CN104830880A - 一种海藻酸裂解酶sha-i基因及其表达载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种海藻酸裂解酶SHA-I基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；本发明构建了海藻酸裂解酶基因SHA-I的原核表达载体，该原核表达载体能够在较短时间内获得表达产物海藻酸裂解酶SHA-I，且具有广泛的底物特异性，既能利用PolyM也能利用PolyG为底物，酶活达到13U/mg，是一种具有广泛应用前景的双功能酶，本发明原核表达载体和整体表达系统容易操作，便于工业化生产。

Description

一种海藻酸裂解酶SHA-I基因及其表达载体

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种海藻酸裂解酶SHA-I基因及其原核表达载体pGEX-4T-SHA-I，该载体高效表达海藻酸裂解酶蛋白SHA-I。

背景技术

近些年来利用海洋生物质---海藻发酵乙醇已经渐渐被人们所接受并被称为第三代生物燃料。海藻作为生产生物能源的理想原料有以下几点优势：（1）光合作用效率高，生长快，产量高，资源丰富；（2）生长不利用耕地；（3）几乎不含有木质素，纤维素的含量很少，预处理简单，便于微生物的利用和发酵。目前，海藻酸降解的方法可分为三大类：一类是化学降解法，目前广泛采用的是酸水解法，这种方法操作步骤繁琐，反应条件剧烈。此外，还有过氧化氢氧化降解法；第二类是物理降解法，例如超声降解海藻酸；第三类是海藻酸裂解酶酶解法，酶法降解海藻酸条件温和，过程可控，得率高，绿色安全，环境友好，作用机理明确，产物确定，可以根据具体目的产物要求选择单一或组合使用不同底物专一性的酶制剂。

海藻酸裂解酶用途十分广泛。首先，它可以用于制备海藻酸寡糖和单糖，其次，海藻酸裂解酶还是藻类研究的重要工具酶，可用于海藻原生质体的制备等。但现有的产海藻酸裂解酶的菌株的酶产量比较低，较难达到实际应用要求。1993年，Boyd等首次克隆了铜绿假单胞菌海藻酸裂解酶的编码基因algL并在大肠杆菌中进行了表达，其粗蛋白活性达到146U/mg。1996年Frederic等将Pseudomonas alginovora中编码海藻酸裂解酶的基因aly在大肠杆菌中表达，并且其催化甘露糖醛酸段的活性达到97U/mg。1998年Pecina等在大肠杆菌中表达了褐球固氮菌的海藻酸裂解酶基因，粗蛋白活性为94U/mg。2012年，Hwan Hee Park等利用Sphingomonassp. MJ-3的基因组构建基因文库，筛选得到了一段海藻酸裂解酶的基因，并将其在大肠杆菌中表达，得到了一种对polyM 和polyG都有活性的双功能酶。

目前，国内外所发现的海藻酸分解菌的种类众多，主要分布于海洋细菌、土壤细菌和真菌等，但被成功克隆及异源表达的海藻酸裂解酶并不多，本发明从Marinicatena alginatilytica SH-52中成功克隆出海藻酸裂解酶基因SHA-I，并进行了异源表达和蛋白纯化的研究，将为进一步研究海藻酸裂解酶分子机理，进而推广到工业生产奠定基础。

发明内容

本发明目的是提供一种海藻酸裂解酶SHA-I基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，本海藻酸裂解酶SHA-I基因来源于Marinicatena alginatilytica SH-52（保藏编号为CCTCC NO：M2013073），由本实验室全基因组测序获得，通过BLAST比对，结果显示与Cellulophaga baltica 18的海藻酸裂解酶亲缘关系相似度为75%。

本发明另一目的是提供海藻酸裂解酶SHA-I基因的原核表达载体，该载体含有Ptac启动子、终止子和海藻酸裂解酶基因SHA-I、细菌核糖体结合位点RBS、GST标签，SHA-I基因的上游为Ptac启动子，Ptac启动子的下游为可被IPTG诱导的操纵子序列，紧靠SHA-I基因起始密码子上游的是一个GST标签序列，可生成融合表达蛋白，之后通过凝血酶可将GST标签切除而不影响目的蛋白的结构活性。

    本发明另一个目的是将海藻酸裂解酶SHA-I的原核表达载体应用在制备海藻酸裂解酶SHA-I中。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

1、Marinicatena alginatilytica SH-52海藻酸裂解酶基因SHA-I的获得和原核表达载体的构建

   （1）根据Marinicatena alginatilytica SH-52海藻酸裂解酶SHA-I基因编码框序列和原核表达载体pGEX-4T-1多克隆位点，设计1对特异引物如下：

          SHA-I-F:5’- GGATCCATGAAAACCAATAAAATTCTG-3’

SHA-I-R:5’-GCGGCCGCTTAGTCATTCTTCGTGAAATAG-3’，在上下游引物的5’端分别加入BamH I和Not I酶切位点（下划线为酶切位点）；提取Marinicatena alginatilytica SH-52的基因组，使用上述引物进行扩增；

    （2）回收并纯化海藻酸裂解酶SHA-I全长基因片段，并将其连接到pMD19-T载体上，采用SDS-碱裂解法提取质粒DNA，通过双酶切检测获得的重组质粒pMD19-T-SHA-I；

    （3）构建原核表达载体pGEX-4T-1-SHA-I，用BamH I和Not I双酶切pMD19-T-SHA-I和pGEX-4T-1，并回收纯化海藻酸裂解酶SHA-I基因片段及pGEX-4T-1载体片段，然后连接、转化、抽提质粒进行双酶切验证，获得原核表达载体pGEX-4T-1-SHA-I，进行测序后，将测序结果进行生物信息学分析；

2、海藻酸裂解酶SHA-I的原核表达

使用热激法将pGEX-4T-1-SHA-I转入大肠杆菌BL21（DE3）中，在终浓度1mM IPTG诱导下筛选最佳表达条件，并在最适条件下进行大量表达；

3、海藻酸裂解酶SHA-I的蛋白纯化

收集菌体进行超声破碎，离心后获得的上清通过GST琼脂糖凝胶柱进行纯化，收集纯化后的蛋白用于SHA-I蛋白表达检测及下一阶段实验。

4、重组海藻酸裂解酶SHA-I的特性研究

对纯化后的海藻酸裂解酶SHA-I进行特性研究，内容包括最适pH，最适温度，热稳定性等，本发明获得的重组海藻酸裂解酶SHA-I，其最适pH为7.0，最适温度为50℃，在40℃，10min损失将近50%的酶活；本发明中采用的测定方法为常规的海藻酸裂解酶酶活性测定法，测定反应底物在A_235nm处吸光值的变化。

本发明对海藻酸裂解酶SHA-I基因进行扩增，并进行原核表达和蛋白纯化，获得SHA-I蛋白。现有的技术野生产海藻酸裂解酶菌株通过发酵培养到产酶，至少需要3天时间，而本发明的基因工程菌株只需6h即可获得最大量的目的蛋白，本发明所获得的重组海藻酸裂解酶SHA-I蛋白具有广泛的底物特异性，既能利用PolyM也能利用PolyG为底物，酶活可以达到13U/mg，是一种具有广阔运用前景的双功能酶，本发明原核表达载体及整体表达系统容易操作，便于工业化生产；本发明解决了现有的产海藻酸裂解酶菌株酶产量较低的问题，也为进一步对海藻酸裂解酶SHA-I进行机理及机制研究奠定了基础。

附图说明

图1是本发明Marinicatena alginatilytica SH-52基因组DNA的检测示意图，图中：M是DNA marker；1和2是基因组DNA；

图2是本发明海藻酸裂解酶SHA-I基因的TA克隆策略示意图；

图3是本发明重组质粒pMD19-T-SHA-I的电泳检测示意图，图中：M是DNA marker；1-3是pMD19-T-SHA-I；

图4是本发明重组质粒pMD19-T-SHA-I的双酶切检测示意图，图中：M是DNA marker；1-2是BamH I与Not I双酶切的pMD19-T-SHA-I质粒；

图5是本发明重组质粒pMD19-T-SHA-I的PCR检验示意图，图中：M是MDN marker；1是负对照；2-5是pMD19-T-SHA-I为模板，用SHA-I-F，SHA-I-R为引物扩增的PCR产物；

图6是本发明海藻酸裂解酶SHA-I基因的原核表达载体构建示意图；

图7是本发明重组质粒pGEX-4T-1-SHA-I的电泳检测示意图，图中：M是DNA marker；1-2是pGEX-4T-1-SHA-I；

图8是本发明重组质粒pGEX-4T-1-SHA-I的酶切检测示意图，图中：M是DNA marker；1是BamH I与Not I双酶切的pGEX-4T-1-SHA-I质粒；

图9是本发明海藻酸裂解酶SHA-I表达的SDS-PAGE检测示意图，图中：M是蛋白marker；1是pGEX-4T-1质粒在28℃，未经IPTG诱导后，6h的细菌总蛋白；2是pGEX-4T-1-SHA-I质粒在28℃，未经IPTG诱导后，6h的细菌总蛋白；3-9是pGEX-4T-1-SHA-I质粒在28℃，经1mM IPTG诱导后，0、2、4、6、8、10、12h的细菌总蛋白；

图10是本发明海藻酸裂解酶的纯化电泳示意图，图中：M是蛋白marker；1是纯化前的细菌上清蛋白；2是纯化后的流川液；3是纯化后的洗涤液；4是用还原性谷胱甘肽洗脱后的洗脱液；

图11是本发明海藻酸裂解酶SHA-I的最适pH示意图，图中：黑色菱形曲线为SHA-I蛋白在pH5.0-7.5磷酸缓冲液中的活性示意图；黑色方块曲线为SHA-I蛋白在pH7.5-9.0 Tris-HCl缓冲液中的活性示意图；黑色倒三角曲线为SHA-I蛋白在pH9.0-1.0 Gly-NaOH缓冲液中的活性示意图；

图12是本发明海藻酸裂解酶SHA-I的最适温度示意图；

图13是本发明海藻酸裂解酶SHA-I的热稳定性示意图；

图14是本发明海藻酸裂解酶SHA-I的底物特异性示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

本实施例中试剂主要分为分子生物学实验试剂，各种限制性内切酶、pfu DNA聚合酶等为日本宝生物工程有限公司（大连）及北京全式金生物技术有限公司产品，质粒提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，其余试剂均为国产分析纯；仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器；所有引物均在上海生工合成。

实施例1：Marinicatena alginatilytica SH-52基因组DNA的制备与检测

本发明所用的Marinicatena alginatilytica SH-52为本实验室筛选菌株，Marinicatena alginatilytica SH-52基因组DNA的制备采用普通细菌基因组提取方法，具体内容如下：取2mL过夜培养菌液于4℃，4000rpm离心2min，弃尽上清液，收集菌体；加入100μl Solution I悬菌、30μl 10%SDS和1μl 20mg/ml蛋白酶K，混匀，37℃孵育1h；加入100μl 15mol/L NaCl，混匀；加入20μl CTAB/NaCl溶液（CTAB 10%，NaCl 0.7mol/L），混匀，65℃，10min；加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）混匀，12000rpm离心5min；取上清，加入2倍体积无水乙醇，0.1倍体积3mol/L NaOAC，-20℃放置30min；12000rpm离心10min；沉淀加入70%乙醇洗涤；沉淀干燥后，溶于20μl TE，-20℃保存，取2μl基因组DNA用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果说明提取到的基因组DNA质量符合要求（图1）。

实施例2：海藻酸裂解酶SHA-I基因的扩增与TA克隆

海藻酸裂解酶SHA-I基因的扩增及克隆如图2所示，首先从全基因组测序结果中查找SHA-I的全长基因序列，并设计一对特异性引物，序列如下：

    SHA-I-F:GGATCCATGAAAACCAATAAAATTCTG

SHA-I-R:GCGGCCGCTTAGTCATTCTTCGTGAAATAG

5’端引物有GGATCC特征序列，并由此形成BamH I酶切位点；3’端加GCGGCCGC特征序列，形成Not I酶切位点。

在PCR反应混合液中加入10ng的Marinicatena alginatilytica SH-52基因组DNA作为模板，同时加入50ng的特异性引物SHA-I-F和SHA-I-R，2.5ul dNTP（10mM），2.5ul的Pfu反应Buffer和0.5ul的pfu（5U/ul）聚合酶（北京全式金生物技术有限公司），加入双蒸水使终体积为25ul。在PCR仪上于94℃加热3min，然后按照94℃、30s，55℃、30s，72℃、1min的程序进行30个循环的反应，最后在72℃延长反应10min的程序进行PCR反应扩增得到SHA-I基因；反应完成后，通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，回收并纯化SHA-I全长基因DNA（1.1kb），然后用宝生物（TaKaRa）的TA克隆试剂盒亚克隆到pMD19-T（大连宝生物公司）载体上，实验操作按试剂盒的说明书进行，反应过夜后用反应混合液转化大肠杆菌感受态Trans1-T1（北京全式金生物技术有限公司），采用碱裂解法提取质粒DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测其大小（图3），选取大小和理论值相符的重组质粒进行酶切检测。分别用BamH I和Not I双酶切连接成功的重组质粒pMD19-T-SHA-I，有两条片段，一条大小为2.6kb左右，另一条为1.1kb左右（图4-5）；测序分析证明重组质粒载体中插入的SHA-I全长基因序列正确。再次确认是连接成功的质粒后，重新转化Trans1-T1，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒pMD19-T-SHA-I。

实施例3：原核表达载体pGEX-4T-1-SHA-I的构建

pGEX-4T-1-SHA-I的构建策略如图6所示，用BamH I（TaKaRa）和Not I（TaKaRa）切开纯化的原核表达载体pGEX-4T-1（购自GE Healthcare公司）和pMD19-T-SHA-I，通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体和插入片段，从凝胶中回收pGEX-4T-1被切割后产生的载体片段pGEX-4T-1（4.9kb）及pMD19-T-SHA-I被切割产生的SHA-I基因的DNA片段（1.1kb左右），然后用宝生物（TaKaRa）的连接酶试剂盒连接pGEX-4T-1载体片段和SHA-I基因的DNA片段产生原核表达载体pGEX-4T-1-SHA-I。用连接反应混合物转化高效率的大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1（北京全式金生物技术有限公司），把转化后的大肠杆菌涂于加有氨苄霉素（Amp，100ug/ml）的平板上，于37℃，过夜培养，筛选Amp抗性重组子菌落，从Amp抗性重组子菌落中提取质粒（图7），用BamH I、Not I（TaKaRa）进行双酶切检测，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上产生4.9kb和1.1kb左右大小的两条带（因为BamH I，Not I在载体处都只有单一识别位点，故双酶切质粒应有两个片段）（图8）。将连接成功的质粒载体pGEX-4T-1-SHA-I重新转化大肠杆菌Trans1-T1，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒pGEX-4T-1-SHA-I。

实施例4：海藻酸裂解酶SHA-I蛋白的表达与表达条件的优化

用原核表达载体pGEX-4T-1-SHA-I转化大肠杆菌BL21的感受态细胞（天根生化科技）。挑取单菌落加入5mL LB（含有Amp 100mg/L）中，37℃过夜培养（OD₆₀₀约为1.5）。然后转接到100ml LB（含有Amp 100mg/L）中，当OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入终浓度为1.0mM的IPTG于28℃诱导0-12h后，离心收集菌体，去掉上清液，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液（Sample loading buffer），于100℃加热10min煮沸菌体。冰浴冷却后于4℃离心（12000 rpm）10min，取上清作SDS-PAGE。根据文献资料和软件分析预测目的融合蛋白大小为67kDa左右（GST融合标签为26kDa），采用12%分离胶；SDS-PAGE电泳参看《分子克隆实验指南（第三版）》。SDS-PAGE电泳结果（图9）表示在28℃诱导6h后SHA-I蛋白表达量最高。

实施例5：海藻酸裂解酶SHA-I蛋白的纯化，具体步骤如下：

（1）菌体的破碎：将在28℃、1mM IPTG下诱导表达6h的1L菌体，经超声破碎菌体（工作5s，休息5s）20min；

（2）收集上清和沉淀：将菌体破碎液4℃、12000 rpm离心20min，分别保留上清和沉淀；

（3）蛋白破碎上清液使用0.22uM过滤器进行过滤，除去杂质；

（4）GST Sefinose Resin柱的预处理：将柱子中保存用的20%乙醇放出；10倍柱体积PBS缓冲液（4.3mM Na₂HPO₄，1.4mM KH₂PO₄，137mM NaCl，2.7mM KCl）平衡柱子，流速为0.5-1 ml/min；

    （5）蛋白样品上柱：流速为0.5ml/min，收集流出液；

    （6）洗柱：使用5-10倍体积PBS缓冲液（4.3mM Na₂HPO₄，1.4mM KH₂PO₄，137mM NaCl，2.7mM KCl，PH7.4）洗脱；

        （7）洗脱：使用5倍柱体积洗脱缓冲液（10mM Glutathione（还原型），50mM Tris-HCl，PH 8.0）洗脱，重复2-3次，收集洗脱液；

（8）GST Sefinose Resin柱的后处理：5倍柱体积PBS缓冲液（4.3mM Na₂HPO₄，1.4mM KH₂PO₄，137mM NaCl，2.7 mM KCl，PH7.4）；5倍柱体积去离子水洗柱；于4℃，3倍柱体积的20%乙醇中保存；

       （9）SDS-PAGE检测：分别取20ul各洗脱梯度流出液，流川液，洗涤液粗酶液加入5ul的5×SDS-PAGE上样缓冲液（Sample loading buffer），于100℃ 加热10min煮沸，上样，进行SDS-PAGE分析，纯化结果如图10，最终获得SHA-I纯化蛋白。

通过上述的实验，本发明达到了如下的结果：利用本发明的SHA-I的原核表达载体（pGEX-4T-1-SHA-I）转化大肠杆菌（BL21），可实现SHA-I蛋白的高水平表达，表达的SHA-I基本在上清中，SHA-I重组蛋白表达量很高，因此不需要大规模培养细菌，纯化SHA-I蛋白的操作相当简单，成本也很低，极易重复使用。

实施例6：海藻酸裂解酶SHA-I蛋白的特性分析，具体内容如下：

1、酶活测定

由于海藻酸裂解酶裂解海藻酸钠产生的不饱和糖醛酸在235nm处具有吸光值，通过测量反应液在该波长下的变化来计算相应的酶活，反应体系（50mM Tris-HCl缓冲液（pH7.5），0.3%海藻酸钠）中加入10ug的海藻酸裂解酶蛋白启动反应，10min后测量235nm处吸光值的变化。

酶活定义：在波长235nm下，以每分钟吸光值增加1定义为一个酶活单位（U）。通过测定，纯化后的重组海藻酸裂解酶SHA-I蛋白的酶活可以达到 13U/mg，远远高于纯化前的酶活。

2、酶学性质的研究

   （1）海藻酸裂解酶SHA-I蛋白最适pH值的测定

    在pH缓冲体系（pH5.0-7.5磷酸缓冲液、pH7.5-9.0 Tris-HCl缓冲液和pH9.0-10.0 Gly-NaOH缓冲液）中用海藻酸钠为底物测定海藻酸裂解酶的最适pH，在35℃反应时间为10min，将处于最适pH下的酶活力定义为100%，海藻酸裂解酶SHA-I的活性与pH值的关系曲线如图11所示，在酸性或碱性条件下酶的活力都不高，海藻酸裂解酶SHA-I最适反应pH条件为pH7.0。

   （2）海藻酸裂解酶SHA-I蛋白最适催化温度和稳定性的测定

     在pH7.0的磷酸缓冲液中用海藻酸钠为底物测定酶的最适反应温度，反应时间为10min，将处于最适温度下的酶活力定义为100%，结果如图12所示，酶的最适反应温度为50℃。将酶液放置在相应温度保温10min后，将酶液与0.3%海藻酸钠溶液（pH7.0）混合，测定反应液的剩余酶活力，酶的热稳定性实验结果如图13所示，由图可知30℃保温10min后，剩余酶活力为84.5%；40℃保温10min后，剩余酶活力为48.1%；50℃保温10min后，剩余酶活力仅有5.7%。

   （3）金属离子对海藻酸裂解酶SHA-I蛋白酶活性的影响

在pH7.0的磷酸缓冲液中用海藻酸钠为底物测定不同金属离子（反应液中金属离子的浓度为0.5mM）对海藻酸裂解酶SHA-I蛋白活性的影响，在最适温度50℃下测定酶活力，将不添加金属离子的对照酶活力定义为100%，结果如表1所示，Hg²⁺对酶活有强烈的抑制作用，Co²⁺和Mn²⁺对酶活有部分抑制作用，而Mg²⁺、Zn²⁺、K⁺和Ca²⁺对酶活有部分促进作用。

 表1是本发明海藻酸裂解酶SHA-I的金属离子影响结果

   （4）海藻酸裂解酶SHA-I蛋白的底物特异性

    将纯化后的海藻酸裂解酶SHA-I（10ug）添加到0.2M磷酸缓冲液（pH7.0）中，同时添加0.3%的不同底物（海藻酸钠、PolyG和PolyM），在反应温度为50℃下反应10min，结果如图14所示，SHA-I对PolyG和PolyM均有底物特异性，但对PolyM的底物特异性相对强一些。

    海藻酸分解菌，通过发酵生产、分离和纯化得到海藻酸裂解酶，然而这种方法存在野生菌产酶量低、酶与降解产物难于分离，生产成本高等问题，成为酶解方法大量制备海藻酸低聚糖的技术难题。本发明采用基因工程技术，构建含有海藻酸裂解酶基因的工程菌株，通过诱导发酵大量生产重组海藻酸裂解酶将解决这一技术难题。与传统方法相比，该方法使得酶的得率大大提高，且酶的纯化过程简单高效。

序列表

<110>  昆明理工大学

<120>  一种海藻酸裂解酶SHA-I基因及其表达载体

<160>  3

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  1089

<212>  DNA

<213> MarinicatenaalginatilyticaSH-52

 

<400>  1

atgaaaacca ataaaattct gccgatattt caagctactt taataacagc ttttgtattc     60

ctgttgatta gctgttccaa taccgcgaaa aaaaaccaaa aggaagaagc tcaagagagg     120

attttcgcaa gcgagcttat tccatttttt gaacattggaa tctgatcctg ggtgatggt     180

tctaatgttg gccaagccat tgactacgag cataaagatt acttctacac ggccaatgac     240

ggacaaacaa actgggttgt gttcaaatcg cccaacgctg gtgataccca cggcacatcg     300

aacaacacaa gaactgagtt ggcgcaacta aagaaatggt cgccactagc cgatgccaaa     360

ttaacagcca cactgaaagt catgaatgta tcggctaccg gtgatgcgcg tgtcgcggct     420

tcgtatgcgg ttgtcgtggg acagattcac agtgctgacg ggcatgagaa cgaaccgctt     480

aaaatatttt acaagaaatt tcccggacac accaaagggt cggtcttctg gcattacgaa     540

ataaacaccg ccggtgataa caactccgga agatgggatt tctcaacagc tgtttggggc     600

aacgattttt cggttgtcgg caccgaagaa aacacctacc cggaagaacc ggaagatggc     660

atagcattgg gagaagagtt cagttatgaa attgaggtga aggacggcgt gatgagctta     720

acctttacga gtgaaggaca tgaaatcaaa acgtttacca aaaacctgat cgagtcggag     780

tatacaacaa aagccgatat tccggagcaa acccaaaaac tgtttgtgcc cattggccag     840

gacggtgtag agcgtgaaaa tgcttactcc gaggagggga ttttcttcaa gttgggttgt     900

tataatcaaa ccaatggctt gtcgcccgat gtaaataaga attggtgttc gggcgccgaa     960

acttttgacg gtgatattca aaaacaatat gaaaccggaa actacgccga ggtttggttt     1020

aaaacagcca gtatttttgt cagtgacgat gccatatcca atcagggcta tttcacgaag     1080

aatgactaa                                                             1089

 

<210>  2

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

ggatccatga aaaccaataa aattctg                                 27

 

<210>  3

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

gcggccgctt agtcattctt cgtgaaatag                              30

Claims (2)

1.一种海藻酸裂解酶SHA-I基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述海藻酸裂解酶SHA-I基因的原核表达载体，其特征在于：该载体含有Ptac启动子、终止子和海藻酸裂解酶基因SHA-I、细菌核糖体结合位点RBS、GST标签，紧靠SHA-I 基因起始密码子上游的是一个GST标签序列，SHA-I基因的上游为Ptac启动子，Ptac启动子的下游为可被IPTG诱导的操纵子序列。