CN102676470B - 一种用于快速基因克隆的酶混合物及制备方法、包含该酶混合物的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于快速基因克隆的酶混合物，该酶混合物由Redα蛋白，Redβ蛋白和Gam蛋白组成，在该酶混合物中，三种蛋白的混合比例如下：Redα蛋白的浓度为3ng/μl；Redβ蛋白的浓度为150ng/μl-1500ng/μl；Gam蛋白的浓度为3ng/μl-300ng/μl。此外，本发明还公开了该酶混合物的制备方法。另外，本发明还公开了含有该酶混合物的试剂盒。本发明的酶混合物及试剂盒可有效应用于无缝克隆(seamless cloning)，与其他相同功能酶或酶混合物相比,在室温放置20分钟就能达到很高的阳性率，操作较其他试剂盒更方便（室温，无需加热及冰上放置等），完成克隆实验的时间更短。

Description

一种用于快速基因克隆的酶混合物及制备方法、包含该酶混合物的试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体地涉及一种酶混合物，尤其涉及一种用于快速基因克隆的酶混合物及其制备方法。此外，本发明还涉及包含该酶混合物的试剂盒。

背景技术

λ噬菌体Red重组系统已成功地应用于基因的定点替代、修复和染色体工程中，特别的，该系统也可应用于快速基因克隆，取代传统的TA克隆法，限制性酶切与连接法等。TA克隆高效、成功率高，但是需要单独再次构建表达载体。限制性酶切与连接法是利用Ⅱ型限制性内切酶双酶切，将目的基因和表达载体切出互补的粘性末端，利用T4 DNA ligase将互补的粘性末端或者平末端连接。这两种方法费时费力并且在克隆设计上经常会遇到很多限制，比如：1.没有合适的酶切位点。2.多余的酶切位点又会增加不必要的氨基酸，在蛋白表达中使重组蛋白与天然蛋白性质变得不同。3.不适合高通量的基因克隆等等。

所以，一种不依赖连接酶，而直接用同源重组的方法，即无缝克隆（seamless cloning）技术，完成目的片段与载体相连接的基因克隆技术日渐获得研究者的青睐。目前，市场上销售的无缝克隆酶或试剂盒有：Invitrogen公司的

Seamless Cloning and AssemblyKit；Clontech的In-Fusion^TM HD Cloning Kit；金斯瑞的

重组克隆试剂盒；德聚生物的Dogene seamless cloning kit等等。这些试剂盒使用融合酶，重组酶或酶混合物，可以促进有15bp末端序列同源的线性化载体和目的片段的同源重组而完成无缝克隆实验。这些试剂盒都无需酶切连接，但是有的反应时间超过30分钟，如，Seamless Cloning andAssembly Kit和

重组克隆试剂盒，有的反应过程复杂，需要两个不同的温度，如

重组克隆试剂盒（室温25°C 30分钟，然后冰上放置5分钟），Dogene seamlesscloning kit（室温25℃，30分钟；然后42℃，15分钟）；Clontech的In-Fusion^TM HD CloningKit虽然只要15分钟，但它需要在50℃温度下反应，需要提前预热水浴锅，不如室温25℃放置简单方便，等等这些都给实验带来不便。因此，亟需研发一种新的融合酶，重组酶或酶混合物用于无缝克隆。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一在于提供一种用于快速基因克隆的酶混合物，其可有效应用于无缝克隆(seamless cloning)，在室温下放置较短时间就能达到很高的阳性率。

本发明要解决的技术问题之二在于提供  一种包含该酶混合物的试剂盒。

本发明要解决的技术问题之三在于提供一种该酶混合物的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

在本发明的一方面，提供一种用于快速基因克隆的酶混合物，该酶混合物由Redα蛋白，Redβ蛋白和Gam蛋白组成，在该酶混合物中，三种蛋白的混合比例如下：Redα蛋白的使用浓度为3ng/μl；Redβ蛋白的使用浓度为150ng/μl-1500ng/μl；Gam蛋白的使用浓度为3ng/μl-300ng/μl。

本发明是一种基于λ噬菌体Red重组系统的应用于快速基因克隆技术的酶混合物。研究表明，Red重组系统要发挥其高效的同源重组功能，需要Redα，Redβ和Gam三种蛋白的作用。Redα，Redβ和Gam来源于基因工程重组蛋白，纯度>95%。Redα是一个24kd的蛋白，具有5′→3′核酸外切酶的活性，可使线性双链DNA产生突出的3′粘性末端。Redβ是一种退火蛋白，分子量为25kD，可以自发地形成环状结构，紧紧地结合在单链DNA3′粘性末端，防止DNA被单链核酸酶降解，同时介导互补单链DNA的退火，促进替代基因两端的序列和与其同源的靶基因序列间发生重组，在重组反应中起非常大的作用。Gam蛋白只有16kd，但它能与宿主细胞中RecBCD核酸酶结合，抑制RecBCD核酸酶对外源DNA的降解，对外源DNA起到保护作用。

在本发明的另一方面，提供一种含有上述酶混合物的试剂盒。该试剂盒还包括如下反应缓冲液：100-500mM的Tris-Hcl（pH 7.5，25℃），100mM的MgCl2，10mM的ATP，5-10mM的DTT，0-0.5%mM的BSA。mM=1mmol/L毫摩尔每升。

在本发明的另一方面，提供一种该酶混合物的制备方法，包括如下步骤：

（1）Redα，Redβ和Gam蛋白表达菌株的获得：全基因合成Redα，Redβ和Gam蛋白的DNA序列，合成Redα，Redβ和Gam蛋白的引物，以合成好的基因为模板，用对应的引物PCR获得的产物Nde1和Xho1双酶切后连接到用相同的酶酶切好的Pet30a载体上，转化DH5a，测序获得正确的阳性表达质粒：pet30a-Redα，pet30a-Redβ，pet30a-Gam；然后这三种质粒转化BL21（DE3），获得表达菌株；

（2）Redα，Redβ和Gam蛋白的表达和纯化：步骤（1）获得的表达菌株接种到LB培养基中培养，进行诱导表达，离心收菌，进行超声破菌，离心收集上清；过Ni柱纯化，阴离子柱纯化，得到纯化后的Redα，Redβ和Gam蛋白。

步骤（1）中，所述的引物序列为：

reda nde F：5’-ccgCATATGACACCGGACATTATCC-3’（SEQ ID NO.1），

reda xho R：’-ccgCTCGAGTCGCCATTGCTCCCCAAATAC-3’（SEQ ID NO.2）；

redb nde F：5’-ccgCATATGAGTACTGCACTCGCAAC-3’（SEQ ID NO.3），

redb xho R：5’-ccgCTCGAGTGCTGCCACCTTCTGCTC-3’（SEQ ID NO.4）；

gam nde F：5’-ccgCATATGGATATTAATACTG-3’（SEQ ID NO.5），

gam xho R：5’-ccgGATATTGATTCAGAGGTACTCGAG-3’（SEQ ID NO.6）。

步骤（2）具体为：将步骤（1）获得的表达菌株1∶100接种到LB培养基中，37℃，250rmp震荡培养到OD600=0.6时，加入1mM IPTG诱导表达，同时将培养温度降至20℃，低温诱导表达过夜，5k转离心收菌；1g菌体加入10ml缓冲液，超声破菌；12k转离心30min收集上清，过Ni柱纯化；阴离子柱纯化。

步骤（2）中，所述过Ni柱纯化具体包括如下步骤：

第一步平衡：用平衡缓冲液平衡柱子，直至pH达到8.0，紫外检测读数为5~10个柱体积，检测调零后上样；

第二步上样：样品应保持澄清，如发现沉淀浑浊则需要离心，收集流出；

第三步平衡：上样结束，用平衡缓冲液平衡层析柱，直到紫外检测读数回到基线或相对稳定；

第四步预洗：用预洗缓冲液预洗，收集洗脱组分；

第五步洗脱：用洗脱液洗脱目标蛋白，收集洗脱组分；

第六步洗柱：用洗柱缓冲液冲洗层析柱，收集洗脱组分。

步骤（2）中，所述阴离子柱纯化具体包括如下步骤：

第一步平衡：用缓冲液平衡柱子，直至pH达到8.0，紫外检测读数为5~10个柱体积，检测调零后上样；

第二步上样：样品应保持澄清，如发现沉淀浑浊则需要离心，样品中离子强度不宜超过5ms/cm，收集流出；

第三步平衡：上样结束，用平衡液平衡层析柱，直到紫外检测读数回到基线或相对稳定；

第四步洗脱：用不同盐浓度：1）20mM Tris-HCl，pH8.0，50mMNaCl；2）20mM Tris-HCl，pH8.0，100mMNaCl；3）20mM Tris-HCl，pH8.0，200mMNaCl；4）20mM Tris-HCl，pH8.0，300mMNaCl；5）20mM Tris-HCl，pH8.0，500mMNaCl分步洗脱，分步收集各个洗脱组分。

本发明的有益效果在于：本发明将λ噬菌体Red重组系统的三种蛋白在体外按一定浓度比例混合后，在特定的反应体系下，该混合物就能在室温25℃，20min内完成克隆实验，克隆效率和阳性率与其他试剂盒相当。该混合物制备简单，成分明确，可以有效应用于无缝克隆(seamless cloning)。与其他相同功能酶或酶混合物相比，本发明酶混合物及试剂盒在室温(25℃)放置20分钟就能达到很高的阳性率，操作较其他试剂盒更方便（室温，无需加热及冰上放置等），完成克隆实验的时间更短。

附图说明

图1是实施例2中15%的SDS-PAGE蛋白电泳图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1.Redα，Redβ和Gam蛋白表达菌株的获得：

全基因合成Redα，Redβ和Gam蛋白的DNA序列，序列参照NCBI中λ噬菌体（NC_001416）的基因序列。合成如下引物：

reda nde F：5’-ccgCATATGACACCGGACATTATCC-3’（SEQ ID NO.1），

reda xho R：’-ccgCTCGAGTCGCCATTGCTCCCCAAATAC-3’（SEQ ID NO.2）；

redb nde F：5’-ccgCATATGAGTACTGCACTCGCAAC-3’（SEQ ID NO.3），

redb xho R：5’-ccgCTCGAGTGCTGCCACCTTCTGCTC-3’（SEQ ID NO.4）；

gam nde F：5’-ccgCATATGGATATTAATACTG-3’（SEQ ID NO.5），

gam xho R：5’-ccgGATATTGATTCAGAGGTACTCGAG-3’（SEQ ID NO.6）；

以合成好的基因为模板，用对应的引物PCR获得的产物Nde1和Xho1双酶切后连接到用相同的酶酶切好的Pet30a载体上，转化DH5a，测序获得正确的阳性表达质粒：pet30a-Redα，pet30a-Redβ，pet30a-Gam。然后这三种质粒转化BL21（DE3），获得表达菌株。

实施例2.Redα，Redβ和Gam蛋白的表达和纯化：

1.将实施例1获得的菌种1：100接种到LB培养基中，37℃，250rmp震荡培养到OD600=0.6时，加入1mM IPTG诱导表达，为了提高蛋白可溶性表达的比例，同时将培养温度降至20℃，低温诱导表达过夜(16h)，5k转离心收菌。

2.破菌∶菌体总量与破菌缓冲液(50mM Tis-Hcl，pH 8.0，500mM NaCl)1∶10混合，即1g菌体加入10ml缓冲液，超声破菌。12k转离心30min收集上清，过Ni柱纯化。

3.Ni柱纯化：

3.1第一步平衡：用平衡缓冲液（20mM Tris-HCl，pH8.0，500mMNaCl，20mM咪唑）平衡柱子，缓冲液及样品中不可有EDTA，Arg等物质，直至pH达到8.0，紫外检测读数稳定，一般为5~10个柱体积，检测调零后可以上样。

3.2第二步上样：样品应保持澄清，如发现沉淀浑浊则需要离心，收集流出。

3.3第三步平衡：上样结束，用平衡缓冲液平衡层析柱，直到紫外检测读数回到基线或相对稳定。

3.4第四步预洗：用预洗缓冲液（20mM Tris-HCl，pH8.0，500mMNaCl，50mM咪唑）预洗，收集洗脱组分。

3.5第五步洗脱：用洗脱液（20mM Tris-HCl，pH8.0，500mMNaCl，200mM咪唑）洗脱目标蛋白，收集洗脱组分。

3.6第六步洗柱：用洗柱缓冲液（20mM Tris-HCl，pH8.0，500mMNaCl，500mM咪唑）冲洗层析柱，收集洗脱组分。

Redα，Redβ和Gam蛋白会在第五步洗脱下来，纯度达到95%。

4.为了去除蛋白中微量的但会影响后期实验的宿主残留DNA或质粒DNA，这部分样品会再经过阴离子柱纯化（Q Sepharose Fast Flow）。阴离子柱纯化具体步骤如下：

4.1第一步平衡：用缓冲液（20mM Tris-HCl，pH8.0）平衡柱子，直至pH达到8.0，紫外检测读数稳定，一般为5~10个柱体积，检测调零后可以上样。

4.2第二步上样：样品应保持澄清，如发现沉淀浑浊则需要离心，样品中离子强度不宜超过5ms/cm，收集流出。

4.3第三步平衡：上样结束，用平衡液平衡层析柱，直到紫外检测读数回到基线或相对稳定。

4.4第四步洗脱：用不同盐浓度（1）20mM Tris-HCl，pH8.0，50mMNaCl；2）20mM Tris-HCl，pH8.0，100mMNaCl；3）20mM Tris-HCl，pH8.0，200mMNaCl；4）20mM Tris-HCl，pH8.0，300mMNaCl；5）20mM Tris-HCl，pH8.0，500mMNaCl）分步洗脱，分步收集各个洗脱组分。

5.因为残留DNA一般在高盐组分中，所以收集低盐洗脱的蛋白质样品供后续实验。

6.蛋白样品加入相同体积甘油-80℃保存（Redα，Redβ和Gam蛋白的电泳检测结果见图1）。

实施例3.蛋白残留宿主DNA的影响鉴定

取实施例2纯化好的蛋白（1mg/ml）10μl转化100μl DH5a感受态（感受态效率>10⁹cfu/ug），42℃热激后加入900μl无抗SOC培养基，复苏1h后，5k离心5min，去掉800μl上清，剩余200μl混匀后涂在kana抗性的LB板上，37℃过夜培养，计算板上克隆数。实验结果表明，板上没有克隆长出，说明纯化好的蛋白没有DNA污染，可以供后续实验。

实施例4

载体puc19经EcoR1/Sal1双酶切后割胶回收，回收后线性化载体浓度为(20ng/μl)。目的片段经PCR获得，长度为1kb，胶回收后浓度为(50ng/μl)两端与线性化puc19载体有15bp的同源序列。载体与插入片段的摩尔数比为1∶3。反应体系为20μl，各组分含量分别如表1所示：

表1

混匀后，室温（25℃）放置20分钟后，取10μl加入100μl DH5a感受态细胞（感受态效率>5×106cfu/μg）中进行转化实验，转化方法等同常规方法：冰上放置30分钟后，42℃热激1分钟后再在冰上放置3分钟，加入900μl SOC培养基37℃孵育45分钟，取100μl菌液均匀涂在含有氨苄抗性、加有IPTG和x-gal的LB平板上，37℃过夜培养。第二天，数板上白斑克隆数，同时菌落PCR进行阳性鉴定。

同时对其他公司无缝克隆试剂盒按其说明书一起进行反应，同样数白斑克隆和菌落PCR，比较效果。实验结果如表2所示：

表2

表2是实施例4中不同公司不同无缝克隆(seamless cloning)试剂盒效果比较。从表2的实验数据可以说明本发明酶混合物及反应体系（本发明试剂盒）可以在较短的时间内（20分钟）完成较高的克隆反应并且保持很高的阳性率，操作较其他试剂盒更方便（室温，无需加热及冰上放置等）。

实施例5

载体puc19经EcoR1/Sal1双酶切后割胶回收，回收后线性化载体浓度为(20ng/μl)。目的片段经PCR获得，长度分别为A（1kb），B(2kb)，C(3kb)，胶回收后浓度为(50ng/μl)，插入片段两端与线性化puc19载体有15bp的同源序列。载体与插入片段的摩尔数比为1∶3。反应体系为20μl，各组分含量分别如表3所示：

表3

混匀后，室温（25℃）放置20分钟后，取10μl加入100μl DH5a感受态细胞（感受态效率>5×106cfu/μg）中进行转化实验，转化方法及阳性克隆鉴定方法同实施例4。

实验结果如表4所示：

表4

表4说明：实施例5中不同插入片段无缝克隆(seamless cloning)效果比较，说明本发明酶混合物及反应体系（本发明试剂盒）对大片段（3k）也有较高的克隆效率及阳性率。

实施例6

载体puc19经EcoR1/Sal1双酶切后割胶回收，回收后线性化载体浓度为(20ng/μl)。插入目的片段经PCR获得，由A（长度为1kb）和B(长度为2kb)组成，A的尾端和B的前端有15bp同源序列，A和B胶回收后浓度为(50ng/μl)，A的前端和B的尾端分别与线性化puc19载体有15bp的同源序列。载体与插入片段的摩尔数比为1∶3。反应体系为20μl，各组分含量分别为如表5所示：

表5

混匀后，室温（25℃）放置20分钟后，取10μl加入100μl DH5a感受态细胞（感受态效率>5×10⁶cfu/μg）中进行转化实验，转化方法及阳性克隆鉴定方法同实施例4。实验结果如表6所示：

表6

表6说明：实施例6中，插入片段为两个PCR片段的无缝克隆(seamless cloning)效果，说明本发明酶混合物及反应体系（本发明试剂盒）可应用于两个片段的克隆，并且保持较高的克隆效率及阳性率。

Claims (7)

1.一种用于快速基因克隆的酶混合物，其特征在于，该酶混合物由λ噬菌体的Redα蛋白，Redβ蛋白和Gam蛋白组成；在该酶混合物中，三种蛋白的混合比例如下：Redα蛋白的浓度为3ng/μl；Redβ蛋白的浓度为150ng/μl-1500ng/μl；Gam蛋白的浓度为3ng/μl-300ng/μl。

2.一种含有权利要求1所述酶混合物的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括如下反应缓冲液：100-500mM的Tris-HCl，100mM的MgCl₂，10mM的ATP，5-10mM的DTT，0-0.5%的BSA。

3.一种如权利要求1所述的用于快速基因克隆的酶混合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）Redα，Redβ和Gam蛋白表达菌株的获得：全基因合成Redα，Redβ和Gam蛋白的DNA序列，合成Redα，Redβ和Gam蛋白的引物，以合成好的基因为模板，用对应的引物PCR获得的产物Nde1和Xho1双酶切后连接到用相同的酶酶切好的Pet30a载体上，转化DH5a，测序获得正确的阳性表达质粒：pet30a-Redα，pet30a-Redβ，pet30a-Gam；然后这三种质粒转化BL21（DE3），获得表达菌株；

（2）Redα，Redβ和Gam蛋白的表达和纯化：步骤（1）获得的表达菌株接种到LB培养基中培养，进行诱导表达，离心收菌，进行超声破菌，离心收集上清；过Ni柱纯化，阴离子柱纯化，得到纯化后的Redα，Redβ和Gam蛋白。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的引物序列为：

reda nde F：5’-ccgCATATGACACCGGACATTATCC-3’，

reda xho R：’-ccgCTCGAGTCGCCATTGCTCCCCAAATAC-3’；

redb nde F：5’-ccgCATATGAGTACTGCACTCGCAAC-3’，

redb xho R：5’-ccgCTCGAGTGCTGCCACCTTCTGCTC-3’；

gam nde F：5’-ccgCATATGGATATTAATACTG-3’，

gam xho R：5’-ccgGATATTGATTCAGAGGTACTCGAG-3’。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）具体为：将步骤（1）获得的表达菌株1：100接种到LB培养基中，37℃，250rmp震荡培养到OD₆₀₀=0.6时，加入1mM IPTG诱导表达，同时将培养温度降至20℃，低温诱导表达过夜，5k转离心收菌；1g菌体加入10ml缓冲液，超声破菌；12k转离心30min收集上清，过Ni柱纯化；阴离子柱纯化。

6.如权利要求3或5所述的方法，其特征在于，所述过Ni柱纯化具体包括如下步骤：

第一步平衡：用平衡缓冲液平衡柱子，直至pH达到8.0，紫外检测读数为5～10个柱体积，检测调零后上样；

第二步上样：样品应保持澄清，如发现沉淀浑浊则需要离心，收集流出；

第三步平衡：上样结束，用平衡缓冲液平衡层析柱，直到紫外检测读数回到基线或相对稳定；

第四步预洗：用预洗缓冲液预洗，收集洗脱组分；

第五步洗脱：用洗脱液洗脱目标蛋白，收集洗脱组分；

第六步洗柱：用洗柱缓冲液冲洗层析柱，收集洗脱组分。

7.如权利要求3或5所述的方法，其特征在于，所述阴离子柱纯化具体包括如下步骤：

第一步平衡：用缓冲液平衡柱子，直至pH达到8.0，紫外检测读数为5～10个柱体积，检测调零后上样；

第二步上样：样品应保持澄清，如发现沉淀浑浊则需要离心，样品中离子强度不宜超过5ms/cm，收集流出；

第三步平衡：上样结束，用平衡液平衡层析柱，直到紫外检测读数回到基线或相对稳定；

第四步洗脱：用不同盐浓度：1）20mM Tris-HCl，pH8.0，50mMNaCl；2）20mM Tris-HCl，pH8.0，100mMNaCl；3）20mM Tris-HCl，pH8.0，200mMNaCl；4）20mM Tris-HCl，pH8.0，300mMNaCl；5）20mM Tris-HCl，pH8.0，500mMNaCl分步洗脱，分步收集各个洗脱组分。

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