JPH02227069A

JPH02227069A - 細菌の培養法

Info

Publication number: JPH02227069A
Application number: JP1046818A
Authority: JP
Inventors: Hideaki Yamada; 秀明山田; Toru Nagasawa; 長沢　透
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1989-02-28
Filing date: 1989-02-28
Publication date: 1990-09-10
Anticipated expiration: 2010-06-07
Also published as: JPH0753104B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の背景〕本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性の高いロドコッカ
ス属ロドクロウス種の菌体を高収量で生産する方法に関
する。

近年、微生物、酵素またはそれらを固定化して種々の単
位化学反応や複合化学反応の触媒として利用しようとす
る動きが盛んになってきている。

ニトリルヒドラターゼはニトリル類を水和して相当する
アミド類を生成させる酵素として、本発明者の中の山田
らにより見出されており（Ａｇｒｌｃ。

Ｂｌｏｔ、　Ｃｈｅｌｌ、　４６１１６５　（１９８２
）参照〕、その具体的利用例としてニトリルヒドラター
ゼを有する細菌を用いてニトリル類からアミド類を製造
する方法が提案されている〔特公昭５９−３７９５１号
公報参照〕。

さらに、本発明者らは先に、本発明のロドコッカス属ロ
ドクロウス種の細菌を用いた、特に芳香族ニトリル類か
らのアミド類の製造に適した、アミド類の製造方法を提
案している〔特願昭６３−２３１７４４号明細書参照〕
。このような場合に、ニトリルヒドラターゼ活性の高い
ロドコッカス属ロドクロウス種の細菌菌体が高収率で取
得できれば禅益するところは大きい。

〔発明の概要〕

要旨本発明は上記の点に解決を与えることを目的とし、該細
菌の培養に際して、培地中に特定の物質、すなわち特定
の尿素誘導体およびコバルトイオン、を存在させること
によって、この目的を達成しようとするものである。

従って、本発明によるニトリルヒドラターゼ活性の高い
ロドコッカス属ロドクロウス種の細菌の培養方法は、ロ
ドコッカス属ロドクロウス種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ
　ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ　）に属してニトリルヒドラ
ターゼを産生ずる能力を有する細菌を培養してニトリル
ヒドラターゼ酵素活性を有する細菌菌体を製造するに際
し、培地中に下記Ｉ〜ＩＶ式で示される尿素誘導体の少
なくとも１種およびコバルトイオンを存在させること、
を特徴とするものである。

ＲＩＲ２ＮＣＯＮＲ３Ｒ４〔Ｉ〕（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ−
Ｈ，−ＣＨ３、または−Ｃ２Ｈ５基を表す。

ただし、すべてが−Ｈである場合を除く。）ＲＲＮＣＯ
ＯＣ２Ｈ５（ＩＩ）（ここで、ＲおよびＲ６は、それぞれ−Ｈ２Ｓ −ＣＩ　　　または−Ｃ２Ｈ５基を表す。）３ゝＮ　Ｈ２ＣＳ　Ｎ　Ｈ２（ＩＩＩ）ＣＨ３ＣＯＮ　Ｈ２（ＩＶ）効果培地中に式Ｉ〜ＩＶ式で示される特定の尿素誘導体の少
なくとも１種およびコバルトイオンを存在させてロドコ
ッカス属ロドクロウス種の細菌の培養を行なうと、単位
培養液当りのニトリルヒドラターゼ活性が極めて顕著に
増大する。

この単位培養液当りのトニリルヒドラターゼ活性の増大
は、菌体の濃度（すなわち、菌体の収量）および（また
は）菌体の活性（すなわち、菌体内のニトリルヒドラタ
ーゼの量）の増大に因るものと解される。

本発明において、尿素誘導体およびコバルトイオンの存
在は特に後者に有効である。

〔発明の詳細な説明〕

１、ロドコッカス属ロドクロウス種細菌本発明において
使用す°る細菌は、ニトリルヒドラターゼ活性を有し、
ニトリル、特に芳香族ニトリル、を水和して対応アミド
を生成させることができるロドコッカス属ロドクロウス
種の細菌である。具体的には、例えば、前記特願昭６３
−２３１７４４号明細書に記載のロドコッカス・ロドク
ロウスＪ−１株（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｈｏｄｏ
ｃｈｒｏｕｓＪ−１）微工研条寄第１４７８号（ＦＥＲ
Ｎ　ＢＰ−１４７８）を挙げることができる。この菌の
詳細は、前記特願昭６３−２３１７４４号明細書に記載
されていて、具体的には下記の通りである。

（１）由来および寄託Ｊ−１株は、本発明者らが京都市左京区の土壌から採取
したものであって、昭和６２年９月１８日に工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託されて、ＦＥＲＭ　　ＢＰ
−１４７８号の受託番号を得ている。

（２）　　′ｒＲ学的性質（ａ）形　態（１）細胞の形および大きさ　　。、９〜１．。ｕｘ３
〜１ｏｕ（２）細胞の多形性の有無　　　培養初期に長
稈状を呈し、楔棒状で湾曲なくスナツピングを伴った発
育を示し、のちに短桿菌状に断裂する（３）運動性　　　なしく４）胞子の有無　　　　　　な　しく５）ダラム染色性　　　　　　陽　性（８）抗酸性　
　　陰性（７）真東小体　　　　　　認められる（ｂ）各培地に
おける生育状態（３０℃）（１）肉汁寒天平板培養　　
　　直径１＋ｍ（４８時間）円形、不規則、平滑で表面
乾き気味、扁平、不透明、淡オレンジピンク色（２）肉汁寒天斜面培養　　　　糸状、表面平滑、断面
はやや隆起状で乾き気味、淡オレンジピンク色（３）肉汁液体培養　　　　　　菌膜を形成し、旺盛に
発育する。生育するにしたがって、中程度の濁り、沈澱を生ずる。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養（５）リドマスミルク（ｃ）生理学的性質（１）硝酸塩の還元（２）脱窒反応（３）ＭＲテスト（４）ＶＰテスト（５）インドールの生成（６）硫化水素の生成（７）デンプンの加水分解（８）クエン酸の利用（９）無機窒素源の利用（ｌＯ）色素の生成（１１）ウレアーゼ（１２）オキシダーゼ表面に良く生育、穿刺部にそってロート状に発育するが、下層部にはほとんど発育しない。ゼラチンは、液化は認められない。

変化しない陽性陰性陰性陰性陽性陽性陰性コーサーの培地：陰　性クリステンセンの培地：陽　性硝酸塩：陽　性アンモニウム塩二陽　性陰性陽性陰性（１３）カタラーゼ　　　　　　　陽　性（１４）セル
ロースの加水分解　　陰　性（１５）生育の範囲　　　
　　　　ｐＨ：５〜１０温度＝１０〜４１℃ （１６）酸素に対する態度　　　　好気性（１７）チロ
シンの分解　　　　陽　性（１８）アデニンの分解　　
　　陽　性（１９）ホスファターゼ　　　　　陽　性（
２０）Ｔｗｅｅｎ８０加水分解　陽　性（２１）Ｏ−Ｆ
テスト　　　　　　０（弱い）（２２）耐熱性（１０％
スキムミルク中７２℃、１５分）なしく２３）糖から酸およびガスの生成酸の生成　ガスの生成Ｌ−アラビノースＤ−キシロースＤ−グルコースＤ−マンノースＤ−フラクトース麦芽糖＋＋＋ショ糖乳糖トレハロースＤ−ソルビットＤ−マンニットグリセリン（２４）単一炭素源としての生育イノシトール麦芽糖Ｄ−マンニットラムノースＤ−ソルビットｍ−ハイドロキシ安息香酸アジピン酸ナトリウム安息香酸ナトリウムクエン酸ナトリウム乳酸ナトリウムテストテトロンＬ−チロシングリセロール（１％）　（Ｖ／Ｖ）十＋＋＋＋＋トレハロース（＋）（２５）脂肪酸と細胞壁分析（＋）弱いが陽性である。

不飽和、飽和直鎖脂肪酸、およびラベルクロステアリン酸を含む。ミコール酸のＴＬＣは単一スポットを与える。

以上の菌体的性質をバージ−の細菌付類書（［３ｅｒｇ
ｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　
Ｉ３ａｃｔｅｒｌｏｌｏｇｙ　）（１９８Ｇ）に基づい
て分類すると、Ｊ−１株は、好気性、グラム陽性、弱抗
酸性、カタラーゼ陽性の内生胞子を生じない桿菌であり
、鞭毛をむ生じない。また、発育の初期過程で長桿菌状
で菌糸状を呈し、枝分れ（Ｂｒａｎｃｈｌｎｇ　）を伴
なった発育を示し、後に短桿菌状に断裂することよりノ
カルデイア型の細菌に属するものと認められる。

脂肪酸組成の分析は、ラベルクロステアリン酸を含む不
飽和、飽和の直鎖脂肪酸を含む。ミコール酸のＴＬＣは
標準画Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ
（ＩＰｏ　３３３ｇ）と同じＲｆを示す単一スポットを
与えることから、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属とは区
別される。

またミコール酸の組成（炭素数）からＮｏｃａｒｄｉａ
属とは区別される。その他生化学的諸性質の検討から、
本成はＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｈｏｄｏｃｈｏｕｓ
と認められる。

２、尿素誘導体本発明において尿素誘導体は酵素誘導剤として作用する
が、本発明のようなニトリルヒドラターゼの誘導に尿素
誘導体が有効であることは、従来の知見からは全く意外
なことである。

式Ｉで示される化合物としては、例えばメチル尿素、エ
チル尿素、１．１−ジメチル尿素、１゜３−ジメチル尿
素等が挙げられる。

式■で示される化合物としては、例えばウレタン、メチ
ルウレタン等が挙げられる。

式■はチオ尿素、弐■はアセトアミドである。

尿素誘導体を培地中に存在させるには、これを培地に一
時に、あるいは逐次的に添加する。「逐次的」とは、連
続的または間歇的いずれをも意味するものである。

３、コバルトイオン上記の酵素誘導剤である尿素誘導体を培地に存在させて
もニトリルヒドラターゼは得られないので、本発明では
培地にコバルトイオンを存在させることが必須である（
本発明の細菌のニトリルヒドラターゼの産生にコバルト
イオンの存在が必須であることは、前記特願昭６３−２
３１７４４号明細書に記載の通りである）。

コバルトイオンは、培地が水性であるところより、水溶
性コバルト化合物を培地に添加することによって生成さ
せることがふつうである。水溶性のコバルト化合物は化
学辞典類の明らかにするところであり、適当なものを選
択使用することは当業者にとって容易であろう。代表的
なコバルト化合物は例えばＣｏ　　またはＣｏ　　　を
与えるもの、特に、ＣＯを与えるもの、であって、具体
的には塩化コバルト、硫酸コバルト、酢酸コバルト、臭
化コバルト、硼酸コバルトを例示することができる。

この他、本発明ではビタミンＢ１□および金属コバルト
もコバルト源として使用することができる。

ビタミン”１２中にはコバルトが錯体として含まれてお
り、培養の際イオン化する。また、金属コバルトは培養
中機生物による酸化力でイオン化する。

４、培養／ニトリルヒドラターゼの産生本発明のロドコ
ッカス属ロドクロウス種細菌の培養は、培地に尿素誘導
体およびコバルトイオンを存在させるということを除け
ば、他の条件に関してはそれが合目的的なものである限
り制限はない。

例えば、下記のような基本培地に尿素誘導体およびコバ
ルトイオンを所定量存在させて１５〜５０℃程度、好ま
しくは２０〜４５℃程度、特に好ましくは３０℃前後、
の温度で、ｐＨ７〜９で、約３０時間以上、好ましくは
４０時間以上（上限は、例えば１２０時間）、培養を行
なえばよい。

培地中の尿素誘導体の濃度は１〜３０ｇ／リットル、好
ましくは２〜２０ｇ／リットル、より好ましくは５〜１
５ｇ／リットル、程度およびコバルトイオンの濃度はＣ
ｏ　Ｃ１２換算で５〜１５膳ｇ／リットル程度である。

基本培地：培地Ａ成　　　　　分に２ＨＰＯ４Ｈ２ＰＯ４ａＣ１量（培地１リツトル中）１３．４ｇ６．５ｇ１．０ｇ０．２ｇ０９１ｍ１（ｐＨ７，０）ＭｇＳ０４・７Ｈ２０ビタミン混合物本１蒸留水　　　　　　　　　　残部＊ｌ　組　成（溶液１リツトル中）ビオチンパントテン酸カルシウムイノシトールニコチン酸塩酸チアミン塩酸ピリドキシンｐ−アミノ安息香酸リボフラビン葉酸０ｇｇ４ｍｇＯ＋ａｇ４ａ＋ｇ４ｍｇ４ｍｇｎｇ４ｍｇ１ｎｇ蒸留水培地Ｂ２ＨＰ０４Ｈ２ＰＯ４Ｍｇ５ＯΦ７Ｈ２０イーストエキス蒸留水培地Ｃグルコースに２ＨＰＯ４Ｈ２ＰＯ４Ｍｇ５Ｏ・７Ｈ２０イーストエキスペプトン蒸留水５、実験例活性の測定および定義（１）ニトリルヒドラターゼ活性の測定法ニトリルヒド
ラターゼ活性は、基質として３シアノピリジン（ＩＭ）
　、１．０ｍｌリン酸カリウ０ｇ０、５０、５０、５１、　０７．５残部（ｐＨ７，２）残部０、５ｇ０．５ｇ０、５ｇ３．０ｇ残部（ｐＨ７，２）ムバッフ７−　（０，１Ｍ％ｐＨ７，０）０．５ｍｌお
よび所定量の菌体（培養液から分離したもの）を含む反
応混合液２ｍｌについて、２０℃で所定時間反応を行な
わせてから０．２ｍｌのＩＮ　　ＨＣＩを添加して反応
を停止させることによって７ｉｐｌ定した。

（２）活性の定義活性は、比活性（Ｓ、　Ａ、　）および全活性（Ｔ、Ａ
、）について調べた。これらは、下記の通り定義される
。

Ｓ、　Ａ、　　：μモル各アミド／ＩＩ１ｇ−菌体・分
子、　Ａ、　　；μモル各アミド／ｍｌ−培地・分実施
例ｌＣｏＣｌ２１０ｍｇ／リットルを含む前記基本培地Ｃに
所定量の尿素誘導体を添加し、それぞれの培地６０ｍ１
にロドコッカス・ロドクロウス１１株（ＰＥＲＭ　ＢＰ
−１４７８）の前培養液（前記基本培地Ｃ使用）４ｍｌ
を加えて、２８℃で９６時間振丑培養を行なった。

なお、比較のため、尿素誘導体としてメチル尿素または
Ｃｏ　Ｃ１２のみを添加したものについても同様に培養
を行なった。

結果を表−１に示した。表−１には、その間の活性の測
定において、それぞれ最高の全活性（Ｔ。

Ａ、　）が得られたときの数値を示した。

これより、尿素誘導体およびＣｏ　Ｃｌ　２両者の添加
がニトリルヒドラターゼの生産増大に必須であることが
分かる。

Claims

【特許請求の範囲】１、ロドコッカス属ロドクロウス種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）
に属してニトリルヒドラターゼを産生する能力を有する
細菌を培養してニトリルヒドラターゼ酵素活性を有する
細菌菌体を製造するに際し、培地中に下記 I 〜IV式で
示される尿素誘導体の少なくとも１種およびコバルトイ
オンを存在させることを特徴とする、ロドコッカス属ロ
ドクロウス種の細菌の培養法。Ｒ＿１Ｒ＿２ＮＣＯＮＲ＿３Ｒ＿４〔 I 〕にこで、Ｒ＿１、Ｒ＿２、Ｒ＿３およびＲ＿４は、それ
ぞれ−Ｈ、−ＣＨ＿３、または−Ｃ＿２Ｈ＿５基を表す
。ただし、すべてが−Ｈである場合を除く。）Ｒ＿５Ｒ＿
６ＮＣＯＯＣ＿２Ｒ＿５〔II〕（ここで、Ｒ＿５およびＲ＿６は、それぞれ−Ｈ、−Ｃ
Ｈ＿３、または−Ｃ＿２Ｈ＿５基を表す。）ＮＨ＿２Ｃ
ＳＮＨ＿２〔III〕ＣＨ＿３ＣＯＮＨ＿２〔IV〕２、ロドコッカス属ロドクロウス種に属してニトリルヒ
ドラターゼを産生する能力を有する細菌が、ロドコッカ
ス属ロドクロウスＪ−１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１４７８
）である、請求項１記載の細菌の培養法。３、培地中の尿素誘導体の濃度が１〜３０ｇ／リットル
である、請求項１〜２のいずれか１項記載の細菌の培養
法。４、培地中のコバルトイオンの濃度がＣｏＣｌ＿２換算で５〜１５ｍｇ／リットルである、請
求項１〜３のいずれか１項記載の細菌の培養法。