるべく用いる。
タバコ葉円盤にもう1度再びA・ツメファシエンスの保存物を接種し、再びカナマイシン耐性細胞をTMIV耐性につき試験する。
個々のTMV耐性クローンを用いて、上記のようにポリメラーゼ連鎖反応によりGSEを分離する。
次いでGSE候補を用いて個々のGSE発現ベクターを作成し、これらをA・ツメファシエンスに挿入してタバコ葉円盤に接種する。
接種されたタバコ葉円盤をカナマイシン耐性細胞につき選択し、これら細胞から自家受粉した個々の苗を作成してTMV耐性につき試験する。
Figure 2004321195
Figure 2004321195
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Figure 2004321195
Figure 2004321195
Figure 2004321195
Figure 2004321195
Figure 2004321195
第1図は、ラムダゲノムにおけるGSEの分布を示す。
GSEにて配列が見られる遺伝子のみをラムダの遺伝子マップに示す。白棒はセンス配向のGSEを示す。陰棒枠はアンチセンス配向のGSEを示す。棒の高さは各種類にっき配列決定されたGSEクローンの個数に対応する。棒の頂部に示した数字は、各種類の代表的クローンによるプロファージ誘発の抑制程度を示す。
第2図は、GSEのoop/ori種類および対応のラムダ耐性表現型の分布を示す。矢印は転写の方向を示す。アンチセンスoop転写体のマップ位置はクリンケおよびウルフ[ジーンズ・ディベロップメント、第１巻、第1005頁(1988)]にしたがう。4種の上方のクローンがGSE選択により得られた。2種の下方のクローンが、対応プライマを用いるPCR合成により作成された。 図３-1から図３−３は、実施例6に記載されたようにヒトトポイソメラーゼIIから誘導されたGSEのヌクレオチド配列を示す。AはSeq ID No:1であり;BはSeq ID No:2であり;CはSeq ID No:3であり;DはSeq ID No:4であり;EはSeq ID No:5であり;FはSeq ID No:6であり;GはSeq・IDNo:7であり;HはSeq ID No:8であり;1はSeq ID No:9であり;JはSeq ID No:10である。 図３-1から図３−３は、実施例6に記載されたようにヒトトポイソメラーゼIIから誘導されたGSEのヌクレオチド配列を示す。AはSeq ID No:1であり;BはSeq ID No:2であり;CはSeq ID No:3であり;DはSeq ID No:4であり;EはSeq ID No:5であり;FはSeq ID No:6であり;GはSeq・IDNo:7であり;HはSeq ID No:8であり;1はSeq ID No:9であり;JはSeq ID No:10である。 図３-1から図３−３は、実施例6に記載されたようにヒトトポイソメラーゼIIから誘導されたGSEのヌクレオチド配列を示す。AはSeq ID No:1であり;BはSeq ID No:2であり;CはSeq ID No:3であり;DはSeq ID No:4であり;EはSeq ID No:5であり;FはSeq ID No:6であり;GはSeq・IDNo:7であり;HはSeq ID No:8であり;1はSeq ID No:9であり;JはSeq ID No:10である。

Claims (26)

  1. （ａ）抑制すべき遺伝子と相同のｃＤＮＡをランダムに断片化してｃＤＮＡ断片を生成させるステップと、
    （ｂ）上記ｃＤＮＡ断片を発現ベクターに移行させて保存物を作製するステップであって、ここで発現ベクターは遺伝子抑制を選択またはスクリーニングしうる生細胞にて該ｃＤＮＡ断片を発現することができるステップと、
    （ｃ）上記保存物を生細胞に導入することにより該生細胞を遺伝子的に改変するステップと、
    （ｄ）遺伝子的に改変された遺伝的抑制要素を含有する生細胞を遺伝子抑制に関する選択またはスクリーニングによって単離または濃縮するステップと、
    （ｅ）上記遺伝子的に改変された細胞から遺伝的抑制要素を得るステップと、
    を含んで成る遺伝的抑制要素（ＧＳＥ）を得る方法。
  2. 遺伝的抑制要素が、ペプチドをコードするセンス配向の遺伝的抑制要素である請求項１に記載の方法。
  3. 遺伝的抑制要素が、アンチセンスＲＮＡをコードするアンチセンス配向の遺伝的抑制要素である請求項１に記載の方法。
  4. 遺伝的抑制要素がトポイソメラーゼＩＩ、β２−マイクログロブリン、ＭＨＣクラスＩ蛋白質又はＨＬＡクラスＩ蛋白質のいずれか１つの発現を抑制する請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 遺伝的抑制要素がトポイソメラーゼＩＩ発現を抑制する請求項４に記載の方法。
  6. 遺伝的抑制要素が、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．）１乃至１０に示したヌクレオチド配列よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する請求項５に記載の方法。
  7. 標的遺伝子の発現を調節する遺伝子の遺伝的抑制要素を得る方法であって、該方法は、
    （ａ）抑制すべき遺伝子と相同のＤＮＡをランダムに断片化してＤＮＡ断片を生成させるステップと、
    （ｂ）上記ＤＮＡ断片を発現ベクターに移行させて保存物を作製するステップであって、ここで発現ベクターは上記標的遺伝子の発現を調節する遺伝子の抑制を選択またはスクリーニングしうる生細胞にて該ＤＮＡ断片を発現することができるステップと、
    （ｃ）上記保存物を生細胞に導入することにより該生細胞を遺伝子的に改変するステップと、
    （ｄ）遺伝子的に改変された上記標的遺伝子の発現を調節する遺伝子に対応する遺伝的抑制要素を含む生細胞を該標的遺伝子の発現の変化に関する選択またはスクリーニングにより単離または濃縮するステップと、
    （ｅ）上記遺伝子的に改変された細胞から上記標的遺伝子の発現を調節する遺伝子に対応した遺伝的抑制要素を得るステップと、
    を含んで成る前記方法。
  8. 遺伝的抑制要素が、ペプチドをコードするセンス配向の遺伝的抑制要素である請求項７に記載の方法。
  9. 遺伝的抑制要素が、アンチセンスＲＮＡをコードするアンチセンス配向の遺伝的抑制要素である請求項７に記載の方法。
  10. センス配向の遺伝的抑制要素によりコードされるペプチドに相当する合成ペプチドの作製方法であって、該方法は、
    （ａ）抑制すべき遺伝子と相同のＤＮＡをランダムに断片化してＤＮＡ断片を生成させるステップと、
    （ｂ）上記ＤＮＡ断片を発現ベクターに移行させて保存物を作製し、ここで発現ベクターは遺伝子抑制を選択またはスクリーニングしうる生細胞にて該ＤＮＡ断片を発現することができるステップと、
    （ｃ）上記保存物を生細胞に導入することにより該生細胞を遺伝子的に改変するステップと、
    （ｄ）遺伝子的に改変された遺伝的抑制要素を含有する生細胞を遺伝子抑制に関する選択またはスクリーニングによって単離または濃縮するステップと、
    （ｅ）上記遺伝子的に改変された細胞から遺伝的抑制要素を得るステップと、
    （ｆ）上記遺伝的抑制要素によりコードされるアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するペプチドを合成するステップと、
    を含んで成る前記方法。
  11. 遺伝的抑制要素がトポイソメラーゼＩＩ、β２−マイクログロブリン、ＭＨＣクラスＩ蛋白質又はＨＬＡクラスＩ蛋白質のいずれか１つの発現を抑制する請求項１０に記載の方法。
  12. アンチセンス配向の遺伝的抑制要素によりコードされるアンチセンスＲＮＡに対応する合成オリゴヌクレオチドの作製方法であって、該方法は、
    （ａ）抑制すべき遺伝子と相同のＤＮＡをランダムに断片化してＤＮＡ断片を生成させるステップと、
    （ｂ）上記ＤＮＡ断片を発現ベクターに移行させて保存物を作製するステップであって、ここで発現ベクターは遺伝子抑制を選択またはスクリーニングしうる生細胞にて該ＤＮＡ断片を発現することができるステップと、
    （ｃ）上記保存物を生細胞に導入することにより該生細胞を遺伝子的に改変するステップと、
    （ｄ）遺伝子的に改変された遺伝的抑制要素を含有する生細胞を遺伝子抑制に関する選択またはスクリーニングによって単離または濃縮するステップと、
    （ｅ）上記遺伝子的に改変された細胞から遺伝的抑制要素を得るステップと、
    （ｆ）上記遺伝的抑制要素によりコードされるアンチセンスＲＮＡのヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを合成するステップと、
    を含んで成る前記方法。
  13. 遺伝的抑制要素がトポイソメラーゼＩＩ、β２−マイクログロブリン、ＭＨＣクラスＩ蛋白質又はＨＬＡクラスＩ蛋白質のいずれか１つの発現を抑制する請求項１２に記載の方法。
  14. 請求項１に記載の遺伝的抑制要素を細胞中へ導入することにより生細胞を遺伝子的に改変するステップを含むことを特徴とする遺伝的抑制要素を含有する生細胞を得る方法。
  15. （ａ）ＤＮＡ配列が抑制すべき遺伝子の部分と相同であるランダム断片化したｃＤＮＡ配列を含む保存物を導入することにより生細胞を遺伝子的に改変し、該保存物は該生細胞にて該ｃＤＮＡ配列を発現することができるステップと、
    （ｂ）遺伝的抑制要素を含有する遺伝子的に改変された生細胞を遺伝子抑制に関するスクリーニングまたは選択により単離または濃縮するステップと、
    を含むことを特徴とする遺伝的抑制要素を含有した生細胞を得る方法。
  16. 請求項１４に記載の方法により得られる、遺伝的抑制要素を含有する遺伝子的に改変された生細胞。
  17. 請求項１５に記載の方法により得られる、遺伝的抑制要素を含有する遺伝子的に改変された生細胞。
  18. 遺伝的抑制要素（ＧＳＥ）により不活性化させた際に該不活性遺伝子を有する細胞に対し選択もしくはスクリーニングしうる表現型を付与する劣性遺伝子に対応したＧＳＥを作製するに際し、
    （ａ）ゲノムＤＮＡ又は全ｃＤＮＡ集団を細胞から得るステップと、
    （ｂ）上記ゲノムＤＮＡ又は全ｃＤＮＡ集団をランダムに断片化してランダムＤＮＡ断片を生成させるステップと、
    （ｃ）上記ランダムＤＮＡ断片を合成アダプタに結合させて、増幅しうるランダムＤＮＡ断片を生成させるステップと、
    （ｄ）上記ランダムＤＮＡ断片の増幅混合物を選択自在な標識を持った適する発現ベクターにクローン化させてランダム断片発現保存物を生成させるステップと、
    （ｅ）上記ランダム断片発現保存物を適する標的細胞に移行させるステップと、
    （ｆ）上記発現ベクターに存在する選択自在な標識の存在につき標的細胞を選択して、選択自在な標識を有する標的細胞を得るステップと、
    （ｇ）ＧＳＥによる劣性遺伝子の不活性化により細胞に付与された選択もしくはスクリーニングしうる表現型に関して上記選択自在な標識を有する標的細胞を選択もしくはスクリーニングするステップと、
    （ｈ）上記選択もしくはスクリーニングしうる表現型を持った標的細胞からＧＳＥを回収するステップと、
    を含むことを特徴とするＧＳＥの作製方法。
  19. 標的細胞が哺乳動物細胞、細菌細胞および植物細胞からなる群から選択される請求項１８に記載の方法。
  20. 前記保存物が、該保存物内において、細胞から低レベルで発現されるＲＮＡをコードするクローン表示数が細胞から中庸レベル乃至高レベルで発現されるＲＮＡをコードするクローン表示数と実質的に等しくなるように標準化したｃＤＮＡ保存物である請求項１８又は１９に記載の方法。
  21. 遺伝的抑制要素が、ペプチドをコードするセンス配向の遺伝的抑制要素である請求項１８に記載の方法。
  22. 遺伝的抑制要素が、アンチセンスＲＮＡをコードするアンチセンス配向の遺伝的抑制要素である請求項１８に記載の方法。
  23. センス配向の遺伝的抑制要素（ＧＳＥ）によりコードされるペプチドに相当する合成ペプチドの作製方法であって、該ＧＳＥはＧＳＥにより不活性化させた際に該不活性遺伝子を有する細胞に対し選択もしくはスクリーニングしうる表現型を付与する劣性遺伝子に対応し、該方法は、
    （ａ）ゲノムＤＮＡ又は全ｃＤＮＡ集団を細胞から得るステップと、
    （ｂ）上記ゲノムＤＮＡ又は全ｃＤＮＡ集団をランダムに断片化してランダムＤＮＡ断片を生成させるステップと、
    （ｃ）上記ランダムＤＮＡ断片を合成アダプタに結合させて、増幅しうるランダムＤＮＡ断片を生成させるステップと、
    （ｄ）上記ランダムＤＮＡ断片の増幅混合物を選択自在な標識を持った適する発現ベクターにクローン化させてランダム断片発現保存物を生成させるステップと、
    （ｅ）上記ランダム断片発現保存物を適する標的細胞に移行させるステップと、
    （ｆ）上記発現ベクターに存在する選択自在な標識の存在につき標的細胞を選択して、選択自在な標識を有する標的細胞を得るステップと、
    （ｇ）ＧＳＥによる劣性遺伝子の不活性化により細胞に付与された選択もしくはスクリーニングしうる表現型に関して上記選択自在な標識を有する標的細胞を選択もしくはスクリーニングするステップと、
    （ｈ）上記選択もしくはスクリーニングしうる表現型を持った標的細胞からＧＳＥを回収するステップと、
    （ｉ）該ＧＳＥによりコードされるアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するペプチドを合成するステップと、
    を含んで成る前記方法。
  24. アンチセンス配向の遺伝的抑制要素（ＧＳＥ）によりコードされるアンチセンスＲＮＡに対応する合成オリゴヌクレオチドの作製方法であって、該ＧＳＥはＧＳＥにより不活性化させた際に該不活性遺伝子を有する細胞に対し選択もしくはスクリーニングしうる表現型を付与する劣性遺伝子に対応し、該方法は、
    （ａ）ゲノムＤＮＡ又は全ｃＤＮＡ集団を細胞から得るステップと、
    （ｂ）上記ゲノムＤＮＡ又は全ｃＤＮＡ集団をランダムに断片化してランダムＤＮＡ断片を生成させるステップと、
    （ｃ）上記ランダムＤＮＡ断片を合成アダプタに結合させて、増幅しうるランダムＤＮＡ断片を生成させるステップと、
    （ｄ）上記ランダムＤＮＡ断片の増幅混合物を選択自在な標識を持った適する発現ベクターにクローン化させてランダム断片発現保存物を生成させるステップと、
    （ｅ）上記ランダム断片発現保存物を適する標的細胞に移行させるステップと、
    （ｆ）上記発現ベクターに存在する選択自在な標識の存在につき標的細胞を選択して、選択自在な標識を有する標的細胞を得るステップと、
    （ｇ）ＧＳＥによる劣性遺伝子の不活性化により細胞に付与された選択もしくはスクリーニングしうる表現型に関して上記選択自在な標識を有する標的細胞を選択もしくはスクリーニングするステップと、
    （ｈ）上記選択もしくはスクリーニングしうる表現型を持った標的細胞からＧＳＥを回収するステップと、
    （ｉ）該ＧＳＥによりコードされるアンチセンスＲＮＡのヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを合成するステップと、
    を含んで成る前記方法。
  25. 細胞に選択もしくはスクリーニングしうる表現形を付与する遺伝的抑制要素（ＧＳＥ）を得る方法であって、該方法は、
    （ａ）全ｃＤＮＡ集団を細胞から得るステップと、
    （ｂ）上記全ｃＤＮＡ集団をランダムに断片化してランダムＤＮＡ断片を生成させるステップと、
    （ｃ）上記ランダムＤＮＡ断片を合成アダプタに結合させて、増幅しうるランダムＤＮＡ断片を生成させるステップと、
    （ｄ）上記ランダムＤＮＡ断片の増幅混合物を選択自在な標識を持った適する発現ベクターにクローン化させてランダム断片発現保存物を生成させるステップであって、ただし該保存物はｃＤＮＡ保存物であるステップと、
    （ｅ）上記ランダム断片発現保存物を適する標的細胞に移行させるステップと、
    （ｆ）上記発現ベクターに存在する選択自在な標識の存在につき標的細胞を選択して、選択自在な標識を有する標的細胞を得るステップと、
    （ｇ）ＧＳＥにより細胞に付与された選択もしくはスクリーニングしうる表現型に関して上記選択自在な標識を有する標的細胞を選択もしくはスクリーニングするステップと、
    （ｈ）上記選択もしくはスクリーニングしうる表現型を持った標的細胞からＧＳＥを回収するステップと、
    を含んで成る前記方法。
  26. 細胞に選択もしくはスクリーニングしうる表現形を付与する遺伝的抑制要素（ＧＳＥ）を得る方法であって、該方法は、
    （ａ）全ｃＤＮＡ集団を細胞から得るステップと、
    （ｂ）上記全ｃＤＮＡ集団をランダムに断片化してランダムＤＮＡ断片を生成させるステップと、
    （ｃ）上記ランダムＤＮＡ断片を合成アダプタに結合させて、増幅しうるランダムＤＮＡ断片を生成させるステップと、
    （ｄ）上記ランダムＤＮＡ断片の増幅混合物を選択自在な標識を持った適する発現ベクターにクローン化させてランダム断片発現保存物を生成させるステップであって、ただし該保存物は、該保存物内において、細胞から低レベルで発現されるＲＮＡをコードするクローン表示数が細胞から中庸レベル乃至高レベルで発現されるＲＮＡをコードするクローン表示数と実質的に等しくなるように標準化したｃＤＮＡ保存物であるステップと、
    （ｅ）上記ランダム断片発現保存物を適する標的細胞に移行させるステップと、
    （ｆ）上記発現ベクターに存在する選択自在な標識の存在につき標的細胞を選択して、選択自在な標識を有する標的細胞を得るステップと、
    （ｇ）ＧＳＥにより細胞に付与された選択もしくはスクリーニングしうる表現型に関して上記選択自在な標識を有する標的細胞を選択もしくはスクリーニングするステップと、
    （ｈ）上記選択もしくはスクリーニングしうる表現型を持った標的細胞からＧＳＥを回収するステップと、
    を含んで成る前記方法。
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