CN109294949A - 高效结冷胶裂解酶产生菌及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种假单胞菌及其用途，具体而言，本发明公开了一种高效结冷胶裂解酶产生菌PE5(假单胞菌PE5)，为Pseudomonas hunanensis，其保藏号为：CGMCC NO:16440。本发明还同时公开了上述高效结冷胶裂解酶产生菌PE5的用途：产生高效结冷胶裂解酶。

Description

高效结冷胶裂解酶产生菌及其用途

技术领域

本发明涉及一种假单胞菌(高效结冷胶裂解酶产生菌)及其用途。

背景技术

微生物多糖作为发酵工业产品，不仅性能优良且具备许多其它同类多糖所欠缺的特殊功用，比动植物多糖应用更广泛，且其生产不受地理环境、气候、自然灾害等因素的影响，生产周期短，产量及质量稳定，性价比较高；在很大程度上能满足人们对天然无公害食品的需求。结冷胶是一种新型的微生物多糖，于1978年被发现，是伊乐鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas elodea)在有氧条件下发酵产生的线性阴离子杂多糖。先后在日本、美国、欧盟及我国获得批准作为食品添加剂应用于各类食品中。其理化性质及凝胶性能优越，逐步作为新型乳化剂、悬浮剂、增稠剂、稳定剂、凝胶剂、缓释剂、成膜材料等日益应用于食品、医药、化工等领域，甚至已逐步取代卡拉胶、琼脂等同类食品添加剂，且市场需求量在逐年增加，其年增长率在30％以上。

但是由于结冷胶的高粘度及高分子量限制了其应用范围的进一步扩展，目前拥有的工业化裂解结冷胶的方法为辐照裂解和酸性裂解，其通过相应物理或化学手段降低结冷胶的分子量，但两种方法都存在裂解速率慢，裂解产物不可控等缺陷，限制了其工业应用的进一步发展。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种高效结冷胶裂解酶产生菌PE5(假单胞菌PE5)及其用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种高效结冷胶裂解酶产生菌PE5(假单胞菌PE5)：为Pseudomonas hunanensis，其保藏号为：CGMCC NO:16440。

本发明还同时提供了上述高效结冷胶裂解酶产生菌PE5的用途：产生结冷胶裂解酶(为高效结冷胶裂解酶)。

本发明的菌株PE5，保藏名称为Pseudomonas hunanensis，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC NO.16440，保藏时间2018年09月07日。

本发明利用该菌株生产高效结冷胶裂解酶并提供了裂解酶活性检测方法，并且同现有裂解酶菌株酶学活性对比研究表明，PE5(Pseudomonas sp.)裂解酶活性极高，并且其裂解产物为具有生理活性的功能性寡聚糖，具有极高的发明应用价值。

本发明所采用的结冷胶裂解酶活测定方法：结冷胶裂解酶活检测采用0.05％的生物技术级结冷胶为底物，与粗酶液混合后验证在235nm条件下吸收峰，建立酶学裂解曲线，确定裂解酶活性。

本发明采用的酶学裂解，酶作为一种特殊的催化剂，具有极强的底物特异性和产物专一性且裂解产物分子量可控，便于后续分离提纯，因此酶解是目前最理想的裂解方法。使用酶法裂解结冷胶可以轻易实现对反应情况的实时监控，及时对相关条件进行调整，达到获得对应分子量的结冷胶裂解产物的目的，而且与物理和化学方法相比，该方法在较为温和的条件下进行，不需加入多种化学试剂，故对环境污染相应较少。并且，据本发明人查阅相关文献和书籍，目前国内外还未发现有关结冷胶高效裂解酶工业化应用的报道，本发明为酶法裂解结冷胶工业化应用的实现打下了坚实基础。

综上所述，本发明是针对现有工业裂解结冷胶技术的缺陷，改善辐照裂解和酸性裂解两种现行方法的不足，创新性的使用适合工业化生产的具有高效裂解结冷胶能力的裂解酶生产菌株，为实现目前最理想裂解方法---酶学裂解的工业化应用打下坚实基础。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为菌株电镜照片。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

结冷胶，CAS:[71010-52-1]，例如可购自生工生物工程(上海)公司。

实施例1：高效结冷胶裂解酶产生菌PE5(假单胞菌PE5)

筛选方法为：配置改良MM基础筛选培养基，使用结冷胶为唯一碳源与凝固剂，土壤样本1g使用9ml无菌水溶解，涂布于平板内，培养箱内30℃培养，随着菌株利用分解结冷胶，平板上会产生明显孔洞，由此筛选产生的成型菌株具有裂解使用结冷胶的能力，其中平板内空洞最为明显的为高效结冷胶裂解酶产生菌PE5(假单胞菌PE5)。

将菌株PE5进行了保藏，保藏名称为Pseudomonas hunanensis，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC NO.16440，保藏时间2018年09月07日。

该菌株PE5的各项特征如下：

一、菌株PE5(假单胞菌PE5)的形态特征与生理生化特征：

1、菌株PE5在改良MM固体培养基上培养，培养条件：生长环境pH7.0～7.2，培养温度30℃培养箱；

改良MM固体培养基的配方为：20g结冷胶、硝酸铵1.0g、磷酸二氢钾0.5g、磷酸氢二钠1.5g、氯化钠1.0g、自来水1000ml，调节pH为7.2；最后加入七水硫酸镁0.2g。

培养96h后，在平板上产生明显凹陷，形成的菌落成圆型，边缘齐整，表面光滑湿润，菌落成淡黄色不透明，形成的菌落大小为0.8-1.5mm。菌株革兰氏染色可变，该菌为直状革兰氏阴性杆菌，细菌无核，以极生鞭毛运动，不形成芽孢，无荚膜，化能有机营养，严格好氧，呼吸代谢，从不发酵。杆状，长2.3-3.1μm，宽0.4-0.9μm，周身鞭毛，有氧化酶、接触酶活性，具有极强裂解使用结冷胶，降低结冷胶分子量及粘性的作用。在培养后的平板滴加刚果红染色剂，能产生明显的淡黄色多糖结冷胶降解圈。

2、菌株PE5的生理生化特征

菌株PE5能水解淀粉，氧化酶阴性，吲哚试验阴性，不产生色素，不能氧化乙醇到乙酸，不能液化明胶，不产生H₂S，不能利用柠檬酸盐、丙二酸盐，不能利用纤维二糖、D-甘露糖、L-阿拉伯醇、古老糖、D-塔格糖、D-海藻糖、D-甘露醇，能利用硝酸钠、氯化铵、硝酸铵、硫酸铵；精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、七叶苷、氨对、枸橼酸盐、尿素生化阳性，硝酸盐还原、靛基质、ONPG、蔗糖、麦芽糖、木糖、葡萄糖、硫化氢、甲基红、维普、靛基质均显阴性；与现存菌株相比在单糖、二糖利用上能力较弱，适应于多糖能源转化利用。

二、菌株PE5的分子生物学鉴定

PCR扩增和序列分析：采用chelex-100基因组提取DNA；正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCMTGCTCAG-3′，反向引物1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。反应体系50ul。

反应条件是94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min。PCR产物的纯化、克隆、测序由上海生物工程有限公司完成，所测序列与Ezbiocloud进行同源性比较，该菌株16S rRNA序列与Pseudomonas sp.的相似度为98.2％。

该菌株16S rRNA序列如序列表所述。

实施例2、菌株PE5的生长特性：

1、培养基：

LB培养基(LB液体培养基)：酵母提取物5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，自来水1000ml，pH7.4。

改良MM基础培养基：结冷胶0.5％、硝酸铵1.0g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钠1.5g/L、氯化钠1.0g/L、七水硫酸镁0.2g/L(最后放)，调节pH为7.2。

即，改良MM基础培养基为：5g结冷胶、硝酸铵1.0g、磷酸二氢钾0.5g、磷酸氢二钠1.5g、氯化钠1.0g、自来水1000ml，调节pH为7.2；最后加入七水硫酸镁0.2g。

PY发酵培养基的组成：结冷胶0.2％、酵母提取物0.1％、蛋白胨0.2％；pH7.0。

即，PY发酵培养基为：2g结冷胶、1g酵母提取物、2g蛋白胨、自来水1000ml，pH7.0。

2、种子液的制备；将一接种环的保存在改良MM基础培养基上的菌接种到100ml LB液体培养基中，转速200r/min，30℃培养24h；得种子液。

3、温度对生长的影响：

将种子液接稀于PY发酵培养基，种子液：PY发酵培养基＝1:9的体积比；

转速200r/min，分别在不同温度下培养不同的时间，测定细胞浓度；该菌的生长温度范围为10-40℃，其中30℃为最适生长温度。

4、pH对生长的影响：

PY发酵培养基灭菌后用2M盐酸和1M氢氧化钠调pH，使灭菌后发酵培养基的pH分别为3-12之间，于28℃培养24h，其他条件同上，测定细胞浓度。

该菌的生长pH范围为4-11，最适生长pH为7。

综上所述，菌株PE5生长温度范围为10-40℃，最适生长温度为30℃；生长pH范围为4-11，最适生长pH范围为7。

实施例3：利用假单胞菌PE5生产结冷胶裂解酶的方法，依次进行以下步骤：

1)、将一接种环的假单胞菌PE5转接至100ml LB液体培养基于200r/min，30℃进行富集培养，培养时间为24h；得富集培养液。

2)、将步骤1)所得的富集培养液接至PY发酵培养基内于200r/min，30℃进行活化培养，培养时间为36h，富集培养液：PY发酵培养基＝1:9的体积比；

所得的活化培养液于4℃条件下，8000rpm，离心15min，收集上清液(位于上层)。

3)、将上清液全数加入10KDa孔径大小的超滤管7000rpm，20min，使用移液器吸取4℃预冷的5ml,0.01M,pH7.0的Tris-HCl缓冲液冲洗超滤膜，来回抽吸数次保证裂解酶充分洗脱，获得粗酶液。

实施例4：结冷胶裂解酶粗酶液(实施例3所得)的活性检测的方法，

1)、按照1：1的体积比将Tris-HCl缓冲液(0.01M,pH7.0)与PY发酵培养基混合均匀，在235nm测量OD值，以此为空白对照组。

2)、配置Tris-HCl缓冲液(0.01M,pH7.0)，加入0.05％的结冷胶作为底物(即，在1LTris-HCl缓冲液中加入0.5g的结冷胶)；

按照1：1的体积比将粗酶液与底物混合均匀，分别在235nm测量OD值，确定酶学活性。

因结冷胶在裂解酶作用下产生的产物会产生双键，因而在235nm条件下会存在吸收峰，随着裂解作用时间的变化，裂解产物的堆积，OD值会不断增加，因此比较设定的裂解时间(例如24h)的OD值与空白对照组OD值的差值，可以得出结冷胶裂解酶裂解结冷胶的结果。

实施例5、结冷胶裂解酶粗酶液(实施例3所得)的性质

1、酶作用温度对酶活的影响：

将得到的粗酶液分别在25℃、30℃、40℃、45℃、条件下测定酶活力(酶活力的测定方法如实施例4所述)，发现酶的最适反应温度是30℃。OD值具体如表1所述。

表1、温度对结冷胶裂解酶活力的影响

总结：该酶的最适反应温度是30℃，20℃时有约47％的残余酶活，70℃时有约19％的残余酶活；该酶在30℃稳定性最好，随着温度的升高，稳定性逐渐下降，30℃的半衰期为36h，35℃的半衰期为24h，40℃的半衰期为6h。

2、酶作用pH对酶活的影响：将得到的粗酶液分别在pH2、3、4、5、6、7、8、9、10条件下测定酶活力，发现酶的最适反应pH为5-8。具体如表2所示。

表2、pH对结冷胶裂解酶活力的影响

总结：该酶的最适反应pH为5-8，该酶在pH2时有14％的残余酶活，在pH 10时有72％残余酶活；该酶在pH 6-8时稳定性较好，在中性环境中酶活力较稳定。

3、酶的热稳定性：粗酶液分别在30℃、35℃、40℃条件下分别保温3h、6h、12h、24h、36h，48h在40℃测定剩余酶活力。发现该酶在30℃稳定性最好，随着温度的升高，稳定性逐渐下降，30℃的半衰期为36h，35℃的半衰期为24h，40℃的半衰期为6h。

4、酶的pH稳定性：将粗酶液在30℃不同pH条件下保温1h后在最适反应温度条件下测定剩余酶活力，该酶在pH 6-8时稳定性较好，在中性环境中酶活力较稳定。

5、酶的离子及抑制剂作用：将粗酶液在30℃，pH7.0条件下测量在不同金属氯盐中及部分抑制剂内的裂解酶活性，可得Ba²⁺、Ca ²⁺、Na⁺对该酶活有促进作用，Mg²⁺、K⁺对酶活没有影响，EDTA、urea能够强烈的抑制酶活。

表3、离子及抑制剂作用对结冷胶裂解酶的影响

总结：Ba²⁺、Ca²⁺、Na⁺对该酶活有促进作用，Mg²⁺、K⁺对酶活没有影响，EDTA、urea能够强烈的抑制酶活。

实验1、裂解结冷胶

利用实施例3所得的结冷胶裂解酶粗酶液裂解结冷胶，使用Tris-HCl缓冲液(0.01M,pH7.0)配置0.1％的结冷胶溶液，测量起始235nm条件下吸光度为空白对照，按照1:1的体积比加入粗酶液混合均匀，测量24h条件下的吸光度值，两者差值即为结冷胶裂解产生的寡糖数量。

对比本发明实验过程中筛选到的各类结冷胶裂解酶产生菌(PE1、PE3、PE4)、以及别的类似菌的在相应条件下的吸光度差值(见表4)，确定PE5菌株具有极强裂解使用结冷胶，降低结冷胶分子量及粘性的作用，且裂解速率高，裂解酶活力强的技术优势。

表4

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江理工大学

杭州凉凉生物有限公司

<120> 高效结冷胶裂解酶产生菌及其用途

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1458

<212> DNA

<213> Pseudomonas hunanensis

<400> 1

acacatgcaa gtcgagcggt aacagagagt agcttgctac tttgctgacg agcggcggac 60

gggtgagtaa tgcttgggaa tatgccttat ggtgggggac aacagttgga aacgactgct 120

aataccgcat gatgtctacg gaccaaagtg ggggaccttc gggcctcacg ccataagatt 180

agcccaagtg ggattagcta gttggtgagg taatggctca ccaaggcgac gatccctagc 240

tggtttgaga ggatgatcag ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 300

gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg caagcctgat gcagccatgc cgcgtgtgtg 360

aagaaggcct tcgggttgta aagcactttc agtaaggagg aaaggttaag tgttgatagc 420

acttagctgt gacgttactt acagaagaag caccggctaa ctccgtgcca gcagccgcgg 480

taatacggag ggtgcgagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgtac gcaggcggtt 540

tgttaagcga gatgtgaaag ccccgggctc aacctgggaa ctgcatttcg aactggcaaa 600

ctagagtgtg atagagggtg gtagaatttc aggtgtagcg gtgaaatgcg tagagatctg 660

aaggaatacc gatggcgaag gcagccacct gggtcaacac tgacgctcat gtacgaaagc 720

gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gtctactaga 780

agctcgactc ttcggagttg tttttcaaag ctaacgcatt aagtagaccg cctggggagt 840

acggccgcaa ggttaaaact caaatgaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg 900

tggtttaatt catgcaacgc gaagaacctt acctacgctt gacatacaga gaacttacca 960

gagatggttt ggtgccttcg ggaactctga tacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg 1020

tgttgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccctatcctt agttgccagc 1080

gattcggtcg ggaactctaa ggagactgcc ggtgataaac cggaggaagg tggggacgac 1140

gtcaagtcat catggccctt acgtgtaggg ctacacacgt gctacaatgg cgcatacaga 1200

gtgctgcgaa cctgcgaggg taagcgaatc acttaaagtg cgtcgtagtc cggattggag 1260

tctgcaactc gactccatga aatcggaatc gctagtaatc gcatatcaga atgatgcggt 1320

gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg gttgctccag 1380

aagtggatag tctaaccttc gggaggacgt tcaccacgga gtgattcatg actggggtga 1440

agtcgtaaca aggtaacc 1458

Claims (2)

1.高效结冷胶裂解酶产生菌PE5，其特征在于：为Pseudomonas hunanensis，其保藏号为：CGMCC NO:16440。

2.如权利要求1所述的高效结冷胶裂解酶产生菌PE5的用途，其特征在于：产生结冷胶裂解酶。