CN116875594B - 乳酸片球菌高强度组合启动子的构建及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了乳酸片球菌高强度组合启动子的构建及应用，属于合成生物技术领域。本发明基于乳酸片球菌转录组数据筛选得到高转录强度启动子和高翻译强度启动子，构建获得了具有高表达强度的组合启动子Phpp1‑ldhL,Phpp1‑pepT,Phpp1‑ldhD,Phpp1‑rplM,Pcsp‑ldhL,Pcsp‑pepT,Pcsp‑ldhD,Pcsp‑rplM,PrpsU‑ldhL,PrpsU‑pepT,PrpsU‑ldhD和PrpsU‑rplM，可使蛋白的表达强度相比标准组成型启动子P32提高1.55～8.53倍。
Description
技术领域
本发明涉及乳酸片球菌高强度组合启动子的构建及应用，属于合成生物技术领域。
背景技术
作为基因表达的第一个控制元件，通过调控启动子的强度来控制其下游基因的表达水平成为了最直接有效的手段。筛选或构建能够精细调控基因表达的启动子，对于实现代谢工程目标很重要。乳酸链球菌素诱导表达(NICE)系统是乳酸菌中最常用的诱导表达系统，但数量有限的诱导表达系统难以调控不同水平的多基因的转录。相比之下，由梯度强度组成型启动子组成的基因调控工具箱可能是更好的选择，特别是在精确调节多基因表达以优化代谢网络方面。
存在于基因组中的天然启动子有着高度序列多样性，并且其广泛的转录强度能够实现基因表达的精确调控。此外，从基因组中挖掘天然启动子可以防止引入外源或非自然序列，这有利于乳酸片球菌中食品级表达系统的构建。然而，由于大部分组成型启动子的强度未知，以及与强度对应的启动子精确序列未知使得直接利用组成型启动子进行基因表达困难重重。此外，大部分的天然启动子的转录强度于基因的翻译强度不统一，往往具有高转录水平的启动子的蛋白质翻译效率却并不高，而低转录水平的启动子却拥有较高的蛋白质表达水平。因此，如何找到具有高转录强度和高翻译强度的组成型启动子成为了关键。
发明内容
本发明提供了乳酸片球菌组成型启动子，明确测定出其转录强度和翻译强度，报道了其明确的DNA序列。随后通过启动子工程提供了若干可在乳酸片球菌内更高效表达的启动子，为避免基因表达过程中的诱导剂添加提供了选择，同时可用于调节多基因的表达途经，控制菌体代谢流向。
本发明的第一个目的是提供可在乳酸片球菌内高效表达的启动子，包括：Phpp1-ldhL,Phpp1-pepT,Phpp1-ldhD,Phpp1-rplM,Pcsp-ldhL,Pcsp-pepT,Pcsp-ldhD,Pcsp-rplM,PrpsU-ldhL,PrpsU-pepT,PrpsU-ldhD和PrpsU-rplM。
在一种实施方式中，所述启动子Phpp1-ldhL,Phpp1-pepT,Phpp1-ldhD,Phpp1-rplM,Pcsp-ldhL,Pcsp-pepT,Pcsp-ldhD,Pcsp-rplM,PrpsU-ldhL,PrpsU-pepT,PrpsU-ldhD和PrpsU-rplM的核苷酸序列分别如SEQID NO.8～19所示。
本发明还提供了携带所述启动子的重组表达载体。
在一种实施方式中，所述表达载体包括但不限于pNZ8148。
本发明还提供了含有所述表达载体的重组乳酸片球菌。
在一种实施方式中，所述乳酸片球菌的宿主包括但不限于乳酸片球菌DY15；所述乳酸片球菌DY15保藏编号为CCTCC NO：M 20211291，已公开于公开号为CN114058543A的专利申请文件中。
本发明还提供所述启动子在代谢工程领域的应用。
在一种实施方式中，所述应用包括但不限于提高基因的表达强度。
在一种实施方式中，所述应用是用启动子Pcsp-ldhL、PrpsU-ldhL、Phpp1-ldhL或PrpsU-pepT调控目的基因的表达。
在一种实施方式中，所述目的基因包括但不限于荧光蛋白基因。
本发明还提供了具有梯度强度的高强度启动子文库，包括调控强度依次提高的启动子PrpsU-rplM、Pcsp-ldhD、Phpp1-ldhD、Phpp1-rplM、Pcsp-rplM、PrpsU-ldhD、Pcsp-pepT、Phpp1-pepT、PrpsU-pepT、Pcsp-ldhL、Phpp1-ldhL和PrpsU-ldhL。
本发明还提供所述高强度启动子文库在调控基因表达强度中的应用。
有益效果：
(1)本发明构建了具有梯度强度的高强度组合启动子，可使蛋白的表达强度相比标准组成型启动子P32提高1.55～8.53倍。
(2)本发明提供了含有高强度组合启动子的启动子文库，启动子强度跨度为10.4倍，可用于对多基因表达途径进行微调。
附图说明
图1是不同启动子调控下荧光强度图。
具体实施方式
材料与方法
大肠杆菌JM109用于质粒构建，乳酸片球菌DY15用于表达蛋白测定启动子强度，所述乳酸片球菌DY15保藏编号为CCTCC NO：M 20211291，已公开于公开号为CN114058543A的专利申请文件中。
实施例1
分析乳酸片球菌转录组数据(NCBI登录号：PRJNA921976)，以乳酸片球菌DY15基因组为模版，扩增启动子Phpp1(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示),Pcsp(核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示),PrpsU(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示),PldhL(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示),PrplM(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示),PpepT(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)和PldhD(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)。为测定这7个启动子的强度，以融合PCR的方式融合Phpp1,Pcsp,PrpsU,PldhL,PpepT,PldhD,,PrplM和报告基因sfGFP。以载体pMG36e为模板，设计引物扩增启动子P32(核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示)，通过融合PCR与sfGFP，并连接至载体pNZ8148，为测定并构建高强度组合启动子。PCR扩增反应均由高保真DNA聚合酶PrimeSTAR HS(premix)(TaKaRa)扩增。扩增引物见表1。
表1所用引物序列
*:带下划线的碱基为同源臂
将融合PCR产物通过同源臂与载体pNZ8148质粒连接，化学转化大肠杆菌JM109中。选择测序正确的菌株过夜培养后提取质粒，电转化乳酸片球菌DY15中，用于后续的启动子强度测定。
1、转录强度
将构建的重组菌于MRS培养基中37℃，180rpm条件下培养，培养至对数后期(8h)后于6000rpm，4℃离心收集菌体，提取菌体的总mRNA，反转录后进行实时定量PCR检测，测定sfGFP的胞内mRNA丰度。检测结果显示启动子Phpp1,Pcsp,PrpsU,PldhL,PrplM,PpepT和PldhD,转录的mRNA丰度分别是标准组成型启动子P32的13.3、20.1、13.7、1.73、1.27、0.96和0.26倍。
2、翻译强度
为了测定所筛选的组成型启动子Phpp1,Pcsp,PrpsU,PldhL,PpepT,PldhD,和PrplM的翻译强度，以sfGFP为表达基因，以pNZ8148为表达载体，构建经各启动子调控sfGFP表达的重组乳酸片球菌。将重组菌于MRS培养基中37℃，180rpm条件下培养，培养至对数后期(OD≈3.5)后于6000rpm，4℃离心收集菌体，利用PBS(pH＝7.4)缓冲液清洗细胞2次，以除去死菌体、菌体分泌物和培养基沉淀成分从而降低荧光检测背景。将清洗后的菌体至于96孔荧光板中于多功能荧光酶标仪检测荧光强度和菌体OD600，检测条件为488nm激发，520nm发射。启动子翻译强度为荧光强度于OD600的比值。荧光酶标仪检测结果显示翻译强度分别为标准组成型启动子P32的2.36,2.34,1.09,1.81,1.31,0.82和2.45倍。
对比启动子Phpp1,Pcsp,PrpsU,PldhL,PpepT,PldhD,和PrplM对sfGFP的转录和翻译强度发现，启动子Phpp1,Pcsp和PrpsU具有较高的转录强度，而翻译强度相对较低。启动子PldhL,PpepT,PldhD,和PrplM具有较低的转录强度，而翻译强度较高。分析原因，可能是由于启动子Phpp1,Pcsp和PrpsU含有强的转录控制区域(-10区和-35区)而启动子PldhL,PpepT,PldhD,和PrplM则具有较强的5'-UTR区域。因此结合双方优势有可能构建得到高强度的组合启动子
实施例2组合启动子的构建
以融合PCR的方式将启动子Phpp1,Pcsp和PrpsU的转录控制区域(-10区和-35区)与启动子PldhL,PpepT,PldhD,,PrplM的5'-UTR区域融合，从而构建得到12种组合启动子Phpp1-ldhL(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示),Phpp1-pepT(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示),Phpp1-ldhD(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示),Phpp1-rplM(核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示),Pcsp-ldhL(核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示),Pcsp-pepT(核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示),Pcsp-ldhD(核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示),Pcsp-rplM(核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示),PrpsU-ldhL(核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示),PrpsU-pepT(核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示),PrpsU-ldhD(核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示)和PrpsU-rplM(核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示)。随后将组合启动子与sfGFP基因以融合PCR的方式融合，通过同源重组的方式插入至质粒pNZ8148的终止子上游，构建经各启动子调控sfGFP表达的重组乳酸片球菌。
为了测定经过启动子工程改造后的组合启动子Phpp1-ldhL,Phpp1-pepT,Phpp1-ldhD,Phpp1-rplM,Pcsp-ldhL,Pcsp-pepT,Pcsp-ldhD,Pcsp-rplM,PrpsU-ldhL,PrpsU-pepT,PrpsU-ldhD和PrpsU-rplM的表达强度，按照实施例1的培养条件培养本实施例构建的各重组乳酸片球菌。荧光酶标仪检测结果显示组合启动子Phpp1-ldhL,Phpp1-pepT,Phpp1-ldhD,Phpp1-rplM,Pcsp-ldhL,Pcsp-pepT,Pcsp-ldhD,Pcsp-rplM,PrpsU-ldhL,PrpsU-pepT,PrpsU-ldhD和PrpsU-rplM蛋白表达强度强度分别为标准组成型启动子P32的7.92、4.76、3.57、3.66、7.37、4.68、3.07、3.74、8.53、6.13、4.40和1.55倍。由此可知，经过启动子工程得到的十二种组合启动子获得了高转录和高翻译效率。
实施例3组合启动子在调控基因表达中的应用
选取启动子Pcsp-ldhL、Phpp1-ldhD和PrpsU-pepT表达红色荧光蛋白RFP(核苷酸序列如SEQID NO.21所示)，表达策略同实施例2，通过融合PCR分别将组合启动子Pcsp-ldhL、Phpp1-ldhD和PrpsU-pepT与红色荧光蛋白(RFP)连接，并连接至载体pNZ8148。按照实施例1相同条件培养重组菌株，并测定胞内荧光强度。结果显示，荧光强度分别为P32启动子的6.18、3.42和4.41倍。该结果表明表达不同的基因时组合启动子同样具有较高的表达强度。
对比例1：
具体实施方式同实施例2，区别在于，利用筛选得到的另一种高转录强度组成型启动子Phpp2的转录控制区域(-10区和-35区)分别与PldhL,PpepT,PldhD,和PrplM的5’-UTR区域组合构建一系列的组合启动子，Phpp2-ldhL,Phpp2-pepT,Phpp2-ldhD和Phpp2-rplM。结果显示，组合启动子Phpp2-ldhL,Phpp2-pepT,Phpp2-ldhD和Phpp2-rplM的GFP表达强度分别为Phpp2的0.13，0.20，0.74和0.37倍。这几种组合启动子强度均有所下降。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (9)
1.启动子，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.8~19任一所示。
2.携带权利要求1所述启动子的重组表达载体。
3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体包括但不限于pNZ8148。
4.含有权利要求2或3所述重组表达载体的重组乳酸片球菌。
5.根据权利要求4所述的重组乳酸片球菌，其特征在于，以乳酸片球菌DY15为宿主细胞。
6.权利要求1所述的启动子在乳酸片球菌代谢工程领域的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括但不限于提高基因的表达强度。
8.高强度启动子文库，其特征在于，含有调控强度依次提高的启动子PrpsU-rplM、Pcsp-ldhD、Phpp1-ldhD、Phpp1-rplM、Pcsp-rplM、PrpsU-ldhD、Pcsp-pepT、Phpp1-pepT、PrpsU-pepT、Pcsp-ldhL、Phpp1-ldhL和PrpsU-ldhL；启动子Phpp1-ldhL, Phpp1-pepT, Phpp1-ldhD, Phpp1-rplM, Pcsp-ldhL, Pcsp-pepT, Pcsp-ldhD,Pcsp-rplM, PrpsU-ldhL, PrpsU-pepT, PrpsU-ldhD和PrpsU-rplM的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.8~19所示。
9.权利要求8所述的高强度启动子文库在调控乳酸片球菌基因表达强度和/或控制乳酸片球菌菌体代谢流向中的应用。
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