ES2337027T3 - Nuevo metodo de clonacion de dna basado en el sistema de recombinacion rece-rect de e. coli. - Google Patents
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Abstract
Un método para la clonación de moléculas de DNA en células, que comprende los pasos de (a) proporcionar una célula huésped aislada capaz de realizar la recombinación homóloga mediante un mecanismo dependiente de recET, (b) poner en contacto en la mencionada célula huésped una primera molécula de DNA circular, capaz de ser replicada en la mencionada célula huésped, con una segunda molécula de DNA que comprende al menos dos regiones de homología de secuencia para regiones de la primera molécula de DNA, en condiciones que favorecen la recombinación homóloga entre las mencionadas moléculas primera y segunda de DNA mediante un mecanismo dependiente de recET y (c) seleccionar una célula huésped aislada en la que ha ocurrido la recombinación homóloga entre las mencionadas moléculas primera y segunda de DNA, en el cual una segunda molécula de DNA se introduce en la célula huésped de una forma que permite la recombinación sin modificación ulterior, con la condición de que la célula huésped no sea una célula madre embrionaria humana o una célula de una línea germinal humana.
Description
Nuevo método de clonación de DNA basado en el
sistema de recombinación recE-recT de E.
coli.
La invención hace referencia a un nuevo método
para la clonación de moléculas de DNA utilizando un mecanismo de
recombinación homóloga entre al menos dos moléculas de DNA. Además,
se proporcionan nuevos estuches de reactivos adecuados para la
clonación de DNA.
Los métodos actuales para clonación de DNA
extraño en células bacterianas comprenden usualmente los pasos de
proporcionar un vector bacteriano adecuado, escindir dicho vector
con una enzima de restricción e insertar in vitro un
fragmento de DNA extraño en dicho vector. Los vectores recombinantes
resultantes se utilizan luego para transformar bacterias. Aunque
tales métodos de clonación se han utilizado satisfactoriamente desde
hace aproximadamente 20 años, presentan varios inconvenientes.
Estos inconvenientes son, en particular, que los pasos in
vitro requeridos para insertar DNA extraño en un vector son a
menudo muy complicados y requieren mucho tiempo, si no están
disponibles sitios de restricción adecuados en el DNA extraño o el
vector.
Adicionalmente, los métodos actuales están
basados usualmente en la presencia de sitios de escisión por enzimas
de restricción adecuadas en el vector en el cual se inserta el
fragmento de DNA extraño. Esto impone dos limitaciones en el
producto de clonación final. En primer lugar, el fragmento de DNA
extraño puede insertarse usualmente sólo en el vector en la
posición de un sitio o sitios de restricción de este tipo. Así, el
producto de clonación está limitado por la disposición de sitios de
restricción adecuados y la clonación en regiones del vector en las
cuales no existe un sitio de restricción adecuado es difícil y a
menudo imprecisa. En segundo lugar, dado que los sitios de
restricción tienen típicamente una longitud de 4 a 8 pares de bases,
los mismos se presentan un número múltiple de veces a medida que
aumenta el tamaño de las moléculas de DNA que se utilizan. Esto
representa una limitación práctica para el tamaño de las moléculas
de DNA que pueden manipularse por la mayoría de las técnicas de
clonación actuales. En particular, los tamaños mayores de DNA
clonados en vectores tales como cósmidos, BACs, PACs y P1s son
tales que usualmente es imposible en la práctica manipularlos
directamente por técnicas basadas en enzimas de restricción. Por
esta razón, existe necesidad de proporcionar un nuevo método de
clonación, del cual se hayan eliminado al menos en parte los
inconvenientes de la técnica anterior.
De acuerdo con la presente invención, se ha
encontrado que un mecanismo de recombinación homóloga eficiente
entre dos moléculas de DNA tiene lugar a frecuencias utilizables en
una célula huésped bacteriana que es capaz de expresar los
productos de los genes recE y recT o genes funcionalmente afines
tales como los genes red\alpha y red\beta, o el sistema de
recombinación del fago P22 (Kolod-ner et al.,
Mol. Microbiol. 11 (1994) 23-30; Fenton, A.C. y
Poteete, A.R., Virology 34 (1984) 148-160; Poteete,
A.R. y Fenton, A.C., Virology 134 (1984) 161-167.
Este nuevo método de clonación de fragmentos de DNA se denomina
"clonación ET".
La identificación y caracterización de las
proteínas RecE y RecT de E. coli ha sido descrita por Gillen
et al. (J. Bacteriol. 145 (1981), 521-532) y
Hall et al. (J. Bacteriol. 175 (1993),
277-287). Hall y Kolodner (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 91 (1994) 3205-3209) describen el apareamiento
homólogo in vitro y el intercambio de cadenas de DNA
bicatenario lineal y DNA monocatenario circular homólogo promovidos
por la proteína RecT. En dichos lugares no puede encontrarse
referencia alguna al uso de este método para la clonación de
moléculas de DNA en células.
El camino recET de recombinación genética en
E. coli es conocido (Hall y Kolodner (1994), supra;
Gillen et al. (1981), supra). Este camino requiere la
expresión de dos genes, recE y recT. La secuencia de DNA de estos
genes ha sido publicada (Hall et al., supra). La proteína
RecE es similar a proteínas de bacteriófago, tales como \lambda
exo o \lambda Red\alpha (Gillen et al., J. Mol. Biol. 113
(1977), 27-41; Little, J. Biol. Chem. 242 (1967),
679-686; Radding y Carter, J. Biol. Chem. 246
(1971), 2513-2518; Joseph y Kolodner, J. Biol. Chem.
258 (1983), 10418-10424. La proteína RecT es
similar a proteínas de bacteriófago, tales como \lambda
\beta-proteína o \lambda Rec\beta (Hall et
al. (1993), supra; Muniyappa y Radding, J. Biol. Chem.
261 (1996), 7472-7478; Kmiec y Hollomon, J. Biol.
Chem. 256 (1981), 12636-12639). El contenido de los
documentos citados anteriormente se incorpora en esta memoria por
referencia.
Oliner et al. (Nucl. Acids Res. 21
(1993), 5192-5197 describen la clonación in
vivo de productos PCR en E. coli por recombinación
homóloga intermolecular entre un producto lineal de PCR y un vector
de plásmido linealizado. Otros intentos previos para desarrollar
nuevos métodos de clonación basados en recombinación homóloga en
procariotas, asimismo, se basaban en el uso de enzimas de
restricción para linealizar el vector (Bubeck et al., Nucleic
Acids Res. 21 (1993), 3601-3602; Oliner et
al., Nucleic Acids Res. 21 (1993), 5192-5197;
Degryse, Gene 170 (1996), 45-50) o en el sistema de
recombinación dependiente de recA específico del huésped (Hamilton
et al., J. Bacteriol. 171 (1989), 4617-4622;
Yang et al., Nature Biotech. 15 (1997),
859-865; Dabert y Smith, Genetics 145 (1997),
877-889). Estos métodos son de aplicabilidad muy
limitada y se utilizan escasamente en la práctica.
El nuevo método de clonación de DNA de acuerdo
con la presente invención no requiere tratamientos in vitro
con enzimas de restricción o DNA-ligasas, y por
consiguiente es fundamentalmente distinto de las metodologías
estándar de clonación de DNA. El método está basado en un camino de
recombinación homóloga en E. coli que implica los productos
de los genes recE y recT, o los productos de los genes red\alpha y
red\beta, o productos de genes funcionalmente equivalentes. El
método combina covalentemente un fragmento de DNA preferiblemente
lineal y preferiblemente extracromosómico, el fragmento de DNA a
clonar, con una segunda molécula vectora de DNA preferiblemente
circular, sea un episoma o el cromosoma o cromosomas
endógeno(s) del huésped. Por consiguiente, dicho método es
distinto de las descripciones previas de clonación en E. coli
por recombinación homóloga que están basadas en el uso de dos
fragmentos de DNA lineales o caminos de recombinación
diferentes.
La presente invención proporciona un camino
flexible para utilizar recombinación homóloga a fin de diseñar
grandes moléculas de DNA que incluyen un plásmido intacto >76 kb
y el cromosoma de E. coli. Así, prácticamente no hay
limitación alguna de elección de la diana, de acuerdo con el tamaño
o el sitio. Por consiguiente, cualquier DNA receptor en una célula
huésped, desde un plásmido de copias altas al genoma, es susceptible
de alteración precisa. Además del diseño por ingeniería genética de
grandes moléculas de DNA, la invención reseña nuevos métodos
independientes de las enzimas de restricción para el diseño de DNA.
Por ejemplo, deleciones entre dos pares de bases seleccionados
cualesquiera en un episoma diana pueden realizarse por elección de
ramas de homología de oligonucleótidos. Análogamente, pueden
insertarse secuencias de DNA seleccionadas en un par de bases
seleccionado para crear, por ejemplo, marcos de lectura de proteínas
alterados. Combinaciones concertadas de inserciones y deleciones,
así como mutaciones puntuales, son también posibles. La aplicación
de estas estrategias es particularmente relevante para
construcciones de DNA complejas o difíciles, por ejemplo, las
propuestas para recombinaciones homólogas en células eucariotas, v.
g. células madre de embrión de ratón. Adicionalmente, la presente
invención proporciona un camino simple para posicionar sitios diana
de recombinación específica de sitio exactamente donde se desee.
Esto simplificará las aplicaciones de recombinación específica de
sitio en otros sistemas vivos, tales como plantas y ratones.
Una materia objeto de la presente invención es
un método para la clonación de moléculas de DNA en células
procariotas que comprende los pasos de:
- a)
- proporcionar una célula huésped aislada procariota capaz de expresar genes recE y recT y capaz de realizar recombinación homóloga por la vía de un mecanismo dependiente de RecET,
- b)
- poner en contacto en dicha célula huésped una primera molécula de DNA circular que es capaz de replicarse en dicha célula huésped con una segunda molécula de DNA que comprende al menos dos regiones de homología de secuencia para regiones de la primera molécula de DNA, en condiciones que favorecen la recombinación homóloga entre dichas moléculas de DNA primera y segunda, por la vía de un mecanismo dependiente de RecET y
- c)
- seleccionar una célula huésped aislada en la cual ha ocurrido la recombinación homóloga entre dichas moléculas de DNA primera y segunda, con la condición de que la célula huésped no sea una célula madre embrionaria humana o una célula de una línea germinal humana.
En el método de la presente invención, la
recombinación homóloga ocurre por la vía de un mecanismo dependiente
de recET, es decir la recombinación homóloga está mediada por los
productos génicos de los genes recE y recT que se seleccionan
preferentemente de los genes de E. coli recE y recT o genes
funcionalmente afines tales como los genes red\alpha y red\beta
del fago \lambda.
La célula huésped aislada adecuada para el
método de la presente invención es una célula bacteriana, v. g. una
célula bacteriana gram-negativa. Más
preferiblemente, la célula huésped es una célula enterobacteriana,
tal como Salmonella, Klebsiella o Escherichia. Muy preferiblemente,
la célula huésped es una célula de Escherichia coli. Debe
indicarse, sin embargo, que el método de clonación de la presente
invención es adecuado también para células eucariotas, tales como
células de hongos, plantas o animales, con la condición de que la
célula animal no sea una célula madre embrionaria humana o una
célula de una línea germinal humana.
Preferiblemente, la célula huésped aislada
utilizada para recombinación homóloga y propagación del DNA clonado
puede ser cualquier cepa bacteriana en la cual se expresan los
productos de los genes recE y recT, o red\alpha y red\beta. La
célula huésped puede comprender los genes recE y recT localizados en
el cromosoma de la célula huésped o en DNA no cromosómico,
preferiblemente en un vector, v. g. un plásmido. En un caso
preferido, los productos de los genes RecE y RecT, o Red\alpha y
Red\beta, se expresan a partir de dos promotores regulables
diferentes, tales como el promotor BAD inducible por arabinosa o el
promotor lac, o a partir de promotores no regulables.
Alternativamente, los genes recE y recT, o red\alpha y red\beta,
se expresan en un mRNA policistrónico a partir de un solo promotor
regulable o no regulable. Preferiblemente, la expresión está
controlada por promotores regulables.
Es también especialmente preferida una
realización, en la cual el gen recE o red\alpha es expresado por
un promotor regulable. Así, el potencial recombinogénico del sistema
se suscita únicamente cuando se requiere y, en otros momentos, las
posibles reacciones de recombinación no deseadas están limitadas. El
gen recT o red\beta, por otra parte, está sobreexpresado
preferiblemente con respecto a recE o red\alpha. Esto puede
realizarse por utilización de un promotor constitutivo fuerte, v. g.
el promotor EM7 y/o por utilización de un número de copias más
elevado de los genes recT, o red\beta, en comparación con recE, o
red\alpha.
Para el propósito de la presente invención,
cualesquiera genes recE y recT son adecuados en la medida en que
los mismos permiten una recombinación homóloga de moléculas primera
y segunda de DNA con eficiencia suficiente para dar lugar a
productos de recombinación en más de 1 en 10^{9} células
transfectadas con DNA. Los genes recE y recT pueden derivarse de
cualquier cepa bacteriana o de bacteriófagos, o pueden ser mutantes
y variantes de los mismos. Se prefieren genes recE y recT que se
derivan de E. coli o de bacteriófagos de E. coli,
tales como los genes red\alpha y red\beta procedentes de fagos
lambdoides, v. g. el bacteriófago \lambda.
Más preferiblemente, el gen recE o red\alpha
se selecciona de una molécula de ácido nucleico que comprende
(a) la secuencia de ácido nucleico desde la
posición 1320 (ATG) a 2159 (GAC) como se representa en Fig. 7B,
(b) la secuencia de ácido nucleico desde la
posición 1320 (ATG) a 1998 (CGA) como se representa en Fig. 14B,
(c) un ácido nucleico que codifica el mismo
polipéptido dentro de la degeneración del código genético y/o
(d) una secuencia de ácido nucleico que se
hibrida en condiciones severas con la secuencia de ácido nucleico de
(a), (b) y/o (c).
\vskip1.000000\baselineskip
Más preferiblemente, el gen recT o red\beta se
selecciona de una molécula de ácido nucleico que comprende:
(a) la secuencia de ácido nucleico desde la
posición 2155 (ATG) a 2961 (GAA) como se representa en Fig. 7B,
(b) la secuencia de ácido nucleico desde la
posición 2086 (ATG) a 2868 (GCA) como se representa en Fig. 14B,
(c) un ácido nucleico que codifica el mismo
polipéptido dentro de la degeneración del código genético y/o
(d) una secuencia de ácido nucleico que se
hibrida en condiciones severas con las secuencias de ácido nucleico
de (a), (b) y/o (c).
\vskip1.000000\baselineskip
Debe indicarse que la presente invención abarca
también mutantes y variantes de las secuencias dadas, v. g.
mutantes y variantes existentes naturalmente o mutantes y variantes
obtenidos(as) por ingeniería genética. Adicionalmente, debe
indicarse que el gen recE representado en Fig. 7B es un gen ya
truncado que codifica los aminoácidos 588-866 de la
proteína nativa. Los mutantes y variantes tienen preferiblemente una
identidad de secuencia nucleotídica de al menos 60%,
preferiblemente de al menos 70% y más preferiblemente de al menos
80% de las secuencias de recE y recT representadas en Fig. 7B y 13B,
y de las secuencias red\alpha y red\beta representadas en Fig.
14B.
De acuerdo con la presente invención, la
hibridación en condiciones severas se define preferiblemente de
acuerdo con Sambrook et al. (1989), infra, y comprende una
señal de hibridación detectable después de lavado durante 30
minutos en 0,1 x SSC, 0,5% SDS a 55ºC, preferiblemente a 62ºC y más
preferiblemente a 68ºC.
En un caso preferido, los genes recE y recT se
derivan de los genes endógenos correspondientes presentes en la
cepa K12 de E. coli, y sus derivados, o de bacteriófagos. En
particular, son adecuadas cepas que llevan la mutación sbcA.
Ejemplos de tales cepas son JC8679 y JC9604 (Gillen et al.
(1981), supra). Alternativamente, los genes correspondientes
pueden obtenerse también a partir de otros colifagos tales como
fagos lambdoides o el fago P22.
El genotipo de JC 8679 y JC 9604 es Sex (Hfr,
F+, F-, o F'): F-.JC 8679 comprende las mutaciones: recBC 21, recC
22, sbcA 23, thr-1, ara-14, leu B 6,
DE(gpt-proA) 62, lacY1,
tsx-33, gluV44 (AS), galK2 (Oc), LAM-,
his-60, relA 1, rps L31 (strR), xyl A5,
mtl-1, argE3 (Oc) y thi-1. JC 9604
comprende las mismas mutaciones y adicionalmente la mutación recA
56.
Adicionalmente, debe indicarse que los genes
recE y recT, o red\alpha y red\beta, pueden aislarse a partir
de una primera fuente donante, v. g. una célula donante bacteriana y
transformarse en una segunda fuente receptora, v. g. una célula
receptora bacteriana o eucariota en la cual se expresan aquéllos por
medios de DNA recombinante.
En una realización de la invención, la célula
huésped utilizada es una cepa bacteriana que tiene una mutación
sbcA, v. g., una de las cepas de E. coli JC 8679 y JC 9604
mencionadas anteriormente. Sin embargo, el método de la invención
no está limitado a células huésped que tengan una mutación sbcA o
células análogas. Sorprendentemente, se ha encontrado que el método
de clonación de la invención funciona también en células sin la
mutación sbcA, sea células recBC+ o recBC-, v. g. también en
células huésped procariotas recBC+, v. g. en células recBC+ de
E. coli. En tal caso, se usan preferiblemente aquellas
células huésped en las cuales se expresa el producto de un gen
inhibidor de exonucleasa de tipo recBC. Preferiblemente, el
inhibidor de exonucleasa es capaz de inhibir el sistema recBC del
huésped o un equivalente del mismo. Un ejemplo adecuado de un gen
inhibidor de exonucleasa de este tipo es el gen red\gamma de
\lambda (Murphy, J. Bacteriol. 173 (1991),
5808-5821) y equivalentes funcionales del mismo,
respectivamente, que se pueden obtener, por ejemplo, a partir de
otros colifagos tales como el fago P22 (Murphy, J. Biol. Chem. 269
(1994), 22507-22516).
Más preferiblemente, el gen inhibidor de
exonucleasa se selecciona de una molécula de ácido nucleico que
comprende
(a) la secuencia de ácido nucleico desde la
posición 3588 (ATG) a 4002 (GTA) como se representa en Fig. 14A,
(b) un ácido nucleico que codifica el mismo
polipéptido dentro de la degeneración del código genético y/o
(c) una secuencia de ácido nucleico que se
hibrida en condiciones severas (como se han definido anteriormente)
con la secuencia de ácido nucleico de (a) y/o (b).
\vskip1.000000\baselineskip
Sorprendentemente, se ha encontrado que la
expresión de un gen inhibidor de exonucleasa en ambas cepas recBC+ y
recBC- conduce a una mejora significativa de la eficiencia de
clonación.
El método de clonación de acuerdo con la
presente invención emplea una recombinación homóloga entre una
primera molécula circular de DNA y una segunda molécula de DNA. La
primera molécula de DNA puede ser cualquier molécula de DNA que
lleve un origen de replicación que es operativo en la célula
huésped, v. g. un origen de replicación de E. coli.
Adicionalmente, la primera molécula de DNA está presente en una
forma que es capaz de replicarse en la célula huésped. La primera
molécula de DNA, es decir, el vector, puede ser cualquier molécula
de DNA extracromosómico que contenga un origen de replicación que
es operativo en dicha célula huésped, v. g. un plásmido con
inclusión de plásmidos de número de copias único, bajo, medio o
alto, u otras moléculas de DNA circular extracromosómicas basadas
en tecnología de cósmidos o vectores P1, BAC o PAC. Ejemplos de
tales vectores han sido descritos, por ejemplo, por Sambrook et
al. (Molecular Cloning, Laboratory Manual, 2ª Edición (1989),
Cold Spring Harbor Laboratory Press) y Ioannou et al. (Nature
Genet. 6 (1994), 84-89) o las referencias citadas
en dicho lugar. La primera molécula de DNA puede ser también un
cromosoma de la célula huésped, particularmente el cromosoma de
E. coli. Preferiblemente, la primera molécula de DNA es una
molécula de DNA bicatenario.
La segunda molécula de DNA es preferiblemente
una molécula de DNA lineal y comprende al menos dos regiones de
homología de secuencia, preferiblemente de identidad de secuencia
para regiones de la primera molécula de DNA. Estas regiones de
homología o identidad son preferiblemente al menos de 15 nucleótidos
cada una, más preferiblemente al menos de 20 nucleótidos y, muy
preferiblemente, al menos de 30 nucleótidos cada una. Se obtuvieron
resultados especialmente satisfactorios cuando se utilizaron
regiones de homología de secuencia que tenían una longitud de
aproximadamente 40 nucleótidos o más, v. g. 60 nucleótidos o más.
Las dos regiones de homología de secuencia pueden estar localizadas
en el fragmento de DNA lineal de tal modo que una se encuentra en
un extremo y la otra se encuentra en el otro extremo; sin embargo,
las mismas pueden también estar localizadas internamente. De modo
preferible, también la segunda molécula de DNA es una molécula de
DNA bicatenario.
Las dos regiones de homología de secuencia se
seleccionan de acuerdo con el diseño experimental. No existe
limitación alguna en cuanto a qué regiones de la primera molécula de
DNA pueden seleccionarse para las dos regiones de homología de
secuencia localizadas en la segunda molécula de DNA, excepto que el
suceso de recombinación homóloga no puede delecionar el origen de
replicación de la primera molécula de DNA. Las regiones de homología
de secuencia pueden estar interrumpidas por regiones de secuencia
no idéntica con tal que se retenga una homología de secuencia
suficiente para la reacción de recombinación homóloga. Por la
utilización de ramas de homología de secuencia que tengan regiones
de secuencia no idéntica comparadas con el sitio diana, pueden
introducirse mutaciones tales como sustituciones, v. g. mutaciones
puntuales, inserciones y/o deleciones en el sitio diana por
clonación ET.
La segunda molécula de DNA extraño que va a
clonarse en la célula bacteriana puede derivarse de cualquier
fuente. Por ejemplo, la segunda molécula de DNA puede sintetizarse
por una reacción de multiplicación de ácido nucleico tal como una
PCR en la cual ambos oligonucleótidos de DNA utilizados para iniciar
la multiplicación contienen además de secuencias en los extremos 3'
que sirven como iniciador para la multiplicación, una u otra de las
dos regiones de homología. Utilizando oligonucleótidos de este
diseño, el producto de DNA de la multiplicación puede ser cualquier
secuencia de DNA adecuada para multiplicación y tendrá
adicionalmente una región de homología de secuencia en cada
extremo.
Un ejemplo específico de la generación de la
segunda molécula de DNA es la multiplicación de un gen que sirve
para transmitir una diferencia fenotípica a las células huésped
bacterianas, en particular, resistencia a antibióticos. Una
variación simple de este procedimiento implica el uso de
oligonucleótidos que incluyen otras secuencias además de la
secuencia del iniciador de la PCR y la región de homología de
secuencia. Una variación simple adicional es el uso de más de dos
iniciadores de la multiplicación para generar el producto de
multiplicación. Una variación simple adicional es el uso de más de
una reacción de multiplicación para generar el producto de
multiplicación. Una operación adicional es el uso de fragmentos de
DNA obtenidos por métodos distintos de la PCR, por ejemplo, por
escisión con endonucleasas o enzimas de restricción para linealizar
fragmentos a partir de cualquier fuente de DNA.
Debe indicarse que la segunda molécula de DNA no
es necesariamente una especie simple de molécula de DNA. Por
supuesto, es posible utilizar una población heterogénea de segundas
moléculas de DNA, v. g. para generar una genoteca de DNA, tal como
una genoteca genómica o genoteca de cDNA.
El método de la presente invención puede
comprender la puesta en contacto de las moléculas de DNA primera y
segunda in vivo. En una realización de la presente invención,
el segundo fragmento de DNA se transforma en una cepa bacteriana
que aloja ya la primera molécula de DNA vector. En una realización
diferente, la segunda molécula de DNA y la primera molécula de DNA
se mezclan juntas in vitro antes de la
co-transformación en la célula huésped bacteriana.
Estas dos realizaciones de la presente invención se representan
esquemáticamente en Fig. 1. El método de transformación puede ser
cualquier método conocido en la técnica (v. g. Sambrook et al.
supra). Sin embargo, el método de transformación o
co-transformación preferido, es la
electroporación.
Después de la puesta en contacto de las
moléculas de DNA primera y segunda en condiciones que favorecen la
recombinación homóloga entre las moléculas de DNA primera y segunda
por la vía del mecanismo de clonación ET se selecciona una célula
huésped, en la cual ha ocurrido recombinación homóloga entre dichas
moléculas de DNA primera y segunda. Este procedimiento de selección
puede llevarse a cabo por varios métodos diferentes. A continuación
se representan tres métodos de selección preferidos en la Fig. 2, y
se describen en detalle más
adelante.
adelante.
En un primer método de selección, se emplea un
segundo fragmento de DNA que lleva un gen para un marcador situado
entre las dos regiones de homología de secuencia en las cuales es
detectable la recombinación homóloga por expresión del gen
marcador. El gen marcador puede ser un gen para un marcador
fenotípico que no se expresa en el huésped o a partir de la primera
molécula de DNA. Después de la recombinación por clonación ET, el
cambio en fenotipo de la cepa huésped transmitido por la
adquisición estable del segundo fragmento de DNA identifica el
producto de la clonación ET.
En un caso preferido, el marcador fenotípico es
un gen que transmite la resistencia a un antibiótico, en particular,
genes que transportan resistencia a kanamicina, ampicilina,
cloranfenicol, tetraciclina o cualquier otra sustancia que exhiba
efectos bactericidas o bacteriostáticos en la cepa bacteriana
empleada.
Una variación simple es el uso de un gen que
complementa una deficiencia presente en la cepa huésped bacteriana
empleada. Por ejemplo, la cepa huésped puede estar mutada de tal
modo que sea incapaz de crecimiento sin un suplemento metabólico.
En ausencia de este suplemento, un gen en el segundo fragmento de
DNA puede complementar el efecto mutacional permitiendo de este
modo el crecimiento. Únicamente crecerán aquellas células que
contienen el episoma portador de la transposición de DNA deseada
causada por el paso de clonación ET.
En otro ejemplo, la cepa huésped lleva un gen
marcador fenotípico que está mutado de tal modo que uno de sus
codones es un codón de parada que trunca el marco de lectura
abierto. La expresión de la proteína de longitud total a partir de
este gen marcador fenotípico requiere la introducción de un gen
supresor de tRNA que, una vez expresado, reconoce el codón de
parada y permite la traducción del marco de lectura abierto total.
El gen de tRNA supresor es introducido por el paso de clonación ET
y los recombinantes satisfactorios se identifican por selección
para, o identificación de, la expresión del gen marcador fenotípico.
En estos casos, únicamente crecerán aquellas células que contienen
la transposición de DNA deseada causada por el paso de clonación
ET.
Una variación simple adicional es el uso de un
gen informador que transmite un cambio fácilmente detectable en el
color o la morfología de la colonia. En un caso preferido, puede
utilizarse la proteína de fluorescencia verde (GFP), y las colonias
que llevan el producto de la clonación ET pueden identificarse por
las emisiones de fluorescencia de GFP. En otro caso preferido,
puede utilizarse el gen lacZ y las colonias que llevan el producto
de la clonación ET se pueden identificar por un color azul de la
colonia cuando se añade X-gal al medio de
cultivo.
En un segundo método de selección, la inserción
del segundo fragmento de DNA en la primera molécula de DNA por la
clonación ET altera la expresión de un marcador presente en la
primera molécula de DNA. En esta realización, la primera molécula
de DNA contiene al menos un gen marcador entre las dos regiones de
homología de secuencia y la recombinación homóloga puede detectarse
por una expresión alterada, v. g. la falta de expresión del gen
marcador.
En una aplicación preferida, el marcador
presente en la primera molécula de DNA es un producto de un gen
contra-seleccionable, tal como los genes sacB,
ccdB, o de resistencia a la tetraciclina. En estos casos, las
células bacterianas que llevan la primera molécula de DNA no
modificada por el paso de clonación ET después de la transformación
con el segundo fragmento de DNA, o co-transformación
con el segundo fragmento de DNA y la primera molécula de DNA, se
cultivan sobre un medio de tal modo que la expresión del marcador
contra-seleccionable transmite un efecto tóxico o
bacteriostático al huésped. Únicamente crecerán aquellas células
bacterianas que contienen la primera molécula de DNA que lleva la
transposición de DNA deseada causada por el paso de clonación
ET.
En otra aplicación preferida, la primera
molécula de DNA lleva un gen informador que transmite un cambio
fácilmente detectable en el color o la morfología de la colonia. En
un caso preferido, puede estar presente la proteína de
fluorescencia verde (GFP) en la primera molécula de DNA y las
colonias que llevan la primera molécula de DNA con o sin el
producto de la clonación ET pueden distinguirse por diferencias en
las emisiones de fluorescencia de GFP. En otro caso preferido,
puede estar presente el gen lacZ en la primera molécula de DNA y las
colonias que llevan la primera molécula de DNA con o sin el
producto de la clonación ET pueden identificarse por un color de
colonia azul o blanco cuando se añade X-gal al medio
de cultivo.
En un tercer método de selección, la integración
del segundo fragmento de DNA en la primera molécula de DNA por la
clonación ET elimina un sitio diana para una recombinasa específica
de sitio, denominada aquí RT (por recombinasa diana) presente en la
primera molécula de DNA entre las dos regiones de homología de
secuencia. Un suceso de recombinación homóloga puede ser detectado
por la eliminación del sitio diana.
En ausencia del producto de la clonación ET, la
RT está disponible para uso por la recombinasa específica de sitio
correspondiente. La diferencia entre la presencia o no de esta RT es
la base para la selección del producto de la clonación ET. En
presencia de esta RT y de la recombinasa específica de sitio
correspondiente, la recombinasa específica de sitio media la
recombinación en esta RT y cambia el fenotipo del huésped de tal
manera que éste no es capaz de crecer, o bien presenta un fenotipo
fácilmente observable. En ausencia de esta RT, la recombinasa
específica de sitio correspondiente no es capaz de mediar la
recombinación.
En un caso preferido, la primera molécula de DNA
a la cual se dirige el segundo fragmento de DNA, contiene dos RTs,
una de las cuales es adyacente a, pero no forma parte de, un gen de
resistencia a los antibióticos. El segundo fragmento de DNA está
dirigido, por diseño, para eliminar esta RT. Después de exposición a
la recombinasa específica de sitio correspondiente, aquellas
moléculas del primer DNA que no llevan el producto de la clonación
ET se someterán a una reacción de recombinación específica de sitio
entre las RTs que eliminan el gen de resistencia a los antibióticos
y por consiguiente la primera molécula de DNA ya no transmitirá la
resistencia al antibiótico correspondiente. Únicamente aquellas
primeras moléculas de DNA que contienen el producto de la clonación
ET, o que han fracasado en la recombinación específica de sitio por
cualquier otra razón, transmitirán la resistencia al
antibiótico.
En otro caso preferido, la RT a eliminar por la
clonación ET del segundo fragmento de DNA es adyacente a un gen que
complementa una deficiencia presente dentro de la cepa huésped
empleada. En otro caso preferido, la RT a eliminar por la clonación
ET del segundo fragmento de DNA es adyacente a un gen informador que
transmite un cambio fácilmente detectable en el color o la
morfología de la colonia.
En otro caso preferido, la RT a eliminar por la
clonación ET del segundo fragmento de DNA se encuentra en cualquier
parte en una primera molécula de DNA episómico y el episoma
transporta un origen de replicación incompatible con la
supervivencia de la célula huésped bacteriana si el mismo se integra
en el genoma del huésped. En este caso, el genoma del huésped lleva
una segunda RT, que puede ser o no una RT mutada de tal manera que
la recombinasa específica de sitio correspondiente puede integrar el
episoma, por la vía de su RT, en la RT situada en el genoma
huésped. Otras RTs preferidas incluyen RTs para recombinasas
específicas de sitio de la clase de las resolvasas/transposasas.
Las RTs incluyen aquéllas descritas por ejemplos existentes de
recombinación específica de sitio, así como variaciones naturales o
mutadas de las mismas.
Las recombinasas específicas de sitio preferidas
incluyen Cre, FLP, Kw o cualquier recombinasa específica de sitio
de la clase de las integrasas. Otras recombinasas específicas de
sitio preferidas incluyen recombinasas específicas de sitio de la
clase de las resolvasas/transposasas.
No existe limitación alguna en cuanto al método
de expresión de la recombinasa específica de sitio en la célula
huésped. En un método preferido, la expresión de la recombinasa
específica de sitio se regula de tal manera que la expresión puede
inducirse y extinguirse de acuerdo con la optimización de la
eficiencia de la clonación ET. En este caso, el gen de la
recombinasa específica de sitio puede estar o bien integrado en el
genoma huésped o bien transportando en un episoma. En otro caso
preferido, la recombinasa específica de sitio se expresa a partir
de un episoma que lleva un origen de replicación condicional de tal
manera que el mismo puede ser eliminado de la célula huésped.
En otro caso preferido, se combinan al menos dos
de los tres métodos de selección anteriores. Un caso particularmente
preferido implica un uso en dos pasos del primer método de
selección anterior, seguido por el uso del segundo método de
selección. Este uso combinado requiere, del modo más sencillo, que
el fragmento de DNA a clonar incluya un gen, o genes que
permita(n) la identificación, en el primer paso, de los
productos de la clonación ET correctos por la adquisición de un
cambio fenotípico. En un segundo paso, la expresión del gen o genes
introducido(s) en el primer paso se altera de tal manera que
puede identificarse una segunda tanda de productos de clonación ET.
En un ejemplo preferido, el gen empleado es el gen de resistencia a
la tetraciclina y los productos del primer paso de clonación ET se
identifican por la adquisición de resistencia a la tetraciclina. En
el segundo paso, se identifica la pérdida de la expresión del gen de
tetraciclina por pérdida de la sensibilidad al cloruro de níquel,
al ácido fusárico o a cualquier otro agente que sea tóxico para la
célula huésped cuando se expresa el gen de tetraciclina. Este
procedimiento de dos pasos permite la identificación de los
productos de la clonación ET, en primer lugar por la integración de
un gen que transmite un cambio fenotípico al huésped, y en segundo
lugar por la pérdida de un cambio fenotípico afín, de modo muy
simple por eliminación de algunas de las secuencias de DNA
integradas en el primer paso. Con ello, los genes utilizados para
identificar los productos de la clonación ET pueden insertarse y
eliminarse luego para dejar productos de clonación ET que están
exentos de estos genes.
En otra realización de la presente invención, la
clonación ET también puede ser usada para un método de recombinación
que comprende los pasos de
(a) proporcionar una fuente de proteínas RecE y
RecT, o Red\alpha y Red\beta,
(b) poner en contacto una primera molécula de
DNA, que es capaz de ser replicada en una célula huésped adecuada,
con una segunda molécula de DNA que comprende al menos dos regiones
de homología de secuencias para regiones de la primera molécula de
DNA, en condiciones que favorecen la recombinación homóloga entre
las mencionadas primera y segunda moléculas de DNA y
(c) seleccionar moléculas de DNA en las que ha
ocurrido una recombinación homóloga entre las mencionadas primera y
segunda moléculas de DNA, en las que una segunda molécula de DNA
está en una forma que permite la recombinación sin modificación
ulterior.
\vskip1.000000\baselineskip
La fuente de proteínas RecE y RecT, o
Red\alpha y Red\beta, puede ser de proteínas purificadas o
parcialmente purificadas RecE y RecT, o Red\alpha y Red\beta, o
de extractos de células que comprenden proteínas RecE y RecT, o
Red\alpha y Red\beta.
El suceso de recombinación homóloga en esta
realización puede ocurrir in vitro, por ejemplo al
proporcionar un extracto celular que contiene más componentes
requeridos para la recombinación homóloga. El suceso de
recombinación homóloga, sin embargo, también puede ocurrir in
vivo, por ejemplo introduciendo proteínas RecE y RecT, o
Red\alpha y Red\beta, o el extracto en una célula huésped (que
puede ser o no ser recET positiva o rec\alpha\beta positiva) y
poniendo en contacto las moléculas de DNA en la célula huésped, con
la condición de que la célula huésped no sea una célula madre
embrionaria humana o una célula de una línea germinal humana.
Cuando la recombinación ocurre in vitro,
la selección de moléculas de DNA puede realizarse mediante la
transformación de la mezcla de recombinación en una célula huésped
adecuada y la selección de clones positivos, como se describe más
arriba. Cuando la recombinación ocurre in vivo, los métodos
de selección descritos más arriba pueden aplicarse directamente.
Una materia adicional de la invención es el uso
de células, preferiblemente células bacterianas y, más
preferiblemente, células de E. coli, capaces de expresar los
genes de recE y recT, o red\alpha y red\beta, como una célula
huésped para un método de clonación que implica la recombinación
homóloga.
Otra materia adicional objeto de la invención es
un sistema vector capaz de expresar genes recE y recT, o
red\alpha y red\beta, en una célula huésped y su uso para un
método de clonación que implica la recombinación homóloga.
Preferiblemente, el sistema vector también es capaz de expresar un
gen inhibidor de exonucleasa como se define anteriormente, por
ejemplo el gen rec\gamma de \lambda. El sistema vector puede
comprender al menos un vector. Los genes recE y recT, o red\alpha
y red\beta, están localizados preferiblemente en un solo vector y
más preferiblemente bajo control de un promotor regulable que puede
ser el mismo para ambos genes o un promotor individual para cada
gen. Es especialmente preferido un sistema vector que es capaz de
sobreexpresar el gen recT, o red\beta, en comparación con el gen
recE, o red\alpha.
Otra materia adicional objeto de la invención es
el uso de una fuente de proteínas RecE y RecT, o Rec\alpha y
Rec\beta, para un método de clonación que implica la recombinación
homóloga.
Otra materia adicional objeto de la invención es
un estuche de reactivos para clonación que comprende
(a) una célula huésped aislada, preferiblemente
una célula huésped bacteriana
(b) medios de expresión de los genes RecE y
RecT, o red\alpha y red\beta, en la mencionada célula huésped,
por ejemplo que comprende un sistema vector, y
(c) un vehículo de clonación receptor, por
ejemplo un vector, capaz de ser replicado en la mencionada
célula.
\vskip1.000000\baselineskip
Por una parte, el vehículo de clonación receptor
que corresponde a la primera molécula de DNA del proceso de la
invención puede estar presente ya en la célula bacteriana. Por otra
parte, el mismo puede estar presente separado de la célula
bacteriana.
En otra realización, el estuche de reactivos
comprende
(a) una fuente de proteínas RecE y RecT, o
Red\alpha y Red\beta, y
(b) un vehículo de clonación receptor capaz de
ser propagado en una célula huésped y
(c) opcionalmente, una célula huésped aislada
adecuada para la propagación del mencionado vehículo de clonación
receptor.
\vskip1.000000\baselineskip
El estuche de reactivos contiene adicionalmente,
de manera preferible, medios para expresar una recombinasa
específica de sitio en dicha célula huésped, en particular cuando el
producto de la clonación ET receptor contiene al menos un sitio
diana de recombinasa específica de sitio. Además, el estuche de
reactivos puede contener también moléculas de DNA adecuadas para
utilización como fuente de fragmentos de DNA lineales utilizados
para la clonación ET, preferiblemente por servir como plantillas
para la generación del fragmento lineal por PCR, y también como
vectores de DNA diseñados específicamente a partir de los cuales se
libera el fragmento lineal de DNA por escisión mediante enzimas de
restricción, o como fragmentos lineales preparados incluidos en el
estuche para uso como controles positivos y otras misiones. Además,
el estuche de reactivos puede contener también iniciadores de la
multiplicación de ácidos nucleicos que comprenden una región de
homología para dicho vector. Preferiblemente, esta región de
homología está localizada en el extremo 5' del iniciador de la
multiplicación de ácidos
nucleicos.
nucleicos.
\newpage
La invención se ilustra adicionalmente por los
listados de secuencia, figuras y ejemplos siguientes.
- SEQ ID Núm. 1:
- muestra la secuencia de ácido nucleico del plásmido pBAD24-recET (Fig. 7).
- SEQ ID Núms. 2/3:
- muestra las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos del gen recE truncado (t-recE) presente en pBAD24-recET en las posiciones 1320-2162.
- SEQ ID Núms. 4/5:
- muestra las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos del gen recT presente en pBAD24-recET en las posiciones 2155-2972.
- SEQ ID Núms. 6/7:
- muestra las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos del gen araC presente en la cadena complementaria a la representada de pBAD24-recET en las posiciones 974-996.
- SEQ ID Núms. 8/9:
- muestras las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos del gen bla presente en pBAD24-recET en las posiciones 3493-4353.
- SEQ ID No. 10:
- muestra la secuencia de ácido nucleico del plásmido pBAD-ET\gamma (Fig. 13).
- SEQ ID No. 11:
- muestra la secuencia de ácido nucleico del plásmido pBAD-\alpha\beta\gamma (Fig. 14) así como las regiones codificantes para los genes red\alpha (1320-200), red\beta (2086-2871) y red\gamma (3403-3819).
- SEQ ID Núms. 12-14:
- muestra las secuencias de aminoácidos de las proteínas Red\alpha, Red\beta y Red\gamma, respectivamente. La secuencia red\gamma está presente en cada uno de pBAD-ET\gamma (Fig. 13) y pBAD-\alpha\beta\gamma (Fig. 14).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
1
Se muestra en diagrama un método preferido para
la clonación ET. El fragmento de DNA lineal a clonar se sintetiza
por PCR utilizando iniciadores oligonucleotídicos que contienen una
rama de homología izquierda seleccionada para adaptar las
secuencias en el episoma receptor y una secuencia para la iniciación
de la reacción PCR, y una rama de homología derecha seleccionada
para adaptar otra secuencia en el episoma receptor y una secuencia
para la iniciación de la reacción PCR. El producto de la reacción
PCR, en este caso un gen marcador seleccionable (sm1), está
flanqueado consiguientemente por las ramas de homología izquierda y
derecha y puede mezclarse in vitro con el episoma antes de
la co-transformación, o transformarse en una célula
huésped que aloja el episoma diana. La célula huésped contiene los
productos de los genes recE y recT. Los productos de la clonación ET
se identifican por la combinación de dos marcadores seleccionables,
sm1 y sm2 en el episoma receptor.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
2
Se representan tres vías para identificar los
productos de la clonación ET. La primera (en la parte izquierda de
la figura), muestra la adquisición, por clonación ET, de un gen que
transmite una diferencia fenotípica al huésped, en este caso un gen
marcador seleccionable (sm). La segunda (en el centro de la figura)
muestra la pérdida, por clonación ET, de un gen que transmite una
diferencia fenotípica al huésped, en este caso un gen marcador
contra-seleccionable (contra-sm). La
tercera muestra la pérdida de un sitio diana (RT, mostrado como
triángulos en el episoma circular) para una recombinasa específica
de sitio (SSR), por clonación ET. En este caso, el producto de
clonación ET correcto deleciona uno de los sitios diana requeridos
por la SSR para delecionar un gen marcador seleccionable (sm). El
fracaso de la SSR para delecionar el gen sm identifica el producto
de clonación ET correcto.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
3
Se presenta un ejemplo simple de clonación
ET.
(a) Panel superior - Productos PCR (pista
izquierda) sintetizados a partir de oligonucleótidos diseñados como
se describe en Fig. 1 para multiplicar por PCR un gen de resistencia
a la kanamicina y que están flanqueados por ramas de homología
presentes en el vector receptor, se mezclaron in vitro con el
vector receptor (segunda pista) y se cotransformaron en un huésped
E. coli recET+. El vector receptor llevaba un gen de
resistencia a la ampicilina. (b) La transformación de la cepa
JC9604 sbcA de E. coli con el producto de PCR solo (0,2
\mug) o el vector solo (0,3 \mug) no transmitía la resistencia a
la selección doble con ampicilina y kanamicina (amp + kan); en
cambio, la cotransformación conjunta del producto PCR y el vector
producía colonias de resistencia doble. Más del 95% de estas
colonias contenían el producto de clonación ET correcto en el cual
el gen de kanamicina se había integrado de manera precisa en el
vector receptor de acuerdo con la elección de las ramas de
homología. Las dos pistas de la parte derecha de (a) muestran la
digestión por la enzima de restricción Pvu II del vector receptor
antes y después de la clonación ET. (c) Como en el caso de b,
excepto que se cotransformaron seis productos PCR (0,2 \mug de
cada uno) con pSVpaZ11 (0,3 \mug de cada uno) en JC9604 y se
cultivaron sobre placas Amp + Kan o placas Amp. Los resultados se
muestran gráficamente como colonias resistentes a Amp + Kan, que
representan productos de recombinación, divididas por las colonias
resistentes a Amp, que representan la eficiencia de transformación
de plásmidos de la preparación de células competentes, x 10^{6}.
Los productos PCR eran equivalentes al producto PCR
a-b, excepto que se variaron las longitudes de las
ramas de homología. Los resultados corresponden a cinco
experimentos que utilizaron los mismos lotes de células competentes
y DNAs. Las barras de error representan la desviación estándar. (d)
Ocho productos flanqueados por ramas de homología de 50 pb se
cotransformaron con pSVpaZ11 en JC9604. La totalidad de los ocho
productos PCR contenían la misma rama de homología izquierda y el
gen neo multiplicado. Las ramas de homología de la derecha se
seleccionaron a partir de la secuencia pSVpaZ11 que era adyacente a
(0), o a distancias crecientes (7-3100 pb), a partir
de la izquierda. Los resultados corresponden a cuatro
experimentos.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
4
Se utilizó un clon P1 que utiliza un gen de
resistencia a la kanamicina como marcador seleccionable y que
contiene al menos 70 kb de la agrupación de genes de ratón Hox a.
Antes de la clonación ET, este episoma transmite la resistencia a
la kanamicina (panel superior, parte superior izquierda) a su E.
coli huésped que son sensibles a la ampicilina (panel superior,
parte superior derecha). Se obtuvo un fragmento lineal de DNA
diseñado para reemplazar el gen de resistencia a la kanamicina con
un gen de resistencia a la ampicilina por PCR como se reseña en la
Fig. 1 y se transformó en células huésped E. coli en las
cuales era residente el vector receptor Hox a/P1. La clonación ET
dio como resultado la deleción del gen de resistencia a la
kanamicina, y la restauración de la sensibilidad a la kanamicina
(panel superior, parte inferior izquierda) y la adquisición de la
resistencia a la ampicilina (panel superior, parte inferior
derecha). La recombinación de DNA precisa se comprobó por digestión
mediante restricción y análisis de transferencia Southern del DNA
aislado antes y después de la clonación ET (panel inferior).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
5
Un fragmento PCR (panel superior, parte
izquierda, pista tercera) obtenido como se reseña en Figs. 1 y 2
para contener el gen de resistencia a la kanamicina se dirigió por
sus ramas de homología seleccionadas para delecionar el gen
contra-seleccionable ccdB presente en el vector,
pZero-2.1. El producto PCR y el vector pZero se
mezclaron in vitro (panel superior, parte izquierda, primera
pista) antes de la cotransformación en un huésped E. coli
recE/recT+. La transformación de pZero-2.1 solo y el
cultivo en placa sobre un medio de selección de kanamicina dio como
resultado un crecimiento de colonias pequeño (panel inferior, parte
izquierda). La cotransformación de pZero-2.1 y el
producto PCR presentó productos de la clonación ET (panel inferior,
parte derecha) que mostraban el suceso molecular deseado como se
visualizó por digestión con Pvu II (panel superior, parte
derecha).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
6
RecE/RecT median la recombinación homóloga entre
moléculas de DNA lineales y circulares. (a) El plásmido
pBAD24-recET se transformó en E. coli
JC5547, y después de ello se prepararon lotes de células competentes
después de inducción de la expresión RecE/RecT por adición de
L-arabinosa el número de veces indicado antes de la
cosecha. Un producto PCR, obtenido utilizando los oligonucleótidos
e y f para contener el gen de resistencia al cloranfenicol (cm) de
pMAK705 y ramas de homología de 50 pb seleccionadas para flanquear
el gen de resistencia a la ampicilina (bla) de
pBAD24-recET, se transformó luego y se identificaron
los recombinantes en placas de cloranfenicol. (b) Se añadió
arabinosa a cultivos de JC5547 transformado con
pBAD24-recET diferentes veces inmediatamente antes
de la cosecha para la preparación de células competentes. La
expresión total de proteínas se analizó por
SDS-PAGE y tinción con azul Coomassie. (c) El número
de colonias resistentes al cloranfenicol por \mug de producto PCR
se normalizó contra un control para eficiencia de transformación,
determinada por inclusión de 5 pg de pZero 2.1, que transmite la
resistencia a la kanamicina, en la transformación y cultivo de una
parte alícuota sobre placas Kan.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
7A
Se muestra en diagrama el plásmido
pBAD24-recET. El plásmido contiene los genes recE
(en una forma truncada) y recT bajo control del promotor inducible
BAD (P_{BAD}). El plásmido contiene además un gen de resistencia a
la ampicilina (Amp') y un gen araC.
\newpage
Figura
7B
Se representa la secuencia de ácido nucleico y
las porciones codificantes de proteína de
pBAD24-recET.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
8
Manipulación de un episoma grande de E.
coli por pasos de recombinación múltiples. a Esquema de las
reacciones de recombinación. Un clon P1 del complejo Hoxa de Ratón,
residente en JC9604, se modificó por recombinación con productos
PCR que contenían el gen neo y dos dianas de recombinación Flp
(FRTs). Los dos productos PCR eran idénticos excepto que uno estaba
flanqueado por ramas de homología g y h (inserción), y el otro
estaba flanqueado por ramas de homología i y h (deleción). En un
segundo paso, el gen neo se eliminó por recombinación Flp entre los
FRTs por transformación transitoria de un plásmido de expresión Flp
basado en el origen de pSC101 sensible a la temperatura (ts ori). b
Panel superior; gel de agarosa teñido con hidrobromuro de etidio que
muestra digestiones con EcoR1 de preparaciones de DNA de P1 a
partir de tres colonias independientes para cada paso. Panel
central; una transferencia Southern del panel superior hibridada con
una sonda del gel neo. Panel inferior; una transferencia Southern
del panel superior hibridada con una sonda Hoxa3 para visualizar el
sitio de recombinación. Pistas 1, el clon Hoxa3 P1 original
cultivado en la cepa NS3145 de E. coli. Pistas 2,
reemplazamiento del gen de resistencia a la kanamicina Tn903
residente en el vector P1 con un gen de resistencia a la ampicilina
incrementaba la banda de 8,1 kb (pistas 1), hasta 9,0 kb. Pistas 3,
la inserción del gen Tn5-neo con ramas de homología
g-h aguas arriba de Hoxa3, aumentaba la banda de 6,7
kb (pistas 1, 2) hasta 9,0 kb. Pistas 4, la recombinasa Flp
delecionaba el gen neo g-h reduciendo la banda de
9,0 kb (pistas 3) a 6,7 kb. Pistas 5, la deleción de 6 kb del DNA
intergénico Hoxa3-4 por reemplazamiento con el gen
i-h neo, disminuía la banda de 6,7 kb (pista 2)
hasta 4,5 kb. Pista 6: la recombinasa Flp delecionaba el gen neo
i-h reduciendo la banda de 4,5 kb a 2,3 kb.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
9
Manipulación del cromosoma de E. coli. A
Esquema de las reacciones de recombinación. El gen lacZ endógeno de
JC9604 en 7.8' del cromosoma de E. coli, representado en
forma expandida con sitios relevantes Ava I y coordenadas, fue
bombardeado por un fragmento FR que contenía el gen neo flanqueado
por ramas de homología j y k, y sitios loxP, como se representa. La
integración del gen neo eliminaba la mayor parte del gen lacZ con
inclusión de un sitio Ava I para alterar las bandas de 1443 y 3027
pb a una banda de 3277 pb. En un segundo paso, el gen neo se
eliminó por recombinación Cre entre los loxPs por transformación
transitoria de un plásmido de expresión Cre basado en el origen
sensible a la temperatura de pSC101 (ts ori). La eliminación del gen
neo por la recombinasa Cre reduce la banda de 3277 a 2111 pb. b
Expresión de \beta-galactosidasa evaluada por
aplicación en estrías de colonias sobre placas
X-Gal. La fila superior de tres estrías muestra la
expresión de \beta-galactosidasa en la cepa
huésped JC9604 (w.t.), las tres filas inferiores (Km) muestran 24
colonias primarias independientes, 20 de las cuales exhiben una
pérdida de expresión de \beta-galactosidasa
indicativa del suceso de recombinación deseado. c Análisis Southern
del DNA cromosómico de E. coli digerido con AvaI utilizando
una sonda aleatoria cebada obtenida a partir de la región
codificante lacZ entera; pistas 1, 2, w.t.; pistas
3-6, cuatro colonias blancas independientes después
de integración del gen j-k neo; pistas
7-10, las mismas cuatro colonias después de
transformación transitoria con el plásmido de expresión Cre.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
10
Dos tandas de clonación ET para introducir una
mutación puntual. a Esquema de las reacciones de recombinación. El
gen lacZ de pSVpaX1 se interrumpió en JC9604 lacZ, una cepa
preparada por el experimento de Fig. 9 para suprimir la expresión
endógena de lacZ y eliminar las secuencias competitivas, por una
casete del gen sacB-neo, sintetizada por PCR hasta
pIB279 y flanqueada por las ramas de homología l y m. Los
recombinantes, denominados
pSV-sacB-neo, se seleccionaron sobre
placas Amp+Kan. El gen lacZ de
pSV-sacB-neo se reparó luego por un
fragmento PCR obtenido a partir del gen lacZ intacto utilizando
ramas de homología l^{.} y m^{.}. La rama de homología m^{.}
incluía un cambio silencioso de C a G que creaba un sitio BamHI. Los
recombinantes, denominados pSVpaX1^{.}, se identificaron por
contra-selección contra el gen sacB utilizando
sacarosa al 7%. b La expresión de
\beta-galactosidasa a partir de pSVpaX1 se
interrumpió en pSV-sacB-neo y se
restauró en pSVpaX1^{.}. La expresión se analizó sobre placas
X-gal. Se muestran tres colonias independientes de
cada uno de pSV-sacB-neo y
pSVpaX1^{.}. c Geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio de
DNA digerido con BamHI preparado a partir de colonias independientes
recogidas después de contra-selección con sacarosa.
Todas las colonias que expresaban
\beta-galactosidasa (azules) contenían el sitio
de restricción BamHI introducido (panel superior). Todas las
colonias blancas presentaban grandes transposiciones y ningún
producto transportaba el fragmento de restricción de diagnóstico de
1.5 kb BamHI (panel inferior).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
11
Transferencia de la clonación ET a un huésped
recBC+ para modificar un episoma grande. a Esquema del plásmido,
pBAD-ET\gamma, que transporta el sistema ET móvil,
y la estrategia empleada para bombardeo del episoma Hoxa P1.
pBAD-ET\gamma está basado en pABD24 e incluye (i)
el gen recE truncado (t-recE) bajo el promotor
P_{BAD} inducible por arabinosa; (ii) el gen recT bajo el
promotor EM7; y (iii) el gen red\gamma bajo el promotor Tn5. Se
transformó en NS3145, una cepa de E. coli recA que contenía
el episoma Hoxa P1. Después de la inducción por arabinosa, se
prepararon células competentes y se transformaron con un producto
PCR que llevaba el gen de resistencia al cloranfenicol (cm)
flanqueado por ramas de homología n y p. Se seleccionaron n y p de
modo que se recombinaran con un segmento del vector P1. b
Transferencias Southern de DNAs digeridos con Pvu II hibridados con
una sonda obtenida a partir del vector P1 para visualizar el sitio
diana de la recombinación (panel superior) y una sonda obtenida a
partir del gen de resistencia al cloranfenicol (panel inferior).
Pista 1, DNA preparado a partir de células que alojaban el episoma
Hoxa P1 antes de la clonación en T. Pistas 2-17, DNA
preparado a partir de 16 colonias independientes resistentes al
cloranfenicol.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
12
Los plásmidos pBAD-ET\gamma o
pBAD\alpha\beta\gamma, representados, se transformaron en la
cepa de E. coli recA-, recBC+, DK1 y fueron bombardeados por
un gen de resistencia al cloranfenicol con se describe en Fig. 6
para evaluar las eficiencias de la clonación ET. La inducción por
arabinosa de la expresión de proteína tuvo una duración de 1
hora.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
13A
Se muestra en diagrama el plásmido
pBAD-ET\gamma.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
13B
Se representan la secuencia de ácido nucleico y
las porciones codificantes de proteína de
pBAD-ET\gamma.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
14A
Se muestra en diagrama el plásmido
pBAD-\alpha\beta\gamma. Este plásmido
corresponde sustancialmente al plásmido que se muestra en Fig. 13
excepto que los genes recE y recT están sustituidos por los genes
red\alpha y red\beta.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
14B
Se representan la secuencia de ácido nucleico y
las porciones codificantes de proteína de
pBAD-\alpha\beta\gamma.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron condiciones de reacción PCR
estándar para multiplicar fragmentos lineales de DNA. Las secuencias
de los iniciadores utilizados se representan en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla
1
El gen Tn5-neo de pJP5603
(Penfold y Pemberton, Gene 118 (1992), 145-146) se
multiplicó por utilización de pares de oligonucleótidos a/b y c/d.
El gen resistente al cloranfenicol (cm) de pMAK705
(Hashimoto-Gotoh y Sekiguchi, J. Bacteriol. 131
(1977), 405-412) se multiplicó por utilización de
los pares de iniciadores e/f y n/p. El gen Tn5-neo
flanqueado por sitios FRT o loxP se multiplicó a partir de pKaZ o
pKaX
(http://www.embl-heidel-berg.de/ExternalInfo/stewart)
utilizando los pares de oligonucleótidos i/h, g/h y j/k. La casete
sacB-neo procedente de pIP279 (Blomfield et
al., Mol. Microbiol. 5 (1991), 1447-1457) se
multiplicó por utilización del par de oligonucleótidos l/m). El
fragmento del gen lacZ procedente de pSVpaZ11 (Buchholz et
al., Nucleic Acids Res. 24 (1996), 4256-4262)
se multiplicó utilizando el par de oligonucleótidos l^{.}/m^{.}.
Los productos PCR se purificaron utilizando el Estuche de
Purificación QIAGEN PCR y se eluyeron con H_{2}O_{2}, seguido
por digestión de cualquier plantilla de DNA residual con DpnI.
Después de la digestión, los productos de la PCR se extrajeron una
sola vez con fenol:CHCl_{3}, se precipitaron con etanol y se
suspendieron de nuevo en H_{2}O a aproximadamente 0,5
\mug/\mul.
\vskip1.000000\baselineskip
Cultivos saturados de una sola noche se
diluyeron 50 veces en medio LB, y se dejaron crecer hasta un valor
DO600 de 0,5, seguido por enfriamiento en hielo durante 15 minutos.
Las células bacterianas se centrifugaron a 7000 rpm durante 10 min
a 0ºC. El sedimento se resuspendió en glicerol al 10% enfriado en
hielo y se centrifugó de nuevo (7000 rpm, -5ºC, 10 min). Esto se
repitió dos veces más y el sedimento de células se suspendió en un
volumen igual de glicerol al 10% enfriado en hielo. Partes alícuotas
de 50 \mul se congelaron en nitrógeno líquido y se guardaron a
-80ºC. Las células se descongelaron en hielo y se añadió 1 \mul de
solución de DNA (que contenía, para la
co-transformación, 0,3 \mug de plásmido y 0,2
\mug de productos PCR; o bien, para la transformación, 0,2 \mug
de productos PCR). La electroporación se realizó utilizó cubetas
enfriadas en hielo y un equipo Bio-Rad Gene Pulser
ajustado a 25 \muFD, 2,3 kV con el Controlador de Impulsos
ajustado a 200 ohms. Se añadió medio LB (1 ml) después de la
electroporación. Las células se incubaron a 37ºC durante 1 hora con
sacudidas y se extendieron luego sobre placas de antibióticos.
\vskip1.000000\baselineskip
E. coli JC5547 que llevaba
pBAD24-recET se cultivó durante una noche en medio
LB más 0,2% de glucosa, y 100 \mug/ml de ampicilina. Se iniciaron
cinco cultivos LB paralelos, uno de los cuales (0) incluía 0,2% de
glucosa, por una inoculación 1/100. Los cultivos se incubaron a
37ºC con sacudidas durante 4 horas y se añadió 0,1% de
L-arabinosa 3, 2, 1 ó 1/2 horas antes de la cosecha
y el procesamiento como anteriormente. Inmediatamente antes de la
cosecha, se apartaron 100 \mul para análisis sobre un gel de
SDS-poliacrilamida al 10%. E. coli NS3145
que llevaba Hoxa-P1 y
pBAD-ET\gamma se indujo con
L-arabinosa al 0,1% durante 90 min antes de la
cosecha.
\vskip1.000000\baselineskip
Los plásmidos de expresión FLP y Cre,
705-Cr y 705-FLP (Buchholz et
al, Nucleic Acids Res. 24 (1996), 3318-3319),
basados en el origen de pSC101 sensible a la temperatura, se
transformaron en células bacterianas competentes con cloruro de
rubidio. Las células se extendieron sobre placas con 25 \mug/ml de
cloranfenicol, y se dejaron crecer durante 2 días a 30ºC, después
de lo cual se seleccionaron las colonias, se extendieron nuevamente
en placas de L-agar sin antibiótico alguno y se
incubaron a 40ºC durante una noche. Se analizaron colonias simples
sobre diversas placas de antibióticos y todas ellas mostraban la
pérdida esperada de la resistencia al cloranfenicol y la
kanamicina.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa de E. coli JC9604 lacZ, generada
como se describe en Fig. 11, se cotransformó con un fragmento PCR
de sacB-neo y pSVpaX1 (Buchhold et al.,
Nucleic Acids Res. 24 (1996), 4256-4262). Después de
selección sobre placas con 100 \mug/ml de ampicilina y 50
\mug/ml de kanamicina, se aislaron plásmidos
pSVpaX-sacB-neo y se
cotransformaron en células JC9604lacZ nuevas con un fragmento PCR
multiplicado a partir de pSVpaX1 utilizando los iniciadores
l^{.}/m^{.}. El oligo m^{.} llevaba una mutación puntual
silenciosa que generaba un sitio BamHI. Las células se cultivaron
en placas con 7% de sacarosa, 100 \mug/ml de ampicilina, y 40
\mug/ml de X-gal y se incubaron a 28ºC durante 2
días. Las colonias azules y blancas que crecieron en las placas de
sacarosa se contaron y se comprobaron ulteriormente por análisis de
restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron la preparación de DNA y el
análisis Southern de acuerdo con procedimientos estándar. Se
generaron sondas de hibridación por cebado aleatorio de fragmentos
aislados a partir del gen Tn5 neo (PvuII), el gen Hoxa3 (ambos
fragmentos HindIII), los genes lacZ (fragmentos EcoRI y BamHI
procedentes de pSVpaX1), el gen cm (fragmentos BstBI procedentes de
pMAK705) y fragmentos del vector P1 (fragmentos EcoRI de 2,2 kb,
procedentes del vector P1).
\vskip1.000000\baselineskip
Para identificar una reacción de recombinación
homóloga flexible en E. coli, se diseñó un ensayo basado en
la recombinación entre DNAs lineales y circulares (Fig. 1, Fig. 3).
Se preparó por PCR un DNA lineal que llevaba el gen Tn5 de
resistencia a la kanamicina (neo) (Fig. 3a). Inicialmente, los
oligonucleótidos utilizados para la multiplicación por PCR de neo
eran 60-meros constituidos por 42 nucleótidos en sus
extremos 5' idénticos a regiones seleccionadas en el plásmido y, en
los extremos 3', 18 nucleótidos para servir como iniciadores de la
PCR. Se mezclaron DNAs lineales y circulares en proporciones
equimolares y se co-transformaron en una diversidad
de huéspedes E. coli. La recombinación homóloga se detectó
únicamente en los huéspedes de E. coli sbcA. Más del 95% de
las colonias de doble resistencia a ampicilina/kanamicina (Fig. 3b)
contenían el plásmido esperado recombinado homólogamente como se
determinó por digestión con restricción y secuenciación. Únicamente
se apreciaba un ruido de fondo bajo de resistencia a la kanamicina,
debido a la integración genómica del gen neo (no representado).
La reacción de recombinación lineal más circular
se caracterizó de dos maneras. La relación entre la longitud de las
ramas de homología y la eficiencia de recombinación era simple,
recombinándose más eficientemente las ramas más largas (Fig. 3c).
La eficiencia aumentaba con la gama ensayada, hasta 60 pb. Se
examinó el efecto de la distancia entre los dos sitios de homología
seleccionados en el plásmido receptor (Fig. 3d). Se generó una
serie de ocho fragmentos PCR por el uso de una rama izquierda
constante de homología con ramas de homología derecha diferentes.
Las ramas de homología derecha se seleccionaron a partir de la
secuencia del plásmido que eran 0-3100 pb desde la
izquierda. Se obtuvieron fácilmente productos correctos de todas
ellas, con una diferencia menor que 4 veces entre los mismos,
aunque el producto de inserción (0) era menos eficiente. Los
productos correctos dependían también de la presencia de ambas ramas
de homología, dado que los fragmentos PCR que contenían solamente
una rama no eran activos.
\vskip1.000000\baselineskip
La relación entre el genotipo del huésped y esta
reacción de recombinación homóloga se examinó más sistemáticamente
utilizando un panel de cepas de E. coli deficientes en
diversos componentes de recombinación (Tabla 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla
2
Únicamente las dos cepas sbcA, JC8679 y JC9604
presentaban los productos de recombinación deseados, y no se
requería RecA. En las cepas sbcA, la expresión de RecE y RecT está
activada. La dependencia de recE puede deducirse de la comparación
de JC8679 con JC8691. Es notable que no se observó producto de
recombinación alguno en JC9387, lo que sugiere que el ruido de
fondo de sbcBC no es capaz de soportar la recombinación homóloga
basada en ramas de homología de 50 nucleótidos.
Para demostrar que RecE y RecT están implicados,
parte del operón recET se clonó a un vector de expresión inducible
para crear pBAD24-recET (Fig. 6a). El gen recE se
truncó en su extremo N-terminal, dado que los
primeros 588 aminoácidos de RecE son prescindibles. La cepa recBC,
JC5547, se transformó con pBAD24-recET y se realizó
una inducción a lo largo del tiempo de RecE/RecT por adición de
arabinosa a los medios de cultivo en diversos momentos antes de la
cosecha de células competentes. Los lotes de células competentes
cosechados se evaluaron respecto a la expresión de proteínas por
electroforesis en gel (Fig. 6b) y respecto a la recombinación entre
un fragmento de DNA lineal y el plásmido
pBAD24-recET endógeno (Fig. 6c). Sin inducción de
RecE/RecT, no se encontró producto recombinante alguno, mientras
que la recombinación aumentaba en concordancia aproximada con la
expresión incrementada de RecE/RecT. Este experimento muestra
también que la co-transformación de DNAs lineales y
circulares no es esencial y que el receptor circular puede ser
endógeno en el huésped. A partir de los resultados que se muestran
en las Figs. 3 y 6 y en la Tabla 2, se llega a la conclusión de que
RecE y RecT median una reacción de recombinación homóloga muy útil
en recBC E. coli a las frecuencias prácticas. Dado que están
implicados RecE y RecT, se hace referencia a este modo de
recombinación de fragmentos lineales y circulares de DNA como
"clonación ET".
\vskip1.000000\baselineskip
Para demostrar que podrían manipularse grandes
episomas de DNA en E. coli, un clon P1 mayor que 76 kb que
contiene al menos 59 kb del complejo intacto Hoxa de ratón
(confirmado por secuenciación de DNA y transferencia Southern), se
transfirió a una cepa de E. coli que tenía un ruido de fondo
de sbcA (JC9604) y se sometió a dos tandas de clonación ET. En la
primera tanda, el gen de resistencia a la kanamicina Tn903 residente
el vector P1 se reemplazó por un gen de resistencia a la ampicilina
(Fig. 4). En la segunda tanda, se direccionó el intervalo entre los
genes Hoxa3 y a4 por inserción del gen neo entre dos pares de bases
aguas arriba del promotor proximal Hoxa3, o por deleción de 6203 pb
entre los genes Hoxa3 y a4 (Fig. 8a). Ambos productos de clonación
ET por inserción y por deleción se obtuvieron fácilmente (Fig. 8b,
pistas 2, 3 y 5), lo que demostraba que las dos tandas de clonación
ET tenían lugar en este gran episoma de E. coli con precisión
y sin recombinación indeseada aparente.
La aplicabilidad general de la clonación ET se
examinó ulteriormente por direccionamiento de un gen en el
cromosoma de E. coli (Fig. 9a). Se seleccionó el gen de
\beta-galactosidasa (lacZ) de JC9604 a fin de que
la relación entre los recombinantes correctos e incorrectos pudiera
determinarse por evaluación de la expresión de
\beta-galactosidasa. Las condiciones estándar (0,2
\mug de fragmento PCR; 50 \mul ce células competentes),
produjeron 24 colonias primarias, 20 de las cuales eran correctas
como se determinó por expresión de
\beta-galactosidasa (Fig. 9b), y análisis de DNA
(Fig. 9c, pistas 3-6).
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos de la clonación ET como se ha
descrito anteriormente están limitados por la inclusión necesaria
de genes marcadores seleccionables. Se desarrollaron dos vías
diferentes de utilización de un paso de recombinación adicional a
fin de eliminar esta limitación. En la primera vía se empleó la
recombinación específica de sitio mediada por la recombinasa Flp o
Cre. En los experimentos de las Figs. 8 y 9 se incluyeron sitios
diana de recombinación Flp (FRTs) o sitios diana de recombinación
Cre (loxPs) para flanquear el gen neo en los sustratos lineales. La
recombinación entre los FRTs o loxPs se realizó por Flp o Cre,
respectivamente, expresados a partir de plásmidos con el origen de
replicación de pSC101 sensible a la temperatura
(Hashimoto-Gotoh y Sekiguchi J. Bacteriol. 131
(1977), 405-412) para permitir la eliminación simple
de estos plásmidos después de la recombinación específica de sitio
por desplazamiento de temperatura. El vector HoxaP1 recombinado con
precisión se recuperó después de ambas recombinaciones ET y Flp sin
ningún otro producto de recombinación aparente (Fig. 8, pistas 4 y
6). Análogamente, la recombinasa Cre recombinaba con precisión el
alelo lacZ diana (Fig. 9, pistas 7-10). Así pues,
la recombinación específica de sitio puede acoplarse fácilmente con
la clonación ET para eliminar secuencias operativas y dejar un
sitio diana de recombinación específica de sitio de 34 pb en el
punto de la manipulación del DNA.
En la segunda vía para eliminar el gen marcador
seleccionable, se utilizaron dos tandas de clonación ET, que
combinaban pasos de selección positiva y de
contra-selección, para dejar el producto de DNA
exento de cualesquiera secuencias operativas (Fig. 10a).
Adicionalmente, este experimento se diseñó para
evaluar, por un ensayo funcional basado en la actividad de
\beta-galactosidasa, si la clonación ET promovía
pequeñas mutaciones tales como mutaciones de desplazamiento de
marco o mutaciones puntuales dentro de la región que se manipulaba.
En la primera tanda, el gen lacZ de pSVpaX1 se interrumpió con un
fragmento PCR de 3,3 kb que llevaba el gen neo y el gen sacB de
B. subtilis (Blomfield et al., Mol. Microbiol. 5
(1991), 1447-1457), por selección en cuanto a
resistencia a la kanamicina (Fig. 10a). Como se ha mostrado
anteriormente para otros productos de recombinación seleccionados
positivamente, virtualmente todas las colonias seleccionadas eran
blancas (Fig. 10b), lo que indicaba la interrupción con éxito de
lacZ, y 17 de 17 se confirmaron como recombinantes correctos por
análisis de DNA. En la segunda tanda, se introdujo un fragmento PCR
de 1,5 kb diseñado para reparar lacZ por
contra-selección contra el gen sacB. La reparación
de lacZ incluía una mutación puntual silenciosa para crear un sitio
de restricción BamHI. Aproximadamente una cuarta parte de las
colonias resistentes a la sacarosa expresaban
\beta-galactosidasa, y todas las analizadas (17
de 17; Fig. 10c) llevaban el gen lacZ reparado con la mutación
puntual BamHI. Las tres cuartas partes restantes de las colonias
resistentes a la sacarosa no expresaban
\beta-galactosidasa, y todas las analizadas (17 de
17; Fig. 10c) habían sufrido una diversidad de sucesos de mutación
grandes, ninguno de los cuales se asemejaba al producto de la
clonación ET. Así pues, en dos tandas de clonación ET dirigidas al
gen lacZ, no se observó alteración alguna de la actividad de
\beta-galactosidasa por las mutaciones pequeñas,
lo que indicaba que la recombinación RecE/RecT actúa con alta
fidelidad. La presencia significativa de productos incorrectos
observada en el paso de contra-selección es una
limitación inherente del uso de la
contra-selección, dado que será seleccionada
cualquier mutación que anule la expresión del gen de
contra-selección. Es notable que todos los productos
incorrectos eran mutaciones grandes y por consiguiente se
distinguían fácilmente del producto ET correcto por análisis de DNA.
En un experimento diferente (Fig. 5), se observó que la clonación
ET en pZero2.1 (InVitroGen) por contra-selección
contra el gen ccdB daba un ruido de fondo de productos incorrectos
menor (8%), lo que indicaba que el ruido de fondo de la
contra-selección es variable de acuerdo con
parámetros que difieren de aquéllos que influyen en las eficiencias
de la clonación ET.
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos mostrados anteriormente se
realizaron en huéspedes E. coli recBC- dado que la mutación
sbcA se había identificado como un supresor de recBC (Barbour et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 67 (1970),
128-135; Clark, Genetics 78 (1974),
259-271). Sin embargo, muchas cepas E. coli
útiles son recBC+, incluyendo las cepas utilizadas comúnmente para
propagación de los episomas P1, BAC o PAC. Para transferir la
clonación ET a cepas recBC+, los autores de la invención
desarrollaron pBAD-ET\gamma y
pBAD-\alpha\beta\gamma (Figs. 13 y 14). Estos
plásmidos incorporan tres características importantes para la
movilidad de la clonación ET. En primer lugar, RecBC es la
exonucleasa principal de E. coli y degrada los fragmentos
lineales introducidos. Por esta razón, se incluyó el inhibidor
RecBC, Red\gamma (Murphy, J. Bacteriol. 173 (1991),
5808-5821). En segundo lugar, se reguló el
potencial recombinogénico de RecE/RecT, o Red\alpha/Red\beta,
poniendo recE o red\alpha bajo un promotor inducible. Por
consiguiente, la clonación ET puede inducirse en sucesos de
recombinación requeridos y no deseados que están restringidos en
otras ocasiones. En tercer lugar, se observó que las eficiencias de
la clonación ET se mejoran cuando se sobreexpresa RecT, o
Red\beta, pero no RecE, o Red\alpha. Por esta razón, los
autores de la invención pusieron recT, o red\beta, bajo el
promotor constitutivo fuerte EM7.
Se transformó pBAD-ET\gamma en
E. coli NS3145 que alojaba el episoma P1 original Hoxa (Fig.
11a). Una región en la cadena principal del vector P1 se direccionó
por multiplicación PCR del gen de resistencia al cloranfenicol (cm)
flanqueado por ramas de homología n y p. Como se ha descrito
anteriormente para las reacciones de clonación ET seleccionadas
positivamente, la mayoría (más del 90%) de las colonias resistentes
al cloranfenicol eran correctas. Notablemente, la eficiencia global
de la clonación ET, en términos de DNA lineal transformado, era
aproximadamente tres veces mejor utilizando
pBAD-ET\gamma que con experimentos similares
basados en el direccionamiento del mismo episoma en el huésped
sbcA, JC9604. Esto es consistente con la observación de los autores
de la invención de que la sobreexpresión de RecT aumenta las
eficiencias de la clonación ET.
Se realizó una comparación entre las eficiencias
de la clonación ET mediadas por RecE/RecT, expresados a partir de
pBAD-ET\gamma, y Red\alpha/Red\beta,
expresados a partir de pBAD-\alpha\beta\gamma
en la cepa de E. coli recA-, recBC+, DK1 (Fig. 12). Después
de la transformación de E. coli DK1 con
pBAD-ET\gamma o
pBAD-\alpha\beta\gamma, se llevó a cabo el
mismo experimento que se ha descrito en la Figura 6a,c, para
reemplazar el gen bla del vector pBAD con un gen de cloranfenicol.
Tanto pBAD-ET\gamma como
pBAD-\alpha\beta\gamma presentaban
eficiencias de clonación ET similares en términos de sensibilidad a
la inducción por arabinosa de RecE y Red\alpha, y número de
sucesos direccionados
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: European Molecular Biology Laboratory (EMBL)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Meyerhofstrasse 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Heidelberg
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAIS: DE
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CODIGO POSTAL (ZIP): D-69117
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevo método de clonación de DNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NUMERO DE SECUENCIAS: 14
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: EP 97121562.2
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 05-DIC-1997
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: EP 98118756.0
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 05-OCT-1998
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6150 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: pBAD24-recET
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (96...974)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto = "araC"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (1320...2162)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto = "t-recE"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (2155...2972)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto = "recT"
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (3493..4353)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto = "bla"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 843 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: t-recE
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..843
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto = "t-recE"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 281 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 810 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: recT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..810
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto = "recT"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 270 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 876 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: araC
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (1...876)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto = "araC"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 292 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 861 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: bla
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..861
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto = "bla"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 287 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7195 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambas
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: pBAD-ETgamma
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3588..4004
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto = "red gamma"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7010 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: pBAD-alfa-beta-gamma
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1320..2000
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto = "red alfa"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2086..2871
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto = "red beta"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3403..3819
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto = "red gamma"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 227 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 262 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 139 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (26)
1. Un método para la clonación de moléculas de
DNA en células, que comprende los pasos de
(a) proporcionar una célula huésped aislada
capaz de realizar la recombinación homóloga mediante un mecanismo
dependiente de recET,
(b) poner en contacto en la mencionada célula
huésped una primera molécula de DNA circular, capaz de ser replicada
en la mencionada célula huésped, con una segunda molécula de DNA que
comprende al menos dos regiones de homología de secuencia para
regiones de la primera molécula de DNA, en condiciones que favorecen
la recombinación homóloga entre las mencionadas moléculas primera y
segunda de DNA mediante un mecanismo dependiente de recET y
(c) seleccionar una célula huésped aislada en la
que ha ocurrido la recombinación homóloga entre las mencionadas
moléculas primera y segunda de DNA,
en el cual una segunda molécula de DNA se
introduce en la célula huésped de una forma que permite la
recombinación sin modificación ulterior, con la condición de que la
célula huésped no sea una célula madre embrionaria humana o una
célula de una línea germinal humana.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El método conforme a la reivindicación 1 en
el que la célula huésped es capaz de expresar los genes recE y
recT.
3. El método conforme a la reivindicación 2 en
el que los genes recE y recT se seleccionan de genes recE y recT de
E. coli o de genes red\alpha y red\beta de \lambda.
4. El método conforme a las reivindicaciones 2 o
3 en el que la célula huésped se transforma con al menos un vector
que expresa los genes recE y/o recT.
5. El método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que la célula huésped es capaz
además de expresar un gen inhibidor recBC.
6. El método conforme a la reivindicación 5 en
el que la célula huésped se transforma con un vector que expresa el
gen inhibidor recBC.
7. El método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que la primera molécula de DNA es
una molécula de DNA extracromosómico que contiene un origen de
replicación que es operativo en la célula huésped.
8. El método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 en el que la primera molécula de DNA es un
cromosoma de la célula huésped.
9. El método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que la segunda molécula de DNA es
lineal.
10. El método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que las regiones de homología de
secuencia son al menos de 15 nucleótidos cada una.
11. Un método para la clonación de moléculas de
DNA que comprende los pasos de:
(a) proporcionar una fuente de proteínas RecE y
RecT,
(b) poner en contacto una primera molécula de
DNA circular, capaz de ser replicada en una célula huésped adecuada,
con una segunda molécula de DNA que comprende al menos dos regiones
de homología de secuencia para regiones de la primera molécula de
DNA, en condiciones que favorecen la recombinación homóloga mediante
un mecanismo dependiente de recET entre las mencionadas moléculas
primera y segunda de DNA y
(c) seleccionar moléculas de DNA en las que ha
ocurrido la recombinación homóloga entre las mencionadas moléculas
primera y segunda de DNA,
en el cual una segunda molécula de DNA está en
una forma que permite la recombinación sin modificación
ulterior.
\vskip1.000000\baselineskip
12. El método de la reivindicación 11 en el que
las mencionadas proteínas RecE y RecT se seleccionan de proteínas
RecE y RecT de E. coli o de proteínas Red\alpha y
Red\beta del fago \lambda.
13. El método de las reivindicaciones 11 o 12 en
el que la recombinación ocurre in vitro.
14. El método de las reivindicaciones 11 o 12 en
el que la recombinación ocurre en una célula huésped aislada, con la
condición de que la célula huésped no sea una célula madre
embrionaria humana o una célula de una línea germinal humana.
15. El uso de una célula aislada capaz de
expresar los genes recE y recT como una célula huésped para un
método de clonación que implica la recombinación homóloga conforme a
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, con la condición de que
la célula huésped no sea una célula madre embrionaria humana o una
célula de una línea germinal humana.
16. El uso de un sistema vector que expresa los
genes recE y recT en una célula huésped para un método de clonación
que implica la recombinación homóloga conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14.
17. El uso de las reivindicaciones 15 o 16 en el
que los genes recE y recT se seleccionan de genes recE y recT de
E. coli o de genes red\alpha y red\beta de \lambda.
18. El uso de una fuente de proteínas RecE y
RecT para un método de clonación que implica la recombinación
homóloga conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
19. El uso de la reivindicación 18 en el que los
mencionados RecE y RecT o las proteínas se seleccionan de proteínas
RecE y RecT de E. coli o de proteínas Red\alpha y
Red\beta del fago \lambda.
20. El uso de un estuche de reactivos en un
método para la clonación de moléculas de DNA conforme a cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el equipo comprende
(a) una célula huésped aislada
(b) medios para expresar los genes recE y recT
en la mencionada célula huésped y
(c) un vehículo de clonación receptor capaz de
ser replicado en la mencionada célula, con la condición de que la
célula huésped no sea una célula madre embrionaria humana o una
célula de una línea germinal humana.
\vskip1.000000\baselineskip
21. El uso del estuche de reactivos conforme a
la reivindicación 20 en el que los medios del apartado (b)
comprenden un sistema vector que expresa los genes recE y recT en la
célula huésped.
22. El uso del estuche de reactivos conforme a
las reivindicaciones 20 o 21 en el que los genes recE y recT se
seleccionan de genes recE y recT de E. coli o de genes
red\alpha y red\beta de \lambda.
23. El uso de un estuche de reactivos en un
método para la clonación de moléculas de DNA conforme a cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el estuche de reactivos
comprende
(a) una fuente para las proteínas RecE y RecT
y
(b) un vehículo de clonación receptor capaz de
ser propagado en una célula huésped aislada.
\vskip1.000000\baselineskip
24. El uso del estuche de reactivos conforme a
la reivindicación 23 que comprende además una célula huésped
adecuada para la propagación del mencionado vehículo de clonación
receptor, con la condición de que la célula huésped no sea una
célula madre embrionaria humana o una célula de una línea germinal
humana.
25. El uso del estuche de reactivos conforme a
las reivindicaciones 23 o 24 en el que las mencionadas proteínas
RecE y RecT se seleccionan de proteínas RecE y RecT de E.
coli o de proteínas Red\alpha y Red\beta del fago
\lambda.
26. Un sistema vector que comprende los genes
recE y recT y un gen inhibidor recBC.
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EP97121462 | 1997-12-05 | ||
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EP98118756 | 1998-10-05 |
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ES02021915T Expired - Lifetime ES2337027T3 (es) | 1997-12-05 | 1998-12-07 | Nuevo metodo de clonacion de dna basado en el sistema de recombinacion rece-rect de e. coli. |
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---|---|---|---|
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