CN107475257B

CN107475257B - 高效启动表达外源蛋白的启动子样基因及其应用

Info

Publication number: CN107475257B
Application number: CN201710716314.5A
Authority: CN
Inventors: 井申荣; 仉秋实; 苑荣亮; 陈伟; 金维维
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2017-08-21
Filing date: 2017-08-21
Publication date: 2020-07-10
Anticipated expiration: 2037-08-21
Also published as: CN107475257A

Abstract

本发明公开了一种从真核细胞非洲绿猴肾细胞(Vero)中发现的能够在原核细胞内启动外源蛋白表达的组成型启动子样基因VP2及其截短序列Vh2，启动子样基因VP2核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；截短序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中60~107bp所示；该基因通过构建组成表达报告基因氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）重组载体进行筛选，将筛选载体和待筛选基因片段进行重组并构建基因文库，并将含有启动子样基因序列的重组菌株通过筛选氯霉素抗性的方法来获得启动子样序列；该序列能在原核细胞中高效的启动表达外源蛋白。

Description

高效启动表达外源蛋白的启动子样基因及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种在原核细胞中高效表达外源蛋白的组成型启动子样基因序列及其应用。

背景技术

随着分子生物学及基因工程的不断发展，蛋白表达是现代工业、医疗和基础研究领域的难点和热点。一些真核表达系统，像酵母蛋白表达系统、昆虫细胞表达系统等虽然能表达异源蛋白，但其表达产物易降解，表达量不可控，生产成本高。因此，外源蛋白在原核细胞中的表达显得尤为重要，而外源蛋白表达时，启动子是构建高水平表达异源蛋白表达载体的关键因素。据了解，许多真核细胞中的启动子在进化过程中仍然保留了原核细胞启动子的部分，像Hogness等在真核基因中发现了类似原核细胞中Pribnow框的共同序列，即位于-25～-30 bp处的TATAAAAG，也称TATA框（TATA box）。他们同样可以启动原核表达系统中蛋白的表达。现如今，不少学者将原核启动子如T7启动子整合到真核系统中进行研究，我们以遗传背景清楚、成本低、表达产物分离纯化相对简单的大肠杆菌表达系统为代表，来研究遗传性状稳定、易培养的Vero细胞启动子的表达情况。

现阶段的组成型启动子样序列（Constitutive Promoter，CP）一般具有蛋白表达量低且特异性不高的特征。

发明内容

本发明的目的是提供一种组成型启动子VP2，能够在大肠杆菌中高效启动外源蛋白表达的组成型启动子，旨在改进外源基因在原核系统高效表达，该启动子样基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示或SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的截短序列Vh2。

本发明的Vero细胞组成型启动子能启动表达多种外源蛋白，与诱导型启动子相比，蛋白表达水平没有明显的差别，进而可以替代一些只能表达低产率特异蛋白的组成型启动子。大肠杆菌是重要基因工程菌，遗传背景清楚，操作简便、快速且成本低廉，成为筛选表达外源基因原核启动子样序列的首选。

本发明的DNA序列是来源于Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）的基因组，组成型启动子样基因筛选方法通过启动氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）组成型表达报告基因的表达思路，在CAT的上游插入DNA序列后，菌株表现出较高的氯霉素抗性，因而通过该方法来大规模筛选相应的启动基因表达的序列。

本发明中启动子基因的截短序列如SEQ ID NO：1中60~107bp所示，即如SEQ IDNO：2所示。

本发明中所述组成型启动子样基因能够启动外源基因表达，可以直接插入到外源蛋白基因上游区域。

本发明首先提取Vero细胞的基因组，基因组经酶切获取500bp以下DNA片段，分别重组到筛选载体CAT上游，构建基因文库；通过对含启动子样序列的重组菌株进行氯霉素抗性报告基因筛选，对启动CAT蛋白的能力、启动子截短序列的方向性及启动其他蛋白的表达能力进行检测。

本发明通过如下技术方案实现本发明目的：

（1）含融合报告基因重组载体的构建及菌株的筛选

首先对Vero细胞提取基因组DNA，通过酶切获得500bp以下的片段，回收纯化后，通过同尾酶互补插入到重组载体pCMR8a CAT基因的上游，转化入E.coli DH5α感受态细胞中，构建细菌基因组文库。设置氯霉素浓度梯度平板，筛选出在较高氯霉素浓度生长的菌株，即该菌株为具有较强启动能力的菌株。

（2）序列测定，分析同源性序列来源及最强启动子的筛选

设计测序引物JD-CEXU-F/R，将质粒和引物进行测序后确定插入基因序列，在NCBIBLastN中，将这些序列的同源性进行分析并寻找序列来源；考马斯亮蓝染色法检测CAT蛋白表达情况，灰度分析其表达量，从而筛选出最强的一个启动子。

（3）对最强启动子进行截短，进而验证启动子的顺反性

通过Promoters在线分析工具对最强启动子核心区域进行预测，根据预测结果对该启动子进行截短，截断后的核心区域命名为Vh2，将核心区域插入载体中表达CAT蛋白并与原长VP2的蛋白表达量进行对比，同时，在CAT基因上游反向插入启动子的核心区域Vh2，再次检测它反向启动CAT蛋白表达能力。

（4）检测启动子启动其他蛋白的能力

将已经插入Vh2的pCMR8a表达载体双酶切CAT基因，然后将其替换为外源蛋白基因，检测外源蛋白的表达情况，以诱导型表达载体作为对照，比较筛选得到的组成型启动子VP2启动外源蛋白表达能力。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、在现有的表达系统中很多外源基因经常出现蛋白表达水平低，进而使这些基因工程产品的开发受限；本发明VP2序列能够启动氯霉素抗性报告基因的高效表达，且能够启动多种其他外源蛋白在细菌中的表达；

2、本发明的表达载体为改造后的pET-28a，启动子VP2序列能够适用于原核表达的所有载体，使之应用于不同原核表达系统的能力大大增强，提高了VP2序列的实用性；

3、筛选的启动子VP2来源于Vero细胞，是一种组成型启动子，具有较强的持续表达能力，其核心序列Vh2基因序列较短(47bp)，能比较方便的将它插入到不同原核表达载体内，提高了它的适应性，极高的增加了应用范围。

附图说明

图1是pCMR8a载体图谱；

图2是抗性平板筛选得到的3个菌株的菌落PCR电泳示意图；其中，泳道1-3是3个筛选菌株PCR条带；泳道4：空载的pCMR8a条带；泳道5：DNA Marker DL2000；

图3是SDS-PAGE检测CAT蛋白的表达量示意图；其中，泳道1：非预染蛋白分子量标准；泳道2：DH5α；泳道3：pCMR8a/DH5α；泳道4：pCMR8a-VP1/DH5α；泳道5：pCMR8a- VP 2/DH5α；泳道6：pCMR8a- VP3/DH5α；

图4是SDS-PAGE检测CAT蛋白表达的灰度分析示意图；

图5是对最强启动子截短后SDS-PAGE检测CAT蛋白表达情况示意图；其中泳道1：Protein Marker；泳道2：pCMR8a/DH5α，泳道3：pCMR8a-Vh2/DH5α；

图6是反向后启动子PCR电泳示意图；其中泳道1：DNA Marker DL2000；泳道2：反向启动子；

图7是SDS-PAGE检测Vh2反向后启动CAT蛋白表达情况示意图；其中泳道1是Protein Marker；泳道2：pCMR8a/DH5α；泳道3：反向启动子蛋白表达情况；泳道4：pCMR8a-Vh2/DH5α蛋白表达情况；

图8是SDS-PAGE检测Vh2启动子表达谷胱甘肽（GST）蛋白示意图；其中泳道1是Protein Marker；泳道2：GST-pET-28a/DH5α未诱导；泳道3：GST-pET-28a/DH5α诱导；泳道4：Vh2-GST-pCMR8a /DH5α；

图9是Western blotting检测Vh2启动外源蛋白3AB表达情况示意图；其中泳道1：Vh2-3AB –pCMR8a/DH5α；泳道2：pCMR8a/DH5α；泳道3：3AB-pET-28a /DH5α诱导；EGFP为内参蛋白；

图10是Western blotting检测外源蛋白3AB蛋白表达的灰度分析示意图；

图11是Western blotting检测Vh2启动外源蛋白TMEM120A表达情况示意图；其中泳道1：Vh2-TMEM120A-pCMR8a /DH5α；泳道2：pCMR8a/DH5α；泳道3：TMEM120A- pET-28a/DH5α诱导；EGFP为内参蛋白；

图12是Western blotting检测外源蛋白TMEM120A蛋白表达的灰度分析示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护性范围不仅仅局限于具体实施所述内容；实施例中主要采用常规的分子生物学基因克隆的方法，此方法为本领域最常用的技术方法。按照以下实施案例，可根据具体情况略作修改和改变，进而成功实施本发明，这些修改和改变均落在本申请权利要求的范围内。

实施例1：筛选载体的构建

由昆明硕擎生物技术有限公司合成引物catF/catR(上游引物catF：5ˊ- CGC CATATG GAG AAA AAA ATC ACT GGA TAT -3ˊ，下游引物catR：5ˊ-CCG CTC GAG TTA CGC CCCGCC CTG CCA CTC -3ˊ)，通过引物catF/catR在载体pACYC184(购买于New EnglandBioLabs公司，VKN0287)上扩增CAT，再将CAT用Fd NdeI (购买于TAKARA，FD0584)和Fd XhoI(购买于TAKARA，FD0694) 酶切，连接到pET-28a载体 (购买于Novagen，69864-3)上，形成pET-28a -CAT；由昆明硕擎生物技术有限公司合成引物M28a_F/ M28a_R：(上游引物M28a_F：5ˊ-AGA TCT GCG GCC GCA AGC TTG TCG ACG GAG CTC GGA TCC AAG GAG ATA TAC ATATGA CAC GAG-3ˊ；下游引物M28a_R：5ˊ-TCT AGA CGC CGG CGT TCG AAC AGC TGC CTC GAGCCT AGG TTC CTC TAT ATG TAT ACT GAG CTC-3ˊ)，两引物变性退火，就形成含有BglⅡ和Xho酶切粘性末端的双链DNA片段，将质粒pET-28a-CAT用BglⅡ和XhoⅠ酶切后，二者酶连，这样就在载体上加入了一个多克隆位点 (GCG GCC GCA AGC TTG TCG ACG GAG CTC GGA TCC ATC GAT AAG GAG ATA TA)，在Nde I、Bgl II酶切位点间同时还插入了ClaI、 BamH I、Sac I、Sal I、Hind III酶切位点以及一个核糖体结合位点(RBS)，即成功构建出组成型启动子筛选载体pCMR8a，如图1。

实施例2：基因文库的构建及启动子的初步筛选

将Vero(购自于ATCC，CL28)细胞复苏，并用含胎牛血清(购自于PAN-Biotech，P141101 )的DMEM（购自于GE Healthcare Life Sciences，AAE202588）培养基在二氧化碳培养箱中培养三天，用试剂盒(购买于天根生物科技，DP304)制备样品DNA基因组，再用Sau3A Ⅰ (购买于TAKARA，1082A) 37℃酶切基因组3h，用普通琼脂糖凝胶胶DNA回收试剂盒(购买于天根生化科技（北京）有限公司，DP209)回收约500bp及以下片段。用BamH Ⅰ (购自于Thermo Fisher FD0055)酶切pCMR8a载体15min，利用同尾酶的特征将酶切后的pCMR8a载体与胶回收的500bp以下基因组片段，用T4 DNA连接酶(购自于TAKARA，SD0268)16℃ 酶连过夜。将连接产物用热休克法转化E.coliDH5α（购买于生工公司，B528413）感受态细胞，构建得到细菌基因组文库。

把基因组文库涂布在氯霉素(购自于Sangon Biotech，A110230-0010)浓度为8.5μg/mL，卡那霉素（Kan）(购自于Sangon Biotech，A110408-005)浓度为50μg/mL的平板上，37℃恒温室培养24h，有8个单菌落生长，即筛选出具有启动CAT基因表达的启动子基因序列有8个。将8个细菌单菌落分别转接到不同LB平板上（氯霉素浓度分别为100、200、400、600、800、1000、1200μg/mL，Kan浓度为50μg/mL），37℃ 恒温培养24h，在终浓度为1200μg/mL的氯霉素平板上有3个菌落生长。这就得到了3个具有较强启动能力的启动子样基因序列，分别命名为VP1、VP2、VP3，如图2。

实施例3：比较筛选的3个启动子启动CAT能力，选出启动能力最强启动子基因序列

将筛选得到的3株菌，挑取单菌落到5mL LB液体培养基中培养（Kan抗生素，50μg/mL ，Yeast Extract 2.5g，Tryptone 5g，NaCI 5g，ddH₂O定容500mL），当菌液OD₆₀₀值达到0.6时，按1:100转接到新的含Kan抗生素的5mL 液体LB培养基中，在8h、12h、24h据菌液OD₆₀₀的值取样，用SDS-PAGE电泳检测CAT蛋白的表达情况，如图3，用Image J软件进行量化分析，结果如图4所示。在24h内蛋白表达量随着时间延长先升高然后下降，在12h时CAT蛋白表达量达到最高，之后在24h时CAT蛋白表达量有所降低，因此后续实验选取12h进行取样检测。同时灰度分析结果显示：VP2号启动子具有最高的蛋白表达量，所以VP2是最强启动子。

实施例4：对启动子样基因序列进行测定、分析、截短并验证其顺反性

设计测序引物JD-CEXU-F，序列为：5’-GTC GGC GAT ATA GGC GCC AGC-3’（由生工生物工程（上海）有限公司合成），用该引物对VP2启动子进行序列测序。

在http://molbiol-tools.ca/Promoters.htm网站对VP2启动子序列进行核心区域预测分析，预测出VP2启动子的转录起始位点及-10区和-35区，确定了47bp的核心区域，命名为Vh2，在上海捷瑞生物工程有限公司进行引物合成(P1上游：5’- CCC AAG CTT CCCCAA TTG TTG GAA GCT GCC AAT ATG TTA C-3’；P2下游：5’-CGG GAT CCT GCA AAG ACTTTT ATT GTA ACA TAT TGG CAG CT-3’)。扩增核心启动子序列，用Fd BamHI（CKB701A）和FdHindIII(FD0505)酶切。同样双酶切的筛选载体pCMR8a，琼脂糖凝胶回收骨架片段，用T4DNA连接酶将二者37℃ 酶连3h，即将核心启动子连接到筛选载体pCMR8a的CAT基因前面。连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布含Kan抗生素的LB平板，37℃ 恒温培养过夜。挑单菌落到5mL LB-Kan液体培养基中37℃培养，当OD₆₀₀达到0.6时，按1:100转接新的LB液体培养基当中， 12h时取样，SDS-PAGE检测CAT蛋白表达情况，如图5。在上海捷瑞生物工程有限公司合成引物(上游引物：5’- CGG GAT CCC CCC AAT TGT TGG AAG CTG CCA ATA TGTTAC-3’，下游引物：5’-CCC AAG CTT TGC AAA GAC TTT TAT TGT AAC ATA TTG GCA GCT-3’)，将Vh2启动子上下游的酶切位点BamH I和HindIII进行交换，PCR扩增出Vh2的反向启动子如图6。通过上述的构建方式，把启动子反向插入到CAT前面，SDS-PAGE分析反向启动子能否启动CAT蛋白表达，结果如图7，CAT蛋白有少量表达，所以Vh2是一个双向的启动子，但是反向启动能力较弱。

实施例5：构建内参载体，检测Vh2启动GST、3AB、TMEM120A蛋白表达的能力

1、Vh2启动外源蛋白GST表达能力

谷胱甘肽S转移酶（GST）标签蛋白大小为26KD，本身是一个在解毒过程中重要的转移酶。将它作为外源蛋白在大肠杆菌中大量表达，检测启动子的启动能力，起到提高表达量的作用。由昆明硕擎生物科技有限公司进行引物合成(上游引物GST1：5’- GGA ATT CCATAT GTC CCC TAT ACT AGG TTA TTG-3’，下游引物GST2：5’- GAC CAT CCT CCA AAA TCGGAT CTC GAG CGG-3’) 。以pET-41a(购自于Novagen，70535-3)质粒为模板PCR扩增GST基因，用XhoⅠ和NdeⅠ分别双酶切GST基因片段、含有Vh2启动子的pCMR8a筛选载体及pET-28a载体，用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（购自于天根生化（北京）有限公司，DP209）回收。将双酶切回收的GST基因分别与同样双酶切的pCMR8a和pET-28a T4 DNA连接酶16℃酶接3h，酶连产物转化E.coliDH5α感受态细胞，涂布含Kan抗生素LB平板，37℃恒温培养过夜，挑取单菌落接种5mL 含Kan-LB液体培养基37℃培养，酶切和测序验证。结果正确的样品按照1：100转接新的含Kan抗生素的LB液体培养基，12h测菌液OD₆₀₀值为1.2，取480ul的菌液，12000rpm离心30s，沉淀用50ul ddH₂0重悬，沸水煮样10min，加入2×上样buffer沸水再煮10min；取30μl处理好的样品进行SDS-PAGE分析GST蛋白的表达量，与pET-28a载体上的T7诱导型启动子比较，结果如图8所示；组成型启动子Vh2和诱导型启动子T7都高效表达了目的GST蛋白，且二者蛋白表达量基本一致。

2、设计内参载体，检测Vh2启动外源蛋白3AB表达能力

由昆明硕擎生物科技有限公司合成序列（上游引物utp1：5’- GAT CTT TTC TACGGG GTC TG-3' ，下游引物utp2：5’-GCC AGT ATA TAC ACT CCG CT-3'），以pUT18C质粒为模板，PCR扩增其骨架片段。由昆明硕擎生物科技有限公司合成序列（上游引物p15a1：5’-GCC AGG AAC CGT AAA AAG GCA GCG GAG TGT ATA TAC TGG C-3'，下游引物p15a2：5’-CAGACC CCG TAG AAA AGA TCA CGT GTT CCG CTT CCT TTA G-3'），以pKT25质粒为模板获得复制子p15A序列，用多片段同源重组试剂盒（诺维赞生物科技有限公司 C113-01/02）将二者连接到一起，就获得了pAT15载体。设计EGFP引物(上游引物：5’- GGA ATT CCA TAT GGTGAG CAA GGG CGA G-3'，下游引物：5'- CCG CTC GAG TTA CTT GTA CAG CTC GTC-3' )，在昆明硕擎生物科技有限公司合成，以载体p-EGFP-N2(购买于Biofeng，6081-1) PCR扩增EGFP基因，连接到pAT15载体中，构建成内参载体EGFP-pAT18。

3AB蛋白是CVA16病毒中一种重要的结构蛋白，大小为12KD左右，能够促进病毒RNA的合成。在上海捷瑞生物工程公司全序列合成CVA16-3AB（GENBAK登录号： KF991007.1）基因，并在其N端加入His标签蛋白，用BamH I和EcoR I酶切连接到pET-28a和Vh2-pCMR8a质粒中，即得到重组质粒3AB-pET-28a和Vh2-3AB-pCMR8a。将内参质粒EGFP-pAT18分别与Vh2-3AB-pCMR8a、3AB-pET-28a和pCMR8a共转入E.coli BL21感受态中，涂布含Kan和Amp的双抗平板，37℃恒温过夜。挑单菌落接种至5mL LB双抗培养基中，37℃震荡培养，当菌液OD₆₀₀值达到0.4~0.6时，加入1mmol/l的IPTG诱导6h，收集菌液，进行SDS-PAGE电泳分析，其步骤和GST蛋白分析过程相同，然后用湿转法电转PVDF膜（购自于MILLIPORE，IPVH00010），用10%的脱脂奶封闭1h， TPBS震荡清洗三次，每次清洗10min，用1：5000稀释的His-Tag Mouse mAb抗体(购自于天德悦北京生物科技用有限公司，TDY004)作为一抗37℃标记1h，TPBS洗三次，每次10min，二抗用1:10000稀释的Goat anti-Mouse IgG(购自于KPL，074-1806) 37℃标记1h。TPBS震荡漂洗三次，每次15min，添加化学发光HRP底物试剂盒（购自于MILLIPORE，WBKLS0100）样品显色，X-OMAT BT Film（购自于Kodak，6535876）暗室曝光。结果如图9所示，灰度分析结果显示，组成型启动子Vh2与诱导型启动子T7启动3AB蛋白表达效果几乎一致。

Western blotting鉴定EGFP的表达情况。步骤跟3AB基本相同，不同之处是用1：7000稀释的GFP-Tag Mouse mAb单克隆抗体(购自于天德悦北京生物科技用有限公司，TDY009C)作为一抗，结果如图9、10所示，EGFP做为内参蛋白，表达量无明显差别。

3、Vh2启动外源蛋白TMEM120A表达能力

全序列合成HepG2 HB-8065^TM TMEM120A（GENBAK登录号：NM-031925）基因序列，（昆明硕擎生物科技有限公司），在N端加入HA标签蛋白，将TMEM120A-HA分别连入Vh2-pCMR8a和pET-28a质粒中，比较两种启动子表达TMEM120A蛋白的能力。实验步骤同3AB蛋白一致，不同之处是以HA-Tag Mouse mAb（1：5000）(abcam，ab18181)作为一抗。结果如图11、12所示，组成型启动子Vh2与T7启动子蛋白表达效果几乎没有区别。EGFP内参蛋白，表达量基本一致。

表明与诱导型的启动子相比，组成型的启动子也具有较强的启动表达能力，且相差不大。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 高效启动表达外源蛋白的启动子样基因及其应用

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 199

<212> DNA

<213> Vero细胞

<400> 1

ctctgtttct actgttctcg ctcactgtgg taggcagaat ggcctccaaa tatgtccagg 60

ccccaattgt tggaagctgc caatatgtta caataaaagt ctttgcaaat acaatttagg 120

ttatagactt taagagacag agattattct gaattatctt ggtagaccca atctaatcaa 180

atgaaccctt taaagcaga 199

<210> 2

<211> 47

<212> DNA

<213> Vero细胞

<400> 2

ccccaattgt tggaagctgc caatatgtta caataaaagt ctttgca 47

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgccatatgg agaaaaaaat cactggatat 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccgctcgagt tacgccccgc cctgccactc 30

<210> 5

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agatctgcgg ccgcaagctt gtcgacggag ctcggatcca aggagatata catatgacac gag 63

<210> 6

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tctagacgcc ggcgttcgaa cagctgcctc gagcctaggt tcctctatat gtatactgag ctc 63

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtcggcgata taggcgccag c 21

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cccaagcttc cccaattgtt ggaagctgcc aatatgttac 40

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgggatcctg caaagacttt tattgtaaca tattggcagc t 41

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgggatcccc ccaattgttg gaagctgcca atatgttac 39

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cccaagcttt gcaaagactt ttattgtaac atattggcag ct 42

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggaattccat atgtccccta tactaggtta ttg 33

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gaccatcctc caaaatcgga tctcgagcgg 30

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gatcttttct acggggtctg 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gccagtatat acactccgct 20

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gccaggaacc gtaaaaaggc agcggagtgt atatactggc 40

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cagaccccgt agaaaagatc acgtgttccg cttcctttag 40

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ggaattccat atggtgagca agggcgag 28

<210> 19

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ccgctcgagt tacttgtaca gctcgtc 27

Claims

1.一种高效启动表达外源蛋白的启动子样基因，其特征在于，核苷酸序列选自：

（1）如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

（2）SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的截短序列；

所述截短序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中60~107bp所示。

2.权利要求1所述的高效启动表达外源蛋白的启动子样基因在组成型表达外源蛋白中的应用，其特征在于：将启动子样基因插入到外源蛋白基因的上游区域。