CN106754816B

CN106754816B - 一种高保真快速扩增融合酶及其制备方法

Info

Publication number: CN106754816B
Application number: CN201710102864.8A
Authority: CN
Inventors: 荀恒杰; 陈旭; 陈刚
Original assignee: Excell Biology Taicang Co ltd
Current assignee: Suzhou Ecosai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-02-24
Filing date: 2017-02-24
Publication date: 2020-10-27
Anticipated expiration: 2037-02-24
Also published as: CN106754816A

Abstract

本发明提供了一种高保真快速扩增融合酶以及该高保真快速扩增融合酶的制备方法。其中本发明所述的高保真快速扩增融合酶包括在高温条件下能够与模板和引物结合的非特异性双链结合区的氨基酸序列，以及经过多步生物技术方法改造后的嗜热古细菌DNA聚合酶的氨基酸序列。本发明所述的高保真快速扩增融合酶，保真度高，扩增速度快，在高温条件下活性好，并且可以特别用于超长序列扩增和测序，应用前景广阔。

Description

一种高保真快速扩增融合酶及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术的应用领域，涉及到一种高保真快速扩增融合酶以及其制备方法，特别但不限于应用于超长序列扩增和测序。

背景技术

DNA聚合酶是基因工程领域常见的一大类工具酶，被广泛应用于分子克隆、探针标记、链或引物延伸、补平或抹平以及核苷酸测序等许多领域。它有4大类型，其中A型和B型占多，A型和B型DNA聚合酶一部分为常用的常温DNA聚合酶，对微量底物模板的扩增效率不高，影响了其使用范围；一部分为常用的耐高温DNA聚合酶，它们对微量底物模板的扩增效率非常高，可以通过PCR将底物模板在很短的时间内将模板量增加几百到几千万倍，因而在生物医学领域有较广泛的应用。比较常见的DNA聚合酶为Taq DNA Polymerase、Pfu DNAPolymerase、Kod DNA Polymerase、Vent DNA Polymerase、 Deep Vent DNA Polymerase等。

根据相关文献记载，Taq DNA Polymerase无3^，-5^，外切酶活性，在PCR循环中，产生的错误碱基的渗入率较高，突变率为2x10^-5/碱基/循环，DNA聚合时的延伸速度为1kb左右/min，95℃时半衰期40分钟左右；Pfu DNA Polymerase有3^，-5^，外切酶活性，在PCR循环中，产生的错误碱基的渗入率中等，突变2.5x10^-6/碱基/循环，DNA聚合时的延伸速度为0.6kb左右/min，95℃温浴1小时仍然有90%以上的酶保持活性；Kod DNA Polymerase有3^，-5^，外切酶活性，在PCR循环中，产生的错误碱基的渗入率中等，突变率为2.0x10^-6/碱基/循环，DNA聚合时的延伸速度为2kb左右/min，100℃温浴1小时仍然有70%以上的酶保持活性；Vent DNAPolymerase有3^，-5^，外切酶活性，在PCR循环中，产生的错误碱基的渗入率中等，突变率为4x10^-6/碱基/循环，DNA聚合时的延伸速度为1kb左右/min，95℃温浴1小时仍然有90%以上的酶保持活性；Deep Vent DNA Polymerase有3^，-5^，外切酶活性，它的错误碱基的渗入突变率和延伸速度与Vent DNA Polymerase相似，但是耐热性更高，95℃时半衰期长达8小时左右。

以上的几种用于PCR扩增的DNA聚合酶，在突变率，耐热性和延伸速度，要么有缺点，要么整体上这几个方面的性能并不十分突出，而这三个方面是该酶是否适用于超长序列扩增和测序，快速获得最佳效果和准确数据的关键指标。

发明内容

发明目的：为了克服以上不足，本发明的目的在于优化设计并表达纯化出具有较低突变率和较高延伸速度的高性能PCR反应及测序用融合酶，以及其制备方法，并进一步提供了该高保真快速扩增融合酶的氨基酸和基因编码信息，特别应用于超长序列扩增和测序。

技术方案：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供了一种高保真快速扩增融合酶，包括在高温条件下能够与模板和引物结合的非特异性双链结合区的氨基酸序列，以及经过多步生物技术方法改造后的嗜热古细菌DNA聚合酶的氨基酸序列。本发明所述的高保真快速扩增融合酶包括可以与DNA模板或引物结合的非特异性双链结合区，该结合区含有在高温条件下仍然具有较高的核酸结合能力的氨基酸基序列；同时含有经过多步生物技术方法改造后的嗜热古细菌DNA聚合酶氨基酸序列，以提高PCR扩增效率和保真度。其中，嗜热古细菌DNA聚合酶的氨基酸基序列来源于高温温泉的嗜热古细菌，可以在高温下仍保持高活性。此外，嗜热古细菌DNA聚合酶的氨基酸基序列通过生物技术方法改造后，含有多个突变、缺失或插入位点的特异性序列，可以增加了PCR过程中核苷酸链的延伸速度；同时增加了识别渗入产物链中错误碱基的识别能力，保真性好；而且还增加切除产物链中错误碱基的3^，-5^，外切酶的活性，避免了单纯3^，-5^，外切酶活性的增加而导致核苷酸链的延伸速度大大下降。其中，非特异性双链结合区是指在PCR反应体系中能够与DNA模板和引物非特异性相结合的蛋白结构域，减少有限PCR反应体系中游离DNA聚合酶和引物的数量，增加该DNA聚合酶与模板和引物结合几率，从而该酶在依赖模板和引物的条件下快速延伸，同时非特异性双链结合区在下一轮变性的过程中与模板和引物的解离，开始新一轮的变性解离，退火结合和延伸的过程，因而增加了该酶在PCR过程中核苷酸链的延伸速度。通过与DNA模板或引物结合的非特异性双链结合区的序列和含有多个突变、缺失或插入位点的特异性序列的嗜热古细菌DNA聚合酶连接起来制备成的融合酶，可以特别应用于超长序列扩增和测序所要求的高保真快速扩增。

进一步的，上述的高保真快速扩增融合酶，所述编码所述融合酶的核苷酸序列包括在高温条件下能够与模板和引物结合的非特异性双链结合区的核苷酸序列，以及经过多步生物技术方法改造后的嗜热古细菌DNA聚合酶的核苷酸序列。通过对嗜热古细菌DNA聚合酶的核苷酸序列进行生物技术方法改造，以改变其氨基酸列序，增强其特异性功能。

进一步的，上述的高保真快速扩增融合酶，所述非特异性双链结合区的氨基酸序列为SEQ ID NO. 14所显的核苷酸序列编码的一个或几个或全部功能区域。

进一步的，上述的高保真快速扩增融合酶，所述经过多步生物技术方法改造后的嗜热古细菌DNA聚合酶的氨基酸序列为SEQ ID NO. 15所显的核苷酸序列编码的一个或几个或全部功能区域。

进一步的，上述的高保真快速扩增融合酶，编码所述融合酶的核苷酸序列为核苷酸序列SEQ ID NO. 16，所述SEQ ID NO. 16为SEQ ID NO. 14和SEQ ID NO. 15所显的核苷酸序列的一个或几个或全部功能区域，并连接到原核表达质粒的启动子下而形成表达载体。

进一步的，上述的高保真快速扩增融合酶，所述融合酶的氨基酸序列为SEQ IDNO. 17所显的氨基酸序列的一个或几个或全部功能区域。

进一步的，上述的高保真快速扩增融合酶，所述生物技术方法改造包括嗜热古细菌DNA聚合酶的氨基酸序列中缺失、插入、替换一个或多个氨基酸。通过在嗜热古细菌DNA聚合酶的氨基酸序列中多位点的缺失、插入、替换一个或多个氨基酸，以改变其氨基酸列序，其效果有些或增加了PCR过程中核苷酸链的延伸速度，或增加了识别渗入产物链中错误碱基的识别能力，或增加切除产物链中错误碱基的3^，-5^，外切酶的活性，这样就避免了3^，-5^，外切酶活性的单独增加而导致核苷酸链的延伸速度大大下降。

进一步的，上述的高保真快速扩增融合酶，所述生物技术方法改造包括嗜热古细菌DNA聚合酶的核苷酸序列中缺失、插入、替换一个或多个核苷酸。通过在嗜热古细菌DNA聚合酶的核苷酸序列中多位点的缺失、插入、替换一个或多个核苷酸，以改变其氨基酸列序，其效果有些或增加了PCR过程中核苷酸链的延伸速度，或增加了识别渗入产物链中错误碱基的识别能力，或增加切除产物链中错误碱基的3^，-5^，外切酶的活性，这样就避免了3^，-5^，外切酶活性的单独增加而导致核苷酸链的延伸速度大大下降。

本发明还提供一种高保真快速扩增融合酶的制备方法，包括以下步骤：

（1）嗜热古细菌DNA聚合酶的核苷酸序列进行多步生物技术方法改造；

（2）将非特异性双链结合区的核苷酸序列与步骤（1）中的核苷酸序列融合在一起；

（3）将步骤（2）的核苷酸序列连接到表达载体；

（4）转化到表达菌株，进行诱导表达；

（5）所述菌株经超声破碎、离心收集、过滤除颗粒和多步纯化，得所述高保真快速扩增融合酶。

本发明所述的高保真快速扩增融合酶的制备方法，方法合理，制备的高保真快速扩增融合酶纯度为98%以上的高活性蛋白，PCR扩增保真度在10^-7级别，比常规的Taq、Pfu、Kod等的保真度明显高1-2个数量级，并且其可以在较短的2分钟内一次PCR扩增长度可以达到20kb左右。

为获得比较好的表达效果，为下一步纯化打下比较好的基础，取所述的重组转化菌株，表达时采用温度梯度和IPTG诱导剂梯度。通过20ml的小规模试验，同时设置非诱导对照，之后收集菌体，超声破碎，离心收集上清，上清全菌进行SDS-PAGE电泳，SDS-PAGE电泳所显示的大小在100道尔顿左右。

再根据电泳的结果确定最佳的表达条件。作为一种优选上述的温度梯度和IPTG诱导剂梯度的范围为温度25-37℃；诱导试剂IPTG诱导剂梯度范围为0.1-1mM。

此外，为保持重组载体在表达菌株中的存在；维持菌体对目的蛋白活性和自生稳定的需要，必要在重组菌株培养和诱导目的蛋白表达的过程中加入一种或几种浓度的抗生素，其中羧苄青霉素的浓度为80-120µg/ml；氯霉素的浓度在10-40µg/ml。

经过在重组质粒在特异性表达菌株中放大培养和诱导表达、离心收集菌体、超声破碎、过滤除颗粒、亲和纯化、脱盐、离子交换和凝胶过滤、浓缩等多个步骤，得到高纯度的高保真快速扩增融合酶，该融合酶尤其适用于超长核酸序列扩增和测序。

此外，在多个纯化步骤中，采用特异性重组表达菌株，并添加了稳定试剂，如还原试剂、蛋白酶抑制试剂、去污试剂以及合适无机盐的种类和浓度，以便该融合酶在多步骤纯化过程中，依然可以使得绝大多数融合酶保持完整性以及保持其接近天然的正确空间构象。

并且，在多个纯化步骤中，采用亲和层析，离子交换，分子筛，高盐洗涤等多种措施，降低表达菌株自身蛋白的核酸酶、基因组以及其它宿主蛋白等杂质残留，以提高该融合酶的品质和质量，使其可以分子生物学和基因工程领域得到广泛应用。

通过超长片段的PCR扩增和蓝白筛选方法，来验证该融合酶具有高超的核苷酸链延伸速度和相当低的突变率，从而进一步说明该融合酶可以用来做超长序列扩增和测序。

进一步的，上述的高保真快速扩增融合酶的制备方法，通过构建含有SEQ ID NO.14和SEQ ID NO. 15所显的核苷酸序列的一个或几个或全部区域，采用重叠PCR技术，将SEQID NO. 14和SEQ ID NO. 15所合成两个片段的核苷酸酸序列和编码连接肽的核苷酸序列进行拼接，经过测序正确后连接到表达载体中。将构建好的表达载体，转化到既可以补充稀有密码子，又可以增加目的蛋白可溶性，同时又可以减少异源蛋白对宿主大肠杆菌毒性的特异性表达菌株中。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明所述的高保真快速扩增融合酶，保真度高，扩增速度快，在高温条件下活性好，并且可以特别用于20Kb左右的超长序列扩增和测序，应用前景广阔。

附图说明

图1含有融合酶的核苷酸序列的重组表达载体双酶切电泳图，

浓度0.8%琼脂糖凝胶，Line1:Recombinant Vector Digested with NdeI/BamHI.Line 2:DNA Marker 10000pb、5000pb、3000pb、2000pb、1500pb、1000pb、750pb、500p、250pb；

图2 融合酶表达条件优化小实验，超声离心收集上清总蛋白SDS-PAG电泳图，

Line 1: Protein Marker 116Da、66.2Da、45Da、35Da、25Da；Line 2: Control 为未诱导的重组表达菌株、37℃；Line 3:1m M IPTG、 30℃、5小时；Line 4:0.5m M IPTG、30℃、5小时；Line 5:0.5m M IPTG、37℃、5小时；Line 6:1m M IPTG、37℃、5小时；

图3 融合酶亲和柱纯化上样和清洗图，

2L发酵液离心收集，超声离心收集上清，溶解于（50mM NaH₂PO₄,500mM KCl,10MmImidazole 2mM DTT,1mM PMSF,0.5mMEDTA pH8.0）溶液；Protio® NI-NTA 10ml预装柱,上样流速1ml/min；（50mM NaH₂PO₄,500mM KCl,20mM Imidazole,2mM DTT pH8.0）溶液洗涤，流速4ml/min；

图4 融合酶亲和柱纯化洗脱图，溶液A：50mM NaH₂PO₄,500mM KCl,20mM Imidazole2mM DTT pH8.0；溶液B;50mM NaH₂PO₄,500mM KCl,500mM Imidazole 2mM DTT pH8.0；洗脱流速4ml/min，0-50%，15分钟梯度；

图5 融合酶纯化Sephdex G-25柱脱盐图，

BXK26mm/400柱(200ml填料)，平衡/洗脱液：20mM Tris-HCl pH 7.0，上样体积40ml，上样流速2ml/min，洗脱流速5ml/min；

图6融合酶纯化SP阳离子柱洗脱图，

BXK26mm/100柱(30ml填料)，溶液A/平衡液：20mM Tris-HCl pH 7.0，溶液B：1MNaCl, 20mMTris-HCl pH 7.0，上样体积45ml，上样流速1.5ml/min，洗脱流速4ml/min，0-100%，20分钟梯度洗脱；

图7融合酶纯化Superdex 200柱分离图，

BXK26mm/700柱(340ml填料)，平衡/洗脱液：(40mM Tris-HCl,0.2mM EDTA,200mMKCl,2mMDTT, pH7.4)，上样体积8ml，流速1ml/min，洗脱流速1ml/min；

图8 最终浓缩后的SDS-PAG电泳图，

胶厚度0.75cm，浓缩胶5%，80v电泳；10%的分离胶，120v电泳，

Line 1:Protein Marker 116Da;66Da,45Da; Line 2 : 纯化Sample(5µg) ;Line 3 :纯化Sample(2µg) ；

图9融合酶核酸内切酶残留检测图；

浓度0.8%琼脂糖凝胶，

Line 1: DNA Marker 5000bp;4000pb;3000pb;1500pb;500pb;Line 2,3,4,5: øX174 DNA RFI；

图10-11融合酶基因组残留检测图，其中，图10为扩增曲线，横坐标为CT值，纵坐标为荧光吸收值；图11为标准曲线横坐标为拷贝数，纵坐标为CT值，1:超纯水、2:稀释液、3:800µg/ml融合酶液、4:80µg/ml融合酶液；

图12 融合酶对超长片段的PCR扩增效果图，

以λ 噬菌体的全长基因组为模板，在2分钟的延伸时间可以扩增得到20kb的PCR产物, DNA Marker为λ DNA-HindIII。

具体实施方式

下面将通过几个具体实施例，进一步阐明本发明，这些实施例只是为了说明问题，并不是一种限制。

材料：

pET15b(+)载体、限制性内切酶NdeI/BamHI、LB液体培养基、羧苄青霉素、氯霉素、IPTG诱导试剂、Bradford法蛋白浓度测定试剂盒、Sephdex G-25、Superdex 200凝胶过滤介质、SP Sepharose 4 FF阳离子纯化介质、Protio® NI-NTA 10ml预装柱等及其他常规分析纯试剂。

实施例1：融合酶基因工程菌的建立

1、融合酶基因序列的合成

采用全基因合成的重叠PCR延伸方法，利用高保真酶合成SEQ ID NO. 14和SEQ IDNO. 15所显示的核苷酸序列，将两部分所显示的核苷酸序列，通过6个氨基酸(GTGGGG)所组成的连接肽相连接，以便于表达纯化出来的融合酶的两个功能区保持原有蛋白的天然构象，发挥各个功能区原有的分子生物学功能。

2、表达载体的构建

再将以上所述两部分功能区和连接肽通过引物重叠PCR连接起来的过程中，对全长片段进行连接时，在上下游引物的两端分别加上NdeI（CATATG）/BamHI(GGATCC)两个限制性内切酶的酶识别和切割位点，同时在下游引物上加上终止密码子。全长扩增后，得到SEQID NO.16所示全长序列，经过双酶切连接到pET15b(+)载体的NdeI（CATATG）/BamHI(GGATCC)两个位点之间，转化大肠杆菌DH5alpha。在500µl LB培养基中，37℃培养0.5小时，离心涂布于含有终浓度100µg/ml羧苄青霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养24小时，挑选单菌落，抽提重组质粒，进行测序和进行双酶切鉴定，其情况如图1所示，选择序列正确的重组质粒.

3、基因工程菌的制备

经过测序双酶切鉴定正确的重组质粒，转化到制备的高效感受态大肠杆菌表达菌株Rosetta-Gami B(DE3)pLysS中，在500µl LB培养基中，37℃，80rpm培养10分钟，再230rpm培养20分钟，离心涂布于含有终浓度100µg/ml羧苄青霉素和30µg/ml氯霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养24小时，待长出肉眼可见的单菌落时，4℃保存待用。

实施例2：融合酶表达条件的确立

为获得比较大的产量和同时方便纯化，挑选基因工程菌单菌落于含有终浓度100µg/ml羧苄青霉素和30µg/ml氯霉素的20ml液体LB培养基中，37℃过夜培养。第二天在5个50ml的培养管中加入含有终浓度100µg/ml羧苄青霉素和30µg/m氯霉素的20ml LB液体培养基，将含有过夜培养基因工程菌的液体培养基按照1:20的比例加入,37℃培养4小时，待OD₆₀₀为0.8左右时，其中一个50ml培养管不加入IPTG诱导试剂；另外四管，两两各加入0.5 mM 和1m M IPTG，两两各在30℃和37℃诱导培养5小时。

5000rpm、10分钟、4℃离心收集和洗涤菌体，重悬于（50mM NaH₂PO₄,500mM KCl,10mM Imidazole ,2mM DTT,1mM PMSF,0.5mMEDTA, pH8）溶液中，采用HN92-II超声破碎仪，Q2号变辐杆，放置于冰盒上，功率100伏、超声4s、间息5s、30个循环、循环三次，再4℃、12000rp离20分钟，取上清，-20℃冻存待用。

按照胶厚度0.75cm，浓缩胶5%，80v电泳，10%的分离胶，120v电泳，进行制作小SDS-PAGE胶和电泳，考马氏亮蓝染色。电泳的结果图2所示，根据此图得到的目的蛋白的大小为98Da左右，与SEQ ID NO. 17所显示的融合酶的蛋白大小基本一致，融合酶的最佳表达条件为1m M IPTG，37℃诱导培养5小时。

实施例3：融合酶的纯化

为方便小规模纯化，获得毫克级的融合酶，满足下一步用于融合酶的质量控制和初步应用中实验需求，进行2L级别的发酵培养，诱导和纯化。

2L级别的发酵培养和诱导的条件按照实施方法二中表达条件确立的方法进行。采用XZ-8M型大容量低温高速离心机（湘仪离心机仪器有限公司），5000rpm，5分钟，4℃离心去菌液，收集菌体。再重悬于100ml（50mM NaH₂PO₄,500mM KCl,10mM Imidazole pH8.0）缓冲液中，震荡离心4℃离心收集菌体，以去除LB液体培养基残留。将沉淀后菌泥重悬于以上同样溶液中，为避免蛋白的降解，维持蛋白的构象和避免蛋白聚集，在上述重悬中加入终浓度为2mM DTT、1mM PMSF和0.5mM EDTA，采用HN92-II超声破碎仪，Q6号变辐杆，冰浴、功率400伏、超声4s、间息5s、30个循环、循环五次，再4℃、10000rpm离40分钟，取上清，采用0.45µm过滤器过滤除颗粒，-20℃冻存待用。

采用APPS MV 50D蛋白纯化仪器（利穗科技(苏州)有限公司）对过滤后的上清进行纯化，100ml上样，用溶液（50mM NaH₂PO₄,500mM KCl,20mM Imidazole, 2mM DTT pH8.0）洗涤到基线， Protio^®NI-NTA 10ml预装亲和柱咪唑梯度洗脱；Sephdex G-25脱盐柱脱盐；SP阳离子柱离子梯洗脱；Superdex 200分子筛柱分离；50ml超滤管浓缩，再加入终浓度为50%的甘油、0.5% Twen-20、0.5% NP-40和200µg/ml BSA，得到6ml(2.5mg/ml)融合酶蛋白，这些过程如图3、图4、图5、图6、图7所显示。

按照胶厚度0.75cm，浓缩胶5%，80v电泳，10%的分离胶，120v电泳，进行制作小SDS-PAGE胶和电泳，考马氏亮蓝染色，电泳的结果图8所示。经过灰度扫描分析，纯度大于98%。

实施例4：融合酶的质量控制和初步应用

1、融合酶核酸内切酶残留检测

6ml(2.5mg/ml)的融合酶原液，用溶液（20mMTris-HCl 0.1mMEDTA,100mM KCl,1mMDTT，50% Glycerol,0.5%Twen-20,0.5% NP-40,200ug/ml BSA pH7.4）稀释到80µg/ml。50µl的反应体系中，2µl的该融合酶与1µg øx174RFI型DNA 37℃温浴4 小时，转变为RFII型的比例较少，不明显。核酸电泳结果如图9显示，说明在纯化的融合酶稀释液中残留的内切酶残留量及其少，不足以影响待扩增的模板的完整性。

2、融合酶基因组残留检测

该融合酶的表达是在大肠杆菌表达菌株Rosetta-Gami B(DE3)pLysS中经过诱导表达后纯化出来的，诱导表达时的OD₆₀₀为0.8左右，此时大肠杆菌处于指数式生长期，大肠杆菌基因组的含量比较高。基因组拷贝数残留量过高，会导致非特异性扩增，特别是在低拷贝模板做PCR扩增时特别明显，例如皮克级的原核基因组测序的过程中，融合酶中含有皮克级宿主菌基因组残留，会导致实验结果失真。因此控制表达菌株的基因组在纯化的融合酶中的残留是融合酶质量好坏和使用范围大小的重要因素之一。

本发明采用培养大肠杆菌DH5alpha，提取其基因组作为模板，5ng的基因组经过计算大约为10⁶拷贝，用超纯水做10⁶-10⁰一系列10倍梯度稀释。利用Agilent StratageneMX3000P定量PCR仪器，采用QPCR绝对定量方法方法对大肠杆菌的16s DNA片段进行扩增，其中上游引物（SEQ ID NO. 1）为：5-AGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTT-3；下游引物（SEQ ID NO.2）为：5-CAGTATCAGATGCAGTTCCCAGGTT-3。反应体系为2x SYBR qPCR Mix(大连宝生物)12.5µl、引物(6µM)各位1.25µl、超纯水8µl、待测样品2µl,共25µl。同时设置2µl的超纯水作为空白对照、2µl融合酶稀释液作为阴性对照。反应条件为：95℃预变性5分钟，95℃变性20秒，55℃复性20秒，72℃延伸30秒，40个循环。

40个循环结束后，以梯度稀释的拷贝数为横坐标，以各个梯度的CT值为纵坐标，做标准曲线，再依据待测样品的CT值，计算出稀释后(80µg/m)融合酶中每微升中残留的大肠杆菌基因组的拷贝数。

标准曲线中基因组拷贝数与CT值如表所显示：

拷贝数	10<sup>6</sup>	10<sup>5</sup>	10<sup>4</sup>	10<sup>3</sup>	10<sup>2</sup>	10<sup>1</sup>	10<sup>0</sup>
								CT值	11.67	14.63	18.07	21.57	24.94	27.9	30.76

结果如图10和11所显示的扩增曲线和标准曲线，其中超纯水、稀释液、800µg/ml融合酶液、80µg/ml融合酶液的CT值均大于30。其中80µg/ml的融合酶稀释液中含有的拷贝数小于1，该融合酶在工作浓度下宿主菌基因组残留量较低，说明经过亲和柱洗脱；SephdexG-25脱盐；SP阳离子柱离子梯度洗脱；Superdex200分子筛柱等分离纯化后去除了绝大部分的大肠杆菌基因组核酸残留。

3、该融合酶保真度检测

在技术背景的叙述中，对Taq DNA Polymerase、Pfu DNA Polymerase、Kod DNAPolymerase、Vent DNA Polymerase、Deep Vent DNA Polymerase等常规的PCR控制酶的保真度进行了说明，除Taq DNA Polymerase在10^-5外，其他几种酶的保真度均为10^-6左右，在对扩增的过程中，随着待扩增片段长度和循环数的增加，错误碱基的渗入会明显增加，因而影响了测序结果的准确性和效果。

对本发明纯化的融合酶采用蓝白斑筛选法，对融合酶的PCR保真度进行测定，具体方法如下：从LacIOZ alpha Plasmid中采用上有引物SEQ ID NO. 3（5-GACGAATTCGTTTTCCCAGTCACGAC-3）和下游引物SEQ ID NO. 4（5-GGTATCTTATAGTCCTGTCG-3）扩增1.4KB左右的片段，采用50µl反应体系( 2mM MgCl₂、0.5µM上下游引物、2.4ng LacIOZalpha Plasmid、0.02 M Tris-HCl、 60 mM KCl 、10mM (NH4)₂SO₄、 0.02% BSA、 pH 8.8、0.3mM dNTP),加入0.5µl的该融合酶（80µg/ml）。反应条件为：95℃预变性0.5分钟，95℃变性10秒，56℃复性20秒，72℃延伸60秒，25个循环，再72℃保持2分钟。

该PCR产物纯化后，经过EcoRI限制性内切酶消化，连接到λgt10型λ噬菌体载体臂上，再进行ƛ噬菌体的包装，转染大肠杆菌DH5alpha,涂布于含有X-gal(1mg/ml)和复制版的X-gal(1mg/ml)+IPTG(1.5mM)的LB平板上，37度培养后，计算蓝色和白色噬菌斑的数量。

由于LacI有效突变区域的碱基数量在349bp左右，而且由于在绝大多数情况下，25个循环PCR后得到产物数量实际并不是原来理想状态下模板的2²⁵倍，我们将25个循环后得到的产物分子数除以模板的分子数得到实际扩增倍数，从而得到理论状态下的PCR循环数，再按照蓝色数量/蓝色和白色噬菌斑总量/349/理论PCR循环数，得出每个碱基在每次循环中产生突变的几率，经过计算该融合酶错误碱基的渗入突变几率为2.3x10^-7/碱基/循环。说明该融合酶具有比现有常规PCR扩增酶具有更低渗入突变几率，保真度非常高。

4、该融合酶对超长片段的PCR扩增效果

在常规的PCR实验中，常规PCR扩增酶的进行性、适应性和延伸速度并不高，进行性通常指在PCR延伸过程中，每个酶分子在每次催化反应过程中能够渗入到延伸链末端的核苷酸分子数，通常进行性好，链的延伸速度也较快。Kod DNA Polymerase在DNA聚合时的延伸速度为2kb/min左右，可以扩增6Kb左右的模板，但是对于大于10kb,甚至20kb以上的待扩增片段就有点力不从心。主要问题每次循环过程中需要的高温时间较长，随着循环次数的增加，导致酶的活性逐渐下降；同时长片段的扩增也导致长片段产物中错误碱基渗入的数量明显增加。为解决以上问题，我们经常采用的办法是增加酶活的稳定性，例如在反应体系中加BSA、海藻糖、甘露醇、非离子型去污试剂、还原试剂、甘油等；优化酶的反应体系包括离子的种类和强度、合适的缓冲体系、适当降低镁离子的浓度、延长延伸时间等。这些方法在一定程度上对长片端的扩增带来一定的好处，但是解决不了根本问题。

该融合酶对10Kb以下的片段的扩增速度为10kb/min左右, 采用50µl反应体系(2mM MgCl₂,0.5µM上下游引物、λ噬菌体基因组0.5ng、0.02M Tris-HCl、60 mM KCl、 10mM(NH4)₂SO₄、 0.02% BSA、 pH 8.8、0.3mM dNTP),加入0.5µl的该融合酶（80µg/ml）。对于不同长度的待扩增目的片段，均采用的反应条件为： 95℃预变性0.5分钟，95℃变性10秒，68℃复性30秒，72℃延伸2分钟，20个循环，再72℃保持5分钟。

扩增的效果如图12所显示，该融合酶的扩增效率较高，可以用于超长序列扩增和测序。

扩增时所使用的引物如下:

F（SEQ ID NO. 5） 5-CCTGCTCTGCCGCTTCACGC-3

R1(0.5K)（SEQ ID NO. 6） 5-TCCGGATAAAAACGTCGATGACATTTGC-3

R2(1K)（SEQ ID NO. 7） 5-GATGACGCATCCTCACGATAATATCCGG-3

R3(2K)（SEQ ID NO. 8） 5-CCATGATTCAGTGTGCCCGTCTGG-3

R4(5K)（SEQ ID NO. 9） 5-CGAACGTCGCGCAGAGAAACAGG-3

R5(8K)（SEQ ID NO. 10） 5-GCCTCGTTGCGTTTGTTTGCACG-3

R6(10K)（SEQ ID NO. 11） 5-GCACAGAAGCTATTATGCGTCCCCAGG-3

R7(15K)（SEQ ID NO. 12） 5-CTTGTTCCTTTGCCGCGAGAATGG-3

R8(20K)（SEQ ID NO. 13） 5-TCTTCCTCGTGCATCGAGCTATTCGG-3

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 依科赛生物科技（太仓）有限公司

<120> 一种高保真快速扩增融合酶及其制备方法

<130> 2017

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

agcggggagg aagggagtaa agtt 24

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

cagtatcaga tgcagttccc aggtt 25

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gacgaattcg ttttcccagt cacgac 26

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ggtatcttat agtcctgtcg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

cctgctctgc cgcttcacgc 20

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

tccggataaa aacgtcgatg acatttgc 28

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213>Artificial Sequence

<400> 7

gatgacgcat cctcacgata atatccgg 28

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

ccatgattca gtgtgcccgt ctgg 24

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

cgaacgtcgc gcagagaaac agg 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

gcctcgttgc gtttgtttgc acg 23

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

gcacagaagc tattatgcgt ccccagg 27

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

cttgttcctt tgccgcgaga atgg 24

<210> Primer 13

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

tcttcctcgt gcatcgagct attcgg 26

<210> 14

<211> 189

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

gctacggtta agtttaaata taagggcgaa gaactggaag tggacatttc taaaatcaaa 60

aaagtgtggc gcgtgggcaa gatgatctct tttacctatg atctgggcgg cggcaaaacg 120

ggccgcggtg cagtgagcga aaaagatgct cctaaagaac tgctgcaaat gctggaaaaa 180

cagaaaaaa 189

<210> 15

<211> 2334

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

atggcgagcg cgattctgga caccgattac atcaccgagg atggtaaacc ggtgattcgt 60

atcttcaaga aagagaacgg cgaatttaag atcgaatatg accgtacctt cgagccgtac 120

ttttatgcgc tgctgaagga cgatagcgcg attgaggaag ttaagaaaat caccgcggaa 180

cgtcacggta ccgtggttac cgtgaagcgt gttgagaaag tgcagaagaa attcctgggc 240

cgtccggtgg aagtttggaa actgtacttt acccacccgc aagacgtgcc ggcgattcgt 300

gataagatcc gtgaacaccc ggcggttatt gacatctacg agtatgatat tccgttcgcg 360

aagcgttacc tgatcgacaa aggtctggtg ccgatggagg gcgatgagga actgaagatg 420

ctggcgttcg acattgaaac cctgtaccac gagggcgagg aatttgcgga aggcccgatt 480

ctgatgatca gctatgcgga tgaggaaggt gcgcgtgtga tcacctggaa aaacgtggac 540

ctgccgtacg ttgatgtggt tagcaccgaa cgtgagatga ttaagcgttt cctgcgtgtg 600

gttaaggaga aagacccgga tgttctgatc acctacaacg gtgacaactt cgattttgcg 660

tatctgaaga aacgttgcga aaaactgggc attaactttg cgctgggtcg tgatggcagc 720

gagccgaaaa tccagcgtat gggtgaccgt ttcgcggtgg aagttaaggg ccgtattcac 780

tttgacctgt acccggtgat tcgtcgtacc atcaacctgc cgacctacac cctggaagcg 840

gtgtatgagg cggttttcgg tcaaccgaag gaaaaagttt atgcggagga aatcaccacc 900

gcgtgggaga ccggcgaaaa cctggagcgt gtggcgcgtt acagcatgga ggatgcgaaa 960

gttacctatg aactgggcaa ggagttcctg ccgatggaag cgcagctgag ccgtctggtg 1020

ggtcaaccgc tgtgggacgt tagccgtagc agcaccggca acctggtgga gtggtttctg 1080

ctgcgtaaag cgtacgaacg taacgaggtt gcgccgaaca agccgagcga ggaagagtac 1140

cagcgtcgtc tgcgtgagag ctataccggt ggcttcgtga aggaaccgga gaaaggcctg 1200

tgggaaaaca ttgtttacct ggattttcac gcgctgtatc cgagcatcat tatcacccac 1260

aacgtgagcc cggataccct gaacctggag ggttgcaaga actacgacat cgcgccgcag 1320

gttggccaca agttctgcaa agacattccg ggttttatcc cgagcctgct gggccacctg 1380

ctggaagagc gtcagaagat taaaaccaag atgaaagaaa cccaagaccc gattgagaaa 1440

atcctgctgg attaccgtca aaaggcgatc aaactgctgg cgaacagctt ctacggttac 1500

tatggctatg cgaaggcgcg ttggtactgc aaagaatgcg cggagagcgt gaccgcgtgg 1560

ggtcgtaaat atattgaact ggtttggaag gagctggaag agaagttcgg ttttaaagtg 1620

ctgtacatcg acaccgatgg cctgtatgcg accattccgg gtggcgaaag cgaagagatc 1680

aagaaaaagg cgctggagtt tctgaagtac atcaacgcga aactgccggg cgcgctggaa 1740

ctggagtacg aaggtttcta taaacgtggc ctgtttgtga ccaaaaagaa atatgcggtt 1800

attgatgaag agggtaaaat caccacccgt ggcctggaga ttgttcgtcg tgactggagc 1860

gaaatcgcga aagagaccca ggcgcgtgtg ctggaagcgc tgctgaagga cggtgatgtt 1920

gagaaagcgg ttcgtatcgt gaaggaagtt accgagaagc tgagcaaata cgaagtgccg 1980

ccggagaagc tggttattca cgaacaaatc acccgtgacc tgaaggatta taaagcgacc 2040

ggtccgcacg tggcggttgc gaaacgtctg gcggcgcgtg gtgtgaagat ccgtccgggc 2100

accgtgatta gctacatcgt tctgaaaggt agcggccgta ttggcgatcg tgcgatcccg 2160

ttcgacgagt ttgatccgac caagcacaaa tatgacgcgg aatactatat tgagaaccag 2220

gtgctgccgg cggttgaacg tatcctgcgt gcgttcggtt accgtaaaga ggacctgcgt 2280

tatcagaaga cccgtcaagt tggtctgagc gcgtggctga agccgaaagg cacc 2334

<210> 16

<211> 2538

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

atggcgagcg cgattctgga caccgattac atcaccgagg atggtaaacc ggtgattcgt 60

atcttcaaga aagagaacgg cgaatttaag atcgaatatg accgtacctt cgagccgtac 120

ttttatgcgc tgctgaagga cgatagcgcg attgaggaag ttaagaaaat caccgcggaa 180

cgtcacggta ccgtggttac cgtgaagcgt gttgagaaag tgcagaagaa attcctgggc 240

cgtccggtgg aagtttggaa actgtacttt acccacccgc aagaccagcc ggcgattcgt 300

gataagatcc gtgaacaccc ggcggttatt gacatctacg agtatgatat tccgttcgcg 360

aagcgttacc tgatcgacaa aggtctggtg ccgatggagg gcgatgagga actgaagatg 420

ctggcgttcg acattgaaac cctgtaccac gagggcgagg aatttgcgga aggcccgatt 480

ctgatgatca gctatgcgga tgaggaaggt gcgcgtgtga tcacctggaa aaacgtggac 540

ctgccgtacg ttgatgtggt tagcaccgaa cgtgagatga ttaagcgttt cctgcgtgtg 600

gttaaggaga aagacccgga tgttctgatc acctacaacg gtgacaactt cgattttgcg 660

tatctgaaga aacgttgcga aaaactgggc attaactttg cgctgggtcg tgatggcagc 720

gagccgaaaa tccagcgtat gggtgaccgt ttcgcggtgg aagttaaggg ccgtattcac 780

tttgacctgt acccggtgat tcgtcgtacc atcaacctgc cgacctacac cctggaagcg 840

gtgtatgagg cggttttcgg tcaaccgaag gaaaaagttt atgcggagga aatcaccacc 900

gcgtgggaga ccggcgaaaa cctggagcgt gtggcgcgtt acagcatgga ggatgcgaaa 960

gttacctatg aactgggcaa ggagttcctg ccgatggaag cgcagctgag ccgtctggtg 1020

ggtcaaccgc tgtgggacgt tagccgtagc agcaccggca acctggtgga gtggtttctg 1080

ctgcgtaaag cgtacgaacg taacgaggtt gcgccgaaca agccgagcga ggaagagtac 1140

cagcgtcgtc tgcgtgagag ctataccggt ggcttcgtga aggaaccgga gaaaggcctg 1200

tgggaaaaca ttgtttacct ggattttcac gcgctgtatc cgagcatcat tatcacccac 1260

aacgtgagcc cggataccct gaacctggag ggttgcaaga actacgacat cgcgccgcag 1320

gttggccaca agttctgcaa agacattccg ggttttatcc cgagcctgct gggccacctg 1380

ctggaagagc gtcagaagat taaaaccaag atgaaagaaa cccaagaccc gattgagaaa 1440

atcctgctgg attaccgtca aaaggcgatc aaactgctgg cgaacagctt ctacggttac 1500

tatggctatg cgaaggcgcg ttggtactgc aaagaatgcg cggagagcgt gaccgcgtgg 1560

ggtcgtaaat atattgaact ggtttggaag gagctggaag agaagttcgg ttttaaagtg 1620

ctgtacatcg acaccgatgg cctgtatgcg accattccgg gtggcgaaag cgaagagatc 1680

aagaaaaagg cgctggagtt tctgaagtac atcaacgcga aactgccggg cgcgctggaa 1740

ctggagtacg aaggtttcta taaacgtggc ctgtttgtga ccaaaaagaa atatgcggtt 1800

attgatgaag agggtaaaat caccacccgt ggcctggaga ttgttcgtcg tgactggagc 1860

gaaatcgcga aagagaccca ggcgcgtgtg ctggaagcgc tgctgaagga cggtgatgtt 1920

gagaaagcgg ttcgtatcgt gaaggaagtt accgagaagc tgagcaaata cgaagtgccg 1980

ccggagaagc tggttattca cgaacaaatc acccgtgacc tgaaggatta taaagcgacc 2040

ggtccgcacg tggcggttgc gaaacgtctg gcggcgcgtg gtgtgaagat ccgtccgggc 2100

accgtgatta gctacatcgt tctgaaaggt agcggccgta ttggcgatcg tgcgatcccg 2160

ttcgacgagt ttgatccgac caagcacaaa tatgacgcgg aatactatat tgagaaccag 2220

gtgctgccgg cggttgaacg tatcctgcgt gcgttcggtt accgtaaaga ggacctgcgt 2280

tatcagaaga cccgtcaagt tggtctgagc gcgtggctga agccgaaagg caccggtggc 2340

ggtggcgcta cggttaagtt taaatataag ggcgaagaac tggaagtgga catttctaaa 2400

atcaaaaaag tgtggcgcgt gggcaagatg atctctttta cctatgatct gggcggcggc 2460

aaaacgggcc gcggtgcagt gagcgaaaaa gatgctccta aagaactgct gcaaatgctg 2520

gaaaaacaga aaaaataa 2538

<210> 17

<211> 845

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 17

Met Ala Ser Ala Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys

1 5 10 15

Pro Val Ile Arg Ile Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu

20 25 30

Tyr Asp Arg Thr Phe Glu Pro Tyr Phe Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp

35 40 45

Ser Ala Ile Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Gly Thr

50 55 60

Val Val Thr Val Lys Arg Val Glu Lys Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly

65 70 75 80

Arg Pro Val Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Thr His Pro Gln Asp Gln

85 90 95

Pro Ala Ile Arg Asp Lys Ile Arg Glu His Pro Ala Val Ile Asp Ile

100 105 110

Tyr Glu Tyr Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly

115 120 125

Leu Val Pro Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Lys Met Leu Ala Phe Asp

130 135 140

Ile Glu Thr Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Ala Glu Gly Pro Ile

145 150 155 160

Leu Met Ile Ser Tyr Ala Asp Glu Glu Gly Ala Arg Val Ile Thr Trp

165 170 175

Lys Asn Val Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Arg Glu

180 185 190

Met Ile Lys Arg Phe Leu Arg Val Val Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val

195 200 205

Leu Ile Thr Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys

210 215 220

Arg Cys Glu Lys Leu Gly Ile Asn Phe Ala Leu Gly Arg Asp Gly Ser

225 230 235 240

Glu Pro Lys Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys

245 250 255

Gly Arg Ile His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn

260 265 270

Leu Pro Thr Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Gln

275 280 285

Pro Lys Glu Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Thr Thr Ala Trp Glu Thr

290 295 300

Gly Glu Asn Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys

305 310 315 320

Val Thr Tyr Glu Leu Gly Lys Glu Phe Leu Pro Met Glu Ala Gln Leu

325 330 335

Ser Arg Leu Val Gly Gln Pro Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr

340 345 350

Gly Asn Leu Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn

355 360 365

Glu Val Ala Pro Asn Lys Pro Ser Glu Glu Glu Tyr Gln Arg Arg Leu

370 375 380

Arg Glu Ser Tyr Thr Gly Gly Phe Val Lys Glu Pro Glu Lys Gly Leu

385 390 395 400

Trp Glu Asn Ile Val Tyr Leu Asp Phe His Ala Leu Tyr Pro Ser Ile

405 410 415

Ile Ile Thr His Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Leu Glu Gly Cys

420 425 430

Lys Asn Tyr Asp Ile Ala Pro Gln Val Gly His Lys Phe Cys Lys Asp

435 440 445

Ile Pro Gly Phe Ile Pro Ser Leu Leu Gly His Leu Leu Glu Glu Arg

450 455 460

Gln Lys Ile Lys Thr Lys Met Lys Glu Thr Gln Asp Pro Ile Glu Lys

465 470 475 480

Ile Leu Leu Asp Tyr Arg Gln Lys Ala Ile Lys Leu Leu Ala Asn Ser

485 490 495

Phe Tyr Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu

500 505 510

Cys Ala Glu Ser Val Thr Ala Trp Gly Arg Lys Tyr Ile Glu Leu Val

515 520 525

Trp Lys Glu Leu Glu Glu Lys Phe Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ile Asp

530 535 540

Thr Asp Gly Leu Tyr Ala Thr Ile Pro Gly Gly Glu Ser Glu Glu Ile

545 550 555 560

Lys Lys Lys Ala Leu Glu Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Ala Lys Leu Pro

565 570 575

Gly Ala Leu Glu Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Leu Phe

580 585 590

Val Thr Lys Lys Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr

595 600 605

Thr Arg Gly Leu Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys

610 615 620

Glu Thr Gln Ala Arg Val Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asp Gly Asp Val

625 630 635 640

Glu Lys Ala Val Arg Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys

645 650 655

Tyr Glu Val Pro Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg

660 665 670

Asp Leu Lys Asp Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys

675 680 685

Arg Leu Ala Ala Arg Gly Val Lys Ile Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser

690 695 700

Tyr Ile Val Leu Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro

705 710 715 720

Phe Asp Glu Phe Asp Pro Thr Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr

725 730 735

Ile Glu Asn Gln Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Arg Ala Phe

740 745 750

Gly Tyr Arg Lys Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly

755 760 765

Leu Ser Ala Trp Leu Lys Pro Lys Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ala Thr

770 775 780

Val Lys Phe Lys Tyr Lys Gly Glu Glu Leu Glu Val Asp Ile Ser Lys

785 790 795 800

Ile Lys Lys Val Trp Arg Val Gly Lys Met Ile Ser Phe Thr Tyr Asp

805 810 815

Leu Gly Gly Gly Lys Thr Gly Arg Gly Ala Val Ser Glu Lys Asp Ala

820 825 830

Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu Glu Lys Gln Lys Lys

835 840 845

Claims

1.一种高保真快速扩增融合酶，其特征在于：所述融合酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.17所显的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的高保真快速扩增融合酶，其特征在于：所述非特异性双链结合区的氨基酸序列为SEQ ID NO. 14所显的核苷酸序列编码的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的高保真快速扩增融合酶，其特征在于：所述经过多步生物技术方法改造后的嗜热古细菌DNA聚合酶的氨基酸序列为SEQ ID NO. 15所显的核苷酸序列编码的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的高保真快速扩增融合酶，其特征在于：编码所述融合酶的核苷酸序列为核苷酸序列SEQ ID NO. 16，所述SEQ ID NO.16为SEQ ID NO. 14和SEQ ID NO.15所显的核苷酸序列，并连接到原核表达质粒的启动子下而形成表达载体。

5.根据权利要求1-4任一项所述的高保真快速扩增融合酶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）采用全基因合成的重叠PCR延伸方法，利用高保真酶合成SEQ ID NO. 14和SEQ IDNO. 15所显示的核苷酸序列；

（2）将SEQ ID NO. 14和SEQ ID NO. 15所合成两个片段的核苷酸序列和编码连接肽的核苷酸序列进行拼接连接；

（3）将测序正确的步骤（2）的核苷酸序列连接到表达载体；

（4）转化到表达菌株，进行诱导表达；

（5）所述菌株经超声破碎、离心收集、过滤除颗粒和纯化，得所述高保真快速扩增融合酶。