JP2014221041A - 遺伝子不活性化のための方法と組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】標的遺伝子の部分的又は完全な不活性化のための組成物と方法が開示される。また例えば治療目的で細胞内の遺伝子を不活性化するために及び／又は標的遺伝子が不活性化されている細胞株を産生するために、これらの組成物（試薬）の製造法と使用法の提供。
【解決手段】ジンクフィンガータンパク質と切断ドメイン又は切断半ドメインとを含むジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用して、ＣＣＲ５遺伝子を不活性化するため、ＺＦＮのジンクフィンガー認識領域を含む、特定な配列からなるＺＦＮをコードするポリヌクレオチド、ＺＦＮをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、例えばアデノウイルス（Ａｄ）ベクター、及びＺＦＮをコードするポリヌクレオチドを含む細胞、及び／又はＺＦＮを含む細胞を用いる。
【選択図】図２０

Description

本開示は、ポリペプチドとゲノム工学及び相同的組換えの分野である。

関連出願の相互参照
本発明は、米国仮特許出願第60/808,501号（２００６年５月２５日出願）；米国仮特許出願第60/847,269号（２００６年９月２６日出願）；米国仮特許出願第60/926,911号（２００７年４月３０日出願）（これらの開示内容のすべては参照することによりその全体が本明細書に援用される）の利益を請求する。

連邦政府に支援された研究でなされた発明に対する権利の陳述
該当せず。

背景
ゲノムＤＮＡの標的化切断のための種々の方法と組成物が記載される。かかる標的化切断は、例えば標的化突然変異誘発を誘導し、細胞ＤＮＡ配列の標的化欠失を誘導し、所定の染色体遺伝子座での標的化組換えを促進するのに使用することができる。例えば米国特許公報第２００３０２３２４１０号、２００５０２０８４８９号、２００５００２６１５７号、２００５００６４４７４号、２００６０１８８９８７号、及び国際特許公報ＷＯ０７／０１４２７５号（これらの開示内容は参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。

ＣＣＲ５（７−膜貫通ケモカイン受容体）は、ＨＩＶ−１がＣＤ４ Ｔ細胞に侵入するための主要な共同受容体である（Samson et al. (1996) Nature 382:722-725; Deng et al. (1996) Nature 381:661-666; Alkhatib (1996) Science 272:1955-1958）。ＣＣＲ５遺伝子におけるＨＩＶ−１耐性付与ホモ接合性Δ３２欠失の発見以来、ＣＣＲ５はＨＩＶ治療法の主要な標的として盛んに研究されている。小分子は受容体のインターナリゼーションを誘導するか又はＣＣＲ５−ＨＩＶ相互作用を阻止することが証明されている（Fatkenheuer et al. (2005) Nat. Med. 11:1170-1172）が、これらの小分子アプローチにより、興味深いことにウイルス侵入のためにＣＣＲ５を使用し続けるエスケープ変異体の選択を介して抵抗性が出現した（Kuhmann et al. (2004) J. Virol. 78:2790-2807）。同様にイントラボディ、アンチセンス、及びＲＮＡｉベースのアプローチは今日まで、ＣＣＲ５発現をほんのわずかしか阻止しない。

すなわち表現型浸透性とＨＩＶ感染への長期抵抗性のために、ＣＣＲ５を完全にノックアウトする組成物に対するニーズがある。

要約
標的遺伝子の部分的又は完全な不活性化のための組成物と方法が開示される。また例えば治療目的で細胞内の遺伝子を不活性化するために及び／又は標的遺伝子が不活性化されている細胞株を産生するために、これらの組成物（試薬）の製造法と使用法が開示される。

ある態様において、ヒトＣＣＲ−５遺伝子中に標的部位を有するジンクフィンガーヌクレアーゼ（zinc finger nuclease）（ＺＦＮ）が提供される。ある実施態様においてこれらのヌクレアーゼによるＣＣＲ−５遺伝子内の切断により、ＣＣＲ５遺伝子が永久に破壊（例えば変異）される。ある実施態様において、天然に存在するＣＣＲ−５Δ３２変異の上流の標的部位に結合するように、ジンクフィンガードメインが遺伝子操作される。ジンクフィンガータンパク質は、１、２、３、４、５、６、又はそれ以上のジンクフィンガーを含有し、それぞれのジンクフィンガーは、標的遺伝子中の標的サブサイトに結合する認識らせんを有する。ある実施態様において標的遺伝子はＣＣＲ−５であり、ジンクフィンガータンパク質は４つのフィンガー（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、及びＦ４と呼ばれ、Ｎ末端からＣ末端にＦ１からＦ４の順に並んでいる）を含み、表１に示す認識領域のアミノ酸配列を含む。

すなわちある態様において、遺伝子操作されたジンクフィンガータンパク質ＤＮＡ結合ドメインが提供され、ここでＤＮＡ結合ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＦ１からＦ４の順に並んだ４つのジンクフィンガー認識領域を含み、Ｆ１、Ｆ３、及びＦ４は以下のアミノ酸配列を含む：Ｆ１：ＤＲＳＮＬＳＲ（配列番号２）；Ｆ３：ＲＳＤＮＬＡＲ（配列番号４）；及びＦ４：ＴＳＧＮＬＴＲ（配列番号８）。ある実施形態においてＦ２は、アミノ酸配列ＩＳＳＮＬＮＳ（配列番号５）を含む。あるいはＦ２は、アミノ酸配列ＶＳＳＮＬＴＳ（配列番号６）を含む。

本明細書に記載のタンパク質は、切断ドメイン及び／又は切断半ドメインをさらに含んでよい（例えば、野生型又は遺伝子操作されたＦｏｋＩ切断半ドメイン）。すなわち本明細書に記載の任意のＺＦＮにおいて、ヌクレアーゼドメインは野生型ヌクレアーゼドメイン又はヌクレアーゼ半ドメイン（例えばＦｏｋＩ切断半ドメイン）を含んでよい。別の実施態様においてＺＦＮは、遺伝子操作されたヌクレアーゼドメイン又は半ドメイン、例えば真性（obligate）ヘテロダイマーを形成する遺伝子操作されたＦｏｋＩ切断半ドメインを含む。例えば米国仮特許出願第６０／８０８，４８６号（２００６年５月２５日出願）を参照のこと。

別の態様において本開示は、本明細書に記載の任意のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書に記載の任意のポリヌクレオチドはまた、標的遺伝子（例えばＣＣＲ−５）への標的化挿入のための配列（ドナー又はパッチ配列）を含んでよい。

別の態様において本明細書に記載の任意のポリヌクレオチドを含む遺伝子送達ベクターが提供される。ある実施態様においてベクターはアデノウイルスベクター（例えばＡｄ５／３５ベクター）である。すなわちまた、標的遺伝子への標的化組み込みのための少なくとも１つのジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする配列及び／又はドナー配列を含む、アデノウイルス（Ａｄ）ベクターが提供される。ある実施態様においてＡｄベクターはキメラＡｄベクター、例えばＡｄ５／３５ベクターである。さらなる態様において標的遺伝子は、ヒトＣＣＲ−５遺伝子である。本明細書に記載のベクターはドナー配列を含んでよい。ある実施態様において１つのベクターが、１つ又はそれ以上のＺＦＮをコードする配列及びドナー配列を含む。別の態様においてドナー配列が第１のベクターに含有され、ＺＦＮコード配列が第２のベクター中に存在する。

本明細書に記載のベクター（例えばＡｄベクター）のＺＦＮ配列は典型的には、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）と切断ドメインもしくは切断半ドメイン（すなわちヌクレアーゼドメイン）の融合体をコードする。ＺＥＮのジンクフィンガータンパク質部分は、標的遺伝子中の標的部位に結合するように遺伝子操作される。ジンクフィンガータンパク質は１、２、３、４、５、６、又はそれ以上のジンクフィンガーを含有し、それぞれのジンクフィンガーは、標的遺伝子中の標的サブサイトに結合する認識らせんを有する。ある実施態様において標的遺伝子はＣＣＲ−５であり、ジンクフィンガータンパク質は４つのフィンガー（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、及びＦ４と呼ばれる）を含み、表１に示す認識領域のアミノ酸配列を含む。

本明細書に記載の任意のポリヌクレオチド又はタンパク質において、切断ドメインは少なくとも１つの切断ドメイン又は少なくとも１つの切断半ドメインを含んでよい。ある実施態様において切断ドメイン又は切断半ドメインは、野生型切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩ野生型切断半ドメイン）である。別の実施態様において切断ドメイン又は切断半ドメインは遺伝子操作される。

さらに別の態様において本開示は、本明細書に記載のタンパク質、ポリヌクレオチド、及び／又はベクターを含む単離された細胞を提供する。ある実施態様において細胞は、造血幹細胞、Ｔ細胞（例えばＣＤ４⁺Ｔ細胞）、マクロファージ、樹状細胞、及び抗原提示細胞よりなる群から選択される。別の態様において本明細書に記載の１つ又はそれ以上のＡｄベクターを含む細胞（Ａｄ−ＺＦＮ、Ａｄ−ＺＦＮ−ドナー、及び／又はＡｄ−ドナーベクター）もまた記載される。細胞には、例えば末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、マクロファージ、間葉系幹細胞、ヒト胚幹細胞（ｈＥＳ細胞）、造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４⁺細胞）、Ｔ細胞（例えばＣＤ４⁺細胞）、樹状細胞、又は抗原提示細胞；又は細胞株、例えばＫ５６２（慢性骨髄性白血病）、ＨＥＫ２９３（胚腎臓）、ＰＭ−１（ＣＤ４⁺Ｔ細胞）、ＴＨＰ−１（単球性白血病）、又はＧＨＯＳＴ（骨肉腫）がある。

別の態様において、１つ又はそれ以上のタンパク質、ポリヌクレオチド、及び／又はベクターを本明細書に記載の細胞に導入することにより、細胞中の標的遺伝子を不活性化する方法が記載される。本明細書に記載の方法においてＺＦＮは、細胞ＤＮＡ配列の標的化突然変異誘発、標的化欠失を含み、及び／又は所定の染色体遺伝子座における標的化組換えを促進する。すなわちある実施態様においてＺＦＮは標的遺伝子の１つ又はそれ以上のヌクレオチドを欠失させる。別の実施態様において標的遺伝子中のゲノム配列は、例えば本明細書に記載のＡｄ−ＺＦＮ及びＺＦＮで標的化切断後に遺伝子中に挿入される「ドナー配列」を使用して置換される。ドナー配列は、Ａｄ−ＺＦＮベクター中に存在するか、別のＡｄベクター中に存在するか、又は異なる核酸送達機構を使用して細胞中に導入してもよい。ある実施態様において標的遺伝子はＣＣＲ−５遺伝子である。

別の態様において細胞又は細胞株中のＣＣＲ−５遺伝子を変異するための及び／又はＣＣＲ−５機能を不活性化させるためのジンクフィンガータンパク質及びその融合体の使用法が提供される。すなわちヒト細胞中のＣＣＲ−５遺伝子を不活性化する方法が提供され、この方法は、本明細書に記載の任意のタンパク質又はポリヌクレオチドを細胞に投与することを含む。

さらに別の態様において本開示は、被験体のＨＩＶ感染を治療または予防する方法であって、（ａ）ポリペプチドが細胞内で発現されるような条件下で、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸を細胞に導入し（ここで、第１のポリペプチドは、（ｉ）ＣＣＲ５遺伝子内の第１の標的部位に結合するように遺伝子操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと、（ii）切断ドメインとを含む）（こうしてポリペプチドは標的部位に結合し、ＣＣＲ５遺伝子を切断する）；そして（ｂ）細胞を被験体に導入する、ことを含んでなる方法を提供する。ある実施態様において細胞は、造血幹細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、及び抗原提示細胞よりなる群から選択される。核酸は、本明細書に記載の任意のポリヌクレオチドを含んでよい。いずれの方法でも、第１の核酸はさらに第２のポリペプチドをコードし、ここで第２のポリペプチドは、第２のポリペプチドが細胞内で発現されるように、（ｉ）ＣＣＲ５遺伝子内の第２の標的部位に結合するように遺伝子操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと、（ii）切断ドメインとを含み、こうして第１及び第２のポリペプチドは各標的部位に結合し、ＣＣＲ５遺伝子を切断する。同様にこれらの方法のいずれもさらに、第２の核酸を細胞に導入する工程を含み、ここで第２の核酸は、ＣＣＲ−５遺伝子と相同的ではない配列にフランクするＣＣＲ−５遺伝子に対する２つの相同性領域を含む。

本明細書に記載の任意の方法と組成物において、細胞は例えば造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４⁺細胞）、Ｔ細胞（例えばＣＤ４⁺細胞）、マクロファージ、樹状細胞、又は抗原提示細胞；又は細胞株、例えばＫ５６２（慢性骨髄性白血病）、ＨＥＫ２９３（胚腎臓）、ＰＭ−１（ＣＤ４⁺Ｔ細胞）、ＴＨＰ−１（単球性白血病）、又はＧＨＯＳＴ（骨肉腫）でもよい。

さらに本明細書に記載の任意の方法を、インビトロ、インビボ、及び／又はエクスビボで実施することができる。ある実施態様において方法は、例えばＰＢＭＣ、例えばＴ細胞を修飾して、ＣＣＲ−５の破壊によりこれらをＨＩＶ感染に対して抵抗性にするように、エクスビボで実施される。

図１は、Ａｄ５／３５ベクターの略図であり、ここでＥ１をコードする配列は欠失され、トランス遺伝子発現カセット（例えば、ＧＦＰ、ＺＦＮ、及び／又はドナー配列をコードする）で置換される。

図２は、野生型ＦｏｋＩ切断半ドメインのアミノ酸配列（配列番号３３）を示す。遺伝子操作された切断半ドメインを生成するために配列を改変できる位置（４８６、４９０、４９９、及び５３８）を太字と下線で示す。

図３は、図４に示す遺伝子操作された切断半ドメインとヘテロダイマーを形成する遺伝子操作された切断半ドメイン例のアミノ酸配列（配列番号３４）を示す。野生型と比較して配列を改変できる位置（アミノ酸残基４８６と４９９に対応する）を下線で示す。

図４は、本明細書に記載のＺＦＮで使用できる別の例の遺伝子操作された切断半ドメインのアミノ酸配列（配列番号３５）を示す。野生型と比較して配列を改変できる位置（アミノ酸残基４９０と５３８に対応する）を下線で示す。

図５は、ＣＣＲ−５相同性アームを有するドナー（パッチ）配列を作成するために使用されるＣＣＲ５遺伝子の一部のヌクレオチド配列（配列番号３６）を示す。実施例１を参照のこと。

図６は、ＣＣＲ−５遺伝子への挿入のために使用される４７ｂｐの「パッチ」配列のヌクレオチド配列（配列番号３７）を示す。実施例１を参照のこと。

図７は、ＣＣＲ−５遺伝子への標的化挿入のために使用されるドナー配列のヌクレオチド配列（配列番号３８）を示す。５’ＣＣＲ−５相同性アームはヌクレオチド１〜４７１に対応する；ＣＣＲ−５への標的化挿入のための「パッチ」配列は下線を付けてあり、これはヌクレオチド４７２〜５１８に対応する；及び３’ＣＣＲ−５相同性アームはヌクレオチド５１９〜１９２８に対応する。実施例１を参照のこと。

図８は、Ａｄ５／３５−ＺＦＮを用いて形質導入された細胞中のＣＣＲ−５遺伝子の位置の配列（配列番号５４〜６６）を示す。細胞タイプはカラム３に示す。野生型ＣＣＲ−５配列と比較して欠失している塩基を点で示す。

図９（配列番号４３、４４、４６〜５０）は、Ａｄ５／３５−ＺＦＮを用いて形質導入された細胞中のＣＣＲ−５遺伝子の一部の配列解析を示す。細胞タイプをカラム３に示す。図に示した修飾ゲノムはＣＣＲ５遺伝子中の種々の小さい挿入部（下線の塩基）を有し、ある場合には、点で示す欠失を有した。

図１０（配列番号５１〜５３）は、Ａｄ５／３５−ＺＦＮを用いて形質導入された細胞中のＣＣＲ−５遺伝子の一部の配列解析を示す。図に示した修飾ゲノムはＣＣＲ−５遺伝子中に種々の長い挿入部（下線の塩基）を有した。

図１１のパネルＡとＢは、野生型ＨＩＶ又はモック感染で暴露後の、Ａｄ５／３５ ＺＦＮ２１５（パネルＡ）とＡｄ５／３５ ＺＦＮ２２４（パネルＢ）で形質導入したＴ細胞中のＣＣＲ−５修飾Ｔ細胞の割合の経時変化を示す。

図１２（配列番号６７及び６８）は、ＣＣＲ５−ＺＦＮ対２１５と２２４のＣＣＲ５遺伝子中の標的部位を示す略図である。

図１３は、ＣＣＲ５又はＩＬ２−Ｒγを標的とする記載のＺＦＮをコードするＡｄ５／３５ベクターで形質導入したＧＨＯＳＴ−ＣＣＲ５細胞中の標的遺伝子破壊のレベルを示す。実施例１３を参照のこと。下の移動産物（矢印で示す）は、ＺＦＮ介在遺伝子破壊の直接の尺度である。「ＮＴＤ」は非形質導入細胞を示す。

図１４のパネルＡは、ＺＦＮ２１５又はＺＦＮ２２４をコードするＡｄ５／３５ベクターで形質導入したＧＨＯＳＴ−ＣＣＲ５細胞のＣＣＲ５表面発現（図１４Ａ）又はＧＦＰ発現（図１４Ｂ）のフローサイトメトリー測定を示すグラフである。図１４Ａは、記載のベクターで形質導入したＧＨＯＳＴ−ＣＣＲ５細胞中のフローサイトメトリーで測定した低下したＣＣＲ５表面発現を示す。ＮＴＤは非形質導入を示す；ＩＬ２Ｒは、ＩＬ２Ｒγ−標的化ＺＦＮを含有する細胞を示す；２１５と２２４は、それぞれＺＦＮ対２１５又は２２４を含有する細胞を示す。「ＭＦＩ」は平均蛍光強度を示す。図１４Ｂは、ＩＬ−２ｒγＺＦＮ及び対照ＧＨＯＳＴ−ＣＣＲ５細胞と比較した、ＣＣＲ５−ＺＦＮ２１５とＣＣＣＲ−ＺＦＮ２２４修飾細胞のＨＩＶ暴露後４８時間のフローサイトメトリーで測定したＨＩＶ−１_BALによる暴露からの防御を示す。ＧＦＰ蛍光はＨＩＶ侵入を示し、陽性対照に対して感染された平均パーセントとしてプロットされる。棒グラフは三重測定の平均を示す。 図１４のパネルＢは、ＺＦＮ２１５又はＺＦＮ２２４をコードするＡｄ５／３５ベクターで形質導入したＧＨＯＳＴ−ＣＣＲ５細胞のＣＣＲ５表面発現（図１４Ａ）又はＧＦＰ発現（図１４Ｂ）のフローサイトメトリー測定を示すグラフである。図１４Ａは、記載のベクターで形質導入したＧＨＯＳＴ−ＣＣＲ５細胞中のフローサイトメトリーで測定した低下したＣＣＲ５表面発現を示す。ＮＴＤは非形質導入を示す；ＩＬ２Ｒは、ＩＬ２Ｒγ−標的化ＺＦＮを含有する細胞を示す；２１５と２２４は、それぞれＺＦＮ対２１５又は２２４を含有する細胞を示す。「ＭＦＩ」は平均蛍光強度を示す。図１４Ｂは、ＩＬ−２ｒγＺＦＮ及び対照ＧＨＯＳＴ−ＣＣＲ５細胞と比較した、ＣＣＲ５−ＺＦＮ２１５とＣＣＣＲ−ＺＦＮ２２４修飾細胞のＨＩＶ暴露後４８時間のフローサイトメトリーで測定したＨＩＶ−１_BALによる暴露からの防御を示す。ＧＦＰ蛍光はＨＩＶ侵入を示し、陽性対照に対して感染された平均パーセントとしてプロットされる。棒グラフは三重測定の平均を示す。

図１５は、Ｒ５向性ＨＩＶ−１_BALでＨＩＶ−１暴露後、又はモックＨＩＶ感染後、３、１０、２１、３１、４２、及び５２日目にＣｅｌ−１アッセイにより測定したＺＦＮ破壊ＣＣＲ対立遺伝子のレベルを示す。破壊したＣＣＲ５対立遺伝子を有する細胞はモック感染培養物中で安定レベルで存在したが、ＨＩＶ−１の存在下では増加した。

図１６は、ＨＩＶ暴露の５２日後のＺＦＮ処理ＰＭ１細胞中のＣＣＲ５対立遺伝子の配列を示す。

図１７は、ＣＣＲ５−ＺＦＮ２１５、ＣＣＲ５−ＺＦＮ２２４、又はＧＦＰを発現するＡｄ５／３５ベクター（Surveyor（登録商標）ヌクレアーゼアッセイで測定するとＭＯＩは３０又は１００）で形質導入した匿名の健常ドナーの初代ＣＤ４ Ｔ細胞中のＺＦＮ破壊ＣＣＲ５対立遺伝子のレベルを示す。破壊されたＣＣＲ５対立遺伝子に対応するバンドを矢印で示す。破壊されたＣＣＲ５対立遺伝子のパーセントを各レーンの下に示す。

図１８は、そのゲノムがＣＣＲ５−ＺＦＮ又はＧＦＰ（対照細胞）をコードするＡｄ５／３５ベクターで形質導入したＣＤ４ Ｔ細胞の集団倍加速度を示す。細胞を０日にＡｄ５／３５ベクターで形質導入した。三角で示す点をつなぐ線は、非形質導入細胞の倍加速度を示す；四角で示す点をつなぐ線は、Ａｄ５／３５ＣＣＲ５ＺＦＮ２２４形質導入細胞の倍加速度を示す；及び、菱形で示す点をつなぐ線は、Ａｄ５／３５ＧＦＰ形質導入細胞の倍加速度を示す。

図１９は、モック感染培養物と比較した、ＣＣＲ５向性ＨＩＶ−１_US1でインビトロ暴露後の経時的なＺＦＮ２１５形質導入ＣＤ４⁺Ｔ細胞中のＺＦＮ破壊ＣＣＲ５対立遺伝子の濃縮を示す。ＣＣＲ５破壊はSurveyor（登録商標）ヌクレアーゼ（Ｃｅｌ−１）アッセイを使用して測定した。四角をつなぐ線はＨＩＶ感染細胞を示し、三角をつなぐ線はモック感染細胞を示す。Ａｄ５／３５形質導入ＣＤ４ Ｔ細胞を非修飾ＣＤ４ Ｔ細胞（１：３）と混合することにより、ＺＦＮ破壊ＣＣＲ５対立遺伝子の約１０％出発レベルが得られた。

図２０は、ＣＣＲ５ＺＦＮ対２１５又は２２４を発現するＡｄ５／３５ベクターで形質導入後２４時間に測定した、初代ＣＤ４⁺Ｔ細胞中の平均核内Ｐ５３ＢＰ１免疫染色巣を示すグラフである。核内巣は、Volocity（登録商標）ソフトウェアを使用して１条件当たり少なくとも１００個の核から計測した。エトポシドで処理した陽性対照細胞と対照細胞（非形質導入）から得られた結果も示す。

図２１は、対照（モック感染）マウス又はＨＩＶ感染マウスの脾臓から４０日目に単離したＣＤ４細胞中の、Surveyor（登録商標）ヌクレアーゼ（Ｃｅｌ−１）アッセイを使用して測定したインビボＣＣＲ５破壊頻度を示すグラフである。各群の結果を平均し、対応の無いt-検定を使用して解析した。

詳細な説明
ヒトＣＣＲ５遺伝子を標的化するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（ＣＣＲ５−ＺＦＮ）が本明細書に記載される。これらのＺＦＮは、例えばＣＣＲ５コード領域中の所定の部位で２本鎖ブレーク（ＤＳＢ）を効率的に生成する。この部位は例えばＣＣＲ５Δ３２変異の上流にある。本明細書に記載のＺＦＮの一過性発現は、ヒト細胞（初代ヒトＣＤ４Ｔリンパ球を含む）中のＣＣＲ５遺伝子の高度に効率的で永久的な破壊を促進し、ＨＩＶ−１感染に対する強固な防御を付与し、そしてインビトロとインビボの両方でこれらの細胞に対する強力な選択的利点を提供する。

特にＣＣＲ５−ＺＦＮの一過性送達は、初代ヒトＣＤ４ Ｔ細胞中の５０％を超える効率を有するヒトＣＣＲ５遺伝子の永久的破壊を引き起こす。ＣＣＲ５−ＺＦＮ作用は極めて特異的であり、充分許容され、これは、（ｉ）選択の非存在下でＺＦＮ改変亜集団の安定性、増殖、及び移植特性を検査すること、（ii）核内ＤＳＢ誘導性５３ＢＰ１巣を直接染色すること、及び（iii）最も類似した推定の標的ではないゲノム部位での切断を試験すること、により証明される。さらに活性ＨＩＶ−１感染の形の選択的圧力の存在下で、ＺＦＮ改変は、インビトロのＣＣＲ５向性（しかしＣＸＣＲ４向性ではない）ＨＩＶ−１暴露アッセイ中に、ヒト化ＣＣＲ５Δ３２細胞で得られるものと匹敵するレベルまで、大きな延命効果を付与する。

本明細書に記載のＣＣＲ５−ＺＦＮ介在ゲノム編集は、初代ヒト細胞でＣＣＲ５ヌル遺伝子型を作成するのに使用される。さらに遺伝的に決定された形質について予測されるように、ＺＦＮ改変細胞は、インビトロとインビボの両方でＨＩＶ−１感染に対する安定で遺伝性の抵抗性を示した。

ＣＣＲ５破壊を介するＨＩＶ治療に対する小分子、イントラボディ、及びアンチセンス又はＲＮＡｉベースのアプローチは、ｍＲＮＡ又はタンパク質レベルでＣＣＲ５を不完全に抑制又は阻止する。Levine et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:17372-17377; Trkola et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:395-400を参照のこと。すなわち他のアプローチとは異なり、本明細書に記載のＣＣＲ５−ＺＦＮは真のＣＣＲ５ヌル細胞を生成し、これは自然選択されるＣＣＲ５Δ３２のように永久かつ完全にＣＣＲ５陰性であり、ＨＩＶ−１感染から優先的に生き延び、ＨＩＶ−１感染に対して等しく抵抗性娘細胞を生成する。一過性ＺＦＮ遺伝子送達と発現はＣＣＲ５発現を排除するのに充分であるため、ＣＣＲ５−ＺＦＮによる永久的な遺伝子改変は、外来ＤＮＡをゲノムに組み込む必要無くウイルス侵入を阻止する。

またＺＦＮを含むアデノウイルス（Ａｄ）ベクター及び／又はこれらのＡｄベクターを含むドナー配列と細胞も、本明細書に記載される。これらのＡｄベクターは、例えば標的化切断後に非相同的末端結合により、又は標的化切断後に外因性ポリヌクレオチド（細胞ヌクレオチド配列との１つ又はそれ以上の相同性領域を含む）とゲノム配列の間の相同的組換えにより、細胞クロマチンの標的化切断及び細胞ヌクレオチド配列の標的化改変の方法において有用である。

概論

本発明の方法の実施、ならびに本明細書で開示される組成物の調製と使用は、特に明記しない場合は、当業者の技術範囲内である分子生物学、生物学、生化学、クロマチン構造と分析、コンピューター化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、及び関連分野の従来の技術を利用する。これらの技術は文献で充分説明されている。例えば、Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989、及び第３版, 2001; Ausubel et al, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987、及び定期的最新版; METHODS IN ENZYMOLOGYシリーズ, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, 第３版, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe編), Academic Press, San Diego, 1999; and METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker編) Humana Press, Totowa, 1999を参照のこと。

定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、及び「オリゴヌクレオチド」は同義に使用され、線状又は環状コンフォメーション、及び１本鎖もしくは２本鎖型のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを意味する。本発明の開示目的のために、これらの用語はポリマーの長さについて決して制限的ではない。この用語は、天然のヌクレオチドならびに塩基、糖、及び／又はリン酸成分が修飾されているヌクレオチド（例えばホスホロチオエート骨格）の既知の類似体を包含する。一般に特定のヌクレオチドの類似体は同じ塩基対合特異性を有する；すなわち、Ａの類似体はＴと塩基対合する。

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は同義に使用され、アミノ酸残基のポリマーを意味する。この用語はまた、１つ又はそれ以上のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学類似体又は修飾誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。

「結合する」は、巨大分子間（例えばタンパク質と核酸間）の配列特異的非共有結合的相互作用を意味する。相互作用全体が配列特異的である限り、必ずしもすべての結合性相互作用が配列特異的である必要は無い（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基との接触）。かかる相互作用は一般に、解離定数（Ｋ_d）が１０^-6Ｍ^-1又はそれ以下が特徴である。「親和性」は結合の強さを意味し、結合親和性の上昇は低いＫ_dと相関する。

「結合タンパク質」は、他の分子に非共有結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えばＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）、及び／又はタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、これは自体に結合できる（ホモダイマー、ホモトリマーなどを形成する）か、及び／又は１つ又はそれ以上の異なるタンパク質に結合することができる。結合タンパク質は２つ以上のタイプの結合活性を有することができる。例えばジンクフィンガータンパク質はＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合、及びタンパク質結合活性を有する。

「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（又は結合ドメイン）は、タンパク質であるか又はより大きなタンパク質内のドメインであり、１つ又はそれ以上のジンクフィンガー（これは、その構造が亜鉛イオンの配位により安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である）を介して配列特異的にＤＮＡに結合する。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、しばしばジンクフィンガータンパク質又はＺＦＰと省略される。

ジンクフィンガー結合ドメインは、所定のヌクレオチド配列に結合するように「遺伝子操作」することができる。ジンクフィンガータンパク質を遺伝子操作する方法の非限定例は設計と選択である。設計されたジンクフィンガータンパク質は、その設計／組成が主に合理的基準により起きる天然には存在しないタンパク質である。設計の合理的基準は、既存のＺＦＰ設計と結合データの情報を保存しているデータベース中の情報を加工する置換規則とコンピューターアルゴリズムとの適用を含む。例えば米国特許第６，１４０，０８１号；６，４５３，２４２号；及び６，５３４，２６１号を参照；またＷＯ９８／５３０５８号；ＷＯ９８／５３０５９号；ＷＯ９８／５３０６０号；ＷＯ０２／０１６５３６号、及びＷＯ０３／０１６４９６号を参照のこと。

「選択された」ジンクフィンガータンパク質は、天然には存在しなくて、その産生は主にファージ表示、相互作用捕捉、又はハイブリッド選択のような経験的方法によるタンパク質である。例えばＵＳ５，７８９，５３８号；ＵＳ５，９２５，５２３号；ＵＳ６，００７，９８８号；ＵＳ６，０１３，４５３号；ＵＳ６，２００，７５９号；ＷＯ９５／１９４３１号；ＷＯ９６／０６１６６号；ＷＯ９８／５３０５７号；ＷＯ９８／５４３１１号；ＷＯ００／２７８７８号；ＷＯ０１／６０９７０号；ＷＯ０１／８８１９７号、及びＷＯ０２／０９９０８４号を参照のこと。

用語「配列」は、任意の長さのヌクレオチド配列を意味し、これはＤＮＡでもＲＮＡでもよい；これは、線状、環状、又は分岐型でもよく、１本鎖でも２本鎖でもよい。用語「ドナー配列」は、ゲノム中に挿入されるヌクレオチド配列を意味する。ドナー配列は任意の長さ、例えば２〜１０，０００ヌクレオチドの長さ（又はこの間もしくはそれ以上の任意の整数値）、好ましくは約１００〜１，０００ヌクレオチドの長さ（又はこの間の整数）、さらに好ましくは約２００〜５００ヌクレオチドの長さでもよい。

「相同的非同一配列」は、第２の配列とある程度の配列同一性を共有するが、その配列が第２の配列とは同一ではない第１の配列を意味する。例えば変異遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドは、変異遺伝子の配列と相同的であり非同一である。ある実施態様において２つの配列間の相同性の程度は、通常の細胞機構を利用してその間の相同的組換えを行うのに充分である。２つの相同的非同一配列は任意の長さでよく、その非相同性の程度は単一のヌクレオチドの小ささ（例えば、標的化相同的組換えによるゲノム点突然変異の補正のため）、又は１０キロ塩基又はそれ以上の大きさ（例えば、染色体中の所定の異所への遺伝子の挿入のため）でもよい。相同的非同一配列を含む２つのポリヌクレオチドは同じ長さでなくてもよい。例えば２０〜１０，０００ヌクレオチド又はヌクレオチド対の外因性ポリヌクレオチド（すなわちドナーポリヌクレオチド）を使用することができる。

核酸配列及びアミノ酸配列の同一性を測定する方法は当該分野で公知である。典型的にはかかる方法は、ある遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定し、及び／又はこれにコードされるアミノ酸配列を決定し、これらの配列を第２のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列と比較することを含む。ゲノム配列もこの方法で決定し比較することができる。一般に同一性は、２つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列のそれぞれ正確なヌクレオチド対ヌクレオチドの一致又はアミノ酸対アミノ酸の一致を意味する。２つまたはそれ以上の配列（ポリヌクレオチド又はアミノ酸）は、これらの同一性パーセントを決定することにより比較することができる。２つの配列の同一性パーセント（核酸配列でもアミノ酸配列でも）は、２つの整列した配列間の正確な一致の数をより短い配列の長さで割って、１００を掛けた数である。核酸配列の適切な整列は、Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)の局所的相同性アルゴリズムにより与えられる。このアルゴリズムは、Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M.O. Dayhoff編, 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USAにより開発され、Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)により標準化されたスコア化マトリックスを使用することにより、アミノ酸配列に適用することができる。ある配列の同一性パーセントを決定するためのこのアルゴリズムの実施例は、Genetics Computer Group (Madison, WI)により「ベストフィット（BestFit）」ユーティリティアプリケーションにより与えられる。この方法のデフォールトパラメータは、ウィスコンシン配列解析パッケージプログラムマニュアル（Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual）、バージョン８（１９９５）（Genetics Computer Group, Madison, WIから利用できる）に記載されている。本開示における同一性パーセントを確立するための好適な方法は、University of Edinburghが著作権を有し、John F. Collins and Shane S. Sturrokにより開発され、IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA)により配布されているＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。このパッケージ群からSmith-Watermanアルゴリズムを使用することができ、ここでスコア化表のためにデフォールトパラメータが使用される（例えば、ギャップオープニングペナルティ（gap opening penalty）が１２、ギャップエクステンションペナルティ（gap extension penalty）が１、及びギャップ（gap）が６）。得られたデータから「Match」値は配列同一性を反映する。配列間の同一性パーセント又は類似性を計算するための他の適切なプログラムは当該分野で公知であり、例えば別の整列プログラムはＢＬＡＳＴであり、デフォールトパラメータを用いて使用される。例えばＢＬＡＳＴＮとＢＬＡＳＴＰは以下のデフォールトパラメータを使用して使用することができる：遺伝コード＝標準；フィルター＝無し；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予測＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；分類法＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝重複無し、 GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR。これらのプログラムの詳細は以下のインタネットアドレスに存在する：http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。本明細書に記載の配列について、配列同一性の所望の程度の範囲は約８０％〜１００％及びこれらの間の任意の整数である。典型的には配列間の同一性パーセントは、少なくとも７０〜７５％、好ましくは８０〜８２％、さらに好ましくは８５〜９０％、さらに好ましくは９２％であり、さらに好ましくは９５％であり、最も好ましくは９８％の配列同一性である。

あるいはポリヌクレオチド間の配列類似性の程度は、相同領域間の安定な２本鎖の形成を可能にする条件下でポリヌクレオチドをハイブリダイズさせ、次に１本鎖特異的ヌクレアーゼで消化し、消化した断片のサイズ測定により決定することができる。２つの核酸又は２つのポリペプチド配列は、上記方法を使用して測定した時、分子の規定の長さにわたって、配列が少なくとも約７０％〜７５％、好ましくは８０〜８２％、さらに好ましくは８５〜９０％、さらに好ましくは９２％、さらに好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性を有する時、互いに実質的に相同的である。本明細書において特定のＤＮＡ又はポリペプチド配列と完全な同一性を示す配列も実質的に相同的である。実質的に相同的なＤＮＡ配列は、例えば特定の系について規定される厳密性条件下でサザンハイブリダイゼーション実験により同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件の規定は当該分野の技術範囲内である。例えば Sambrook et al., 前述; Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, 編者 B.D. Hames and SJ. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press参照のこと。

２つの核酸断片の選択的ハイブリダイゼーションは以下のように測定することができる。２つの核酸分子間の配列同一性の程度は、かかる分子間のハイブリダイゼーションの効率と強度に影響を与える。部分的に同一な核酸配列は、完全に同一な配列の標的分子へのハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害する。完全に同一な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当該分野で公知のハイブリダイゼーションアッセイを使用して評価することができる［例えば、サザン（ＤＮＡ）ブロット、ノーザン（ＲＮＡ）ブロット、サザンハイブリダイゼーションなど、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.を参照）。かかるアッセイは、種々の程度の選択性を使用して、例えば低〜高厳密性までの条件を使用して行うことができる。低厳密性条件が使用される場合、非特異結合の欠如は、非特異結合が欠如する場合は２次プローブが標的に結合しないように、部分的な配列同一性程度さえ欠如した２次プローブ（例えば標的分子と約３０％未満の配列同一性を有するプローブ）を使用して評価することができる。

ハイブリダイゼーションベースの検出系を使用する時、参照核酸配列に相補的な核酸プローブが選択され、次に適切な条件の選択により、プローブと参照配列は互いに選択的にハイブリダイズするか又は結合して２本鎖分子を形成する。中程度の厳密ハイブリダイゼーション条件下で参照配列に選択的にハイブリダイズすることができる核酸分子は典型的には、選択された核酸分子プローブの配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４ヌクレオチドの長さの標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。厳密性ハイブリダイゼーション条件は典型的には、選択された核酸分子プローブの配列と約９０〜９５％以上の配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４ヌクレオチドの長さの標的核酸配列の検出を可能にする。プローブ／参照配列ハイブリダイゼーション（ここでプローブと参照配列は特定の配列同一性の程度を有する）に有用なハイブリダイゼーション条件は、当該分野で公知のように測定することができる（例えば、Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B.D. Hames and SJ. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press を参照）。

ハイブリダイゼーションの条件は当業者に公知である。ハイブリダイゼーションの厳密性は、ミスマッチヌクレオチドを含むハイブリッドの形成に不利なハイブリダイゼーション条件の程度を意味し、高厳密性はミスマッチハイブリッドの低許容性に相関する。ハイブリダイゼーションの厳密性に影響を与える因子は当業者に公知であり、特に限定されないが、温度、ｐＨ、イオン強度、及び有機溶媒（例えばホルムアミド及びジメチルスルホキシド）の濃度がある。当業者に公知のように、ハイブリダイゼーション厳密性は、高温、低イオン強度、及び低溶媒濃度により上昇する。

ハイブリダイゼーションの厳密性条件について、例えば以下の因子を変化させることにより特定の厳密性を確立するのに無数の同等の条件を使用できることは公知である：配列の長さと性質、種々の配列の塩基組成、塩及び他のハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング剤の有無（例えば、デキストラン硫酸、及びポリエチレングリコール）、ハイブリダイゼーション反応温度、時間パラメータ、ならびに変化する洗浄条件。ハイブリダイゼーション条件の特定の設定の選択は、当該分野の標準的方法に従って選択される（例えば、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N. Y.を参照）。

「組換え」は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換過程を意味する。本開示の目的において「相同的組換え（ＨＲ）」は、細胞内の２本鎖ブレークの修復中に起きるかかる交換の特殊な型を意味する。この過程は、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、２本鎖ブレークを経験した分子）の鋳型修復をするために「ドナー」分子を使用し、「非クロスオーバー遺伝子変換」又は「短い遺伝子変換」などと種々に呼ばれ、これは遺伝子情報がドナーから標的に移動するためである。特定の理論に拘束されるつもりはないが、かかる移動は、破壊された標的とドナー間に形成される２本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、及び／又は「合成依存性鎖アニーリング」（ここでドナーは、標的の一部となる遺伝情報を再合成するのに使用される）、及び／又は関連プロセスを含むことがある。かかる特殊なＨＲはしばしば、標的分子の配列の改変を引き起こし、従ってドナーポリヌクレオチドの一部又はすべての配列が標的ポリヌクレオチド中に取り込まれる。

「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の破壊を意味する。切断は、特に限定されないが、ホスホジエステル結合の酵素的又は化学的加水分解を含む種々の方法により開始することができる。１本鎖切断と２本鎖切断の両方が可能であり、２本鎖切断は２つの１本鎖切断の結果として起きる。ＤＮＡ切断は、平滑末端又はずれ末端の産生を引き起こす。ある実施態様において、標的化ＤＮＡ切断のために融合ポリペプチドが使用される。

「切断半ドメイン」は、第２のポリペプチド（同一であるか又は異なる）と共同して、切断活性（好ましくは２本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。用語「第１及び第２の切断半ドメイン」、「＋及び−切断半ドメイン」、及び「右及び左切断半ドメイン」は同義に使用されて、ダイマー化する切断半ドメインの対を意味する。

「遺伝子操作された切断半ドメイン」は、他の切断半ドメイン（例えば他の遺伝子操作された切断半ドメイン）と真性（obligate）ヘテロダイマーを形成するように修飾されている。例えば米国特許公報第２００５００６４４７４号と２００６０１８８９８７号、及び米国仮特許出願第６０／８０８，４８６号（２００６年５月２５日出願）（これらの開示内容は参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。

「クロマチン」は、細胞性ゲノムを含む核タンパク質構造体である。細胞クロマチンは、核酸（主にＤＮＡ）とタンパク質（ヒストン及び非ヒストン染色体タンパク質を含む）とを含む。真核生物細胞のクロマチンの大部分はヌクレオソームの形で存在し、ここではヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４のそれぞれ２つを含む８量体に結合した１５０塩基対のＤＮＡを含み、ヌクレオソームコア間にリンカーＤＮＡ（生物により種々の長さ）が延びている。ヒストンＨ１の分子は一般にリンカーＤＮＡと結合している。本発明の目的において用語「クロマチン」は、すべてのタイプの細胞性核タンパク質（原核生物も真核生物も）を包含する。細胞クロマチンは染色体性クロマチンとエピソーム性クロマチンの両方を含む。

「染色体」は、細胞のゲノムのすべて又は一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムはしばしばその核型を特徴とし、これは細胞のゲノムを含むすべての染色体の集合である。細胞のゲノムは１つ又はそれ以上の染色体を含むことができる。

「エピソーム」は複製性核酸、核タンパク質複合体、又は細胞の染色体性核型の一部ではない核酸を含む他の構造体である。エピソームの例にはプラスミド及びいくつかのウイルスゲノムがある。

「アクセス可能領域」は、核酸中に存在する標的部位が、標的部位を認識する外因性分子により結合されることができる細胞クロマチン中の部位である。特定の理論に拘束されるつもりはないが、アクセス可能領域はヌクレオソーム構造中にパッケージされない領域であると考えられる。アクセス可能領域のこの明確な構造は、しばしば化学的及び酵素的プローブ（例えばヌクレアーゼ）に対する感受性により検出することができる。

「標的部位」又は「標的配列」は、結合が存在するための充分な条件がある場合に結合分子が結合する核酸の一部を規定する核酸配列である。例えば配列５’−ＧＡＡＴＴＣ−３’はＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼの標的部位である。

「外因性」分子は通常は細胞中に存在しないが、１つ又はそれ以上の遺伝的、生化学的、又は他の方法により細胞中に導入することができる分子である。「細胞中の正常な存在」は、細胞の特定の成長段階及び環境条件により決定される。例えば、筋肉の胚成長中にのみ存在する分子は、成体筋肉細胞にとって外因性分子である。同様に熱ショックにより誘導される分子は、非熱ショック細胞にとって外因性分子である。外因性分子は、例えば機能不全の内因性分子の機能性型又は通常は機能性である内因性分子の機能不全型を含むことがある。

外因性分子は、特に小分子、例えばコンビナトリアル化学法により生成されるもの、又は巨大分子、例えばタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の任意の修飾誘導体、又は１つ又はそれ以上の上記分子を含む任意の複合体でもよい。核酸にはＤＮＡ、ＲＮＡがあり、１本鎖でも２本鎖でもよく、線状でも、分岐状、又は環状でもよく、任意の長さでよい。核酸には、２本鎖を形成できるもの、ならびに３本鎖を形成できる核酸がある。例えば米国特許第５，１７６，９９６号及び５，４２２，２５１号を参照のこと。タンパク質には、特に限定されないが、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、及びヘリカーゼがある。

外因性分子は、内因性分子と同じタイプの分子、例えば外因性タンパク質もしくは核酸でもよい。例えば外因性核酸には、細胞内に導入される感染性ウイルスゲノム、プラスミド、又はエピソーム、又は通常細胞内に存在しない染色体がある。外因性分子の細胞内への導入法は当業者に公知であり、特に限定されないが、脂質介在輸送（すなわち、リポソーム、例えば中性及び陽イオン性脂質を含む）、電気穿孔法、直接注入法、細胞融合、粒子衝撃法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン介在輸送、及びウイルスベクター介在輸送がある。

これに対して「内因性」分子は、特定の細胞中に特定の成長段階で特定の環境条件下で存在する分子である。例えば内因性核酸は、染色体、ミトコンドリアのゲノム、葉緑体もしくは他の細胞小器官、又は天然に存在するエピソーム性核酸がある。追加の内因性分子には、タンパク質、例えば転写因子や酵素がある。

「融合」分子は、２つ又はそれ以上のサブユニット分子が好ましくは共有結合で結合している分子である。サブユニット分子は同じ化学タイプの分子でも、又は異なる化学タイプの分子でもよい。第１のタイプの融合分子の例には、特に限定されないが、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとの融合体）、及び融合核酸（例えば、上記融合タンパク質をコードする核酸）がある。第２のタイプの融合分子の例には、特に限定されないが、３本らせん形成核酸とポリペプチドとの融合体、及び小くぼみ結合体と核酸との融合体がある。

細胞中の融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達又は細胞への融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達により生じる（ここでポリヌクレオチドは転写され、転写体は翻訳される）。トランススプライシング、ポリペプチド切断、及びポリヌクレオチド連結はまた、細胞中のタンパク質の発現に関与している。細胞へのポリヌクレオチド及びポリペプチド送達の方法は、本開示の別のところで提示される。

本発明の目的において「遺伝子」は、遺伝子産物（後述）をコードするＤＮＡ領域、ならびに遺伝子産物の産生を制御するすべてのＤＮＡ領域（制御配列がコード配列及び／又は転写配列に隣接しているかどうかにかかわらず）を含む。従って遺伝子は、特に限定されないが、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳制御配列、例えばリボゾーム結合部位及び内部リボゾーム侵入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、複製開始点、マトリックス結合部位、及び遺伝子座制御領域を含む。

「遺伝子発現」は、遺伝子内に含まれる情報の遺伝子産物への変換を意味する。遺伝子産物は、遺伝子の直接の転写産物（例えばｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、又は任意の他のタイプのＲＮＡ）、又はｍＲＮＡの翻訳により産生されるタンパク質でもよい。遺伝子産物はまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、及びエディッティングのような方法により修飾されるＲＮＡ、及び例えばメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化、及びグリコシル化により修飾されるタンパク質を含む。

遺伝子発現の「調節」は、遺伝子の活性の変化を意味する。発現の調節には、特に限定されないが、遺伝子活性化と遺伝子抑制がある。

「真核生物」細胞には、特に限定されないが、真菌細胞（例えば酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、及びヒト細胞（例えばＴ細胞）がある。

「目的の領域」は、細胞クロマチンの任意の領域、例えば遺伝子又は遺伝子内もしくは隣接する非コード配列（これは外因性分子に結合することが好ましい）でもよい。結合は、標的化ＤＮＡ切断及び／又は標的化組換えのためでもよい。目的の領域は、染色体中、エピソーム中、細胞小器官ゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）中、又は感染性ウイルスゲノム中に存在してもよい。目的の領域は、遺伝子のコード領域内、転写非コード制御内、例えばリーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロンでも、又は非転写領域内、例えばコード領域の上流もしくは下流でもよい。目的の領域は、１つのヌクレオチド対の小ささでも又は最大２，０００ヌクレオチド対の長さ、又は任意の整数値のヌクレオチド対でもよい。

用語「作用可能な結合」及び「作用可能なように結合した」は、２つまたはそれ以上の成分（例えば配列要素）について同義で使用され、ここで成分は、２つの成分が正常に機能しかつ少なくとも１つの成分が少なくとも１つの他の成分に発揮される機能を仲介することを可能にするように、構成される。例えば転写制御配列（例えばプロモーター）が１つ又はそれ以上の転写制御因子の有無に応答してコード配列の転写レベルを制御する場合は、転写制御配列はコード配列に作用可能なように結合している。転写制御配列は一般にコード配列とシスで作用可能なように結合しているが、必ずしも直接隣接している必要は無い。例えばエンハンサーは、連続的ではなくてもコード配列に作用可能なように結合した転写制御配列である。

融合ポリペプチドについて用語「作用可能なように結合した」は、各成分があたかもそのような結合をしていないように、他の成分と連結して同じ機能を果たすことを意味する場合がある。例えばＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合している融合ポリペプチドについて、もし融合ポリペプチド中でＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインがその標的部位及び／又はその結合部位に結合でき、切断ドメインが標的部位の近傍のＤＮＡを切断することができるなら、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインは作用可能なように結合している。

タンパク質、ポリペプチド、又は核酸の「機能性断片」は、その配列が完全長タンパク質、ポリペプチド、又は核酸と同じではないが、完全長タンパク質、ポリペプチド、又は核酸と同じ機能を保持しているタンパク質、ポリペプチド、又は核酸である。機能性断片は、対応する未変性の分子より多くの、少ない、又は同じ数の残基を有するか、及び／又は１つ又はそれ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含んでよい。核酸の機能（例えばコーディング機能、他の核酸にハイブリダイズする能力）を測定するための方法は当該分野で公知である。同様にタンパク質の機能を測定するための方法は公知である。例えばポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えばフィルター結合、電気泳動移動度シフト、又は免疫沈降アッセイにより測定することができる。ＤＮＡ切断はゲル電気泳動により測定することができる。Ausubel et al.（前述）を参照のこと。タンパク質が他のタンパク質と相互作用する能力は、例えば同時免疫沈降、２ハイブリッドアッセイ、又は相補性（遺伝的及び生化学的）により測定することができる。例えばFields et al. (1989) Nature 340:245-246；米国特許第５，５８５，２４５号、及びＰＣＴＷＯ９８／４４３５０号を参照のこと。

ジンクフィンガーヌクレアーゼ
遺伝子不活性化、例えばＣＣＲ５遺伝子の不活性化に使用できるジンクフィンガーヌクレアーゼ（zinc finger nuclease）が本明細書に記載される。ＺＦＮはジンクフィンガータンパク質（ZFP）とヌクレアーゼ（切断）ドメインとを含む。

Ａ．ジンクフィンガータンパク質
ジンクフィンガー結合ドメインは選択された配列に結合するように遺伝子操作することができる。例えば、Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416を参照のこと。遺伝子操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して新規結合特異性を有することができる。遺伝子操作法には、特に限定されないが、合理的設計と種々のタイプの選択とがある。合理的設計は、例えばトリプレット（又はクアドルプレット）ヌクレオチド配列と個々のジンクフィンガーミノ酸配列とを使用し、ここで各トリプレット又はクアドルプレットは、特定のトリプレット又はクアドルプレット配列に結合するジンクフィンガーの１つ又はそれ以上のアミノ酸配列と結合している。例えば本出願人の米国特許第６，４５３，２４２号及び６，５３４，２６１号を参照（これらは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。

ファージ表示と２ハイブリッドシステムとを含む選択法の例は、米国特許第５，７８９，５３８号；５，９２５，５２３号；６，００７，９８８号；６，０１３，４５３号；６，４１０，２４８号；６，１４０，４６６号；６，２００，７５９号；及び６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ９８／３７１８６号；ＷＯ９８／５３０５７号；ＷＯ００／２７８７８号；ＷＯ０１／８８１９７号；及びＧＢ２，３３８，２３７号に開示されている。

ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば本出願人のＷＯ０２／０７７２２７号に記載されている。

標的部位の選択；ＺＦＰ、及び融合タンパク質（及びこれをコードするポリヌクレオチド）の設計と構築法は当該分野で公知であり、米国特許公報第２００３０２３２４１０号；２００５０２０８４８９号；２００５０６４４７４号；２００５００２６１５７号；２００６０１８８９８７号；国際公報ＷＯ０７／０１４２７５号；米国特許出願第１０／５８７，７２３号（２００６年７月２７日出願）；１１／４９３，４２３号（２００６年７月２６日出願）（これらの開示内容は参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に関連して詳細に説明されている。

ある実施態様において本明細書に記載のＡｄ−ＺＦＮベクターのジンクフィンガーヌクレアーゼはＣＣＲ５遺伝子内に結合する。表１は、ヒトＣＣＲ５遺伝子中のヌクレオチド配列に結合するように遺伝子操作された多くのジンクフィンガー結合ドメインを示す。各行は、別のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを示す。各ドメインのＤＮＡ標的配列は、第１列（ＤＮＡ標的部位は大文字で示す；非接触ヌクレオチドは小文字で示す）に示され、第２〜第５の列は、タンパク質中のジンクフィンガー（Ｆ１〜Ｆ４）の認識領域（らせんのそれぞれの開始点についてアミノ酸−１〜＋６）を示す。また各タンパク質について識別番号が第１のカラムに示される。

後述するようにある実施態様において、表１に示す４フィンガー結合ドメインが切断半ドメイン、例えばIIs型制限エンドヌクレアーゼの切断ドメイン（例えばＦｏｋＩ）に融合される。一対のかかるジンクフィンガー／ヌクレアーゼ半ドメイン融合体は、例えば米国特許公報第２００５００６４４７４号（出願第１０／９１２，９３２号）に開示されているように、標的化切断のために使用される。例えばＺＦＮ−２１５は、８２６７（これは配列番号１に示す標的配列を認識し、配列番号２、６、４、及び８で示される４つの認識らせんを含む）と８１９６ｚ（これは配列番号９に示す標的配列を認識し、配列番号１０、１７、１２、及び１３で示される４つの認識らせんを含む）と呼ぶジンクフィンガー結合ドメインを含有する一対の融合タンパク質を示す。ＺＦＮ−２０１は、８２６６（これは配列番号１に示す標的配列を認識し、配列番号２、２、４、及び８で示される４つの認識らせんを含む）と８１９６ｚ（これは配列番号９に示す標的配列を認識し、配列番号１０、１７、１２、及び１３で示される４つの認識らせんを含む）と呼ぶジンクフィンガー結合ドメインを含有する一対の融合タンパク質を示す。

標的化切断のために、結合部位の近くの端は５又はそれ以上の対により分離することができ、融合タンパク質のそれぞれはＤＮＡ標的の向かい合う鎖に結合することができる。従って表１中の「ｒ１６２設計」として特定されるタンパク質の１つ（これは、逆鎖に結合し、結合部位の下流の端がヌクレオチド１６２にあることを示す）は、「１６８設計」（これは、ｒ１６２設計により結合されるものと反対の鎖に結合し、結合部位の上流の端がヌクレオチド１６８にあることを示す）として特定されるタンパク質と対合することができる。例えばタンパク質８２６７はタンパク質８１９６、又はタンパク質８１９６ｚ又は他の１６８設計の任意のものと対合するし、タンパク質８２６６はタンパク質８１９６又は８１９６ｚ又は他の１６８設計の任意のものと対合することができる。ｒ１６２と１６８設計のすべての対の組合せは、ＣＣＲ−５遺伝子の標的化切断と突然変異誘発のために使用することができる。同様に７５２４タンパク質（又は任意の他のｒ６２７設計）は８０４０タンパク質（又は任意の他の６３３設計）と共同して使用して、ＣＣＲ−５遺伝子の標的化切断と突然変異誘発を得ることができる。

本明細書に記載のＣＣＲ５−ＺＦＮは、ＣＣＲ５ゲノム中の任意の配列に標的化することができる。例えばＣＣＲ５ゲノム配列（ＣＣＲ５−Δ３２のような対立遺伝子変種を含む）は当該分野で公知であり、ＣＣＲ５−Δ３２にホモ接合性である個体（例えば、Liu et al. (1996) Cell 367-377を参照）は、ＨＩＶ−１感染に対して抵抗性である。

Ｂ．切断ドメイン
ＺＦＮはまた、ヌクレアーゼ（切断ドメイン、切断半ドメイン）を含む。本明細書に開示された融合タンパク質の切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼから得ることができる。そこから切断ドメインが得られるエンドヌクレアーゼの例には、特に限定されないが、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼがある。例えば、2002-2003 カタログ, New England Biolabs, Beverly, MA; 及び Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388を参照のこと。ＤＮＡを切断する追加の酵素は公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；大豆ヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅＩ；ミトコンドリアヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；またLinn et al. (編) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993を参照のこと。これらの酵素（又はその機能性断片）の１つ又はそれ以上は、切断ドメイン及び切断半ドメインの供給源として使用することができる。

同様に切断半ドメインは、上記したように任意のヌクレアーゼ又はその一部から得られ、これは切断活性のためにダイマー化を必要とする。一般に融合タンパク質が切断半ドメインを含むなら切断のために２つの融合タンパク質が必要である。あるいは２つの切断半ドメインを含む１つのタンパク質を使用することができる。２つの切断半ドメインは同じエンドヌクレアーゼ（又はその機能性断片）から得られるか、又は各切断半ドメインは異なるエンドヌクレアーゼ（又はその機能性断片）から得ることができる。さらに好ましくは、これらの各標的部位に対する２つの融合タンパク質の結合が、切断半ドメインが例えばダイマー化により機能性切断ドメインを形成することを可能にする互いに空間的配置に切断半ドメインを置くように、２つの融合タンパク質の標的部位は配置される。すなわちある実施態様において、標的部位の近くの端は５〜８ヌクレオチド又は１５〜１８ヌクレオチドだけ離れている。しかし２つの標的部位の間に任意の整数のヌクレオチド又はヌクレオチド対が介在してもよい（例えば、２〜５０ヌクレオチド対又はそれ以上）。一般に切断の部位は標的部位の間にある。

制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種に存在し、ＤＮＡへの配列特異的結合（認識部位での）及び結合の部位又はその近くでＤＮＡを切断することができる。いくつかの制限酵素（例えばIIS型）は、認識部位から離れた部位でＤＮＡを切断し、結合ドメインと切断ドメインが離れている。例えばIIS型酵素であるＦｏｋＩは、１つの鎖ではその認識部位から９ヌクレオチドの位置で、別の鎖ではその認識部位から１３ヌクレオチドの位置でＤＮＡの２本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；５，４３６，１５０号、及び５，４８７，９９４号；ならびに Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764- 2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31, 978-31, 982を参照のこと。すなわちある実施態様において融合タンパク質は、少なくとも１つのIIS型制限酵素からの切断ドメイン（又は切断半ドメイン）と、１つ又はそれ以上のジンクフィンガー結合ドメインとを含み、これは遺伝子操作されてもされなくてもよい。

その切断ドメインが結合ドメインから分離しているIIS型制限酵素の例はＦｏｋＩである。この特定の酵素はダイマーとして活性である。Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10,570-10575。従って本開示の目的において、開示された融合タンパク質で使用されるＦｏｋＩ酵素の部分は切断半ドメインと考えられる。すなわちジンクフィンガーＦｏｋＩ融合体を使用する細胞性配列の標的化２本鎖切断及び／又は標的化置換について、それぞれがＦｏｋＩ切断半ドメインを含む２つの融合タンパク質を、触媒活性のある切断ドメインを再構成するために使用することができる。改変ジンクフィンガー結合ドメインを含む１つのポリペプチド分子と２つのＦｏｋＩ切断半ドメインを使用することもできる。ジンクフィンガーＦｏｋＩ融合体を使用する標的化切断と標的化配列改変のためのパラメータは、本開示の別のところに提供される。

切断ドメイン又は切断半ドメインは、機能的切断ドメインを形成するために、切断活性を保持するか、又はマルチマー化（例えばダイマー化）する能力を保持するタンパク質の任意の部分でよい。

IIS型制限酵素の例は、国際公報ＷＯ０７／０１４２７５号（これは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。追加の制限酵素もまた、分離可能な結合ドメインと切断ドメインとを含み、これらは本開示により企図される。例えばRoberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420を参照のこと。

米国特許公報第２００５００６４４７４号及び２００６０１８８９８７号（それぞれ特許出願第１０／９１２，９３２及び１１／３０４，９８１号）、及び米国仮特許出願第６０／８０８，４８６号（２００６年５月２５日出願）（その開示内容は参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のように、ある実施態様において切断ドメインは、ホモダイマー化を最小にするか又は妨害する１つ又はそれ以上の遺伝子操作された切断半ドメイン（ダイマー化ドメイン変異体とも呼ぶ）を含む。ＦｏｋＩの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、及び５３８位のアミノ酸残基はすべて、ＦｏｋＩ切断半ドメインのダイマー化に影響を与えるための標的である。

真性（obligate）ヘテロダイマーを形成ＦｏｋＩの遺伝子操作された切断半ドメインの例には、第１の切断半ドメインがＦｏｋＩの４９０位と５３８位のアミノ酸残基の変異を含み、第２の切断半ドメインがアミノ酸残基４８６位と４９９位で変異を含む対がある。図２、３、及び４を参照のこと。

すなわちある実施態様において図３と４に示すように、４９０位の変異はＧｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換する；５３８位の変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換する；４８６位の変異はＧｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置換する；４９９位の変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換する。特に本明細書に記載の遺伝子操作された切断半ドメインは、１つの切断半ドメイン中の４９０位（Ｅ→Ｋ）と５３８位（Ｉ→Ｋ）を変異させ、別の切断半ドメイン中の４８６位（Ｑ→Ｋ）と４９９位（Ｉ→Ｌ）を変異させることにより、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と呼ぶ遺伝子操作された切断半ドメインを産生することにより調製した。本明細書に記載の遺伝子操作された切断半ドメインは、異常切断が最小化されたか又は排除された真性（obligate）ヘテロダイマー変異体である。例えば米国仮特許出願第６０／８０８，４８６号（２００６年５月２５日出願）（その開示内容は参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）の実施例１を参照のこと。

本明細書に記載の切断半ドメインの例は、任意の適切な方法を使用して、例えば米国特許公報第２００５００６４４７４号（第１０／９１２，９３２号、実施例５）及び米国仮特許出願第６０／７２１，０５４号（実施例３８）に記載のように、野生型切断半ドメイン（ＦｏｋＩ）の部位特異的突然変異誘発により調製することができる。

Ｃ．ＣＣＲ５における標的化切断のための追加の方法
ＣＣＲ５遺伝子中に標的部位を有する任意のヌクレアーゼを本明細書に記載の方法で使用することができる。例えばホーミングエンドヌクレアーゼとメガヌクレアーゼは非常に長い認識配列を有し、その一部は統計的にヒトサイズのゲノム中で１回存在しているようである。ＣＣＲ５遺伝子中にユニークな標的部位を有するかかるヌクレアーゼは、ＣＣＲ５遺伝子中の標的化切断のためにジンクフィンガーヌクレアーゼの代わりに、又は追加的に使用することができる。

ホーミングエンドヌクレアーゼの例には、Ｉ−Ｓｃｅｌ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、及びＩ−ＴｅｖＩＩＩがある。これらの認識配列は公知である。また米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. MoI. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. MoI Biol. 280:345-353 及び New England Biolabs カタログも参照のこと。

ほとんどのホーミングエンドヌクレアーゼの切断特異性はその認識部位について絶対的ではないが、その部位は、その認識部位の１つのコピーを含有する細胞中でホーミングエンドヌクレアーゼを発現することにより、哺乳動物サイズのゲノムについて１回の切断が得るのに充分な長さである。ホーミングエンドヌクレアーゼとメガヌクレアーゼの特異性は、天然に存在しない標的部位に結合するように遺伝子操作することができることも報告されている。例えば、Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66を参照のこと。

送達
本明細書に記載のＺＦＮは、任意の適切な方法により標的細胞に送達することができる。ジンクフィンガーを含むタンパク質を送達する方法は、例えば米国特許第６，４５３，２４２号；６，５０３，７１７号；６，５３４，２６１号；６，５９９，６９２号；６，６０７，８８２号；６，６８９，５５８号；６，８２４，９７８号；６，９３３，１１３号；６，９７９，５３９号；７，０１３，２１９号；及び７，１６３，８２４号に記載されている（これらの開示内容は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。

本明細書に記載のＺＦＮはまた、１つ又はそれ以上のＺＦＮをコードする配列を含有するベクターを使用して送達してもよい。特に限定されないが、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、及びアデノ関連ウイルスベクターなどを含む任意のベクター系が使用される。また米国特許第６，５３４，２６１号；６，６０７，８８２号；６，８２４，９７８号；６，９３３，１１３号；６，９７９，５３９号；７，０１３，２１９号；及び７，１６３，８２４号に記載されている（これらの開示内容は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。

ある実施態様においてベクターはアデノウイルスベクターである。すなわち異種配列（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ））を細胞に導入するためのアデノウイルス（Ａｄ）ベクターが本明細書に記載される。

本出願で使用できるＡｄベクターの非限定例には、組換え（例えばＥ１欠失）、条件的複製可能（例えば腫瘍崩壊性）、及び／又は非ヒト血清型から得られる複製可能Ａｄベクター（例えば、Ａｄ５、Ａｄ１１、Ａｄ３５、又はブタアデノウイルス−３）、及び／又は遺伝子操作したファイバー（例えばノブ又はシャフト）タンパク質（例えばノブタンパク質のＨＩループ内のペプチド挿入のような）を有するキメラＡｄベクター（例えばＡｄ５／３５）又は向性改変Ａｄベクターがある。また「gutless」Ａｄベクター（例えば、免疫原性を低下させＤＮＡ負荷のサイズを増加させるためにすべてのアデノウイルス遺伝子が除去されているＡｄベクター）も有用である。これは例えば、ＺＦＮをコードする配列とドナー配列の同時送達を可能にする。かかるgutlessベクターは、ドナー配列が標的化組み込みにより組み込まれる大きなトランス遺伝子を含む時、特に有用である。

複製欠損組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は高力価で産生することができ、これらは多くの異なる細胞タイプに容易に感染する。ほとんどのアデノウイルスベクターは、トランス遺伝子がＡｄＥ１ａ、Ｅ１ｂ、及び／又はＥ３遺伝子を置換し、次に１つ又はそれ以上の欠失遺伝子機能をトランスで提供する細胞中で複製欠陥ベクターが増殖される。例えばヒト２９３細胞はＥ１機能を供給する。Ａｄベクターは、非分裂性の分化細胞（例えば肝臓、腎臓、及び筋肉中に存在するもの）を含む複数のタイプの組織にインビボで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは大きな運搬能力を有する。臨床治験におけるＡｄベクターの使用例は、筋肉内注入による抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド療法である（Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998)）。

臨床治験における遺伝子輸送のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例は、Rosenecker et al., Infection 24:1 5-10 (1996); Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf et al., Gene Ther. 5:507-513 (1998) がある。

ある実施態様においてＡｄベクターは、２つまたはそれ以上の異なるアデノウイルスゲノムからの配列を含有するキメラアデノウイルスベクターである。例えばＡｄベクターはＡｄ５／３５ベクターでもよい。Ａｄ５／３５は、Ａｄ５のファイバータンパク質遺伝子の１つ又はそれ以上（ノブ、シャフト、テイル、ペントン）を、Ｂ群アデノウイルスからの対応するファイバーゼロタンパク質遺伝子（例えばＡｄ３５）で置換することにより作成される。Ａｄ５／３５ベクター及びこのベクターの特徴は、例えば Ni et al. (2005)、「ヒヒに静脈内注射後のＢ群ファイバーを含有するアデノウイルスベクターの生体分布と安全性の評価」、Hum Gene Ther 16:664-677; Nilsson et al. (2004) 、「臍帯血ＣＤ３４⁺細胞の機能的に明瞭な亜集団は血清型５又は３５向性を有するアデノウイルスベクターにより形質導入される」、Mol Ther 9:377- 388; Nilsson et al. (2004)、「アデノウイルス血清型３５向性を有するアデノウイルスベクター系の開発；初代悪性腫瘍造血細胞への効率的な一過性遺伝子輸送」、J Gene Med 6:631-641; Schroers et al. (2004)、「Ａｄ５／３５キメラアデノウイルスベクターによるヒトＴリンパ球及びナチュラルキラー細胞への遺伝子輸送」、Exp Hematol 32:536-546; Seshidhar et al. (2003)、「遺伝子輸送ベクターとしてのアデノウイルス血清型３５の開発」、Virology 311 :384-393; Shayakhmetov et al. (2000)、「再標的化アデノウイルスベクターによるヒトＣＤ３４（＋）細胞への効率的遺伝子輸送」、J Virol 74:2567-2583; 及び Sova et al. (2004)、「肝臓転移の治療のためのＴＲＡＩＬを発現する腫瘍標的化及び条件的複製性腫瘍崩壊性アデノウイルスベクター」、Mol Ther 9:496-509 に記載されている。

上記したように、ＺＦＮとこれらのＺＦＮをコードするポリヌクレオチドは任意の標的細胞に送達することができる。一般に遺伝子ＣＣＲ−５を不活性化するために、細胞は免疫細胞、例えばリンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞、例えばＴヘルパー（Ｔ_H）、及びＴ細胞毒性細胞（Ｔ_C）、ヌル細胞、例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）、単核細胞（単球、マクロファージ）、顆粒細胞（顆粒球、好中球、好酸球、好塩基球）、肥満細胞、及び／又は樹状細胞（ランゲルハンス細胞、間質性樹状細胞、趾間樹状細胞、循環樹状細胞）である。マクロファージ、Ｂリンパ球、及び樹状細胞は、Ｔ_H細胞活性化に関与する抗原提示細胞である。ある実施態様において標的細胞は、表面上のＣＤ４の発現を特徴とするＴ_H細胞である。標的細胞はまた造血幹細胞でもよく、これは任意の免疫細胞を与える。

用途
開示された方法と組成物は、細胞クロマチン中の目的の領域（例えばゲノム、例えば変異体又は野生型の遺伝子中の所望の位置又は所定の位置）でＤＮＡを切断するために；ゲノム配列（例えば、細胞クロマチン中の目的の領域、また後述の実施例５も参照）を相同的な非同一配列で置換するために（すなわち標的化組換え）；ゲノム中の１つ又はそれ以上の部位でＤＮＡを切断することによりゲノム配列を欠失させるために（この切断部位は次に非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）により結合される）；相同的組換えを促進する細胞因子をスクリーニングするために；野生型配列を変異配列で置換するために；及び／又は１つの対立遺伝子を異なる対立遺伝子に変換するために、使用することができる。かかる方法はまた遺伝疾患を治療するために、細胞株の作成及び／又は修飾（治療及び非治療用途）、宿主の感染症（ウイルス性又は細菌性）の治療（ウイルス又は細菌受容体の発現を阻止し、こうして宿主生物中の感染及び／又は拡散を防ぐ）を可能にする。

すなわち本明細書に記載の組成物と方法は、遺伝子修飾、遺伝子修正、及び遺伝子破壊のために使用することができる。遺伝子修飾の非限定例には、相同的指向性修復（ＨＤＲ）ベースの標的化組み込み；ＨＤＲベースの遺伝子修正；ＨＤＲベースの遺伝子修飾；ＨＤＲベースの遺伝子破壊；ＮＨＥＪベースの遺伝子破壊、及び／又はＨＤＲ、ＮＨＥＪ、及び／又は１本鎖アニーリング（ＳＳＡ）の組合せがある。１本鎖アニーリング（ＳＳＡ）は、５’−３’エキソヌクレアーゼによりＤＳＢを切断して２つの相補的領域を露出させることにより、同じ配向で存在する２つの繰り返し配列間の２本鎖ブレークの修復を意味する。次に２つの直接繰り返し配列をコードする１本鎖は互いにアニーリングし、アニーリングした中間体は、１本鎖テイル（ＤＮＡ配列にもアニーリングしない１本鎖ＤＮＡの部分）を消化して除去し、ギャップをＤＮＡポリメラーゼにより埋め、ＤＮＡ末端を再結合させるように処理される。これは、直接繰り返し配列間に存在する配列を欠失させる。

本明細書に記載の組成物（例えばＡｄ−ＺＦＮベクター）と方法はまた、種々の遺伝疾患及び／又は感染性疾患の治療に使用することができる。

この組成物と方法はまた、特に限定されないが、以下のものを含む幹細胞ベースの治療に適用することもできる：
（ａ）単一遺伝子の遺伝子治療のためのショートパッチ遺伝子変換又は標的化組み込みによる体細胞変異の修正
（ｂ）優性陰性対立遺伝子の破壊
（ｃ）細胞内への病原体の侵入又は生産性感染に必要な遺伝子の破壊
（ｄ） 例えば以下の：
（ｉ）機能的組織の分化又は形成を促進するために遺伝子活性を修飾し；及び／又は
（ii）機能的組織の分化又は形成を促進するために遺伝子活性を破壊すること
による組織遺伝子操作の増強
（ｅ）例えば以下の：
（ｉ）分化を阻止する遺伝子を破壊して、幹細胞が特定の系統経路に分化することを促進し
（ii）幹細胞分化を刺激することができる遺伝子又はｓｉＲＮＡ発現カセットを標的化挿入し
（iii）幹細胞分化を刺激することができ、多能性の良好な拡張と維持を可能にする遺伝子又はｓｉＲＮＡ発現カセットを標的化挿入し
（iv）簡単なマーカーが、幹細胞の分化状態をスコア化し、かつ培地、サイトカイン、増殖条件、遺伝子発現、ｓｉＲＮＡ分子の発現、細胞表面マーカーへの抗体の暴露、又は薬剤の変化が如何にこの状態を変化させるかをスコア化することを可能にする、多能性又は分化状態のマーカーである内因性遺伝子のフレーム内のレポーター遺伝子の標的化挿入すること
による分化の阻止又は誘導：
（ｆ）体細胞核移植、例えば患者自身の体細胞を単離することができ、目的の標的遺伝子を適切な方法で修飾し、細胞クローンを作成し（及びゲノム安全性を確保するために品質管理をする）、そしてこれらの細胞から核を単離し未受精卵中に移して患者特異的ｈＥＳ細胞し、これを直接注入するか又は分化した後患者に移植し、こうして組織拒絶を低減又は排除
（ｇ）ＭＨＣ受容体をノックアウトすることによる万能幹細胞−（このアプローチは、免疫学的個性が低下したか又は完全に除去された細胞を作成するのに使用されるであろう。この方法のための細胞タイプには、特に限定されないが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、造血幹細胞、及び胚幹細胞がある。従ってこれらの幹細胞又はその誘導体（分化細胞タイプ又は組織）は、その起源又は組織適合性に関係なく、任意のヒトに移植できるであろう。）

この組成物と方法はまた、体細胞治療（例えば、自己由来細胞治療法及び／又はＭＨＣ受容体をノックアウトすることによる万能Ｔ細胞、上記セクション（ｇ）を参照）に使用することができ、こうしてその生物学的性質を増強するように修飾されたＴ細胞ストックの産生を可能にする。かかる細胞は、Ｔ細胞のドナー供給源及び受容者への組織適合性に依存せずに、種々の患者に注入することができる。

さらにＺＦＮを送達するための本明細書に記載のＡｄベクターの使用は、ＮＨＥＪの速度を増強する。理論に拘束されるつもりはないが、この作用はＥ４タンパク質（Ｅ４ＯＲＦ６（Ｅ４３４ｋ）、Ｅ４ＯＲＦ３）がＤＳＢ修復に対して有する阻害作用によるようである。

本明細書に記載したすべての特許、特許出願、及び刊行物は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。

明瞭さと理解を目的とする例示と例により本開示をある程度詳細に説明したが、本開示の精神又は範囲を逸脱することなく種々の変更及び修飾が可能であることは当業者に明らかであろう。従って前記開示と以下の例は決して限定的なものではない。

実施例１：ベクター構築
Ａ．Ａｄ５／３５−ＧＦＰとＡｄ５／３５−ＺＦＮベクターの構築

キメラＡｄ５／３５ベクター（Nilsson et al. (2004) Mol Ther 9:377-388; Nilsson et al (2004) J Gene Med 6:631-641）を、図１に模式的に示すように構築した。簡単に説明すると、ＧＦＰの発現カセットをコードする配列（上の線）、内因性ＣＣＲ５遺伝子座を標的とする一対の遺伝子操作ＺＦＮ（ＺＦＮ１とＺＦＮ２）の発現カセット（中央の線）、又はＣＣＲ５遺伝子座中の４７ｂｐパッチ配列を標的とする相同的ドナー配列（下の線）を、ＡｄＥａｓｙ細菌組換え系（Stratagene）を使用してＥ１遺伝子の代わりに挿入した。

Ａｄ−２１５とＡｄ−２０１ベクター構築体はそれぞれ、Ｌｅｕ５５をコードする配列で内因性ＣＣＲ５遺伝子を切断する２つのＺＦＮをコードする配列を含む。両方のＺＦＮとも、２Ａ融合体を介して単一のプロモーターの制御下で発現される。上記表１に示すように、Ａｄ−２１５構築体によりコードされるＺＦＮ２１５対は、それぞれｒ１６２と１６８設計からのジンクフィンガー結合ドメイン８２６７と８１９６ｚを含み、一方Ａｄ−２０１ベクターによりコードされるＺＦＮ２０１対は、それぞれｒ１６２と１６８設計からのジンクフィンガー結合ドメイン８２６６と８１９６ｚを含む。Ａｄ−２１５とＡｄ−２０１ベクターによりコードされるＺＦＮは、野生型ＦｏｋＩ切断半ドメインに融合される。図２を参照のこと。

Ａｄ−２２４構築体によりコードされるＺＦＮ２２４対は、それぞれｒ１６２と１６８設計からのジンクフィンガー結合ドメイン８２６７と８１９６ｚを含む。すなわちＡｄ−２２４構築体はＡｄ−２１５と同じジンクフィンガータンパク質を有する。しかしＡｄ−２２４構築体によりコードされるＺＦＮは、米国仮特許出願第６０／８０８，４８６号（２００６年５月２５日出願）（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のように変異体ＦｏｋＩ切断半ドメインを含有する。特に８２６７ジンクフィンガードメインは、Ｑ４８６ＥとＩ４９９Ｌ変異を含有するＦｏｋＩ切断半ドメインに融合され（図３）、８１９６ｚジンクフィンガードメインは、Ｅ４９０ＫとＩ５３８Ｋ変異を含有するＦｏｋＩ切断半ドメインに融合される（図４）。

Ｂ．標的化挿入のためのドナーベクター
ドナーベクター（Ａｄ５／３５Ｐｏｒｉ、図１の下の線）を作成するために、ＣＣＲ５遺伝子座に対応するヒトゲノムの１８８１ｂｐ断片をＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen）中にクローン化した。この断片の配列を図５に示す（配列番号３６）。

「パッチ」配列を挿入すべきクローニング部位を作成するために、図５に示す配列の２つのヌクレオチドを変化させてＸｂａＩ認識部位を作成した。特にヌクレオチド配列「ａｔｃｃｔｇａｔａａ」（配列番号３９）（ドナー断片中のヌクレオチド４７０〜４７９）を、QuickChange部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene）により「ａｔｃｔａｇａｔａａ」（配列番号４０）（変化させた２つの塩基に下線を引いた）に変化させた。

生じたＤＮＡ配列を次にＸｂａＩで消化し、図６に示す４７ｂｐの「パッチ」配列（配列番号３７）をＸｂａＩ部位に挿入した。

図７に示す生じた配列（配列番号３８）を、ＧＦＰとＺＦＮ発現カセットについて説明したようにＡｄ５／３５ベクター中に挿入した。図７に示す配列について、５’相同性アームはヌクレオチド１〜４７１に対応し、ＣＣＲ−５への標的化挿入のための「パッチ」配列は、下線を引いてあり、ヌクレオチド４７２〜５１８に対応する、そして３’相同性アームはヌクレオチド５１９〜１９２８に対応する。

実施例２：Ａｄ５／３５−ＧＦＰベクターによるｈＥＳ細胞の形質導入
実施例１に記載したＡｄ５／３５−ＧＦＰベクターを以下のようにヒト胚幹細胞（ｈＥＳ）中に導入した。

４００，０００個の細胞と２５μｌ、５μｌ、又は０．５μｌのＡｄ５／３５−ＧＦＰベクター（ＭＯＩはそれぞれ８２００、１６４０、及び１６４）を使用して、５００μｌ容量で ｈＥＳ細胞の感染を行った。４時間後、細胞を洗浄し、新鮮なマウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー細胞上に蒔いた。感染の約２０時間後に得られた生きている細胞の蛍光顕微鏡は、５μｌと２５μｌのウイルスで感染させた幹細胞コロニー中で蛍光を示し、フィーダー細胞中には蛍光は無かった。感染の約２２時間後にＧＦＰ蛍光のＦＡＣＳ解析を行った。結果を表２に示す。

これらの結果は、Ａｄ５／３５ベクターが高効率でヒト胚幹細胞に感染できることを示す。

実施例３：Ａｄ５／３５−ＺＦＮを使用するＣＣＲ−５遺伝子の修飾
ＣＤ４⁺Ｔ細胞とＰＢＭＣはAllCellsから得た。細胞を、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｌ−グルタミン（３０ｍｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−２（１ｎｇ／ｍｌ、Sigma）で培養し、製造業者のプロトコール（Dynal）に従って抗ＣＤ３−ＣＤ２８ビーズで活性化した。２４ウェルプレート中に１ｍｌ容量で細胞を３×１０⁵細胞／ｍｌで接種した。

実施例１に記載したアデノウイルスベクター（Ａｄ５／３５ＧＦＰ、Ａｄ５／３５２１５、又はＡｄ５／３５２２４）を２日後に、ＭＯＩが１０、３０、又は１００（ＭＯＩは感染力価に基づいて計算した）で加えた。

ウイルスに暴露した２日後に細胞を採取し、Ｃｅｌ−１アッセイ（国際特許公報ＷＯ０７／０１４２７５号に記載のように行った）を使用して遺伝子修飾効率を測定した。またOleykowski et al. (1998) Nucleic Acids res. 26:4597-4602; Qui et al. (2004) BioTechniques 36:702-707; Yeung et al. (2005) BioTechniques 38:749-758を参照のこと。

結果を表３に示す：

これらの結果は、ＺＦＮ２１５ヌクレアーゼ対（野生型ＦｏｋＩ切断半ドメインを含む）とＺＦＮ２２４ヌクレアーゼ対（実施例１Ａに記載の変異体ＦｏｋＩ切断半ドメインを含む）の両方をコードするＡｄ５／３５ベクターで細胞を感染後に、遺伝子修飾が観察されたことを示す。さらに結果は、遺伝子修飾レベルが用量依存的に上昇することを示す。

ＺＦＮに誘導された遺伝子修飾の持続を調べるために、感染細胞をさらに８日間培養して維持した（以前と同じ培地を使用した）。細胞を計測し、新鮮な培地で２日毎に希釈した。次に細胞を採取（ウイルス形質導入の１０日後）し、Ｃｅｌ−１アッセイを繰り返した。さらに７日目に一部のＣＤ４⁺Ｔ細胞集団を抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Dynal）で再活性化した。結果を表４に示す。

これらの結果は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞が拡張されて、遺伝子修飾の程度が維持されることを示す。さらに再活性化は、非修飾細胞と比較して修飾細胞の増殖に対して明らかな影響は無かった。

実施例４：ＣＤ３４ ⁺ 細胞中のＡｄ５／３５−ＺＦＮを使用するＣＣＲ−５遺伝子の修飾
ＣＤ４⁺Ｔ細胞とＣＤ３４⁺細胞はAllCellsから得た。０日目にＣＤ４⁺Ｔ細胞をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｌ−グルタミン（３０ｍｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−２（１ｎｇ／ｍｌ、Sigma）で培養し、製造業者のプロトコール（Dynal）に従って抗ＣＤ３−ＣＤ２８ビーズで活性化した。ＣＤ３４⁺細胞を無血清培地（Stemspan H3000, Stem Cell Technologies）で培養し、サイトカイン（Stemspan CClOO, Stem Cell Technologies）を補足した。２４ウェルプレート中に１ｍｌ容量で細胞を６×１０⁵細胞／ｍｌで接種した。翌日（１日目）アデノウイルスベクター（Ａｄ５／３５ＧＦ又はＡｄ５／３５２２４）を、異なるＭＯＩ（ＭＯＩは感染力価に基づいて計算した）で加えた。

４日目に細胞を採取し、Ｃｅｌ−１アッセイを使用して遺伝子修飾効率を測定した。

ＣＤ４⁺Ｔ細胞について、Ａｄ５／３５２２４は、ＭＯＩが２５、５０、及び１００で効率がそれぞれ１８．０％、３４．５％、及び４８．４％でＣＣＲ−５遺伝子修飾を誘導した。

同様にＣＤ３４⁺細胞について、Ａｄ５／３５２２４は、ＭＯＩが１０及び５０で効率がそれぞれ１０．９％及び１１．１％でＣＣＲ５遺伝子修飾を誘導した。

実施例５：Ａｄ５／３５−ＺＦＮを使用するＣＣＲ−５遺伝子への外因性配列の標的化挿入

０日目に、ＣＤ４⁺Ｔ細胞をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｌ−グルタミン（３０ｍｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−２（１ｎｇ／ｍｌ、Sigma）で培養し、製造業者のプロトコール（Dynal）に従って抗ＣＤ３−ＣＤ２８ビーズで活性化した。２４ウェルプレート中に１ｍｌ容量で細胞を３×１０⁵細胞／ｍｌで接種した。２日後（２日目）、異なる組合せのＡｄ５／３５２２４とＡｄ５／３５Ｐｏｒｉドナー（図１と７）で同時形質導入した。Ａｄ５／３５２２４をＭＯＩが０、２５、５０、及び１００で加え、Ａｄ５／３５ＰｏｒｉドナーをＭＯＩが０、１００、及び３００（ＭＯＩは感染力価に基づいて計算した）で加えた。感染の２日後（４日目）細胞を採取し、標的化組み込み効率を以下のようにＲＦＬＰアッセイにより測定した。

形質導入細胞からゲノムＤＮＡを単離し、ドナー相同性領域の外のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。次に増幅した断片を制限酵素ＢｇｌＩ（この認識部位はＰｏｒｉドナー（パッチ）配列内に含有される）とインキュベートした。パッチ配列の標的化挿入の頻度を、切断生成物と非切断生成物の比を測定することにより計算した。細胞を、ＭＯＩが５０のＡｄ５／３５２２４とＭＯＩが３００のＡｄ５／３５Ｐｏｒｉで同時形質導入した時、パッチ配列の標的化挿入の頻度は３．１％であった。

実施例６：Ａｄ５／３５−ＺＦＰを使用して誘導された非相同的末端結合
標的化切断に続いて非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）により作成したＺＦＮ介在変異のタイプを調べるために、修飾細胞のゲノムＣＣＲ−５配列を配列決定し解析した。簡単に説明すると、実施例３に記載したものと同じ方法でＡｄ５／３５ＺＦＮ２１５で形質導入したＰＢＭＣとＣＤ４⁺Ｔ細胞を採取し、これらの細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。次にＣＣＲ５遺伝子座をＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen）中にＴｏｐｏクローン化し、細菌クローンを配列決定し、野生型ＣＣＲ５遺伝子座と比較した。

標的化ＺＦＮ切断により誘導された変異は欠失と挿入とを含み、かかる変化の大きさは広範囲にわたって変化した。単一のヌクレオチド対のように小さい欠失と挿入が観察され、ほとんど１００ヌクレオチド対までの大きさの挿入も観察された。標的化ＺＦＮ介在切断により誘導されたいくつかの変異例の配列を図８〜１０に示す。

図８は、解析中に同定されたいくつかの欠失の配列を示す。欠失している塩基対を点で示す。

５塩基対の挿入がＺＦＮ処理細胞中で高頻度で起きた。５塩基対挿入は、ＺＦＮ結合部位間の５塩基対配列の複製であり、配列 ＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧＡＴＡＡＡＣＴＧＣＡＡＡＡＧ（配列番号４１）をＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧＡＴＣＴＧＡＴＡＡＡＣＴＧＣＡＡＡＡＧ（配列番号４２）（挿入配列に下線を引いてある）に変換する。

別のしばしば観察される変異は、２つのＺＦＮ結合部位の間の４塩基対合挿入であり、配列ＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧＡＴＡＡＡＣＴＧＣＡＡＡＡＧ（配列番号４１）をＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＴＣＴＡＧＡＴＡＡＡＣＴＧＣＡＡＡＡＧ（配列番号４５）（挿入配列に下線を引いてある）に変換する。

図９は、追加の変異のヌクレオチド配列を示す。ある場合に、１ヌクレオチド欠失と５ヌクレオチド挿入の組合せが観察された。

図１０は、標的化ＺＦＮ切断から生じるいくつかのより長い挿入の配列を示す。

ＣＣＲ−５遺伝子座への配列修飾の要約を以下の表５に示す。

実施例７：Ａｄ５／３５−ＺＦＮ形質導入後の細胞生存活性
Ａｄ５／３５−ＺＦＮ構築体で形質導入後の細胞生存活性も評価した。簡単に説明すると、ＣＤ４⁺Ｔ細胞とＰＢＭＣはAllCellsから得た。０日目に細胞をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｌ−グルタミン（３０ｍｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−２（１ｎｇ／ｍｌ、Sigma）で培養し、製造業者のプロトコール（Dynal）に従って抗ＣＤ３−ＣＤ２８ビーズで活性化した。２４ウェルプレート中に１ｍｌ容量で細胞を３×１０⁵細胞／ｍｌで接種した。２日後（２日目）、アデノウイルスベクター（Ａｄ５／３５ＧＦＰ、Ａｄ５／３５２１５、又はＡｄ５／３５２２４）をＭＯＩが１０、３０、及び１００（ＭＯＩは感染力価に基づいて計算した）で加えた。ＧＵＡＶＡ分析フローサイトメーターで提供されたＶＩＡＣＯＵＮＴプロトコールを使用して、製造業者の説明書（Guava Technologies）に従って、４、６、８、１０、及び１２日目に細胞数と細胞生存活性を測定した。

Ａｄ５／３５ＺＦＮは一般に充分に許容され、少なくとも７５％の細胞（低いＭＯＩで最大９０％）がすべての時点で生存活性があった。すなわち最小の毒性が観察された。

実施例８：Ａｄ５／３５−ＺＦＮ形質導入後の細胞増殖
Ａｄ５／３５−ＺＦＮ構築体で形質導入後の細胞増殖（倍加）も評価した。

０日目に、ＣＤ４⁺Ｔ細胞とＰＢＭＣをＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｌ−グルタミン（３０ｍｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−２（１ｎｇ／ｍｌ、Sigma）で培養した。０日目と６日目に製造業者のプロトコール（Dynal）に従って抗ＣＤ３−ＣＤ２８ビーズで細胞を活性化した。２４ウェルプレート中に１ｍｌ容量でまず細胞を３×１０⁵細胞／ｍｌで接種した。２日目に、アデノウイルスベクター（Ａｄ５／３５ＧＦＰ、Ａｄ５／３５２１５、又はＡｄ５／３５２２４）をＭＯＩが１０、３０、及び１００（ＭＯＩは感染力価に基づいて計算した）で加えた。ＧＵＡＶＡ分析フローサイトメーターで提供されたＶＩＡＣＯＵＮＴプロトコールを使用して、実施例７に記載のように細胞数と細胞生存活性を測定した。

細胞増殖又は倍加はアデノウイルス（ＭＯＩが１００のＡｄ５／３５２１５を除く）により最小の影響を受けた。１４日間でＣＤ４⁺Ｔ細胞とＰＢＭＣの両方で、全体に少なくとも８倍加（すなわち＞１００倍の拡張）が達成された。

実施例９：ＣＤ４ ⁺ Ｔ細胞中のアデノウイルスゲノムの持続の測定
ＣＤ４⁺Ｔ細胞をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｌ−グルタミン（３０ｍｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−２（１ｎｇ／ｍｌ、Sigma）で培養し、製造業者のプロトコール（Dynal）に従って抗ＣＤ３−ＣＤ２８ビーズで活性化した。２４ウェルプレート中に１ｍｌ容量で細胞を６×１０⁵細胞／ｍｌで接種した。翌日アデノウイルスベクター（Ａｄ５／３５２１５、又はＡｄ５／３５２２４）をＭＯＩが１０、３０、及び１００（ＭＯＩは感染力価に基づいて計算した）で加えた。細胞を４日目と１４日目に採取した。ＤＮＡをMasterpureキット（Epicenter Biotechnologies）を用いて抽出した。アデノウイルスゲノムの持続を、TaqMan（登録商標）ＰＣＲ（Applied Biosystem）によりＡｄゲノムＤＮＡの存在により定量した。細胞当たりのアデノウイルスゲノムのＥ４領域を標的し検出するために、プライマー／プローブを設計した。TaqMan（登録商標）ＰＣＲプロトコールの検出限界は、約１０^-4アデノウイルスゲノム／細胞である。

全体に、形質導入の２〜１２日間に細胞当たりのアデノウイルスゲノムのレベルは１００〜１０００倍低下した。細胞当たり１０^-2ゲノム未満が、形質導入の１２日までに最も高いＭＯＩ（１００）で検出された。

実施例１０：ＣＤ４ ⁺ Ｔ細胞中のタンパク質発現の持続の測定
０日目に、ＣＤ４⁺Ｔ細胞を実施例９に記載のように培養し活性化した。活性化の翌日（１日目）にアデノウイルスベクター（Ａｄ５／３５ＧＦＰ）をＭＯＩが５０、１００、２５０、及び５００（ＭＯＩは感染力価に基づいて計算した）で加えた。ＧＵＡＶＡ分析フローサイトメーターにより２〜３日毎に、ＧＦＰ陽性細胞パーセントと平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した。

最初（３日目）に顕著なＧＦＰ発現がすべてのＭＯＩで観察された。ＧＦＰ蛍光は１３日目まで続き、３日目に８０〜１００％の細胞がＧＦＰ陽性から１３日目に３０〜６０％の細胞がＧＦＰ陽性になった。しかし同じ期間内にＭＦＩは大きく低下し（ほとんど１００倍）、これは、１３日目の細胞がフローサイトメーターによりＧＦＰ陽性とスコア化されたが、顕著に少ないＧＦＰタンパク質を含有することを示唆する。さらに、ＧＦＰは比較的長い半減期（＞２４時間）を有することが知られている。

実施例１１：Ａｄ５／３５−ＺＦＮベクターで形質導入したＣＤ４ ⁺ Ｔ細胞中のＺＦＮ ｍＲＮＡの測定
０日目に、ＣＤ４⁺Ｔ細胞を実施例９に記載したように培養し活性化した。翌日（１日目）アデノウイルスベクター（Ａｄ５／３５２１５又はＡｄ５／３５２２４）をＭＯＩが３０及び１００（ＭＯＩは感染力価に基づいて計算した）で加えた。３日目と９日目（すなわち形質導入後２日目と８日目）に細胞を採取し、ＲＮＡをHigh Pure（登録商標）ＲＮＡ単離キット（Roche）を用いて抽出した。ＺＦＮ ｍＲＮＡをRT-TaqMan（登録商標）ＰＣＲ（Applied Biosystems）により定量した。プライマー／プローブセットを設計し、最適化して、ＦｏｋＩ切断半ドメインをコードする配列にアニーリングさせた。

形質導入の２日後に多量のＺＦＮ ｍＲＮＡが検出された（ＭＯＩに依存して１×１０⁵〜１×１０⁶コピー／細胞）。しかし形質導入後８日目までに、１つのみの試料（ＭＯＩが１００のＡｄ５／３５２１５）を除いてＺＦＮ ｍＲＮＡレベルはアッセイの検出限界以下であった。Ａｄ５／３５２１５ ＭＯＩ １００試料で約１００コピー／細胞が検出され、形質導入後２〜８日目にｍＲＮＡレベルは１０００倍低下した。

実施例１２：Ａｄ５／３５−ＺＦＮベクターを使用する初代ヒトＣＤ４ ⁺ Ｔ細胞中のＣＣＲ−５遺伝子の破壊
初代ヒトＣＤ４⁺Ｔ細胞（Univ. of Pennsylvaniaから得た）をモック形質導入したか、又はＡｄ５／３５ＧＦＰ、Ａｄ５／３５２１５、又はＡｄ５／３５２２４で形質導入した。

１日目にＴ細胞をペレット化し、１０％胎児牛血清と１％Ｌ−グルタミンを補足したＸｖｉｖｏ１５（BioWhittaker, Walkersville, MD）中１×１０⁶／ｍｌの濃度に再懸濁した。１ｍｌの細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Levine et al. (1997) J. Immunol. 159:5921-5930に記載されたように調製した）に接触させた。翌日（２日目）１×１０⁶細胞を、ＭＯＩが３０又は１００のＡｄ５／３５ＧＦＰ、Ａｄ５／３５２１５、又はＡｄ５／３５２２４ベクターで形質導入した。翌日１０％胎児牛血清、１％Ｌ−グルタミン、０．９％Ｎ−アセチルシステイン、及び３００ＩＵ／ｍｌのヒト組換えＩＬ−２を含有するＸｖｉｖｏ１５で培地の容量を２倍にした。各条件について細胞を２日毎にコールターカウンターで計測し、試料を分析のためにペレット化し、残りの培養物を接種し、１×１０⁶細胞／ｍｌで加えた。６日目に磁石を使用してビーズを取り出し、細胞を上記のＸｖｉｖｏ１５／ＦＣＳ／Ｌ−ＧＬｕｔ／ＮＡＣ／ＩＬ２培地で培養した。８日目に各試料の細胞の一部をＣｅｌ−１による分析のためにペレット化し、各試料中の残りの細胞（１×１０⁶細胞／ｍｌの濃度）にＣＣＲ５向性ＨＩＶ−１株ＵＳ１をＭＯＩ ０．１で感染させた（実施例１３参照）。

２日毎に細胞を計数し、ペレット化し、少量をＣｅｌ−１による分析のために集め、残りの細胞を接種し、同じＸｖｉｖｏ１５／ＦＣＳ／Ｌ−ＧＬｕｔ／ＮＡＣ／ＩＬ２含有培地を加えた。

１３日目にＣＤ４⁺Ｔ細胞培養物を、ＣＤ３２とＯＫＴ３（抗ＣＤ３）と抗ＣＤ２８を発現する放射線照射（３０００ｒａｄ）同種異系ＰＢＭＣと放射線照射（１０，０００ｒａｄ）Ｋ５６２細胞の混合物で再刺激した。

形質導入後１３日目にゲノムＤＮＡを採取し、ＣＣＲ５破壊効率をＣｅｌ−１アッセイにより測定した。結果を表６に示す。

実施例１３：ＨＩＶ暴露
さらに実施例１２に記載のようにＡｄ５／３５ベクターで形質導入した初代ヒトＣＤ４⁺Ｔ細胞を非形質導入細胞で１：３希釈し、モック感染したか又は複製可能ＨＩＶ株ＵＳ１で感染させた（ＭＯＩは０．１）。次にこれらの細胞を継代して、ＨＩＶ感染と複製を複数回行った。感染後それぞれ０、５、１１、及び１７日目に、モック感染及びＨＩＶ感染培養物の両方から少量の細胞を単離して、破壊したＣＣＲ５遺伝子を含有する細胞のパーセントを追跡した。ゲノムＤＮＡを各細胞試料から単離し、変異ＣＣＲ５対立遺伝子の存在をＣｅｌ−１アッセイを使用して測定した。

結果を図１１のパネルＡ（Ａｄ５／３５２１５形質導入細胞）とＢ（Ａｄ５／３５２２４形質導入細胞）に示し、ＡｄＺＦＮベクターでトランスフェクトした細胞では、そのＣＣＲ５遺伝子中に配列変化を含む細胞の数はＨＩＶ感染（ＺＦＮ ＨＩＶ）後に増加したが、ＨＩＶで感染しなかった細胞（ＺＦＮモック）では増加しなかった。

実施例１４：ＧＨＯＳＴ−ＣＣＲ５細胞中のＣＣＲ５のＺＦＮ破壊
Ａ．ＧＨＯＳＴ−ＣＣＲ５細胞中のＺＦＮ誘導変異の測定
ＧＨＯＳＴ−ＣＣＲ５細胞［ＨＩＶ−２ ＬＴＲの制御下で自己由来ＣＣＲ５発現カセットと誘導性ＧＦＰマーカー遺伝子の複数の（約４）のコピーを含むＨＩＶ−１感染のレポーター細胞株（Morner et al. ( 1999) J. Virol. 73:2343-2349）］をNIH AIDS Research and Reference Reagent Programから得て、ＣＣＲ５−ＺＦＮ対２１５（表１についての上記本文参照）と２２４（表１で８１９６ｚと８２６６として示したＺＦＮを含有する）をコードするアデノウイルス（Ａｄ５／３５）ベクター（Schroers et al. (2004) Experimental Hematology 32:536-546）で形質導入した。これらのＺＦＮ対の両方の結合部位は同じであり、図１２に示す。

標的部位におけるＺＦＮ介在変異の誘導を、Surveyor（登録商標）ヌクレアーゼ（Transgenomic）（Ｃｅｌ−１としても知られている、ＺＦＮ誘導性変異の部位でＤＮＡを切断するミスマッチ感受性酵素）に基づくアッセイを使用して測定した。簡単に説明するとゲノムＤＮＡを修飾細胞及び対照細胞から、MasturePure（登録商標）ＤＮＡ精製キット（Epicentre Biotechnologies）を使用して抽出し、放射性ＰＣＲのために５μＣｉのα−Ｐ³²ｄＡＴＰと５μＣｉのα−Ｐ³²ｄＣＴＰを補足した。

修飾細胞及び対照細胞から抽出したゲノムＤＮＡの１００ｎｇについて、放射性ＰＣＲ（５０μｌ反応）を行った（AccuPrime（登録商標）ＰＣＲキット（Invitrogen））。簡単に説明するとＣＣＲ５−ＺＦＮ標的部位を含むＣＣＲ５遺伝子座の２９２ｂｐ断片を、プライマーＣ５＿Ｃｅｌ＿１６０＿Ｆ１：ＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＡＴＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＧＴＣＣ（配列番号２９）とＣ５＿Ｃｅｌ＿１６０＿Ｒ１：ＣＡＡＡＧＴＣＣＣＡＣＴＧＧＧＣＧ（配列番号３０）を使用して、３０サイクル（９５℃−３０秒、６０℃−３０秒、及び６８℃−３０秒）増幅した。

ＰＣＲ産物をＧ−５０カラム（GE Healthcare）で遠心分離し、１μｌの精製産物を１μｌの１０×アニーリング緩衝液（１×アニーリング緩衝液−１０ｍＭトリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ）及び水と混合して、最終容量を１０μｌとした。ＤＮＡを変性させ、ヘテロ２本鎖の形成を可能にするプログラム（９５℃−１０分、−２℃／ｓで９５℃から８５℃へ、及び−０．１℃／ｓで８５℃から２５℃へ）を使用してＰＣＲブロック中で再アニーリングした。再アニーリング後、１μｌのSurveyor（登録商標）ヌクレアーゼ（Transgenomics）、１μｌの１０×AccuPrime（登録商標）ＰＣＲ緩衝液II、及び水を、最終容量２０μｌになるように加えた。反応物を４２℃で２０分インキュベートしてヘテロ２本鎖を消化し、切断生成物を非変性１０％ＴＢＥポリアクリルアミドゲル（Bio-Rad）で分離した。ゲルを乾燥させ、Phosphoimager（登録商標）を使用して分析した。切断されていない親断片と２つの速く泳動する切断生成物の比を求めることにより、ＺＦＮ誘導性標的遺伝子破壊のレベルを測定した。元々の試料中のＺＦＮ破壊ＣＣＲ５対立遺伝子の比率は、式（１−√（親画分））×１００を使用して計算した。アッセイは単一ヌクレオチド変化に感受性であり、検出限界は約１％ＺＦＮ改変対立遺伝子である。

図１３に示す結果は、本明細書に記載のＣＣＲ５−ＺＦＮがＧＨＯＳＴ−ＣＣＲ５細胞（レーン３と４）中のＣＣＲ５を変異させるのに非常に効率的（５０〜８０％）であることを証明した。形質導入しなかった対照細胞（レーン１）とＩＬ−２Ｒγ特異的ＺＦＮをコードするＡｄ５／３５ベクターで形質導入した細胞（Urnov et al. (2005) Nature 435:646-651：レーン２）は、検出可能なＣＣＲ５修飾を示さず、結果がＣＣＲ５−ＺＦＮ特異的であることを示している。

Ｂ．ＨＩＶ暴露
さらに形質導入細胞集団を培養で維持し、１週間後にＨＩＶ−１_BAL（プロトタイプＣＣＲ５向性ＨＩＶ−１分離株）を感染させた。暴露ウイルスは、NIH ADDS Research and Reference Reagent Program から得て、ＣＤ８枯渇ＰＢＭＣ中で増殖させて使用ストックを作成した。

ＨＩＶ−１感染の直前に、ＣＣＲ５表面発現を分析し、ＩＬ２Ｒγ−ＺＦＮで処理した対照細胞と比較してＣＣＲ５−ＺＦＮ形質導入細胞のプールでは＞１０倍低下していることが証明された（図１４Ａ）。

ＨＩＶ−１_BAL暴露の結果は、感染後４８時間のＨＩＶ ＬＴＲ指令ＧＦＰ誘導の喪失により測定すると、ＣＣＲ５−ＺＦＮ処理試料で１週間後にＨＩＶ−１感染の顕著な低下を示した（図１４Ｂ）。ＣＣＲ５内の目的の標的部位での遺伝子修飾は、ＣＣＲ５−ＺＦＮ処理ＧＨＯＳＴ−ＣＣＲ５細胞からのゲノムＤＮＡの配列決定により確認された。

さらにＣＣＲ５−ＺＦＮ形質導入ＧＨＯＳＴ−ＣＣＲ５細胞から単離した単一細胞由来クローンを数週間かけて拡張した。ＣＣＲ５トランス遺伝子を遺伝子型判定し、破壊したＣＣＲ５対立遺伝子のみを有するクローンを試験し、ＨＩＶ−１_BALによりＨＩＶ感染に対して耐性であることを証明した。これらの細胞へのＣＣＲ−５トランス遺伝子の導入はＨＩＶによる感染性を回復し、これは、ＨＩＶ−１感染に対する耐性が、ＺＦＮ介在ＣＣＲ５破壊によるウイルス侵入の欠陥によってのみ仲介されることを証明している。

これらの結果は、ＣＣＲ５−ＺＦＮがＣＣＲ５遺伝子内のこれらのＤＮＡ標的部位を効率的に切断することを示し、高率のＺＦＮ誘導性変異がＣＣＲ５細胞表面発現を妨害し、ＣＣＲ５向性ＨＩＶ−１感染に対して完全に耐性になることを確認している。

実施例１５：ＣＣＲ５−ＺＦＮ改変は延命効果を付与する
ＣＣＲ５のＺＦＮ介在破壊が永久的遺伝的変化から予測されるＨＩＶ−１に対する長期耐性を付与するかどうかを評価するために、以下の実験を行った。

Ａ．長期培養後のＣＣＲ−５破壊
ＰＭ１細胞（ＣＣＲ５発現レベルが初代ＣＤ４⁺Ｔ細胞に似ているＣＤ４⁺Ｔ細胞株）を、ＺＦＮ２０１対をコードするＣＣＲ５−ＺＦＮ発現プラスミドを用いて電気穿孔して、２．４５％の対立遺伝子の内因性ＣＣＲ５破壊レベルを得た。

次にこのＺＦＮ処理細胞集団を７日目にＨＩＶ−１_BAL感染又はモック感染し、細胞を連続培養で７０日間拡張し、ＺＦＮ改変対立遺伝子の比率を、感染前と感染後３、１０、２１、３１、４２、及び５２日目のＤＮＡ分析により測定した。

図１５に示すように感染の５２日目までに、ＨＩＶ−１感染ＰＭ１培養物はＺＦＮ改変ＣＣＲ５対立遺伝子が約３０倍濃縮された（約７３％）。これに対してモック感染集団はＺＦＮ破壊ＣＣＲ５対立遺伝子の安定した存続（約２．３％）を示し、選択圧力の非存在下でＺＦＮ改変対立遺伝子を有する細胞の増殖速度に悪影響が無いことを示した。対照（非ＣＣＲ５標的）ＺＦＮ発現プラスミドで電気穿孔したＰＭ１細胞はＨＩＶ−１感染に対して感受性であり、ＣＣＲ５破壊を示さなかった。

これらの結果は、ＨＩＶ−１感染がＣＣＲ５−ＺＦＮ改変細胞に対して強力な選択的利点を与えること、及び選択的利点は培養物中で長期間維持されることを証明している。

Ｂ．ＺＦＮ介在変異
ＰＭ１細胞中のＣＣＲ５遺伝子のＺＦＮ介在変異の分子的本体をまた、感染後５２日目にＣＣＲ５の標的化領域のＰＣＲ増幅と配列決定により測定した。

配列読取りの７８％（８１配列中の６３）中の多くの分子的に明瞭な短い欠失と挿入が観察され（図１６）、ＨＩＶの存在下での修飾ＣＣＲ５対立遺伝子の存続は１つのまれなイベントに起因するものではないことを示した。

ＣＣＲ５遺伝子配列の永久的修飾を示唆するＺＦＮ認識部位又はその近傍にマッピングされるすべての変異は、ＺＦＮ切断とＮＨＥＪを介するその後の修復に起因する。広範囲の異なる欠失と挿入変異が観察されたが、特異的５ｂｐ挿入（５６位のイソロイシンコドンのすぐ下流の２つの停止コドンの導入を引き起こすＺＦＰ結合部位間の配列の複製）はすべての修飾配列の＞３０％であった（図１６）。

Ｃ．重感染
ＣＣＲ５−ＺＦＮ改変ＰＭ１細胞がＣＸＣＲ４向性ＨＩＶ−１に対する感受性を維持し、ＣＣＲ５向性ウイルスで再感染した時選択的利点を維持していることを確認するために、重感染実験も行った。

簡単に説明するとＰＭ１細胞をモックトランスフェクトしたか、又はＣＣＲ５−ＺＦＮ２０１対をコードするプラスミドもしくは上記の対照ＺＦＮ対（ＧＲ）でトランスフェクトした。これらの細胞集団をＨＩＶ−１_BALで暴露し、感染の５９日後に各試料の一部を親の非トランスフェクトＰＭ１細胞と混合し、ＣＸＣＲ４向性ＨＩＶ−１_BK132又はＣＣＲ５向性ＨＩＶ−１_BALで再感染させた。これらの再感染培養物を経時的に追跡し、再感染後２１日目（最初の感染後８０日目）に遺伝子破壊頻度を測定した。ＨＩＶ−１_BALで感染した細胞は、ＰＭ１細胞で希釈後にＺＦＮ改変細胞が再濃縮され（６４％）、一方モック感染又はＣＸＣＲ４向性ＨＩＶ−１_BK132で感染した細胞集団では、ＣＣＲ５破壊細胞について選択的利点はほとんど又は全く観察されなかった。

ＧＨＯＳＴ−ＣＸＣＲ４細胞はまた、早期（３日目）及び後期（５６日目）時点で取り出したＨＩＶ−１暴露ＣＣＲ５−ＺＦＮトランスフェクトＰＭ１細胞からの上清（５μｌ）に暴露した。これらの培養物はＣＸＣＲ４依存性感染を示さなかった。ＧＨＯＳＴ−ＣＣＲ５細胞に適用した同じ上清は程度は小さかったが感染性を維持し（ただしＣＣＲ５−ＺＦＮトランスフェクト試料を除いて）、ＣＣＲ５ヌルＰＭ１細胞の＞３０倍濃縮によりウイルス感染性が培養の５６日目までに大幅に低下することを示唆した。すなわち、ＣＸＣＲ４共同受容体の使用へのウイルスの進化は、ＣＣＲ５−ＺＦＮ処理しＨＩＶ−１感染培養物からの早期及び後期時点で採取した上清では検出されなかった。

さらに、ウイルス向性に対するＺＦＮ生成ＣＣＲ５ヌル細胞濃縮の経時的影響を調べるために、ＣＣＲ５−ＺＦＮ又はＧＦＰ対照を発現するプラスミドでトランスフェクトしたＨＩＶ−１暴露ＰＭ−１細胞の上清からＶ３ループ配列を得た。ＨＩＶ−１_BAL感染ＣＣＲ５ＺＦＮ処理ＰＭ−１細胞の長期培養物から、１５０個のプロウイルスＨＩＶ ＤＮＡ配列を単離した。これらのうち８８個は３日目に単離し、６２個は感染後５２日目に単離した。対照として７８個のＨＩＶ ＤＮＡ配列をＨＩＶ感染ＧＦＰ処理ＰＭ−１細胞から単離した（３日目に４５個、５２日目に３３個）。Hung et al. (199) J. Virol. 73:8216-8226により開示されたＲ５、Ｒ５Ｘ４、又はＸ４コンセンサスＶ３ループ配列を一致させることにより、向性の変化について配列を評価した。３日目と５２日目にＧＦＰとＣＣＲ５−ＺＦＮ処理した試料からのすべてのＶ３ループ配列は、ＣＣＲ５コンセンサス配列に最もよく一致し、共同受容体使用への切り替えへの進行は迅速ではないことを示唆しており、ＣＣＲ５−ＧＨＯＳＴレポーター細胞株のみでの感染性を示す上記データと一致した。

これらの結果は、天然に存在するＣＣＲ５Δ３２変異を有する個体で観察されるのと同様に、ＣＣＲ５−ＺＦＮの一過性発現が、ＣＣＲ５向性ＨＩＶ−１に対する安定で選択的な耐性を樹立することを証明している。

実施例１６：ＣＣＲ５−ＺＦＮ改変初代ＣＤ４ Ｔ細胞のインビトロ選択
Ａ．ＺＦＮによるＣＣＲ５の破壊
初代ヒト細胞中のＣＣＲ５−ＺＦＮの効力を調べるために、野生型ＣＣＲ５遺伝子を有する健常ドナーからのＣＤ４⁺Ｔ細胞を、ＣＣＲ５−ＺＦＮ２１５又はＣＣＲ５−ＺＦＮ２２４をコードするＡｄ５／３５ベクターで形質導入して、一過性の高効率ＺＦＮ送達を得た。異なるドナーから単離された細胞を使用する多重実験で、ＺＦＮ介在ＣＣＲ５破壊の感染多重度（ＭＯＩ）依存性レベル（ＣＣＲ５対立遺伝子の４０〜６０％に達する）が観察された。例を図１７に示す。

図１８に示すように、修飾初代ＣＤ４ Ｔ細胞の集団倍加速度は非形質導入細胞の速度と区別できず、ＣＣＲ５修飾対立遺伝子の比率は少なくとも１ヶ月間インビトロ培養の間安定であった。

Ｂ．ＨＩＶ暴露
インビトロのＨＩＶ感染に対するバルクＺＦＮ改変ＣＤ４ Ｔ細胞の抵抗性も評価した。

天然に存在するＣＣＲ５Δ３２変異を有する人は、ＨＩＶ感染と進行から防御されることが証明されている。例えば Samson et al. (1996) Nature 382:722-725 (1996); Huang (1996) Nat Med. 2:1240-1243 (1996); Berger et al. (1999) Annu. Rev. Immunol 17:657-700を参照のこと。対照実験でＣＣＲ５Δ３２がホモ接合性のドナーからのＣＤ４⁺Ｔ細胞を、ＣＣＲ５野生型ドナーからのＣＤ４⁺Ｔ細胞と指定された比率で混合し、ＨＩＶ−１_BALに暴露した。暴露後、平行のモック感染試料と比較してＣＣＲ５Δ３２ ＣＤ４ Ｔ細胞の約２倍の濃縮が観察された。

バルクＣＣＲ５−ＺＦＮ形質導入ＣＤ４⁺Ｔ細胞集団のＣＣＲ５向性ＨＩＶ−１_US1による感染も、１７日間の培養にわたって、ＺＦＮ破壊ＣＣＲ５対立遺伝子を含有する遺伝子編集細胞の２倍濃縮（上記のSurveyor（登録商標）ヌクレアーゼ（Ｃｅｌ−１）アッセイを使用して測定した））が得られ、モック感染対照集団はＺＦＮ破壊ＣＣＲ５対立遺伝子の安定なレベルを維持した（図１９）。平行実験でＨＩＶ−１_US1で暴露させたＣＣＲ５−ＺＦＮ形質導入細胞は、対照より有意に低いレベルの可溶性ｐ２４を産生し、これは集団中のＣＣＲ５破壊頻度と一致した。Ａｄ５／３５ＧＦＰ対照ベクターで形質導入したＣＤ４ Ｔ細胞は、そのＣＣＲ５遺伝子の検出可能な破壊を示さなかった。

すなわちＺＦＮ形質導入によりＣＣＲ５ヌルにされたＣＤ４⁺Ｔ細胞が、ＨＩＶ−１感染中に天然に存在するＣＣＲ５Δ３２対立遺伝子がホモ接合性のＣＤ４ Ｔ細胞と同様の効率で選択された。

実施例１７：初代ＣＤ４ Ｔ細胞中のＣＣＲ５−ＺＦＮの特異性
Ａ．２本鎖ブレーク
ＺＦＮ発現後に生成された２本鎖ブレーク（ＤＳＢ）の数を定量するために、我々は核内のＺＦＮ作用の偏りの無い尺度としてＰ５３ＢＰ１の免疫検出によりゲノム全体ＤＳＢの核内染色を行った。Ｐ５３ＢＰ１は修復応答の早期にＤＳＢの部位に動員され、ＮＨＥＪに必要である（Schultz et al. (2000) J Cell Biol. 151:1381-1390）。簡単に説明すると、ＣＣＲ５標的化ＺＦＮを発現するＡｄ５／３５ベクターでＣＤ４⁺Ｔ細胞を形質導入後の２４時間目に、ＣＤ４ Ｔ細胞の核当たりの５３ＢＰ１免疫反応性巣の数を測定した。

メタノール又はパラホルムアルデヒドで固定後０．５％トリトンで核浸透性化を使用して、Ｐ５３ＢＰ１の核内染色を行った。アフィニティ精製したウサギ抗Ｐ５３ＢＰ１（Bethel Laboratories）と２次Alexa Fluor（登録商標）４８８Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体をInvitrogenから得た。抗体は２〜５μｇ／ｍｌの最終濃度で使用した。開口数１．４のZeiss 63x Plan Apo対物レンズを有するZeiss Axioplan-II（Thornwood NY）を使用して、落射蛍光顕微鏡観察を行った。

Improvision Volocity（登録商標）ソフトウェアパッケージ（Lexington MA）取得及び分類モジュールを使用して、画像を取得し分析した。露出時間と閾値を調整して自己蛍光を最小にし、強度ゲーティングを上の４０％の蛍光を含むようにして、Ｐ５３ＢＰ１蛍光の不連続な領域の分析を行った。次に同定した個々の領域を数え測定した。ＤＡＰＩ蛍光で同時局在化された緑色の蛍光領域のみを最終解析に含めた。

結果を図２０に示す。非形質導入及びＺＦＮ２２４形質導入ＣＤ４ Ｔ細胞を比較すると、核内Ｐ５３ＢＰ１巣の平均数に有意差はなかった。これに対してエトポシド処理陽性対照細胞（ｐ＝０．００４）又はＺＦＮ２１５を発現するＡｄ５／３５ベクターで形質導入した細胞（ｐ＝０．００３）は、非形質導入細胞と比較するとＰ５３ＢＰ１核内巣の統計的に有意な上昇を示した。さらにすべての条件でＰ５３ＢＰ１巣の周囲の長さの平均有意差は観察されなかった。ＤＮＡ解析は、ＣＣＲ５遺伝子中の目的の標的部位でのＺＦＮ２１５とＺＦＮ２２４による切断の同等の程度を確認した。

Ｂ．コンセンサスＺＦＮ結合部位の測定
ＺＦＮ２２４作用の特異性を確認するために、コンセンサスＺＦＮ結合部位を測定し、ＣＣＲ５中のユニークな目的の標的配列と一致することがわかった。ＺＦＮ２２４を含む２つのジンクフィンガータンパク質のそれぞれの結合部位選択性を以下の部位選択法を使用して測定した：（１）まず、目的のＺＦＰのＨＡタグ体をＴｎＴクイック結合転写−翻訳システム（Promega）により発現させ、ビオチン化抗ＨＡ Ｆａｂ断片（Roche）及びポリｄＩｄＣ競合ＤＮＡ（Sigma）との存在下で、部分的ランダム化ＤＮＡ配列のプールとインキュベートした；（２）タンパク質（任意の生産的に結合したＤＮＡ配列とともに）をストレプトアビジン被覆磁性ビーズ（Dynal）上に捕捉した；（３）適切なプライマーを含有するRoche ＰＣＲマスターミックス中に磁性ビーズを入れ、次に結合ＤＮＡを放出させ、ＰＣＲ増幅した。次にこのＤＮＡの増幅プールを以後のラウンドのＺＦＰ結合、濃縮、及び増幅のための出発ＤＮＡプールとして使用した。工程（１）〜（３）を含むサイクルを全部で４回の選択ラウンドで繰り返した。最後のラウンド後に増幅されたＤＮＡ断片をクローン化し、配列決定した。各ＤＮＡ配列のランダム化領域を整列させて、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインについてコンセンサス結合部位配列を測定した。この方法により測定したコンセンサス結合部位は、表１で特定された結合部位と一致した。

上記したように測定したＺＦＮ２２４対（８１９６ｚと８２６６、表１）の２つのＣＣＲ５ＺＦＮの標的配列選択性を使用して、ヒトゲノム中の上の１５のオフ標的部位候補のゲノム全体のバイオインフォマティック予測を行った。このバイオインフォマティック分析は、以下のようにオフ標的部位候補を検索しランク付けした：

ＺＦＮ２２４対（８１９６ｚと８２６６、表１）の２つのメンバーのすべてのＤＮＡ結合部位候補を、上記のように測定した各標的部位のコンセンサス配列から最大２つの塩基対ミスマッチを考慮して、ヒトゲノム中で同定した。

任意の２つのＺＦＮがヌクレアーゼ活性の適切な配置（すなわち、間に５又は６ｂｐのスペースを置いてＤＮＡの向かい合う側で結合するＺＦＮ）で結合することを可能にする結合部位（前段落に記載したように同定される）の完全なリストを使用して、すべての可能な切断位置を同定した。

次に切断部位候補の得られたリストをランク付けして、上記の部位選択法により規定される各ＺＦＮのコンセンサスと最も高い類似性を有する部位を優先した。簡単に説明すると部位選択データを使用して、各ＺＦＮの結合部位の１２の位置のそれぞれにおける４つのすべてのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴ）の認識の確率を作成した。各推定ＺＦＮ結合部位を、これらの１２の確率の積としてスコア化した（ゼロのスコア又は確率を排除するために、確率表中でどの入力もゼロでは無いことを確実にするために標準化の前にすべての位置に各ヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴ）について１を加えた）。同様にあるオフターゲット切断部位のスコア（そのようなＺＦＮ部位の２つが占有される必要がある）は、推定切断部位を含む２つのＺＦＮ結合部位のそれぞれに与えられた２つのスコアの積として計算した。同定された１５の部位のうち７つは記載の遺伝子内に入り、これらの２つはエキソン配列内に入る。これらの７つの遺伝子は以下の特徴を共有する：（ｉ）これらの変異又は破壊は、公知の病理とは関連が無い；及び（ii）ＣＣＲ２を除いて、ＣＤ４ Ｔ細胞に記載されている機能が無い。

Surveyor（登録商標）ヌクレアーゼアッセイは、ＣＣＲ２（ヒトゲノム中でＣＣＲ５遺伝子に最も近い）を除いて、これらのいずれの部位でも検出可能なＺＦＮ活性を示さなかった（１％検出限界）。我々は、３５．６％のＺＦＮ改変ＣＣＲ５対立遺伝子を示す条件下で、集団中のＣＣＲ２対立遺伝子の４．１％修飾を観察した。しかしＣＣＲ２−／−マウスは主に遅延マクロファージ移動と動員（Peters et al. (2000) J. Immunol. 16:7072-7077）に関連する無数のゆるい表現型を示すため、ＣＤ４ Ｔ細胞中のＣＣＲ２の喪失は充分に許容される。ＣＣＲ２の変異対立遺伝子は、ＨＩＶ感染個体中のＡＩＤＳの遅延進展に相関しているが、ＨＩＶ−１感染の頻度に対する影響は観察されていない（Smith et al. (1997) Nat. Med. 3:1052-1053）。すなわちＣＣＲ２の平行変異が有害である可能性は低く、ＨＩＶ感染に対する修飾ＣＤ４ Ｔ細胞の防御を増強するかも知れない。

ゲノム中の最も類似しているオフターゲット部位のＺＦＰコンセンサス結合部位特異的分析と、ゲノム全体のＤＳＢ生成のための偏りの無い核内染色との組合せは、ＺＦＮ２２４がＣＣＲ５遺伝子でのみ測定可能な活性（ＣＣＲ５同族体であるＣＣＲ２では約１０倍低い）を有する高度に特異的な遺伝子操作されたヌクレアーゼであることを示す。

実施例１８：ＣＣＲ５−ＺＦＮ改変初代ＣＤ４ Ｔ細胞のインビボ選択
ＨＩＶ感染のＮＯＧ／ＳＣＩＤマウスモデルを使用して、インビボでＺＦＮ改変ＣＤ４ Ｔ細胞の養子免疫細胞移入とＨＩＶ感染からの防御を試験した。Schultz et al. (2007) Nat. Rev. Immunol. 7:118を参照のこと。

初代ＣＤ４⁺Ｔ細胞をＡｄ５／３５ベクターで形質導入し、ＩＬ−２の存在下で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁性ビーズを使用して培養で拡張した。ＮＯＧ／ＳＣＩＤマウス（７〜９週齢）をランダムに２処理群（１群当たりｎ＝８マウス）に割り当てて、各群でオスとメスを等しく混合した。これらのマウスを菌叢確定動物施設で維持した。両方の群に、７５０万個のＣＣＲ５−ＺＦＮエクスビボ拡張初代ヒトＣＤ４ Ｔ細胞と１００万個の休止自己由来ＰＢＭＣを含有する１００μｌのＰＢＳを腹腔内注射して、組合せの移植を促進した。さらにモック処理動物に１００万個の非感染ＰＨＡ活性化自己由来ＰＢＭＣを投与し、一方感染群の動物に、１００万個のＣＣＲ５向性ＨＩＶ−１_US1感染ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣを投与した。

移植を評価するために、養子免疫細胞移入の３週間後と４週間後に末梢血サンプリングを行い、ＣＤ４５、ＣＤ４、及びＣＤ８のフローサイトメトリーにより移植について分析した。４．５週間後マウスを屠殺し、脾臓ＣＤ４Ｔリンパ球をMiltenyi MACS分離キットを使用して精製した。７５％を超える純度を有する試料のみを最終分析に使用した。ＣＣＲ５破壊頻度を測定するために、ネステッドＰＣＲアプローチを使用して修飾Surveyor（登録商標）ヌクレアーゼアッセイを行って、混入マウスゲノムＤＮＡを完全に除去した。精製した脾臓ＣＤ４細胞からのＤＮＡを、まず５０ピコモルの外部プライマー（Ｒ５−ｄｅｔ−ｏｕｔ−Ｆｌ：ＣＴＧＣＣＴＣＡＴＡＡＧＧＴＴＧＣＣＣＴＡＡＧ（配列番号３１）；Ｃ５＿ＨＤＲ＿Ｒ：ＣＣＡＧＣＡＡＴＡＧＡＴＧＡＴＣＣＡＡＣＴＣＡＡＡＴＴＣＣ（配列番号３２））を使用して２５サイクル（９５℃−３０秒、５８℃−３０秒、及び６８℃−３分）増幅し、生じた物質をゲル精製し、精製産物について製造業者の薦めに従ってSurveyor（登録商標）ヌクレアーゼアッセイを行った。

インビボでＨＩＶ感染の１ヶ月後、マウスを屠殺し、脾臓から精製したヒトＣＤ４ Ｔリンパ球からのゲノムＤＮＡを、上記Surveyor（登録商標）ヌクレアーゼアッセイを使用してＺＦＮ介在ＣＣＲ５破壊を分析した。２匹のマウス（１匹はＨＩＶ感染、１匹はモック感染）からの試料は、ＣＤ４細胞精製が不充分であったため、分析から除外した。

すべての群が同等の移植を示したが、ＨＩＶ感染群はＣＤ４対ＣＤ８比が低下しており、ＨＩＶ感染ＣＤ４ Ｔ細胞枯渇に一致していた。

さらに図２１は、ＨＩＶ感染が無い場合のＺＦＮ処理ＣＤ４ Ｔ細胞の同じ出発集団を投与した動物（モック群、８．５％の平均ＣＣＲ５破壊、ｐ＝０．００８）と比較して、ＨＩＶ感染群は、ＺＦＰ破壊ＣＣＲ５対立遺伝子の約３倍の増強（２７．５％の平均ＣＣＲ５破壊）が観察されたことを示す。

これらのデータは、（ｉ）インビボでＨＩＶ−１の存在下でのＺＦＮ形質導入初代ヒトＣＤ４⁺Ｔ細胞の選択的利点と、（ii）この選択圧力の非存在下でさえ、これらの同じＺＦＮ形質導入細胞の正常な移植と増殖とを証明する。これらのデータは、遺伝子操作ＺＦＮの一過性送達により、ＣＣＲ５Δ３２ヌル遺伝子型（及びその結果生じる表現型）の再生に成功したことを示す。

すなわち本明細書に記載のＺＦＮはＣＣＲ５遺伝子内で特異的に切断し、初代ヒトＣＤ４⁺Ｔ細胞のバルク集団においてＣＣＲ５対立遺伝子の５０％を超える永久的破壊を引き起こす。さらにＺＦＮによるＣＣＲ５の遺伝子破壊は、インビトロとインビボでＨＩＶ−１感染に対して強固で安定かつ遺伝可能な防御を提供する。ＺＦＮ改変ＣＤ４ Ｔ細胞は、刺激により移植され正常に増殖する。

Claims (18)

1. ホスホジエステル結合の酵素的加水分解を行う切断ドメインと、遺伝子操作されたジンクフィンガータンパク質ＤＮＡ結合ドメインとを含み、ＣＣＲ−５遺伝子に特異的に結合する、融合タンパク質であって、当該ＤＮＡ結合ドメインが、Ｎ末端からＣ末端の順にＦ１からＦ４と名付けられた４のジンクフィンガー認識領域を含み、ここでＦ１〜Ｆ４が、以下の：
   Ｆ１：ＲＳＤＮＬＳＶ（配列番号１０）
   Ｆ２：ＱＫＩＮＬＱＶ（配列番号１７）
   Ｆ３：ＲＳＤＶＬＳＥ（配列番号１２）
   Ｆ４：ＱＲＮＨＲＴＴ（配列番号１３）
   である、前記融合タンパク質。
2. 前記切断ドメインが、切断半ドメインである、請求項１に記載のタンパク質。
3. 前記切断半ドメインが、野生型ＦｏｋＩ切断半ドメインである、請求項１又は２に記載のタンパク質。
4. 前記切断半ドメインが、遺伝子操作されたＦｏｋＩ切断半ドメインである、請求項３に記載のタンパク質。
5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
6. 請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む、遺伝子送達ベクター。
7. 前記ベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項６に記載の遺伝子デリバリーベクター。
8. 前記アデノウイルスベクターが、Ａｄ５／３５ベクターである、請求項７に記載の遺伝子デリバリーベクター。
9. 請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質又は請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む、単離された細胞。
10. 前記細胞が、造血幹細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、及び抗原提示細胞からなる群から選択される、請求項９に記載の細胞。
11. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ４⁺細胞である、請求項１０に記載の細胞。
12. 前記細胞が、Ｋ５６２細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＭ−１細胞、ＴＨＰ−１細胞、及びＧＨＯＳＴ細胞からなる群から選択される、請求項１０に記載の細胞。
13. エクス・ビボで、ヒト細胞においてＣＣＲ−５遺伝子を不活性化する方法であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質；請求項５に記載のポリヌクレオチド、又は請求項６〜８のいずれか一項に記載の遺伝子送達ベクターを、当該細胞に投与することを含む、前記方法。
14. 前記細胞が、造血幹細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、及び抗原提示細胞からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
15. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ４⁺細胞である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記細胞が、Ｋ５６２細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＭ−１細胞、ＴＨＰ−１細胞、及びＧＨＯＳＴ細胞からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
17. 対象においてＨＩＶ感染を治療または予防するために有用な細胞を製造する方法であって、当該方法が、請求項１３に記載の方法に従って細胞においてＣＣＲ５遺伝子を不活性化することを含む、前記方法。
18. 請求項１７に記載の方法により製造された細胞。