CN104878030A - 一种海藻酸裂解酶sha-3基因及其原核表达载体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海藻酸裂解酶SHA-3基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，本发明构建了海藻酸裂解酶SHA-3基因的原核表达载体，该载体能够在较短时间内获得表达产物海藻酸裂解酶SHA-3，且具有广泛的底物特异性，既能利用聚甘露糖醛酸PolyM也能利用聚古罗糖醛酸PolyG为底物，酶活达到12U/mg，是一种具有广泛应用前景的双功能酶，本发明原核表达载体和整体表达系统容易操作，便于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种海藻酸裂解酶SHA-3基因及其原核表达载体pGEX-4T-1-SHA-3，该载体高效表达海藻酸裂解酶蛋白SHA-3。
背景技术
近年来海洋资源的开发利用已逐渐成为研究的热点，海藻酸因其独特的理化性质在食品、医药和化工等领域具有广泛的应用前景。海藻酸寡糖因具有多种生理活性，成为开发新药的聚焦点。同时海藻酸作为最丰富的海洋生物质之一，因具有以下优势：（1）光合作用效率高，生长快，产量高，资源丰富；（2）生长不占用耕地；（3）几乎不含有木质素，纤维素的含量很少，预处理简单，便于微生物的利用和发酵；从而在生物能源领域受到了广泛的关注。目前，降解海藻酸的方法可分为三大类：第一类是化学降解法，目前广泛采用的是酸水解法，这种方法操作步骤繁琐，反应条件剧烈。第二类是物理降解法，例如超声降解海藻酸。第三类是海藻酸裂解酶酶解法，酶法降解海藻酸条件温和，过程可控，得率高，绿色安全，作用机理明确，产物确定，可以根据具体目的产物要求选择单一的酶制剂或使用不同底物专一性组合的酶制剂。
海藻酸裂解酶主要由海藻酸分解菌和一些海洋动植物等产生，具有很大的应用前景。但野生型海藻酸分解菌产酶量低且成本高，很难达到实际的应用要求。因此，通过基因工程手段对海藻酸裂解酶基因进行异源表达是提高海藻酸裂解酶产量的最有效途径。1993年，Boyd等首次克隆了Pseudomonas alginovora海藻酸裂解酶的编码基因algL并在大肠杆菌中进行了表达，其粗酶液活性达到146U/mg。1996年Frederic等将Pseudomonas alginovora中编码海藻酸裂解酶的基因aly在大肠杆菌中表达，其催化活性达到97U/mg。2009年，Gaofei Duan等人在Pseudoalteromonas sp. CY24中克隆得到了海藻酸裂解酶基因alyPI，并在大肠杆菌中进行表达，得到一个催化活性为121.6U/mg，分子量为58KD的蛋白。2012年，Hwan Hee Park等利用Sphingomonas sp. MJ-3的基因组构建基因文库，筛选得到了一段海藻酸裂解酶的基因，并将其在大肠杆菌中表达，得到了一种对polyM 和polyG都有活性的双功能酶。
发明内容
本发明的目的是提供一种海藻酸裂解酶SHA-3基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，本海藻酸裂解酶SHA-3基因来源于Marinicatena alginatilytica SH-52（保藏编号为CCTCC NO：M2013073），由本实验室全基因组测序获得，通过BLAST比对，结果显示与Cellulophaga baltica NN016038的海藻酸裂解酶的相似度为71%。
本发明另一目的是提供一种海藻酸裂解酶SHA-3基因的原核表达载体，该载体含有Ptac启动子、终止子和海藻酸裂解酶基因SHA-3、细菌核糖体结合位点RBS、GST标签，SHA-3基因的上游为Ptac启动子，Ptac启动子的下游为可被IPTG诱导的操纵子序列，紧靠SHA-3基因起始密码子上游的是一个GST标签序列，可生成融合表达蛋白，之后通过凝血酶可将GST标签切除而不影响目的蛋白的结构活性。
本发明的另一个目的是将Marinicatena alginatilytica SH-52海藻酸裂解酶SHA-3基因的原核表达载体应用在制备海藻酸裂解酶SHA-3中。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
1、Marinicatena alginatilytica SH-52海藻酸裂解酶基因SHA-3的获得和原核表达载体的构建
（1）根据Marinicatena alginatilytica SH-52海藻酸裂解酶SHA-3基因编码框序列和原核表达载体pGEX-4T-1多克隆位点，设计1对特异引物如下：
SHA-3-F:5’- GGATCCATGATGACCAAAACATTAGTG-3’
SHA-3-R:5’-GCGGCCGCTTAATACATCAGCTTCAACTCAAT-3’，在上下游引物的5’端分别加入BamH I和Not I酶切位点（下划线为酶切位点）；提取Marinicatena alginatilytica SH-52的基因组，使用上述引物进行扩增；
（2）回收并纯化海藻酸裂解酶SHA-3全长基因片段，并将其连接到pMD19-T载体上，采用SDS-碱裂解法提取质粒DNA，通过酶切检测获得重组质粒pMD19T-SHA-3；
（3）构建原核表达载体pGEX-4T-1-SHA-3，用BamH I和Not I双酶切pMD19T-SHA-3和pGEX-4T-1，并回收纯化海藻酸裂解酶SHA-3基因片段及pGEX-4T-1载体片段，然后连接、转化、抽提质粒进行双酶切验证，获得原核表达载体pGEX-4T-1-SHA-3，进行测序后，将测序结果进行生物信息学分析。
2、海藻酸裂解酶SHA-3的原核表达
使用热刺激法将pGEX-4T-1-SHA-3转入大肠杆菌BL21（DE3）中，通过IPTG诱导下筛选最佳表达条件，并在最适条件下进行大量表达；
3、海藻酸裂解酶SHA-3的蛋白纯化
收集菌体，进行超声破碎，得到的上清通过GST琼脂糖凝胶柱进行纯化，收集纯化后的蛋白用于SHA-3的蛋白表达检测及下一阶段实验；
4、重组海藻酸裂解酶SHA-3的特性研究
对纯化后的海藻酸裂解酶SHA-3进行以下特性研究：最适温度，最适pH等，本发明获得的重组海藻酸裂解酶SHA-3，其最适温度为55℃，最适pH为7.5；本发明中采用的测定方法为常规海藻酸裂解酶酶活性测定方法，测定反应底物在A235nm处吸光值的变化。
本发明对新型的来自于厌氧海藻酸分解菌Marinicatena alginatilytica SH-52中海藻酸裂解酶基因SHA-3进行了扩增，并进一步进行原核表达和蛋白纯化，获得了SHA-3蛋白。现有技术海藻酸裂解酶的野生菌株通过发酵培养到产酶，至少需要3天的时间，而本发明的基因工程菌株只需10h即可获得最大量的目的蛋白，本发明所获得的重组海藻酸裂解酶SHA-3蛋白具有广泛的底物特异性，既能利用PolyM也能利用PolyG为底物，酶活可以达到12U/mg，是一种具有广阔应用前景的双功能酶，本发明原核表达载体及整体表达系统容易操作，便于工业化生产；本发明解决了现有的产海藻酸裂解酶菌株酶产量较低的问题，也为进一步对海藻酸裂解酶SHA-3进行机理及机制研究奠定了基础。
附图说明
图1是本发明Marinicatena alginatilytica SH-52基因组DNA的检测示意图，图中：M是DNA marker；1和2是基因组DNA；
图2是本发明海藻酸裂解酶SHA-3基因的TA克隆策略示意图；
图3是本发明重组质粒pMD19T-SHA-3的电泳检测示意图，图中：M是DNA marker；1-2是pMD19T-SHA-3；
图4是本发明重组质粒pMD19T-SHA-3的双酶切检测示意图，图中：M是DNA marker；1-2是BamH I与Not I双酶切的pMD19T-SHA-3质粒；
图5是本发明重组质粒pMD19 T-SHA-3的PCR检验示意图，图中：M是DNA marker；1是负对照；2-5是以pMD19T-SHA-3为模板，用SHA-3-F，SHA-3-R为引物扩增的PCR产物；
图6是本发明海藻酸裂解酶SHA-3基因的原核表达载体构建示意图；
图7是本发明重组质粒pGEX-4T-1-SHA-3的电泳检测示意图，图中：M是DNA marker；1-2是pGEX-4T-1-SHA-3；
图8是本发明重组质粒pGEX-4T-1-SHA-3的酶切检测示意图，图中：M是DNA marker；1是BamH I与Not I双酶切的的pGEX-4T-1-SHA-3质粒；
图9是本发明海藻酸裂解酶SHA-3表达的SDS-PAGE检测示意图，图中：M是蛋白marker；1是pGEX-4T-1质粒在28℃，未经IPTG诱导后，6h的细菌总蛋白；2是pGEX-4T-1-SHA-3质粒在28℃，未经IPTG诱导后，6h的细菌总蛋白；3-8是pGEX-4T-1-SHA-3质粒在28℃，经1mM IPTG诱导后，2、4、6、8、10、12h的细菌总蛋白；
图10是本发明海藻酸裂解酶SHA-3在28℃下表达情况，图中：M是蛋白marker；1是pGEX-4T-1-SHA-3质粒在28℃未经IPTG诱导，10h的细菌总蛋白；2-7是pGEX-4T-1-SHA-3质粒在28℃、经终浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mMIPTG诱导10h的细菌总蛋白；
图11是本发明海藻酸裂解酶SHA-3在不同温度诱导下的表达情况，图中：M是蛋白marker；1是pGEX-4T-1-SHA-3质粒在28℃未经IPTG诱导，10h的细菌总蛋白；2-6是pGEX-4T-1-SHA-3质粒分别在15、20、25、28、30℃经终浓度为1mM IPTG诱导10h的细菌总蛋白；
图12是本发明海藻酸裂解酶的纯化电泳示意图，图中：M是蛋白marker；1是纯化前的细菌上清蛋白；2是纯化后的流川液；3是纯化后的洗涤液；4是用还原性谷胱甘肽洗脱后的洗脱液；
图13是本发明海藻酸裂解酶SHA-3的最适pH示意图，图中：菱形曲线为SHA-3蛋白在pH6.0-8.0磷酸盐缓冲液中的活性示意图；正方形曲线为SHA-3蛋白在pH8.0-9.0 Tris-HCl缓冲液中的活性示意图；
图14是本发明海藻酸裂解酶SHA-3的最适温度示意图；
图15是本发明海藻酸裂解酶SHA-3的金属离子影响示意图；
图16是本发明海藻酸裂解酶SHA-3的底物特异性示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
本实施例中试剂主要分为分子生物学实验试剂，各种限制性内切酶、pfu DNA聚合酶、dNTP等为日本宝生物工程有限公司（大连）及北京庄盟国际生物基因科技有限公司产品，质粒提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，其余试剂均为国产分析纯；仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器；所有引物序列均在上海生工合成。
实施例1：Marinicatena alginatilytica SH-52基因组DNA的制备与检测
本发明所用的Marinicatena alginatilytica SH-52为本实验室筛选菌株，SH-52基因组DNA的制备采用普通细菌基因组提取方法，具体内容如下：取2mL过夜培养菌液于4℃，4000rpm离心2min，弃尽上清液，收集菌体；加入100ul Solution I悬菌、30μl 10%SDS和1μl 20mg/ml蛋白酶K，混匀，37℃孵育1小时；加入100μl 15mol/L NaCl，混匀；加入20μl CTAB/NaCl溶液（CTAB 10%，NaCl 0.7mol/L），混匀，65℃，10分钟；加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）混匀，12000rpm离心5分钟；取上清，加入2倍体积无水乙醇，0.1倍体积3mol/L NaOAC，-20℃放置30分钟；12000rpm离心10分钟；沉淀加入70%乙醇洗涤；沉淀干燥后，溶于20μl TE，-20℃保存。取2μl基因组DNA用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果（图1）说明提取到的基因组DNA质量符合要求。
实施例2：海藻酸裂解酶SHA-3基因的扩增与TA克隆
海藻酸裂解酶SHA-3基因的扩增及克隆如图2所示，首先从全基因组测序结果中查找SHA-3的全长基因序列，并设计一对特异性引物，序列如下：
SHA-3-F：GGATCCATGATGACCAAAACATTAGTG
SHA-3-R：GCGGCCGCTTAATACATCAGCTTCAACTCAAT
5’端引物有GGATCC特征序列，并由此形成BamH I酶切位点；3’端加GCGGCC特征序列，形成Not I酶切位点。
在PCR反应混合液中加入10ng的Marinicatena alginatilytica SH-52基因组DNA作为模板，同时加入50ng的特异性引物SHA-3-F和SHA-3-R，2.5μl dNTP（10mM），2.5μl的Pfu反应Buffer和0.5μl的pfu（5U/ul）聚合酶（北京全式金生物技术有限公司），加入双蒸水使终体积为25μl。在PCR仪上于94℃加热3min，然后按照94℃、30s，57℃、30s，72℃、1min的程序进行25个循环的反应，最后在72℃延长反应10min的程序进行PCR反应扩增得到SHA-3基因，反应完成后，通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物。回收并纯化SHA-3全长基因DNA（2.3Kb），然后用宝生物（TaKaRa）的TA克隆试剂盒亚克隆到pMD19-T（大连宝生物公司）载体上，实验操作按试剂盒的说明书进行，反应过夜后用反应混合液转化大肠杆菌感受态Trans1-T1（北京全式金生物技术有限公司），采用碱裂解法提取质粒DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测其大小（图3），选取大小和理论值相符的重组质粒进行酶切检测。连接成功的重组质粒pMD19T-SHA-3有一条大小为4.9kb左右的SHA-3基因DNA片段。进一步用BamH I和Not I双酶切，结果产生两条片段，一条大小为2.6kb左右，另一条为2.3kb左右（图4、5）。测序分析证明重组质粒载体中插入的SHA-3全长基因序列正确。再次确认是连接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌Trans1-T1，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒pMD19T-SHA-3。
实施例3：原核表达载体pGEX-4T-1-SHA-3的构建
pGEX-4T-1-SHA-3的构建策略如图6所示，用BamH I（TaKaRa）和Not I（TaKaRa）切开纯化的原核表达载体pGEX-4T-1（购自GE Healthcare公司）和pMD19T-SHA-3，通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体和插入片段，从凝胶中回收pGEX-4T-1被切割后产生的载体片段pGEX-4T-1（4.9kb）及pMD19T-SHA-3被切割产生的SHA-3基因的DNA片段（2.3kb左右），然后用宝生物（TaKaRa）的连接酶试剂盒连接pGEX-4T-1载体片段和SHA-3基因的DNA片段产生原核表达载体pGEX-4T-1-SHA-3。用连接反应混合物转化高效率的大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1（北京全式金生物技术有限公司），把转化后的大肠杆菌涂于加有氨苄青霉素（Amp，100mg/L）的平板上，于37℃过夜培养，筛选Amp抗性重组子菌落，从Amp抗性重组子菌落中提取质粒（图7），用BamH I、Not I（TaKaRa）进行双酶切检测，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上产生4.9kb和2.3kb左右大小的两条带（因为BamH I，Not I在载体处都只有单一识别位点，故双酶切质粒应有两个片段）（图8）。将连接成功的质粒载体pGEX-4T-1-SHA-3重新转化大肠杆菌Trans1-T1，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒pGEX-4T-1-SHA-3。
实施例4：海藻酸裂解酶SHA-3蛋白的表达与表达条件的优化
用原核表达载体pGEX-4T-1-SHA-3转化大肠杆菌BL21的感受态细胞（天根生化科技）。挑取单菌落加入5mL LB（含有Amp 100mg/L）中，37℃过夜培养（OD600约为1.5）。然后转接到100ml LB（含有Amp 100mg/L）中，当OD600达到0.6-0.8时，分别加入IPTG于不同条件下诱导，离心收集菌体，加入5XSDS-PAGE上样缓冲液（Sample loading buffer），于100℃加热10min煮沸菌体。冰浴冷却后于4℃离心（12000rpm）10min，取上清进行SDS-PAGE。根据文献资料和软件分析预测目的融合蛋白大小为105kDa左右（GST融合标签为26kDa），采用12%分离胶。SDS-PAGE电泳参看《分子克隆实验指南（第三版）》。SDS-PAGE电泳结果（图9、10、11）表示在28℃下经终浓度为0.8mM IPTG诱导10h后SHA-3蛋白表达量最高。
实施例5：海藻酸裂解酶SHA-3蛋白的纯化，具体步骤如下：
（1）菌体破碎：将在28℃、0.8mM IPTG下大量诱导表达10h后的1L菌体，经超声破碎菌体（工作5s，休息5s）20min；
（2）收集上清和沉淀：将菌体破碎液于4℃、12000rpm离心20min，分别保留上清和沉淀；
（3）蛋白破碎上清液用0.22um滤器进行过滤，除去杂质；
（4）GST Sefinose Resin柱预处理：将保存柱子的20%的乙醇放出；10倍柱体积的PBS缓冲液（4.3mM Na2HPO4，1.4mM KH2PO4，137mM NaCl，2.7mM KCl）平衡柱子，流速为0.5-1ml/min；
（5）蛋白样品上柱：流速为0.5ml/min，收集流出液；
（6） 洗柱：使用5-10倍体积PBS缓冲液（4.3mM Na2HPO4，1.4mM KH2PO4，137mM NaCl，2.7mM KCl，PH7.4）洗脱；
（7）洗脱：使用5倍柱体积洗脱缓冲液（10mM Glutathione（还原型），50mM Tris-HCl，PH8.0）洗脱，重复2-3次，收集洗脱液；
（8）GST Sefinose Resin柱的后处理：5倍柱体积PBS缓冲液（4.3mM Na2HPO4，1.4mM KH2PO4，137mM NaCl，2.7mM KCl，PH7.4）；5倍柱床体积去离子水洗柱；于4℃，3倍柱体积的20%乙醇中保存；
（9）SDS-PAGE检测：分别取20μl各洗脱梯度流出液，流川液，洗涤液，粗酶液加入5ul的5× SDS-PAGE上样缓冲液（Sample loading buffer），于100℃加热10分钟煮沸，上样，进行SDS-PAGE分析，纯化结果见图12，最终获得SHA-3纯化蛋白。
通过上述的实验，本发明达到了如下的结果：利用本发明的SHA-3的原核表达载体（pGEX-4T-1-SHA-3）转化大肠杆菌（BL21），可实现SHA-3蛋白的高水平表达，表达的SHA-3基本在上清中。SHA-3重组蛋白表达量很高，因此不需要大规模培养细菌，纯化SHA-3蛋白的操作相当简单，成本也很低，极易重复使用。
实施例6：海藻酸裂解酶SHA-3蛋白的特性分析，具体内容如下：
1、酶活测定
由于海藻酸裂解酶裂解海藻酸钠产生的不饱和糖醛酸在235nm处具有吸收值，通过测量反应液在该波长下的变化而计算相应的酶活。
在反应体系（20mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0），0.3%海藻酸钠）中加入10μg的海藻酸裂解酶蛋白启动反应，10min后测量235nm处吸光值的变化。
酶活定义：在波长235nm下吸光值，以每分钟吸光值增加1定义为一个酶活单位（U）。
通过测定，纯化后的重组海藻酸裂解酶SHA-3蛋白的酶活可以达到 12U/mg，远高于纯化前的酶活。
2、酶学性质的研究
（1）海藻酸裂解酶SHA-3 蛋白最适催化pH值测定
在pH缓冲体系（pH6.0-8.0磷酸钠缓冲液或pH8.0-9.0 Tris-HCl缓冲液）中用海藻酸钠为底物测定海藻酸裂解酶的最适反应pH，在55℃反应时间为10min，将处于最适pH下的酶活力定义为100%，海藻酸裂解酶SHA-3的活性和稳定性与pH值的关系曲线如图13所示，在强酸性或强碱性条件下酶的活力和稳定性都不高，海藻酸裂解酶SHA-3最适酶反应pH条件为7.5。
（2）海藻酸裂解酶SHA-3蛋白最适催化温度测定
在pH7.0的磷酸盐缓冲液中用海藻酸钠为底物测定酶的最适反应温度，反应时间为10min，将处于最适温度下的酶活力定义为100%，结果如图14所示，酶的最适反应温度55℃，在45～57℃范围内有较高的酶活力；当温度降到30℃时，酶活迅速下降，只有峰值的49％。
（3）金属离子对海藻酸裂解酶SHA-3蛋白活性的影响
在pH7.0的磷酸盐缓冲液中用海藻酸钠为底物测定不同金属化合物（反应液中金属离子的浓度为0.5mM）对海藻酸裂解酶SHA-3蛋白活性的影响，以添加相同体积水的溶液作为对照组，在最适温度55℃下测定酶活力，将对照组的酶活力定义为100%，结果如图15所示，Hg2+对酶活有完全抑制作用，Zn2+，Ba2+与Na2+能对酶活有强烈抑制作用，Mg2+、Ca2+与Cu2+对酶活有部分抑制作用，而K+与Co2+对酶活有部分促进作用。
（4）海藻酸裂解酶SHA-3蛋白的底物特异性
将纯化后的海藻酸裂解酶SHA-3（10μg）添加到20mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中，同时添加质量分数为0.3%的不同底物（海藻酸钠、PloyG、PloyM），在反应温度为55℃下反应10min，结果如图16所示，SHA-3对PloyG与PloyM均有底物特异性，但对于PloyM的底物特异性相对略强一些。
传统方法一般是通过利用海藻酸钠分解菌进行发酵，分离、纯化得到海藻酸裂解酶，但却存在野生菌产酶量低，操作繁琐，生产成本高等问题，成为酶解法大量制备海藻酸低聚糖的瓶颈，限制了海藻酸裂解酶的进一步推广使用。
本发明采用基因工程手段，构建含有厌氧菌的海藻酸裂解酶基因的工程菌株，通过诱导表达大量生产海藻酸裂解酶，这与传统方法相比，不仅使得海藻酸裂解酶的得率大大提高，而且酶的纯化过程也简单易于操作。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 一种海藻酸裂解酶SHA-3基因及其原核表达载体
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2319
<212> DNA
<213> MarinicatenaalginatilyticaSH-52
<400> 1
atgatgacca aaacattagt gacagctgtt tttgtttttt tgctgttcgg ctgcggcaaa 60
ggtcctgaaa aagagggtac ctttgtcagc acgattgaag aactggaaaa tgcgctggca 120
gaagtgcagc ccggcgacga aattgtacta tcgaatggtg tttggagcga tgtccaaatc 180
gaattttacg gtaagggtac cccagagaat cctattattc tccgcgcaga aactcccggc 240
aaagtattta ttgaaggaca ttcgttcctg aaattcggtg gtgactatct cactgtaaaa 300
gatttgtatt ttagaaatgg atatacacca tcgaatgcgg tcgtcgaatt cagaacgaag 360
gagaaagtag ccaaccattg tacgtttacc aactgtgtga ttgataattt caaccagcca 420
catagagata ctcaagatca ctgggtggag ttttggggaa gatataatga attgagcaat 480
tgcaatatta tcgggaaatc gaattcaggg ccgactgttc gtgttcaact aaaaggaaac 540
gagagtgtaa aaaattatca ccggattgtc aataatcatt tcggcccaag accacggaaa 600
ggtggtccgc atggtgaaac cattcaaatt ggcgatagcg aaacttcgat gacgccatgt 660
tatgcctttg tttccaataa ttttttcgac cagtgtaacg gtgaagtgga agtcatttcg 720
aacaagtcaa acttcaatga ataccgaaac aatgtatttt acaaatgcga aggttcgctg 780
gtgatgcgcc atggcaacta ctgtattatt gacggaaatt attttatagg agacggtcat 840
tccgaaaata tgggtggaat tcgggttatc aacacgggcc actggataac taacaactat 900
ttctacaacc ttagagggca gaatttcaga agcgccctgg ccattatgaa cggcatccct 960
aaatcgcctc taaaccgata caaccaggta accgacgtgg ttgtggctta taatacgtgg 1020
gtgaaatgca aatcgccctg gcaatttagc gttggttcaa atgtgagtca aaaggaggtg 1080
cttcctccgt cggaaattcg ctctgcccgg ccgatccgaa ctcttttagc caacaatgtc 1140
atatacaatg aggttggtga tgaacaacca attgttgcct acgataaagt cgatggtatt 1200
cattttgagt gtaacattat caacaaccag aatgttgatt ttaaaaatac aaaaggcctg 1260
gacgagagcc caattgagat gacagaagct tatccggata tttatgttcc taaagacgat 1320
ttaaggaaca ttgatgtcta taacggattt gatttcgaaa ccattacaac tgatctgttt 1380
ggaaattcgc gcgctgagaa aaacgtcgta ggagcgattg tgcaggcgtc ggccagtgat 1440
ccggctatta tagacgcaaa aaaatacgga tcaagttggt actcggttga aaaaccggaa 1500
caggccccga aagtcgtgga ggttgctcct gaatcctatg atttagcatc taaaattgcg 1560
gaggctgtaa ccggcgatgt cattgagttg caaccaggtg tttatgagat taatgagtct 1620
ttggtgattg acaagaaaat tacagttcag tccaaggatc aggcaaataa agcacagatt 1680
atttattcgg gtgaaaataa gacccctgca tttgagttgc atccgaaagg agatctggtt 1740
ctgaaaaata tcctgctgga aggcaagagt gagcaatacg cctttgcctg tttgaaagaa 1800
aacatgtcca gtttgtataa tctggacgtg gatggttgtg aaatcagcaa tttcgcatat 1860
gtgttgaaag cttacaaaga atcatttgca gacgaaattc aattctcaaa ttcagttctc 1920
cgggattgtg agaatggcat tgagctgtcg gaagaaacca atgatgaagg tgactacaac 1980
gttgaatttc tgacgattga caattgtaca ttcaattcga ttaaaaagaa tgtaatcgac 2040
tattaccgtg gtggatatga cgagtctacg attggcggta atttgtcggt aaccaatagt 2100
acattcaccg gttgcggagc catggaagag aatggaatcc tgattaatac gaaaggaatt 2160
gtcaatgtag atatttccga taacaccttt aagaataacc cggtacacaa ggtggctctg 2220
ctctgggggg ctaaaaacaa cacgcattcc ggtaaccagg tttcgaactc cggtaaaatc 2280
gaagttcagg agaatattga gttgaagctg atgtattaa 2319
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggatccatga tgaccaaaac attagtg 27
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcggccgctt aatacatcag cttcaactca at 32
Claims (2)
1.一种海藻酸裂解酶SHA-3基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.权利要求1所述海藻酸裂解酶SHA-3基因的原核表达载体，其特征在于：该载体含有Ptac启动子、终止子和海藻酸裂解酶基因SHA-3、细菌核糖体结合位点RBS、GST标签，SHA-3基因的上游为Ptac启动子，Ptac启动子的下游为可被IPTG诱导的操纵子序列，紧靠SHA-3 基因起始密码子上游的是一个GST标签序列。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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