CN107603979B - 一种高效表达外源蛋白的启动子样基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效表达外源蛋白的启动子样基因，其是能够在原核细胞组成型表达外源蛋白的启动子样基因，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示或者为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的截短序列；该基因序列通过构建含氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）为报告基因的表达载体，将待筛选基因片段和筛选重组载体进行连接、转化、构建基因文库，采用氯霉素抗性筛选出含有启动子样基因序列的重组菌株，从而获得启动子样序列，该序列能够在原核细胞中高效的组成型表达报告基因氯霉素活性和外源蛋白。

Description

一种高效表达外源蛋白的启动子样基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种在原核细胞中组成表达外源蛋白的启动子样基因序列，用于在原核细胞中高效的表达外源蛋白。

背景技术

近些年，随着基因工程和分子克隆技术的发展，原核表达系统被越来越多的应用于外源蛋白的表达，外源蛋白的表达在抗体制备、药物合成和食品加工中发挥着越来越重要的作用。外源蛋白表达时，构建高水平表达异源蛋白的表达载体，启动子对外源基因的表达水平影响极大。启动子(promoter)是一段RNA聚合酶识别、结合和起始转录的特定DNA序列，它位于基因的上游。其长度因生物种类而异，一般不超过200 bp，分为组成型启动子和诱导型启动子。诱导型启动子就是在某些特定的物理或化学条件的刺激下，可以大幅度地提高基因的转录水平，其特点是启动子的作用受到物理或化学信号的诱导；而组成型启动子相比于诱导型启动子具有：表达持续时间久，RNA和蛋白质表达量相对恒定，它们不表现时空特异性，也不受外界因素的诱导。

本发明所筛选的组成型启动子样基因序列采用了启动报告基因表达的思路，即氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）组成型表达作为报告基因，在启动子样序列插入后，菌株表现出氯霉素抗性而且抗性得到提高，因而通过增加氯霉素浓度达到大规模筛选以获得相应的启动基因表达的序列。

目前发现的组成型启动子样序列（Constitutive Promoter，CP）一般具有特异性不高且蛋白的表达量低。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够在原核系统中高效表达外源蛋白的组成型启动子样基因，该启动子样基因ZJ-37核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的截短序列37T1。

本发明的组成型启动子样序列能够启动多种外源蛋白的表达，且蛋白表达水平相对于诱导性启动子没有明显差别，进而解决一些组成型启动子只能表达特异蛋白和产率低的问题。

本发明用抗生素基因CAT作为报告基因，筛选的组成型启动子37T1能够启动外源蛋白的高效表达，而且有一定的启动效果，在改善异源基因原核表达系统方面具有重要实用价值。

本发明中截短序列37T1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中的98~141bp所示，即如SEQID NO：2所示。

本发明首先提取云南昆明捞鱼河（北纬24°50′53″，东经102°51′50″）淤泥中混合菌基因组，酶切得到500bp以下DNA片段，由此构建到筛选载体报告基因CAT上游，通过氯霉素抗性报告基因筛选含启动子序列样的菌株，之后，对菌株的氯霉素抗性、启动子样截短序列的顺反性及启动外源蛋白表达的能力进行检测。

本发明通过如下技术方案实现本发明目的：

（1）构建含融合报告基因的重组筛选菌株

首先提取捞鱼河淤泥中混合菌基因组，酶切得到500bp以下DNA片段，利用同尾酶的特性连接到重组载体pCMR8a的CAT基因上游，转化入大肠杆菌感受态细胞中，培养；设置不同浓度梯度的氯霉素，筛选出在高氯霉素浓度下生长的菌株，即含启动子样基因序列且启动能力较强的菌株被筛选出来。

（2）同源性分析序列来源及筛选启动能力最强的启动子

在插入位点的上下游设计引物JD-CEXU-F/R，将引物和质粒送至测序公司，确定插入序列，并将这些序列在NCBI BLastN进行序列同源性检索分析序列来源；再通过SDS-PAGE检测CAT蛋白表达情况，对其进行灰度分析，从而确定出一个最强启动子。

（3）将最强启动子分不同截断序列，验证启动子的方向性

用在线分析工具Promoters预测最强启动子的核心区域，根据预测序列对这个启动子进行截短，删除启动子的冗余序列，得到启动子的核心区域37T1，用核心区域表达CAT蛋白并将其同原长的蛋白表达量进行对比，同时再将启动子的核心区域37T1反向插入到CAT基因前面，检测它能否反向启动蛋白表达。

（4）检测启动子启动外源蛋白的能力

将含有的37T1的重组载体pCMR8a，双酶切，去除CAT基因，然后将其他的外源蛋白基因插入到该CAT基因的位置，检测其他外源蛋白的表达情况，并以诱导型表达载体作为对照，比较本发明筛选得到的启动子37T1表达外源蛋白能力。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、在现有的表达系统中，往往会出现外源蛋白的表达水平低，导致这些基因工程的产品开发受限，本发明ZJ-37序列能够高效启动氯霉素抗性报告基因的表达，且能够高效启动多种其他外源蛋白在原核表达系统中的表达；

2、表达载体选自改造后的pET系列，ZJ-37序列可适用于原核表达系统的所有表达载体，提高了该序列应用到各原核表达系统的可能性，这对提高ZJ-37序列实用性具有重要的意义；

3、筛选得到的启动子ZJ-37是一个组成型启动子，具有持续表达的能力，而且ZJ-37基因截断序列37T1较短(44bp)，容易将它插入到其他的原核表达载体中，增加了它的适应性，扩大了应用范围。

附图说明

图1是改造pET载体图谱示意图，命名pCMR8a；

图2是抗性平板筛选得到的5个菌株的菌落PCR电泳示意图；其中泳道1：DNAMarker DL5000；泳道2-6是5个筛选菌株PCR条带；泳道7：空载的pCMR8a条带；泳道8：阴性对照；

图3是SDS-PAGE检测CAT蛋白的表达量示意图；其中泳道1：非预染蛋白分子量标准；泳道2：DH5α；泳道3：pCMR8a/DH5α；泳道4：pCMR8a-ZJ-1/DH5α；泳道5：pCMR8a-ZJ-21/DH5α；泳道6：pCMR8a-ZJ-32/DH5α；泳道7：pCMR8a-ZJ-37/DH5α；泳道6：pCMR8a-ZJ-45/DH5α；

图4是SDS-PAGE检测CAT蛋白表达的灰度分析示意图；

图5是对最强启动子截短后SDS-PAGE检测CAT蛋白表达情况示意图；其中泳道1：Protein Marker；泳道2： DH5α；泳道3：pCMR8a/DH5α，泳道4：pCMR8a-37T1/DH5α；

图6是反向后启动子PCR电泳示意图，其中泳道1：DNA Marker DL5000；泳道2：反向启动子；泳道3：空载的pCMR8a；

图7是SDS-PAGE检测37T1反向后启动CAT蛋白表达情况示意图；其中泳道1是Protein Marker；泳道2：pCMR8a/DH5α；泳道3：反向启动子蛋白表达情况；泳道4：pCMR8a-37T1/DH5α蛋白表达情况；

图8是SDS-PAGE检测37T1启动子表达谷胱甘肽（GST）蛋白示意图；其中泳道1是pCMR8a/DH5α；泳道2：37T1-GST-pCMR8a /DH5α；泳道3：GST-pET-28a/DH5α未诱导；泳道4：GST-pET-28a/DH5α诱导；泳道5：Protein Marker；

图9是SDS-PAGE检测GST蛋白表达的灰度分析示意图；

图10是Westernblotting检测37T1启动外源蛋白3AB表达情况示意图；其中泳道1：37T1-3AB-pCMR8a /DH5α；泳道2：pCMR8a/DH5α；泳道3：3AB-pET-28a/DH5α诱导EGFP为内参蛋白；

图11是Westernblotting检测外源蛋白3AB蛋白表达的灰度分析示意图；

图12是Westernblotting检测37T1启动外源蛋白TMEM120A表达情况示意图；其中泳道1：37T1-TMEM120A-pCMR8a /DH5α；泳道2： pCMR8a/DH5α；泳道3：TMEM120A- pET-28a/DH5α诱导EGFP为内参蛋白；

图13是Western blotting检测外源蛋白TMEM120A蛋白表达的灰度分析示意图。

具体实施方式

下面通过实施例结合附图进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容；实例中所用的方法是实验室常用的基因工程分子生物学克隆方法，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的；按照以下实施例，不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均落在本申请权利要求的范围内。

实施例1：构建筛选载体pCMR8a

由昆明硕擎生物技术有限公司合成引物catF/catR(上游引物catF：5ˊ-CGCCATATGGAG AAAAAAATCACTGGATAT-3ˊ，下游引物catR：5ˊ-CCGCTCGAGTTACGCCCCGCCCTGCCACTC -3ˊ)，通过上下游引物在载体pACYC184(购买于New England BioLabs公司，VKN0287)上扩增出CAT，Nde I、Xho I（购买于TAKARA，FD0584）双酶切CAT序列，连接到pET-28a (购买于Novagen，69864-3)载体上，形成pET-28a -CAT由昆明硕擎生物技术有限公司合成引物M28a_F/ M28a_R：(上游引物M28a_F：5ˊ-AGATCTGCGGCCGCA AGC TTGTCGACGGAGCTCGGATCCAAGGAGATATACATATGACACGAG-3ˊ；下游引物M28a_R：5ˊ-TCTAGACGCCGGCGTTCGAACAGCTGCCTCGAGCCTAGGTTCCTCTAT ATGTATACTGAGCTC-3ˊ)，将二者变性退火，形成首尾含有Bgl Ⅱ和XhoⅠ粘性末端序列片段，连接到用Bgl Ⅱ和XhoⅠ双酶切pET-28a-CAT上，构建出一个含多克隆位点的基因序列(GCGGCCGCAAGCTTGTCGACGGAGCTCGGATCCATCGATAAGGAGATATA)，在Bgl II、Nde I 两个酶切位点之间还插入了Hind III、Sal I、Sac I、BamH I、Cla I这些酶切位点以及核糖体结合位点(RBS)，即构建出了组成型启动子的筛选载体pCMR8a，如图1。

实施例2：基因文库的构建及启动子的初步筛选

从云南昆明捞鱼河取回的淤泥，加入无菌水成10%悬液，4℃过夜澄清，取上清10mL加入90mL的LB培养液，于37℃震荡培养，收集菌体，用试剂盒（购买于天根生化科技有限公司，DP302-02）提取基因组，再用Sau3A I (购买于TAKARA，1082A) 37℃酶切基因组过夜，用琼脂糖凝胶胶回收试剂盒(购买于北京庄盟国际生物基因科技有限公司，ZP202-02)回收500bp以下片段。用BamH I(购买于TAKARA，CKB701A)将载体pCMR8a单酶切30min；利用同尾酶的特性，用T4 DNA连接酶(购买于TAKARA，SD0268)将线性化的载体pCMR8a与胶回收的基因组片段连接，16℃酶连过夜，即基因组片段连接到CAT基因前面。连接产物通过转化到制备的E.coli DH5α(DH5α购买于TAKARA公司，D9057)，构建细菌基因组文库。

把基因组文库涂布在氯霉素(购自于Sangon Biotech，A110230-0010)浓度为8.5μg/mL，卡那霉素浓度为50μg/mL的平板上，37℃恒温室培养24h，有16个单菌落生长，即筛选出具有启动CAT基因表达的启动子基因序列有16个；然后升高氯霉素浓度，对含有启动子的菌株进一步筛选。将16个单菌落转接到氯霉素浓度分别为100、200、300、500、700、800、900、1000、1200μg/mL，Kan(购自于Sangon Biotech，A110408-005)浓度为1/1000的LB平板上，37℃恒温室培养24h，在氯霉素终浓度为1200μg/mL时有平板上有5个单菌落生长。这样就得到了5个启动能力较强的启动子样基因序列，分别命名为ZJ-1、ZJ-21、ZJ-32、ZJ-37、ZJ-45，如图2。

实施例3：比较筛选的5个启动子启动CAT能力，选出启动能力最强启动子基因序列

将筛选的5菌株，分别挑单菌落接种到5mL 含Kan抗生素LB液体培养基（酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCI 10g，ddH₂O定容至1L）中培养，测菌液OD₆₀₀值，当达到0.4~0.6时，按照1:100接种到新鲜含Kan抗生素5mL LB液体培养基中，在不同时间点(4、12、24、48h)根据菌液OD₆₀₀的值取样，SDS-PAGE检测CAT的表达情况，如图3，并进行量化。量化后结果如图4，在0-48h内随着时间延长，蛋白表达量先升高后下降，在12h时蛋白表达量最高，在24h时蛋白表达量有一定的降低，所以后续实验都选取12h进行检测；结果分析得出：ZJ-37号启动子的蛋白表达量相对最高，所以ZJ-37为最强启动子。

实施例4：对启动子样基因序列进行测定、分析、截短并验证其方向性

设计一条引物JD-CEXU-F序列为：5’-GTCGGCGATATAGGCGCCAGC-3’，（由昆明硕擎生物科技有限公司合成），并用该引物对ZJ-37启动子序列进行测序。

在http://molbiol-tools.ca/Promoters.htm网站对ZJ-37序列进行启动子区域预测分析，预测出启动子的-10区、-35区以及转录起始位点，以此为中心，确定了44bp的核心区域，命名为37T1，在昆明硕擎生物科技有限公司进行引物合成37T1F/37T1R (上游引物37T1F：5’- CCCAAG CTTTCAGGTTTGAATTTTGCAACAGTTCGTACCAT-3’下游引物37T1R：5’-CGGGATCCCAAGCTGAAAGTATGGTACGAACTGTTGCAAAAT-3’)。对核心启动子区进行扩增。用HindⅢ(购买于TAKARA，1060A)和BamHⅠ(购买于TAKARA，1010A)酶切后连接到同样用HindⅢ和BamHⅠ双酶切筛选载体pCMR8a中，即将启动子连接到CAT基因前面。连接产物通过热休克法转化CaCl₂制备的E.coli DH5α感受态细胞，然后涂布到含Kan抗生素的LB平板上，37℃培养24h。分别挑单菌落接种到5mL LB-Kan液体培养基中培养，当OD₆₀₀达到0.4~0.6时，按照1:100转接到新鲜的含Kan抗生素的5mL LB液体培养基中，在12h时取样，SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色，检测CAT的表达情况如图5。核心区域蛋白表达量灰度分析结果与全长进行方差分析误差为0.07，没有显著差异。然后在昆明硕擎生物科技有限公司合成引物(上游引物：5’- CGGGATCCTCAGGTTTGAATTTTGCAACAGTTCGTACCA T-3’，下游引物：5’- CCCAAGCTTCAAGCTGAAAGTATGGTACGAACTGTTGCAAAAT-3’)，即将37T1启动子上下游酶切位点HindⅢ和BamHⅠ进行交换，PCR扩增出37T1的反向启动子如图6。通过上述构建方式，把反向启动子插入到CAT前面，SDS-PAGE检测反向启动子能否启动CAT的表达，结果如图7，CAT蛋白没有明显条带，但重组转化后的菌液可以在氯霉素LB培养基中生长，故反向启动子可以启动CAT蛋白表达，但启动表达能力较低；37T1是一个双向启动子。

实施例5：构建内参载体，检测37T1启动GST、3AB-His、TMEM120A-HA外源蛋白表达的能力

1、37T1启动外源蛋白GST表达能力

GST（谷胱甘肽S转移酶）标签蛋白本身是一个在解毒过程中重要的转移酶，它的天然大小为26KD。将它作为外源蛋白检测启动子的启动能力是因为它可以在大肠杆菌中大量表达，起到提高表达量的作用。设计GST引物(上游引物GST1：5’- GGA ATT CCA TAT GTCCCC TAT ACT AGG TTA TTG-3’，下游引物GST2：5’- GAC CAT CCT CCA AAA TCG GAT CTCGAG CGG-3’) ，在昆明硕擎生物科技有限公司进行引物合成，以pET41a(购买于Novagen，70535-3)载体为模板PCR扩增出GST基因，用NdeⅠ和XhoⅠ酶切PCR产物、含有37T1启动子的pCMR8a的筛选载体和pET-28a载体，用小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（购自于ZOMANBIO，ZP202-02）回收。将得到的双酶切的GST基因与pCMR8a筛选载体和pET-28a载体，用T4 DNA连接酶16℃酶接过夜，产物转化至E.coli DH5α感受态，涂布在含Kan抗生素的LB平板，37℃恒温室培养24h，挑单菌落接种到5mL 含Kan-LB液体培养基中培养，酶切与测序验证。验证正确的样品按1:100转接新的Kan-LB液体培养基，在约12h时测菌液OD₆₀₀值为1.0，取500μl 的菌液12000rpm离心1min，用80μl ddH₂O重悬，沸水煮15min，加入20μl 的5×上样buffer沸水再煮15min。取30μl 煮好样品进行SDS-PAGE分析蛋白的表达量，并与pET-28a载体上的诱导型T7启动子进行对比，结果如图8、图9；组成型启动子37T1和T7启动子都启动表达了GST蛋白，且蛋白表达量相差不大。

2、设计内参载体，检测37T1启动外源蛋白3AB表达能力

由昆明硕擎生物科技有限公司合成序列（上游引物utp1：5’- GATCTTTTCTACGGGGTCTG-3'，下游引物utp2：5’-GCCAGTATATACACTCCGCT-3'），以pUT18C为模板，PCR扩增获得骨架片段。由昆明硕擎生物科技有限公司合成序列（上游引物p15a1：5’- GCCAGGAACCGTAAAAAGGCAGCGGAGTGTATATACTGGC-3'，下游引物p15a2：5’-CAGACCCCGTAGAAAAGATCACGTGTTCCGCTTCCTTTAG-3'），以pKT25为模板，获得p15A复制子序列，利用多片段同源重组试剂盒（诺维赞生物科技有限公司 C113-01/02）将二者连接到一起，就获得了pAT15载体。由昆明硕擎生物科技有限公司合成EGFP引物(上游引物EGFP1：5’- GGAATTCCATATGGTGAGCAAGGGCGA G-3'，下游引物EGFP2：5'- CCGCTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTC-3' )，以pEGFP-N2质粒为模板（Clontech，65081-1）PCR扩增出EGFP基因，构建到pAT15载体中，构建成内参载体EGFP-pAT18。

3AB是CVA16病毒的一种重要的结构蛋白，大小约为12KD。在病毒复制过程中，对病毒RNA的合成起关键作用。本实验旨在验证37T1启动子启动病毒蛋白的能力。在昆明硕擎生物科技有限公司全序列合成CVA16-3AB（GENBAK登录号：KF991007.1）基因，在其N端加上一个His标签，用EcoRI和BamH I酶切后连接到同样酶切的37T1-pCMR8a和pET-28a中,得到构建成功的37T1-3AB-pCMR8a和3AB-pET-28a。将EGFP-pAT18分别与pCMR8a、37T1-3AB-pCMR8a和3AB-pET-28a转于E.coliBL21感受态细胞中，涂布Kan、Amp双抗平板，37℃过夜。挑菌于5mL LB培养基中，37℃恒温培养，待菌液OD₆₀₀值为0.4~0.6时，加入IPTG诱导6h，收集样品，进行SDS-PAGE分析的步骤与GST蛋白相同，之后电转PVDF膜（购自于MILLIPORE，IPVH00010），10%的脱脂奶封闭过夜，用TPBS清洗三次，每次10min，用1：5000稀释的His-TagMouse mAb单克隆抗体(购自于天德悦北京生物科技用有限公司，TDY009C)作为一抗37℃孵育1h，TPBS漂洗三次，每次10min，用1:10000稀释的Goat anti-Mouse IgG(购自于KPL，074-1806)作为二抗，37℃孵育1h。TPBS漂洗三次每次15min，用化学发光HRP底物试剂盒（购自于MILLIPORE，WBKLS0100）显色，用X-OMAT BT Film（购自于Kodak，6535876）曝光；结果如图10所示，组成型启动子37T1较T7启动子启动3AB蛋白表达量偏低。

进行Western blotting鉴定内参EGFP的表达。步骤同上，不同之处用1:7000稀释的GFP-Tag Mouse mAb单克隆抗体(购自于天德悦北京生物科技用有限公司，TDY009C)作为一抗37℃孵育1h，TPBS漂洗三次，每次10min，用1:10000稀释的Goat anti-Mouse IgG(购自于KPL，074-1806)作为二抗37℃孵育1h；TPBS漂洗三次每次15min，用化学发光HRP底物试剂盒（购自于MILLIPORE，WBKLS0100）显色，用X-OMAT BT Film（购自于Kodak，6535876）曝光；结果如图10、11所示，EGFP为内参蛋白，且表达量基本一致。

3、37T1启动外源蛋白TMEM120A表达能力

在昆明硕擎生物科技有限公司全序列合成HepG2 HB-8065^TM TMEM120A（GENBAK登录号：NM-031925）基因，在其N端加上一个HA标签，将其分别连入pET-28a和37T1-pCMR8a中进行蛋白表达对比。实验步骤与表达3AB蛋白相同，不同之处是以HA-Tag Mouse mAb（1:1000）作为一抗；结果如图12、13，组成型启动子37T1较T7启动子蛋白表达效果偏低但区别不大；EGFP内参蛋白，表达量基本一致。

上述结果表明：与诱导型的启动子相比，组成型的启动子ZJ-37在大肠杆菌中具有较强启动外源蛋白表达的能力。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 一种高效表达外源蛋白的启动子样基因及其应用

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 166

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 1

gatgagtacg attgctgctg ctgatggttt aggtatgcct gtatcaacaa cacacgtttt 60

aaacagtgcg gttgcaggta cgatggtggc aaataaatca ggtttgaatt ttgcaacagt 120

tcgtaccata ctttcagctt gggtatttac cttacctgca acgatc 166

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> 细菌

<400> 2

tcaggtttga attttgcaac agttcgtacc atactttcag cttg 44

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgccatatgg agaaaaaaat cactggatat 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccgctcgagt tacgccccgc cctgccactc 30

<210> 5

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agatctgcgg ccgcaagctt gtcgacggag ctcggatcca aggagatata catatgacac gag 63

<210> 6

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tctagacgcc ggcgttcgaa cagctgcctc gagcctaggt tcctctatat gtatactgag ctc 63

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtcggcgata taggcgccag c 21

<210> 8

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cccaagcttt caggtttgaa ttttgcaaca gttcgtacca t 31

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgggatccca agctgaaagt atggtacgaa ctgttgcaaa at 42

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgggatcctc aggtttgaat tttgcaacag ttcgtaccat 30

<210> 11

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cccaagcttc aagctgaaag tatggtacga actgttgcaa aat 43

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggaattccat atgtccccta tactaggtta ttg 33

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gaccatcctc caaaatcgga tctcgagcgg 30

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gatcttttct acggggtctg 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gccagtatat acactccgct 20

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gccaggaacc gtaaaaaggc agcggagtgt atatactggc 40

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cagaccccgt agaaaagatc acgtgttccg cttcctttag 40

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ggaattccat atggtgagca agggcgag 28

<210> 19

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ccgctcgagt tacttgtaca gctcgtc 27

Claims (2)

1.一种高效表达外源蛋白的启动子样基因，其核苷酸序列选自：

(1)如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

(2)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的截短序列；

所述截短序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中的98～141bp所示。

2.权利要求1所述的高效表达外源蛋白的启动子样基因在组成型表达外源蛋白中的应用，其特征在于：将所述启动子样基因插入到表达蛋白基因的上游区域。

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