CN102311930A - 一种由Pseudomonas.sp.HZJ216生产的褐藻胶裂解酶 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种来源于海水的菌株Pseudomonas.sp.HZJ216，该菌株具有营养要求范围广，容易培养和培养时间短的特点。用本发明的菌株作为褐藻胶裂解酶的生产菌株，具有产品的活性高、稳定性好、生产周期短、成本低的特点，能够实现工业化生产。通过酶的分离纯化，SDS-PAGE确定该菌株产生的褐藻胶裂解酶的分子量分别为60.25kDa。

Description

一种由Pseudomonas.sp.HZJ216生产的褐藻胶裂解酶

技术领域

生物技术

背景技术

褐藻胶是褐藻细胞壁和细胞间质的主要组成部分，也是褐藻中含量较高的一种多糖，其分子是由β-D-1，4-甘露糖醛酸(β-D-mannuronic acid，简称M)和α-L-1，4-古罗糖醛酸(α-L-guluronic acid，简称G)两种单体组成的嵌段式线性聚合物，其分子中存在三种嵌段：均聚甘露糖醛酸(M)_n，均聚古罗糖醛酸(G)_n和M、G两种单体交替(MG)_n的嵌段。褐藻胶裂解酶的酶解反应都是在底物的非还原末端生成4-deoxy-erthro-hex-4-enopyranuronosyl基的β消除反应。1992年，Gaseca报道了关于褐藻胶裂解酶的裂解机制，褐藻胶分子中的羧基与酶分子中的阳离子性氨基酸残基结合，C5位的C-H电子对被6位的羧基吸引，5位的C-H结合变弱，然后又一个酶分子中的亲核性氨基酸残基与C5位的质子结合，电子向着生成稳定的中间体的方向运动，最终在C4-C5间生成双键，所以褐藻胶酶解的产物分子中的非还原末端产生C4，5不饱和双键，在230~240nm有强吸收。据本发明人通过查阅资料、文献检索所知，迄今为止报道的褐藻胶裂解酶大多是从海洋生物如褐藻、海洋软体动物、革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、真菌、病毒中分离纯化而来的，陆上生物分离得到的褐藻胶裂解酶全部来源于细菌、黄杆菌(Flavobacuterium multivolum)、Alginovibrio aquatilis、固氮菌(Azobactervinelandii)、克里伯氏菌(Klebsiella aerogene)、(Klebsiella pneumoniae)、肠杆菌(Enterobacter cloacae M-1)、别单胞菌(Alteromonas sp.)、芽胞杆菌(Bacilluscirculans)、(Agarbacterium alginicum)。专利公开了一种Vibria sp.QY101产生的其特征为酶的分子量为39kD的褐藻胶裂解酶。Vibria sp.QY2产生的其特征为酶的分子量为28.5Kd。Vibria sp.QY1产生的其特征为酶的分子量为39kD等，经检索未见有假单胞菌属的细菌产生的与其相同的褐藻胶裂解酶。

发明内容

本发明分离纯化出一株来源于海藻的菌株Pseudomonas.sp.HZJ216，其具有产生褐藻胶裂解酶的特性，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏号为CCTCCNO：M209241。本发明的目的是提供一种来源于海洋的菌株Pseudomonas.sp.HZJ216，利用该菌株生产褐藻胶裂解酶。

本发明的特点如下：首次分离出产褐藻胶裂解酶Pseudomonas.sp.HZJ216菌株。该菌株为不产孢子的弯杆状，革兰氏阴性。不抗酸，没有荚膜，在标准肉汤上生长良好，氧化酶阳性，无色素和黄色，脲酶阳性。0.4-0.7μm×1.3-1.5μm，端生单鞭毛。该菌株分离自海水，3％和7％NaCl胨水中生长良好，经过biolog鉴定和基因测序，确定其为假单胞菌属，命名Pseudomonas.sp.HZJ216。此菌株在2216E培养基上26℃培养24h形成单菌落，菌落乳白色，圆形，边缘整齐。在发酵产酶培养基中培养18h，其发酵液中褐藻胶裂解酶的活力达到最高。用本发明的菌株作为褐藻胶裂解酶的生产菌株，具有产品的活性高、稳定性好、生产周期短、成本低的特点，能够实现工业化生产。通过酶的分离纯化，SDS-PAGE确定该菌株产生的褐藻胶裂解酶的分子量分别为60.25kDa(图1)。其分子量不同于已报导的该菌褐藻胶裂解酶。通过丙酮沉淀、Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Superdex 75凝胶、Superdex HS-100凝胶过滤技术对Pseudomonas.sp.HZJ216菌株产生的褐藻胶裂解酶进行纯化和精制，获得一种电泳纯度的酶蛋白组分，将纯化出的酶蛋白经过Edman法降解后进行蛋白质N末端测序，此种酶的N端氨基酸序列为Gln-Asp-Arg-His-Gly-Val。此蛋白的N端不同于任何已报道的褐藻胶裂解酶的N端序列，此酶与其它的褐藻胶裂解酶的N端进行比较可知此蛋白的N端氨基酸序列不同于任何已报道的褐藻胶裂解酶的N端序列，为一个新酶，该菌株产酶具有营养要求范围广，容易培养和培养时间短的特点。其发酵液中褐藻胶裂解酶的活力达到1980U/ml.

附图说明

图1：纯化的褐藻胶裂解酶SDS-PAGE电泳结果。左边为标准蛋白分子量，右边为Pseudomonas.sp.HZJ216制备并经纯化的褐藻胶裂解酶纯酶单带，表示数量单位为：kDa。

具体实施方式

1.菌株的分离纯化：

本发明Pseudomonas.sp.HZJ216菌株的获得：从深圳湾海水水域采集海水样品，加入到装有25ml富集培养基(海带粉2g，NaNO₃1g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄0.5g，NH₄Cl 0.5g，FeSO₄0.01g，H₂O 1000ml，pH7.2)的三角瓶中，30℃，160r/mim摇瓶培养3d。然后将富集培养液用无菌生理盐水适当稀释后，取0.2ml涂布初筛分离培养基(蛋白胨10g，海带粉1.0g，NaCl 14.0g，KH₂PO₄1.0g，CaCl₂0.1g，琼脂15.0g，H₂O 1000mL，pH 10.0。)平板。30℃倒置培养48h，获得选取平板上有透明圈性状的白色菌落，得到一株能产褐藻胶裂解酶的细菌。

2.菌株的鉴定：

将分离得到是菌株经过16S r DNA基因序列测序结果(序列表)：经过biolog鉴定，确定其为假单胞菌属，命名Pseudomonas.sp.HZJ216，此菌株在2216E培养基上26℃培养24h形成单菌落，菌落乳白色，圆形，边缘整齐。

3.制备酶：将Pseudomonas.sp.HZJ216菌株用液体2216E培养基活化后，以5％的接种量接入到装有100mL发酵培养基(含有0.2％褐藻酸钠的液体2216E培养基)的250mL三角瓶中，26℃摇瓶培养20h，将酶发酵液4℃下3600rpmin冷冻离心5min，上清液中缓慢加入预冷丙酮(4℃下，发酵液上清∶丙酮＝2∶1.5(v/v))并均匀搅拌，置于4℃下30min后，3600rpmin冷冻离心10min，弃上清，沉淀部分加入0.05M Na₂HPO4-KH₂PO4(pH 7.0)缓冲液，使酶充分溶解，3600rpmin冷冻离心10min，去除不溶的杂蛋白，上清部分即为浓缩粗酶液，用于进一步纯化。

4、纯化酶：将粗酶液加样于Q-Sepharose FF柱，洗脱液为含有NaCl(0～1M)的0.05MNa₂HPO₄-KH₂PO₄(pH 7.0)缓冲液，进行梯度洗脱，在280nm下检测蛋白峰，DNS法测酶活，收集有活性的蛋白，进行下一步纯化。将Q-Sepharose FF部分纯化后的活性蛋白浓缩后加样于Sephacryl S-100HR凝胶柱，洗脱液为的0.05M Na₂HPO₄-KH₂PO₄(pH 7.0)缓冲液，在280nm下检测蛋白峰，DNS法测酶活后收集有活性的蛋白，进行下一步纯化。在280nm下检测蛋白峰，DNS法测酶活后收集有活性的蛋白，用于测定酶的分子量和制备电泳纯样品进行N端氨基酸残基的序列测定。

5、酶分子量测定：用SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)技术确定褐藻胶裂解酶的分子量。

具体方法是：将低分子量标准蛋白质(protein marker)和加入2×Sample Buffer的样品在沸水浴中加热5min使其变性，取出冷却后上样电泳，电泳后用考马斯亮蓝R250染色。电泳后，测定标准蛋白质和样品的迁移距离，计算相对迁移率，以相对迁移率和各标准蛋白质分子量的对数以最小二乘法做标准曲线，计算此酶的分子量。此酶在SDS-PAGE上显示的分子量分别为：60.25kDa(见附图1)。

标准蛋白：116kDa：β-Galactosidase，β-半乳糖苷酶；66.2kDa：Rinder serumalbumin(BSA)，牛血清白蛋白；45kDa：Ovalbumin，卵清蛋白；35kDa：乳酸脱氢酶，lactate dehydrogenase；25kDa：核糖核酸酶RNase Bsp981；18.4kDa：β-lactoglobulin，β-乳球蛋白；14.4kDa：lysozyme，鸡蛋清溶菌酶。

6、酶蛋白的N端测序：依据Edman降解法原理，即蛋白质的自由α-氨基与PITC(异硫氰酸苯酯)偶联后，与之相邻的第二残基的肽键大为消弱，在无水酸TFA(三氟乙酸)的作用下发生特异性的断裂，暴露出第二残基的α-氨基，再与PITC反应，循环往复地进行偶联降解地反应。循环次数受Edman反应产率的限制。按照常规条件进行SDS-PAGE，将电泳完毕的凝胶按照海绵，滤纸，PVDF膜，凝胶，滤纸，海绵的次序将电印迹夹层装好，并放入小型电转槽中，在50V(100-170mA)于室温下进行电印迹转移，转移时间为2小时。取出PVDF膜并用去离子水略为漂洗，用甲醇浸泡数秒钟，用丽春红(Ponceau S)染色。蛋白质N末端测序是采用Edman降解法，N端氨基酸残基的序列由AppliedBiosystems公司的PROCISE蛋白质测序仪测定，此酶的N端氨基酸序列为Gln-Asp-Arg-His-Gly-Val(谷氨酰胺-天冬氨酸-精氨酸-组氨酸-甘氨酸-缬氨酸)简写为：QDRHGV。

Claims (4)

1.一种Pseudomonas.sp.HZJ216菌株，该菌种保藏单位：中国典型培养物保藏中心。地址：中国武汉，武汉大学。保藏日期为2009年10月29日，保藏号为M209241。

2.Pseudomonas.sp.HZJ216菌株的遗传标志是16SrDNA核酸序列为：

CCCCAGGCGTAGGCTACCATGCGTGTCGAGCGGTAGAGAGAAGCGTGCTTCTCTTGAGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATG

CCTAGGAATCTGCGTGGTAGTGGGGGATAACGTTCGGAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGG

GGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGA

TCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTAATACGGGAGGCAGCAGTGGGG

AATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAG

TTGGGAGGAAGGGTTGTAGATTAATACTCTGCAATTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGC

AGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGGA

TGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCAAAACTGACTGACTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCT

GTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTAATACTGACACTGAGGT

GCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGAAGCCT

TGAGCTTTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTG

ACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAAT

GAACTTTCTAGAGATAGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGA

TGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGC

CGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATG

GTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACT

CGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCG

CCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTACCACGGTGATCTGCTT

3.一种Pseudomonas.sp.HZJ216菌株产生的褐藻胶裂解酶，其分子量为60.25kDa，

4.一种Pseudomonas.sp.HZJ216菌株产生的褐藻胶裂解酶，N端氨基酸序列为Gln-Asp-Arg-His-Gly-Val(谷氨酰胺-天冬氨酸-精氨酸-组氨酸-甘氨酸-缬氨酸)。

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